Podcasts about tic20

Most chloroplast proteins are encoded for in the nucleus and have to be transported into the organelle after translation in the cytoplasm. The TOC and TIC machineries (Translocon at the Outer/Inner envelope membrane of Chloroplasts) mediate the import of these proteins across the chloroplast membranes. The major aim of this work was to characterize two TIC translocon components: Tic110, the main protein translocation channel in the inner envelope, and Tic20, which was proposed to also form a protein import channel. After a detailed study of Tic110, a topological model could be established, demonstrating that the protein is inserted into the membrane with two hydrophobic and four amphipathic helices, placing residues both to the intermembrane space and to the stromal side. The presence of highly conserved cysteine residues and experiments demonstrating that Tic110 possess a redox active disulfide bridge, which could be reduced by stromal thioredoxins in vitro, indicated that Tic110 might be a possible target for thioredoxin regulation. To explore which cysteines are involved in disulfide bridge formation, mutations were generated for conserved cysteines in Tic110. As a result, Cys492 and Cys890 were identified as possible candidates. To define the functional role of disulfide bridge(s), components of the TIC motor complex were overexpressed and purified and their interaction was analysed with Tic110 via different approaches. The second part of this work focuses on the channel activity of Tic20. Although both Tic110 and Tic20 are clearly important for plant viability and preprotein translocation, there were neither electrophysiological nor biochemical data supporting that Tic20 can form a channel. After inserting the heterologously overexpressed and purified protein into liposomes, swelling assays and electrophysiological measurements provided the first experimental evidence for the channel activity of Tic20, being a cation selective channel with a pore size of about 8-14 Å. Therefore, it was concluded that the TIC translocon consists of at least two distinct translocation channels: Firstly, Tic110 forms the main translocation pore and therefore facilitates import of most of the chloroplast-targeted preproteins. Secondly, Tic20 might be specifically required for the translocation of some possibly essential proteins. To gain further insight into the structure and function of both proteins, preliminary tests were performed for crystallization in lipidic phases. The large sample of grown crystals observed under different conditions will presumably enable to crystallize these proteins and resolve their crystal structures in the future.

The first step of preprotein translocation across the membranes of chloroplasts is facilitated by the Toc translocon. Aim of this work was to elucidate the dynamics and the mechanism of action of this molecular machine. The central, stably associated part of the Toc translocon, the Toc core complex, consists of the pore forming Toc75 and two receptors with GTPase activity, Toc34 and Toc159. The question of Toc159 localization was addressed since controversal results on this topic were reported. In this study, membrane localization of Toc159 was confirmed, which has further implications on the mode of its action. To understand the necessity of multiple isoforms of Toc components as found in Arabidopsis thaliana, expression analysis and tissue-specific localization were conducted. Gathered data suggested the existence of several types of the complex, assembled from different types of subunits. These complexes have different preprotein specificities. Expression analysis provided further arguments for dynamic association of the intermembrane space complex with the Toc core complex. Comparison of gene expression and protein presence of translocon subunits contradicts the function of Tic20 as a general pore for stromal targeted proteins, but not as a protein conducting channel per se. For further analysis of the Toc translocon structure and function, its purification and reconstitution into proteoliposomes was reinvestigated. To this end, a technique for liposome size determination in a single spectrophotometric measurement was developed.

Die Zusammensetzung und Arbeitsweise des Tic Komplexes ist noch ungeklärt. Tic110 ist die einzige von sieben Komponenten, die allgemein akzeptiert ist. Die Funktion und genaue Topologie des Proteins ist aber noch umstritten (Abb.3). Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Experimente zur Klärung der Topologie und Funktion des Proteins durchgeführt. Zum Einen wurde über ein CD-Spektrum eine alpha-helikale Sekundärstruktur für Tic110 gezeigt. Proteasebehandlung sowohl von Vesikeln der inneren Hüllmembran als auch von intakten Chloroplasten lassen vermuten, dass Bereiche von Tic110 in den Intermembranraum zeigen. Auf der anderen Seite weisen Affinitätschromatographieversuche mit dem C-Terminus von Tic110 darauf hin, dass das Protein im Stroma mit HSP93 und HSP70 interagiert. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass ein Teil des C-Terminus in den Intermembranraum ragt und ein anderer Teil ins Stroma. Ob im C-Terminus amphiphile Helices ausgebildet werden können, muss geklärt werden. Mengenmäßig ist Tic110 prominenter in der inneren chloroplastidären Hüllmembran vorhanden als Tic20, der andere „Kandidat“ für die Pore des Tic Komplexes. Im Vergleich zur Menge von Toc75, der Pore der äusseren Hüllmembran, ist Tic110 in ähnlichen Mengen vorhanden. Tic110 ist also ein geeigneter Kandidat, an der Porenbildung beteiligt zu sein. Desweiteren wurden Interaktionspartner vom N-Terminus von Tic110 gesucht. Dabei wurde ein 32 kDa Protein gefunden, dass große Homologien zu sogenannten „short-chain“ Dehydrogenasen aufweist. In der vorliegenden Arbeit wurde über Importversuche und Immunpräzipitationsexperimente eine Zugehörigkeit des Proteins zum Tic Komplex gezeigt. Die Komponente wurde Tic32 genannt. Tic32 ist eine funktionelle Dehydrogenase, deren Beteiligung während des Importprozesses noch zu klären bleibt. T-DNA Insertionslinien von Tic32 ergaben, dass das Protein für die für die Plastidenentwicklung essentiell ist. Da mit Tic32 neben Tic55 und Tic62 nun schon die dritte Tic Komponente gefunden wurde, die Redox Charakteristika aufweist, wurden verschiedene Importexperimente durchgeführt. Dafür wurden zwei chloroplastidäre FNR-Isologe und zwei chloroplastidäre Fd-Isologe in Chloroplasten importiert, deren Redoxzustand vor der Importreaktion mit verschiedenen Metaboliten oder Redoxkomponenten beeinflusst wurde. Sowohl nach Behandlung der Chloroplasten mit HAR, deamino-NAD, Oxalacetat und Kaliumhexacyanoferrat nimmt die Importeffizienz der FNR L2 Form stark ab. Auch für die Ferredoxin-Isologe ließ sich ein unterschiedliches Importverhalten feststellen, wenn auch nicht so eindeutig wie für die FNR-Isologe. Dieser Regulationsmechanismus muß nun in weiteren Experimenten genauer untersucht werden.