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Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Fluoreszenz von Hybridsystemen aus Gold Nanopartikeln und Farbstoffen zeitlich und spektral aufgelöst untersucht. Neben einer ultraschnellen Fluoreszenzemission, welche direkt von den Gold Nanopartikeln stammt, wurde insbesondere die dipolinduzierte Auslöschung der Fluoreszenz von Farbstoffen, welche auf der Partikeloberfläche chemisch gebunden sind, als Funktion der Partikelgröße und des Molekülabstandes untersucht. Hierzu wurden für drei verschiedene Farbstoffe Serien von Hybridsystemen hergestellt, in denen stets nur ein Parameter, nämlich die Nanopartikelgröße oder der Abstand des Farbstoffes, systematisch über eine Größenordnung geändert wird. Die experimentell bestimmten Transienten der Hybridsysteme zeigen, dass bereits die kleinsten Nanopartikel mit einem Radius von nur 1 nm die Quanteneffizienz bei einem Farbstoffabstand von 1 nm um 99,8 % verringern können. Des Weiteren wird nachgewiesen, dass die Quanteneffizienz der Farbstoffe sogar bis zu Abständen von 16 nm noch um über 50 % gesenkt ist. Eine derart hohe Auslöschungseffizienz wird in Energie-Transfer Systemen, welche nur aus organischen Farbstoffen bestehen, nicht erreicht. Gold Nanopartikel sind damit in der Tat viel versprechende Energieakzeptoren für eine zukünftige Generation von Nanosensoren. In dieser Arbeit kann zum ersten Mal die Ursache der effizienten Fluoreszenzauslöschung durch Gold Nanopartikel anhand der experimentellen Bestimmung der strahlenden und nichtstrahlenden Zerfallskanäle des Hybridsystems nachgewiesen werden. Sie resultiert aus einem strahlungslosen Energie-Transfer zum Partikel und einer gleichzeitigen Absenkung der strahlenden Rate des Farbstoffs. Die experimentell ermittelten strahlenden und nichtstrahlenden Raten der Hybridsysteme werden mit Modellrechnungen nach Gersten und Nitzan verglichen. Es zeigt sich, dass bei konstantem Molekülabstand, aber unterschiedlichen Partikelgrößen, eine qualitative Übereinstimmung der Messergebnisse mit den Modellvorhersagen vorliegt, die absoluten Energie-Transfer Raten sich jedoch um zwei Größenordnungen unterscheiden. Die Abweichung von den experimentellen Ergebnissen wird auf das Vorhandensein nichtlokaler Effekte zurückgeführt, welche im Modell nicht berücksichtigt, aber von aufwendigeren Modellierungen vorhergesagt werden. Bereits ohne oberflächengebundene Farbstoffe zeigen die experimentellen Ergebnisse eine Photonenemission aus Gold Nanopartikeln. Die Emission ist in ihrer spektralen Form der Plasmonresonanz sehr ähnlich und weist ebenfalls eine mit zunehmender Partikelgröße charakteristische Rotverschiebung auf. Gold Nanopartikel mit Radien von 1 – 30 nm zeigen, dass die Quanteneffizienz der Emission unabhängig von der Partikelgröße ist. Die quantitative sehr gute Übereinstimmung der Messergebnisse mit Modellrechnungen nach Shabhazyan et al. erlaubt zum ersten Mal eine mikroskopische Erklärung der verantwortlichen physikalischen Prozesse für die beobachtete Fluoreszenz. Sie wird als der strahlende Zerfall eines Partikelplasmons identifiziert: In den Gold Nanopartikeln rekombinieren optisch generierte d-Bandlöcher strahlungslos mit sp-Bandelektronen und emittieren dabei ein Partikelplasmon. Die Rate der Plasmonemission sinkt mit dem Volumen des Nanopartikels. Die Wahrscheinlichkeit dieser generierten Plasmonoszillation, strahlend via Photonenemission zu zerfallen, steigt wiederum mit dem Partikelvolumen. Die Quanteneffizienz des gesamten Prozesses ist daher unabhängig von der Partikelgröße. Sie ist um vier Größenordnungen über derjenigen einer direkten Aussendung eines Photons durch Rekombination von d-Bandlöchern mit sp-Bandelektronen an Goldfilmen. Der Grund liegt in der weitaus stärkeren Polarisierbarkeit und entsprechend höheren strahlenden Rate des Partikelplasmons gegenüber einzelnen Elektron-Loch Paaren.

Zusammenfassung Einleitung Mikrosphären (MS) gelten als Standardmethode zur Messung des regionalen Blutflusses. Hierzu werden MS linksatrial injiziert. Sie verteilen sich dann im arteriellen Teil des Blutkreislaufes. Die Anzahl der in den präkapillären Gefäßen festgehaltenen MS ist direkt proportional der regionalen Organdurchblutung. Da die bisherige Markierung der MS mit instabilen Nukliden die Nachteile des Umgangs mit Radioaktivität mit sich brachte, hat man in den letzten Jahren versucht, die MS mit Fluoreszenzfarbstoffen (FM) zu beladen. Diese neue Art der Markierung erfordert allerdings, daß die FM quantitativ aus den Organproben zurückgewonnen werden müssen. Dies geschah bisher mittels Filtration oder Sedimentation. Beide Methoden bieten jedoch Nachteile. Ziel unserer Studie war es, eine neue Methode zu entwickeln und deren Verarbeitungsprozess zu automatisieren. Dazu wurde ein Filtrationsgefäß entwickelt, das die Probenverarbeitung (Gewichtsbestimmung, Verdauung, Filtration, Spülung und Farbstoffauslösung) in einem einzigen Gefäß zuläßt und hierbei die vollständige Rückgewinnung der FM aus der Organprobe sicherstellt. Material und Methodik: Die von uns am Institut für Chirurgische Forschung entwickelte Sample Processing Unit (SPU) – gebrauchsmustergeschützt - besteht aus drei Untereinheiten: Filterhalter, Filter und Probengefäß. Der essentielle Bestandteil der SPU ist der Filter, der mit einem Polyamid-Filtergewebe (Maschenöffnung 7µm) ausgestattet ist. Das von uns entwickelte Verarbeitungsprotokoll sieht folgende Schritte vor: Die Gewebeprobe wird in den Filter gelegt und das Probengewicht bestimmt. Der Filter wird dann in ein Edelstahlkochgefäß gestellt und zur Verdauung des Gewebes werden 15 ml Digestionsflüssigkeit (4N KOH mit 0,02% Tween) und 1,5 ml Isopropanol 100% hinzugegeben. Nach 6 Stunden Inkubation bei 60°C ist das organische Material vollständig aufgelöst und die FM schwimmen in der Zwischenschicht zwischen KOH und Isopropanol. Mit Hilfe von Unterdruck wird die Flüssigkeit durch das Filtergewebe filtriert. Dadurch kommen die FM auf der Membran zu liegen. Der später von den FM ausgelöste Fluoreszenzfarbstoff benötigt ein neutrales Umgebungsmilieu. Hierzu müssen alle KOH-Rückstände aus dem Filter entfernt werden. Dies geschieht mittels eines Phosphatpuffers (29.9g K2HPO4 in 800ml aqua dest. vermischt mit 5.88g KH2PO4 in 200ml aqua dest.), der auf einen neutralen pH-Wert eingestellt ist. Mit 15 ml dieses Puffers wird die gesamte Innenfläche des Filters abgespült. Durch kurzes Eintauchen des Filters in den Puffer wird auch die Außenfläche von den KOH-Resten befreit. Nach Trocknung des Filters durch Zentrifugation (4000 U/min für 4 min) wird der Farbstoff mit 2 ml eines organischen Lösungsmittels (2-Ethoxyethyl acetat - Cellosolve) aus den FM ausgelöst. Durch erneute Zentrifugation (4000 U/min für 4 min) wird der Farbstoff im Sammelgefäß aufgefangen und die Fluoreszenzintensität in einem Fluoreszenzspektrometer (LS50B, Perkin Elmer, Überlingen, Deutschland) bestimmt. Die Konzentration des Farbstoffes läßt auf die Anzahl der FM rückschließen, welche wiederum direkt proportional zum Blutfluß in der untersuchten Gewebeprobe ist. Der Proportionalitätsfaktor wird durch eine Blutreferenzprobe bestimmt, die während der Injektion der FM aus der Aorta thoracalis unter konstanter Pumpenzuggeschwindigkeit (Harvard Pump, Harvard Apparatus South Nattick, USA) entnommen wird. Diese Blutprobe kann ohne vorherige Verdauung unter Koagulationsschutz (CPDA mit dem Hauptbestandteil Citrat) direkt filtriert werden. Der Farbstoff wird mittels Cellosolve aus den Mikrosphären ausgelöst und die Fluoreszenzintesität bestimmt. Experimente Zunächst wurden die FM und die SPU in vitro Tests unterzogen. Bei den FM wurde mit Hilfe einer Verdünnungsreihe die Proportionalität zwischen der Anzahl der FM und der Fluoreszenzintensität untersucht. Die SPU und die dazugehörige Verarbeitungsmethode wurden einer Wiederfindungsstudie unterzogen. Dabei wurde dieselbe Anzahl von FM aller Farben in Filter und Glasröhrchen pipettiert. Die Filter durchliefen den gesamten Verarbeitungsprozeß. Das Filtrat und die Wände der Filter wurden auf die Präsenz von FM hin kontrolliert. Die Farbstofflösung, welche aus den 40 Filtern gewonnen wurde, wurde mit einer Referenzgruppe (Glasröhrchen ohne Probenverarbeitung, n=20) verglichen. Zur in vivo Validierung der SPU erfolgten an narkotisierten Schweinen (n=8) sechs simultane Injektionen von radioaktiv markierten 15µm MS (RM) (Niob, Strontium, Scandium, Indium, Cerium und Chrom) und 15µm FM (blue, bluegreen, yellowgreen, orange, red, scarlet) zu verschiedenen Zeitpunkten. Nach der Entnahme von Leber und Nieren, wurden diese Organe nach einem vorgegebenen Schema disseziert. Der regionale Blutfluß wurde anhand der Protokolle sowohl für RM (SCHOSSER et al. 1979) als auch FM bestimmt. Zunächst wurde die Radioaktivität der Proben im g-Counter (Canberra Packard, Frankfurt a.M., Deutschland) ermittelt. Hierauf wurde nach Verarbeitung der Organgewebe in der SPU die Fluoreszenzintensität mit Hilfe des Fluoreszenzspektrometers gemessen. Der Vergleich mittels beider Methoden erhobener Meßwerte wurde mit dem Bland-Altman-Plot durchgeführt. Hierbei wird das arithmetische Mittel der Blutflüsse, die durch FM- und RM-Methode berechnet worden sind, gegen die prozentuale Abweichung der FM von den RM aufgetragen. Zur Kontrolle der Filterfunktion und der Zuverläßigkeit der Meßergebnisse wurde die gleiche Anzahl (ca. 2500 FM) einer nicht im Experiment verwendeten 15 µm FM-Spezies (crimson), sowohl in SPU-Filter (SPU-Gruppe, n = 60), als auch in 20 Glasgefäße (Referenzgruppe, n = 20) gegeben. Die SPU wurden dem gesamten Protokoll der Probenverarbeitung unterzogen, wohingegen in der Referenzgruppe lediglich der Farbstoff ausgelöst und gemessen wurde. Die Gruppen wurden mittels t-test nach Student, p0,98). Die Filter weisen eine Wiederfindungsrate von 100% auf. Im Eluat fanden sich keine 15µm FM; zwischen der Filtergruppe und der Referenzgruppe besteht kein signifikanter Unterschied in der Fluoreszenzintensität. Es zeigt sich eine sehr gute Vergleichbarkeit beider Methoden. In den Bland-Altman Plots für die Nieren- und Leberproben wichen die Blutflußwerte mit der FM-Methode um 8,2 bis 13,4% vom mittleren Fluß (arithmetisches Mittel aus RM und FM) ab. Dabei betrug die mittlere Differenz beider Methoden zwischen -7,4% und 3,8%. Der Vergleich der mittleren Intensitäten der Kontrollfarbe crimson zwischen der Referenzgruppe (9,32±0,74, n=20) und der SPU- Gruppe (9,38±0,98, n=60) ergab keinen signifikanten Unterschied. Diskussion und Schlußfolgerung Mit der SPU ist es möglich, FM vollständig aus Organproben zurückzugewinnen und dadurch den regionalen Blutfluß quantitativ zu bestimmen. Die errechneten Blutflusswerte der radioaktiven und fluoreszierenden Methoden sind miteinander vergleichbar. Somit stellen die FM eine valide Alternative zu RM unter Vermeidung der Problematik des Umgangs mit Radioaktivität dar. Der entscheidende Vorteil der SPU ist, daß der gesamte Verarbeitungsprozeß im selben Gefäß stattfindet, und so der Verlust von FM nahezu ausgeschlossen ist.Das standardisierte Protokoll der Probenverarbeitung mittels SPU vermindert im Vergleich zu früheren Protokollen die Bearbeitungszeit von ca. 24h bzw. 48h auf ca. 6h und reduziert die Arbeitsschritte bei denen große Präzision gefordert ist. Das Design der SPU ermöglicht eine Automatisierung der Probenverarbeitung und somit eine Arbeitserleichterung, da die Von-Hand-Bearbeitung nur noch auf das Befüllen der SPU reduziert wird

Die Anpassung der Gewebsdurchblutung an die unterschiedlichen Bedarfssituationen, setzt ein koordiniertes Verhalten der Gefäße im mikrovaskulären Gefäßnetz voraus. Diese Koordination der vasomotorischen Reaktionen im mikrovaskulären Gefäßsystem, ist möglicherweise auf die interzelluläre Kommunikation der Endothelzellen angewiesen. Die Endothelzellen und glattten Muskelzellen der Blutgefäße sind über Gap Junctions gekoppelt, auch eine myoendotheliale Kopplung wird diskutiert. Dadurch können Signale in Form von Ionen (und damit Änderungen des Membranpotentials) oder kleinen Moleküle über solche interzellulären Kanäle entlang der Endothelzellschicht weitergegeben werden. Völlig unbekannt ist aber, ob die Permeabilität dieser endothelialen Gap Junctions reguliert wird. Deshalb wurde in dieser Arbeit untersucht, ob vom Endothel gebildete lokal wirksame Gewebshormone (Autakoide, wie NO und Prostacyclin) die Durchlässigkeit der Gap Junctions beeinflussen. Hierzu wurde in konfluenten Kulturen von humanen umbilikalvenösen Endothelzellen (n=190) die Ausbreitung der Farbstoffe Carboxyfluoresein und Calcein nach Injektion in eine einzelne Endothelzelle in die benachbarten Endothelzellen untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß der injizierte Farbstoff tatsächlich nur über interzelluläre Kanäle von einer Zelle zur nächsten gelangt. Diese Kanäle werden von Connexinen gebildet, denn ein Peptid, das das Aneinanderdocken der Connexine verhindert, reduzierte die Ausbreitung des fluoreszierenden Farbstoffs. Daher kann mit dieser Methode tatsächlich die Kopplung der Zellen über Gap Junctions untersucht werden. Die erhobenen Daten zeigen, daß die Anzahl der fluoreszierenden Zellen nach Hemmung der NO-Synthase mit Nw-nitro-L-Arginin (L-NA, 30µmol/L) um bis zu 29% zunahm, während die anschließende erneute Freisetzung von NO durch zwei differente NO-Donoren (SNAP bzw. SNP, 1 µmol/L) die Zahl der fluoreszierenden Zellen wieder auf den Ausgangswert reduzierte oder sogar unterhalb den, der unbehandelten Kontrollzellen senkte. Diese durch NO hervorgerufene Wirkung blieb in Anwesenheit des Hemmstoffes der löslichen Guanylatcyclase ODQ (10 µmol/L) oder der Radikalfänger Tiron und Superoxiddismutase unverändert. Dies weist daraufhin, daß es sich bei dieser durch NO hervorgerufenen Hemmung um einen direkten Effekt von NO handelt, der weder über die Bildung von cGMP noch über eine gesteigerte Peroxynitritproduktion vermittelt wird. Auch eine Hyperpolarisation der Endothelzellen durch den Aktivator von KATP-Kanälen HOE234 (1 µmol/L) hatte keinen Einfluß auf die Kopplung der Zellen. Im Gegensatz dazu hatte NO in Anwesenheit der Hemmstoffe der Tyrosinphosphatase Orthovanadat (100 µmol/L) und Phenylarsinoxid (1 µmol/L) keinen Einfluß mehr auf die endotheliale Kommunikation via Gap Junctions. Dagegen führte die Behandlung der Zellen mit dem Tyrosinkinase Inhibitor Genistein (100 µmol/L) zu einer deutlichen Reduktion der endothelialen Kopplung (-14%), die mit der Wirkung von NO vergleichbar war. Daraus läßt sich schließen, daß die durch NO hervorgerufene Wirkung auf die interzelulläre Kommunikation über eine Verminderung der Tyrosinphosphorylierung vermittelt zu werden scheint. Außerdem zeigen diese Daten, daß Prostacyclin die endotheliale Kopplung signifikant steigert, und das diese Wirkung über das gebildete cAMP vermittelt wird. Denn nicht nur das Prostacyclin Analogon Iloprost (1 µmol/L), sondern auch der Aktivator der Adenylatcyclase Forskolin (30 µmol/L), verbesserte die Ausbreitung des Farbstoffes signifikant . Schließlich zeigen die Ergebnisse auch, daß die beiden vom Endothel gebildeten Substanzen sich gegenseitig in ihrer Wirkung auf die endothelialen Gap Junctions beeinflussen können. Die erhobenen Daten zeigen erstmals eine Rolle von NO und Prostacyclin in der Regulation der Permeabilität endothelialer Gap Junctions. Diese Regulationsmöglichkeit und die Auswirkungen einer vermehrten oder verminderten Kopplung der Endothelzellen wirft zahlreiche neue Fragestellungen auf z. B. hinsichtlich der Pathophysiologie der coronaren Herzkrankheit oder auch des arteriellen Hypertonus und bietet damit auch die Möglichkeit zur Entwicklung neuer Therapiemöglichkeiten.