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Das Kraftmikroskop hat sich in vieler Hinsicht als effizientes Gerät für Untersuchungen und Manipulationen auf molekularer Ebene erwiesen. Dabei wird selbst unter physiologischen Bedingungen eine Auflösung erreicht, die Proteinsubstrukturen erkennen läßt. Als Kraftspektroskop kann es mechanische Eigenschaften wie Dehnungsverhalten und Reißfestigkeit einzelner Moleküle, die zwischen der Sensorfeder und der Unterlage eingespannt werden, untersuchen. Sogar die Bindungskräfte zwischen einem Molekül am Kraftsensor und einem anderen am Substrat können mittels Kraftspektroskopie mit etwa 3 pN Genauigkeit ermittelt werden. Von besonderem Interesse solcher Untersuchungen sind Moleküle mit spezifischer Affinität nach dem Schlüssel-Schloß-Prinzip, wie Rezeptor-Ligand- Systeme und Adhäsionsmoleküle. Bisher waren hauptsächlich wasserlösliche Moleküle solchen Messungen zugänglich. Bindungen zwischen amphiphilen Proteinen oder Membranproteinen zu messen, die durch hydrophobe Wechselwirkungen in der Membran verankert sind, erfordert neue Konzepte. Diesen Molekülen gilt das Augenmerk dieser Arbeit. Da die Verankerung in sogenanten „supported bi-layern“ und Vesikeln nicht immer zum gewünschten Erfolg führt, wird hier eine ungewöhnliche, aber sehr natürliche Alternative vorgestellt: Das Adhäsionsmolekül wird nicht aufwendig isoliert und der Meßmethode zugänglich gemacht, sondern bleibt in seiner natürlichen Umgebung, der Zelle, wohingegen die Methode angepasst wird. Dies ist durch die Befestigung einer Zelle am Kraftsensor eines Kraftspektroskopes geglückt und es gelang damit erstmals die Adhäsionskraft eines einzelnen Adhäsionsmoleküls in einer lebenden Zelle zu messen. So einfach diese Methode beschrieben ist, so viele Unwägbarkeiten treten dabei durch die hohe Komplexität der Zelle und der Zelloberfläche im Besonderen auf. Daher wird einleitend eine grobe Einführung in die Funktionen und den Aufbau einer Zelle und die üblichen Meßmethoden im Bereich der Zelladhäsionsmessung vorgestellt. Die Beschreibung der Meßmethode und der Umrüstung des Kraftmikroskopes zum Zelladhäsionskraftspektroskop sind durch technische Details im Anhang vervollständigt. Etwas aufwendig ist die Zusammenstellung der Daten, Theorien und Annahmen zum Aufbau eines semi-empirischen Modells zur Beschreibung der Adhäsionskraftmeßkurven beim Trennen adhärierender Zellen, auf der Basis vieler unabhängiger Einzelmolekülbindungen. Mit dem Zelladhäsionkraftspektroskop wurden dafür die Youngs-Moduli und die viskoelastischen Kelvin-Modell-Parameter verschiedener Zellen in dem eigens entwickelten „visko-elastic-response-mode“ vermessen. Ebenso wurden die Einflüsse der Zellkontaktkraft und der Kontaktzeit, sowie der Zuggeschwindigkeit auf die Zelladhäsionsantwort studiert und in Formeln gefaßt. Das Modell simuliert diese Meßdaten in guter Übereinstimmung und gibt dadurch einen Einblick in die physikalischen Randbedingungen für das einzelne Adhäsionsmolekül während solcher Experimente unter Berücksichtigung des zelltypischen Phänomens der Tetherbildung. Insbesondere kann damit die Bindungsdichte bei Adhäsionen auf verschiedenen Oberflächen berechnet werden. Demnach schließt eine Epithelzelle etwa vier Bindungen pro Quadratmikrometer mit einer Glasoberfläche, zwei mit einer anderen Epithelzelle und nur 0,8 mit einer passivierten Oberfläche. Mit kraftspektroskopischen Messungen der Adhäsionskräfte bei der Einnistung eines Trophoblasten in die Gebärmutter an einem naturnahen Laborsystem kann eine andersartige - mit dem Modell unabhängiger Bindungen nicht beschreibbare - Wechselwirkung identifiziert werden. Die Meßergebnisse deuten auf einen kooperativen Prozeß der molekularen Adhäsionsinselbildung hin. Kontrollmessungen an funktionalisierten Oberflächen erhärten diese Hypothese. Mit ersten Ergebnissen von Adhäsionsmessungen zwischen Knochenzellen und potentiellen Implantatoberflächen wird neben dem Einfluß der Oberflächenbeschaffenheit auch der des Meßmediums nachweisbar, wodurch die Generalität dieser Methode verdeutlicht wird. Im letzten Kapitel über die Interaktionen einzelner Zellen wird anhand der induzierten Lektinwechselwirkung zwischen roten Blutkörperchen die prinzipielle Möglichkeit der Zelladhäsionskraftspektroskopie Einzelmolekülereignisse zu vermessen nachgewiesen. Die dafür nötigen geringsten Kontaktkräfte von unter 40 pN, konnten durch extrem weiche Kraftsensoren (

In dieser Arbeit werden Anwendungen der Kraftspektroskopie zur Erforschung und Anwendung von nicht-kovalenten biologischen Bindungen vorgestellt. Analysiert wurde die Bindungsstärke einzelner Rezeptor-Ligand Bindungen und die Wechselwirkung von Zellmonolayern. Als Anwendung der molekularen Erkennung wird die Lokalisation von Zellen auf Grund ihrer spezifischen Wechselwirkung vorgestellt. Durch den Vergleich der Bindungskräfte mehrerer Rezeptoren zu einem Liganden lassen sich Aussagen über die biologische Wirkung und Aufgabe einer Rezeptor-Ligand Bindung treffen. Die Analyse der Trennkurven von biologisch relevanten Zell/Zellmonolayer- oder großflächigen Zell/Protein-Kontakten ergeben Einblicke in zeitliche Abläufe und involvierte Proteine bei der Zelladhäsion. • Dynamische Kraftspektroskopie mit drei verschiedenen Lektinen und zwei Liganden zeigten, daß die jeweilige Bindungskraft in dem experimentell zugänglichen Bereich der Ladungsrate über 3 Größenordnungen (100-10000 pN/sec) eine lineare Abhängigkeit vom Logarithmus der Ladungsrate aufweist. Zusätzlich sind die einzelnen Rezeptor-Ligand Systeme auf Grund ihrer Bindungsstärke bei Ladungsraten größer als 700 pN/sec eindeutig zu unterscheiden. Die Bindungsstärke, die für das schwächste Paar 34 pN und für das stärkste 58 pN bei 3000 pN/sec Ladungsrate beträgt, läßt sich in Relation zur biologischen Wirkung setzen. • Mit Monte Carlo und Wahrscheinlichkeitsdichte Simulationen konnte wegen der experimentell gemessenen linearen Abhängigkeit der Bindungskraft vom natürlichen Logarithmus der Ladungsrate die Breite oder Reichweite des Bindungspotentials der jeweiligen Rezeptor-Ligand Bindung bestimmt werden (4-10 Å). Die für die verschiedenen Bindungen durchgeführten Simulationen zeigten, daß die berechnete Breite des Potentials reziprok mit der gemessenen Dynamik der Bindungsstärke korreliert. • Am Beispiel von Uterusepithel- und Trophoblastzellen wurde gezeigt, daß mit dem Kraftmikroskop die Bindungsfähigkeit von Zellen gemessen werden kann. Experimente mit verschiedenen Modelloberflächen und die Variation der Kontaktzeit machten deutlich, daß die Präsenz von Rezeptoren für Zelladhäsionsproteine, wie z.B. Integrine für Fibronektin, in der apikalen Membran und Kontaktzeiten länger als 20 min die notwendige Voraussetzung für stabile interzelluläre Kontakte zwischen Epithelzellen sind. Für kürzere Kontaktzeiten ist ein Modell mit nicht vernetzten, membrangebundenen Bindungspartnern und deren möglicher viskoser Anbindung an die Zelle erstellt worden. • In einem gemischten Zellmonolayer aus Erythrozyten der Blutgruppe A und O, sind die Zellen der Gruppe A, auf Grund der spezifischen Wechselwirkung mit dem funktionalisierten Kraftsensor, mit einer Affinitätsabbildung lokalisiert worden. Die spezifische Lokalisation von Liganden an lebenden Zellen mit dem Kraftmikroskop ist demnach mit dieser Technik möglich.