Podcasts about proteingemisch

Die Vorhersage der Fertilität und die Aufklärung von Zusammenhängen zwischen der Befruchtungsfähigkeit und Parametern im Organismus ist in der Reproduktionsmedizin ein zentrales Anliegen, um eine effizientere Selektion hochfertiler Tiere zu erreichen. Das Seminalplasma wurde als geeigneter Parameter zur Beurteilung der Fertilität identifiziert, da die positive Beeinflussung der Spermienmotilität und die Vorverlegung der Ovulation durch Seminalplasma nachgewiesen wurde. Diese Arbeit hatte das Ziel anhand verschiedener Pietrainebergruppen und Hybridebergruppen einerseits Komponenten des IGF-Systems im Eberseminalplasma zu identifizieren und ihren Einfluss auf die Fertilität zu überprüfen, andererseits mittels der Proteomics-Technik das komplexe Proteingemisch im Eberseminalplasma zu analysieren. Es wurde das Vorhandensein von IGF-I/II im Eberseminalplasma nachgewiesen, ein Zusammenhang mit der Fertilität bestand nicht. Die Untersuchung der IGFBP-Aktivität ergab beim Vergleich der verschiedenen Pietrainebergruppen signifikante Unterschiede in der relativen Intensität der IGFBP-Banden, die Hybrideber bestätigten diese Ergebnisse nicht. Um eine möglichst einfache, nicht radioaktive Testung dieser IGFBP-Aktivität zu ermöglichen, war es nötig, zu ermitteln, um welche IGFBPs es sich bei diesen Banden handelte. In einer Seminalplasmaprobe wurde IGFBP-5 mittels MALDI-MS identifiziert. Ein Western-Blot mit gegen IGFBP-5 generierten Antikörpern wäre ein effektives Verfahren zur Ermittlung der IGFBP-5-Aktivität im Eberseminalplasma. Die Nutzung der Proteomics-Technik zur Darstellung des Proteinmusters im Eberseminalplasma erwies sich als problematisch, da eine vertikale Streifung und die starke Intensität einzelner Spots die Identifizierung erschwerte. Es wurden mittels MALDI-TOF-TOF PSP-I und b-Mikroseminoprotein identifiziert.Um möglicherweise von PSP-I maskierte Proteine geringerer Intensität darstellen zu können, war es nötig, den PSP-I Gehalt vor der 2D-Gelelektrophorese zu verringern. Antikörper, die gegen zwei Hauptisoformen des PSP-I generiert wurden, zeigten hohe Titer gegen PSP-I und waren auch in der Lage natives PSP-I zu erkennen. Damit ist die affinitätschromatographische Abreicherung von PSP-I möglich und dadurch die Verbesserung der Trennleistung, so dass die 2D-Gelelektrophorese zur Identifizierung positiv wirksamer Proteinkomponenten im Seminalplasmas effizient genutzt werden kann.

Die regulatorischen Fähigkeiten des RNS-Bindeproteins CHLAMY 1 aus C. reinhardtii wurden unter Verwendung eines chimären Reporterkonstruktes überprüft. Hierdurch konnte gezeigt werden, dass ein in CHLAMY 1- angereichertes Proteingemisch die Translation dieses Reporterkonstruktes in einem zellfreien System um durchschnittlich 14,56 % reprimieren konnte. Durch eine Molekularmassenbestimmung unter nativen und denaturierenden Bedingungen wurde der Aufbau von CHLAMY 1 aus mehreren Untereinheiten gezeigt. Der native Komplex hat eine Größe von ca. 160 kDa und besteht, ausgehend von den in dieser Arbeit durchgeführten Experimenten unter denaturierenden Bedingungen, aus den drei Untereinheiten C1 bis C3. Die Aufreinigung von CHLAMY 1 wurde in drei Schritten ausgeführt: (a) Herstellung eines Rohextraktes, (b) Durchführung einer 0,5-1 M AS-Fällung und (c) Ausführung einer spezifischen RNS-Affinitätschromatographie. Es konnten dadurch drei für CHLAMY 1 spezifische Proteine mit den Molekularmassen 60, 50 und 44 kDa aufgereinigt werden. Durch eine Peptid-Sequenzierung wurden insgesamt neun Peptide mit einer Länge von bis zu 24 Aminosäuren sequenziert. Hierbei wurde ein Peptid identifiziert, das Bestandteil der zwei Untereinheiten C1 und C2 ist. In Western Blot-Analysen mit C. reinhardtii-Rohextrakten und Peptid- Antikörpern wurde die Abundanz der CHLAMY 1-Untereinheiten über einen Tag-Nacht-Verlauf bestimmt. Die Untereinheit C1 (60 kDa) scheint konstitutiv exprimiert zu werden, wohingegen die Expression von C3 (44 kDa) von der inneren Uhr kontrolliert zu sein scheint. Durch die Sichtung einer Expressions-Genbank aus C. reinhardtii mit Peptid- Antikörpern wurden zwei für CHLAMY 1 kodierende cDNS-Fragmente isoliert und durch EST-Klone aus dem Sequenzierungsprojekt von C. reinhardtii Richtung 5’-Ende verlängert. Alle Peptide der Untereinheiten C1 und C2 konnten in einer cDNS identifiziert werden, deren ORF für ein Protein von 51,73 kDa kodiert. Für die Untereinheit C3 wurde ein ORF identifiziert, der für ein Protein der Molekularmasse 45,00 kDa kodiert. In allen Proteinen wurden Regionen für mögliche posttranslationale Modifikationen identifiziert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass „UG“-Bindeproteine auch in anderen Organismen vorkommen. CHLAMY 1 kann spezifisch an die 16 „UG“-Wiederholungen in der 3’-NTR der regA-mRNS aus V. carteri binden. In dieser Kugelalge wurde außerdem ein RNS-Bindeprotein (VOLVO 1) identifiziert, das spezifisch an diese „UG“-haltige Region bindet. Im Pilz N. crassa konnte ein CHLAMY 1 analoges Protein identifiziert werden (CRASSA 1), das an die sieben „UG“-Wiederholungen in der 3’-NTR von gs2wt aus C. reinhardtii binden kann. Die Bindeaktivität in einem Tag-Nacht-Verlauf scheint von der circadianen Uhr gesteuert zu werden.