Podcasts about homologien

Mit einer geballten Prise Soul wird es in dieser Folge philosophisch mit einem Hauch Neurowissenschaft. Max und Adrian fragen sich, ob der Seele-Begriff heutzutage noch irgendetwas in der modernen Psychologie verloren hat. Von Hummeln über Homologien zu ‘mit Herz handeln' versuchen die beiden SAQ-Hosts, die niederen Seelenteile fallenzulassen und diskutieren einige im Podcast noch nicht besprochene Begriffe und Ideen. Was ist in der modernen Psychologie noch vom traditionellen Seele-Begriff übrig? Hört rein in SAQ #45 und findet es heraus!

Hallo, schön, dass Du dabei bist, um mit mir gemeinsam das Thema Evolution zu bearbeiten. Heute geht es um die Homologien & Analogien. Dazu werde ich Dir natürlich erstmal die Begriffe erklären. Die Unterschiede werden Dir sicherlich schnell klar. ;) Damit Du die Homologien & Analogien auch wirklich verstehst, werde ich Dir das Erlernte an einem Beispiel noch einmal erklären. Ich hoffe, ich kann Dir mit dieser Folge helfen und Du hast alles gut verstanden. Übrigens haben wir jetzt auch eine eigene Website, schaue doch gerne mal auf: https://www.9thwear.com vorbei. :) Dein Name als Unterstützer am Anfang jeder Podcast-Folge? Ich werde Dich am Anfang der nächsten Podcast-Folge namentlich aufführen. Wenn Dir der Podcast zu einem besseren Gefühl oder einer besseren Note verholfen hat, dann freue ich mich über Deine Unterstützung, damit können wir sicherstellen, dass wir weiterhin für Dich tolle Lerninhalte präsentieren können. Mit Paypal kannst Du uns mit folgendem Link unterstützen: https://www.paypal.me/abiturcrashkurs Auch mit einer Bewertung bei Apple Podcasts oder einer lieben Nachricht von Dir kannst Du uns gern unterstützen ❤ Audiovisuelle Direktion & Produktion: Christian Horn

Hallo und herzlich Willkommen zur 25ten www.abitour.net Folge! Heute kümmern wir uns ein wenig um die weiteren Belege die man für Evolution zu Rate führen kann. Als wichtigste Disziplin ist hier natürlich die Paläontologie zu nennen, und in diesem Zug erklären wir euch natürlich auch die verschiedenen Datierungsmethoden erklären. Dann werden wir noch die Emryologie und die künstliche Züchtung als Belege erklären und vorbringen. Diese Folge ist eine wirklich wichtige Ergämnzung zu vorigen Folge zu Homologien. Geht auf unsere Seite und spendet: www.abitour.net

Hallo und herzlich Willkommen zur 24ten www.abitour.net Folge! Heute beschäftigen wir uns mit dem riesigen Feld der Homologieforschung. Dabei gehen wir nicht nur auf morphologische Homologien ein (Wirbeltierextremität), sondern natürlich auf auf die molekularen Homologien. Wir diskutieren viele Methoden um Homologie festzustelen, darunter: Immun-Präzipitin Test, DNA-Sequenz Analyse, Aminosäuresequenzanalyse, DNA-Hybridisierung und einige andere. Natürlich besprechen wir auch Analogien und den wichtigen Unterschied zu den Homologien. Viele wichtige und zentrale Aspekte fur Belege für die Evolution werden hier besprochen, in einem 2.500 Wörter langem PDF sogar nochmals intensiviert. In diesem Sinne Viel Spaß Olli und Sven Bitte Spendet uns uns helft uns den traffic zu bezahlen

Eine große Gruppe genetisch vererbter Erblindungskrankheiten steht im Zusammenhang mit Mutation in Genen, die in Photorezeptoren exprimiert sind. Diese Mutationen führen nicht nur zu einer Beeinträchtigung des mutierten Proteins selbst, sondern auch zu einer Störung von funktionell nachgeschalteten Proteinnetzwerken. In der Folge ändern sich die Zusammensetzung von Multiproteinkomplexen sowie die Proteinlokalisation, was schwerwiegende physiologische Konsequenzen nach sich zieht. Alleine im lichtwahrnehmenden Molekül Rhodopsin sind mehr als hundert unterschiedliche Mutationen beschrieben worden, die vermutlich im Zusammenhang mit Retinitis pigmentosa, einer degenerativen Erkrankung der Retina, stehen (http://www.sph.uth.tmc.edu/RetNet/). In Saccharose-Dichte Gadienten Experimenten von Dr. Magdalena Swiatek-deLange, die dieser Studie vorangegangen sind, wurde Rhodopsin als Teil eines potentiellen Rhodopsin/Ras Homolog Gene Family, Member A (RhoA)/Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (Rac1)/RhoKinase II (Rock II)/ Collapsin response mediator protein 2 (CRMP2) Signal-Multiproteinkomplexes in Außensegmenten von Stäbchen Photorezeptoren (ROS) identifiziert, welcher im Zuge dieser Studie bestätigt und eingehender untersucht wurde. Ein Zusammenhang zwischen einer Rhodopsin-vermittelten Degeneration von Photorezeptoren und der Regulation des Cytoskeletts durch die kleine GTPase Rac1, wurde von Chang und Kollegen (Chang and Ready, 2000) hergestellt. Sie haben gezeigt, dass die Expression von dominant-aktivem Rac1 in Rhodopsin-Null Mutanten von Drosophila die Rhabdomer Morphogenese erhalten kann. In Zellen fungiert Rac1 durch den Wechsel zwischen einem inaktiven, vorwiegend cytosolischen und einem aktiven, überwiegend membranassoziierten Zustand, als molekularer Schalter in der Signaltransduktion und vermittelt Signale von Membranrezeptoren an das Cytoskelett. Obwohl die Rolle von Rac1 bereits in einer großen Zahl unteerschiedlicher Zellen untersucht worden ist, ist seine Funktion in Photorezeptoren noch immer weitgehend ungeklärt. Die wenigen vorhanden Studien, in denen beispielsweise gezeigt wurde, dass Rac1 an der Fusion von Rhodpsintransportcarriern in Rana barlandieri (Deretic et al., 2004) oder auch an der lichtinduzierten Degeneration von murinen Photorezeptoren beteiligt ist (Belmonte et al., 2006), machen aber deutlich, dass Rac1 ein für die Funktion und Regulation von Photorezeptoren wichtiges Molekül ist. In dieser Studie wurde daher die Rolle von Rac1 in Photorezeptoren eingehender untersucht und ein Rac1-Interaktom in ROS, bestehend aus 22 Interaktoren, identifiziert. Von diesen 22 identifizierten Interaktoren sind fünf bereits als Interaktoren von Rac1 beschrieben worden, darunter CRMP2, einer der Hauptregulatoren von Polarität in neuronalen Zellen, sowie die cytoskelettalen Proteine Aktin ( and  und Tubulin ( and Unter den 17 neuen potentiellen Rac1 Interaktoren befindet sich das Aryl Hydrocarbon Receptor-Interacting Protein Like 1 (AIPL1), das im Zusammenhang mit Leberscher kongenitaler Amaurose (LCA) sowie mit retinalem Proteintransport steht (Sohocki et al., 2000), sowie eine Reihe von Proteinen, die Teil der Phototransduktionskaskade sind, wie die Untereinheit der 3´, 5´-cyclic-GMP Phosphodiesterase 6, Recoverin, Arrestin sowie die ,  und  Untereinheiten von Transducin. Rac1 verbindet damit die Lichtwahrnehmung durch Rhodopsin mit einer Regulation des Cytoskeletts und legt damit eine Interdependenz von Lichtwahrnehmung mit einer korrekten zellulären und funktionalen Struktur von Photorezeptoren nahe. In dieser Studie wurde nicht nur die Existenz des potentiellen Rhodopsin/RhoA/Rac1/Rock II/CRMP2 Multiproteinkomplexes in ROS bestätigt, sonder auch eine lichtabhängige Dynamik und Interaktion der einzelnen Komplexbestandteile beschrieben. In Übereinstimmung mit Daten aus verschiedenen Organismen ((Wieland et al., 1990), (Petrov et al., 1994), (Balasubramanian and Slepak, 2003)) konnte eine lichtabhängige Aktivierung von Rac1 in ROS von Schweinen nachgewiesen werden. Während lichtaktiviertes, GTP-gebundenes Rac1 überwiegend membranassoziiert vorliegt, konnte in dunkeladaptierten ROS insgesamt nur eine sehr geringe Menge an aktivem Rac1 detektiert werden. Des Weiteren wurden in dieser Studie auch deutliche Hinweise geliefert, die auf eine CRMP2 vermittelte Verbindung von Rac1 und RhoA assoziierten Signalwegen hinweisen, wohingegen die Kinase Rock II nur Teil des RhoA assoziierten Signalkomplexes zu sein scheint. Als Funktion von CRMP2 liegt daher eine Rolle als physiologischer Schalter nahe, der die Balance zwischen Rac1 und RhoA vermittelter Signaltransduktion koordiniert. Eine solche Funktion für CRMP2 wurde von Ariumura und Kollegen bereits für die Signaltransduktion in Neuronen vorgeschlagen (Arimura et al., 2000). Um die Signaltransduktion von CRMP2 in ROS eingehender untersuchen zu können, sind CRMP2 Antikörper unabdingbar, welche aber zu Beginn dieser Arbeit kommerziell nicht erhältlich waren. Daher war die Produktion und Charakterisierung von monoklonlalen CRMP2 spezifischen Antikörpern ein wichtiger Teil dieser Studie. Von den vier erhaltenen stabilen Linien monoklonaler, CRMP2 spezifischer Antikörper waren alle für den Einsatz im Western Blot sowie in der Immunohistochemie geeignet, aber nur ein Antikörper erwies sich auch als geeignet für die Immunopräzipitation von nativem CRMP2 aus primärem retinalen Gewebe. Dieser Antikörper stellt damit ein exzellentes Werkzeug für die weitere Charakterisierung der Funktion von CRMP2 in ROS dar. Drei Klassen von Proteinen regulieren die Aktivität von Rac1. Sie alle haben einen Einfluss auf den GTP/GDP-Austausch. Einer dieser Regulatoren ist der Rho GDP Dissociation Inhibitor (RhoGDI). Er kontrolliert die Interaktion von Rac1 mit weiteren regulatorischen Proteinen und Effektoren, sowie durch Interaktion mit dem Prenylrest von Rac1 das Pendeln zwischen Cytosol und Membran. Da aber der RhoGDI nicht in ROS nachgewiesen werden konnte (Balasubramanian and Slepak, 2003), legt dies den Schluss nahe, dass ein anderes Protein diese Funktion in ROS übernimmt. Das 17-kDa große Protein PDEdas lange Zeit als Untereinheit der retinalen cGMP Phosphodiesterase 6 aus Stäbchen galt, weist starke strukturelle Homologien zu RhoGDI auf. Es interagiert mit einer ganzen Reihe von prenylierten und unprenylierten Proteinen. Seine Fähigkeit, prenylierte Proteine von Zellmembranen zu lösen, erinnert stark an die Funktion, welche RhoGDI auf GTPasen der Rho Familie hat. Es wurde daher im Zuge dieser Studie untersucht, ob PDE in ROS GDI Funktion auf Rac1 ausübt. In dieser Arbeit konnte eine lichtabhängige Interaktion von Rac1 mit PDE in ROS von Schweinen nachgewiesen werden. Des Weiteren wurde gezeigt, dass aufgereinigtes PDE Rac1 von isolierten ROS Membranen lösen kann, eine Eigenschaft, die deutlich auf eine GDI-Funktion von PDE für Rac1 hinweist. Zudem wurde gezeigt, dass die Interaktion von Rac1 mit PDE mit einer lichtabhängigen Carboxylmethylierung von Rac1 in ROS korreliert, was ein Hinweis darauf sein kann, dass die die GDI Funktion von PDE durch die Methylierung von Rac1 reguliert wird. Alles in Allem zeigen diese Daten, das PDE für Rac1 in ROS die Funktion eines GDIs ausübt. In dieser Studie geben die identifizierten und mit Rac1 assoziierten Multiproteinkomplexe sowie deren lichtregulierte Dynamik einen deutlichen Hinweis darauf, dass Rac1 die Lichtwahrnehmung durch Rhodopsin mit Signalnetzwerken verbindet, die eine Rolle bei der strukturellen Integrität und Polarität von Photorezeptoren spielen. Dies deutet auf eine Abhängigkeit von Lichtwahrnehmung und funktioneller zellulärer Struktur hin. Mit der Bereitstellung von qualitativ sehr hochwertigen CRMP2 spezifischen Antikörpern liefert diese Studie zudem eine gute Basis für weiterführende Studien in diesem Forschungsfeld. Neben Rhodopsin assoziierten Komplexen stehen auch eine ganze Reihe von ciliären Komplexen in Zusammenhang mit degenerativen Erkrankungen der Retina. Im kürzlich entdeckten ciliären Protein Lebercilin (den Hollander et al., 2007) wurden Mutationen mit Leberscher kongenitaler Amaurose (LCA) in Verbindung gebracht, einer sehr schweren Form einer erblichen retinalen Dystrophie ((Kaplan et al., 1990), (Perrault et al., 1999)). Mit Hilfe von SF-TAP und LC/MS/MS Analysen konnten 24 Lebercilin Interaktoren in HEK Zellen identifiziert werden (den Hollander et al., 2007). Hier in dieser Studie wurden schließlich diese potentiellen Lebercilin Interaktoren auch in Photorezeptoren von Schweinen bestätigt (veröffentlicht in (den Hollander et al., 2007). Die identifizierten Interaktoren stellen mögliche Kandidaten für Gene für LCA und andere Ciliopathien dar und weisen Lebercilin als ein ciliär und mikrotubulär assoziiertes Protein in der Retina aus. Dies betont den Stellenwert, welche gestörte ciliäre Prozesse in der molekularen Pathogenese von LCA besitzen.

Im Escherichia coli Stamm ECOR31 konnte erstmals eine atypische Insertionsstelle der weit verbreiteten Pathogenitätsinsel Yersinia-HPI beschrieben werden. Statt dem asnT-tRNA-Gen findet sich am Integrase-Ende der HPI eine weitere, offenbar horizontal transferierte Region, die RegX genannt wurde. Diese besitzt eine Größe von 24196 Basenpaaren und unterscheidet sich mit einem G+C-Gehalt von 47,9% vom E. coli-Kerngenom. Weder auf DNA noch auf Protein-Ebene existieren höhere Homologien zu E. coli-DNA. Nach Anfertigung einer Cosmid-Bank wurde die gesamte Region sequenziert und annotiert. RegX weist eine mosaikartige Struktur auf, mit Punktmutationen, Deletionen und Insertionen. Sie besteht aus 22 offenen Leserastern und alle potentiellen Gene und deren Translationsprodukte wurden durch Vergleiche mit der NCBI-Datenbank charakterisiert. Die Transkription verschiedener Gen-Cluster und deren Operonstruktur wurde mittels RT-PCR nachgewiesen. Die DNA-Region enthält eine interessante Anhäufung von putativen Aufnahme-Systemen für divalente Metallionen, wie Eisen, Zink, Mangan. Zudem beheimatet die Region X Regulatorgene ähnlich zu Fur und Zur und Zink-abhängige Enzyme. Im Gesamtvergleich der Region X ergeben sich die höchsten Homologien zu Teilen des Plasmids pLVPK von Klebsiella pneumoniae CG43 30. Anhand der strukturellen Unterschiede der Sequenzen mit Punktmutationen und Rekombinations-Ereignissen kann der anhaltende Wandel bakterieller Genome nachvollzogen werden. Des Weiteren wurde die Verbreitung dieser Region unter klinisch relevanten Enterobacteriaceae und Pseudomonaceae untersucht. Von 530 gescreenten Bakterien konnte ein Klebsiella pneumoniae Stamm isoliert werden, der in der groben Struktur identisch zu der untersuchten Region von ECOR31 ist. In diesem Isolat, das aus der Blutkultur eines Patienten mit Sepsis stammt, konnte sowohl die gesamte Region X, als auch die benachbarte Yersinia-HPI und die atypische Insertionsstelle der HPI nachgewiesen werden. Es ist davon auszugehen, dass die untersuchte Region auf einem konjugativen Klebsiella-Plasmid lokalisiert ist und so zusammen mit der HPI horizontal zwischen verschiedenen Spezies übertragen werden kann.

Gram-negative Bakterien haben unterschiedliche Sekretionssysteme entwickelt um verschiedene molekulare Komplexe durch die bakterielle Membran in die extrazelluläre Umgebung oder in andere Zellen zu transferieren. Typ IV-Sekretionssysteme werden als Konjugationssysteme für den horizontalen Gentransfer zwischen Bakterien verwendet, sie stellen aber auch einen wichtigen Virulenzfaktor Gram-negativer Bakterien dar. Das von der cag-Pathogenitätsinsel kodierte CagA-Protein aus Helicobacter pylori wird durch den Cag Typ IV-Sekretionsapparat in verschiedene eukaryontische Zellen transloziert und ist mit der Enstehung von gastrointestinalen Ulzera, dem Magenkarzinom und MALT-Lymphom assoziiert. Die Charakterisierung des Translokationsmechanismus könnte als Grundlage zur Entwicklung spezifischer Interventionstherapien dienen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Sekretionsprozess des CagA-Proteins näher untersucht. Mit Hilfe gezielter Mutationen des cagA-Gens und der Herstellung von Fusionsproteinen konnte gezeigt werden, dass sowohl der C- als auch der N-Terminus für die Translokation notwendig sind, wobei die Termini hierfür nicht frei zugänglich sein müssen. Ein Entfernen der 20 C-terminalen Aminosäuren des CagA-Proteins reichte aus, um eine Sekretion zu verhindern. Durch den Austausch dieser C-terminalen Domäne des CagA-Proteins gegen den entsprechenden Bereich eines anderen Typ IV-sezernierten Proteins mit Ähnlichkeiten in der Primärsequenz (die MobA-Relaxase des Plasmids RSF 1010), konnte die Translokationsfähigkeit wiederhergestellt werden. Die Ergebnisse zeigen, dass trotz diverser Homologien zwischen verschiedenen Typ IV-Sekretionssystemen auch Unterschiede bestehen, die auf der Anpassung an spezifische Funktionen und Organismen beruhen. Gemeinsamkeiten und individuelle Anforderungen dieser Sekretionssysteme gilt es in Zukunft weiter zu differenzieren.

Die vorliegende Arbeit diente der funktionellen Charakterisierung der Zwei-Komponenten Systeme (ZKS) des halophilen Archaeons Halobacterium salinarum. Von der Existenz mehrerer Histidinkinasen (HK) und Antwortregulatoren (RR) neben dem Chemotaxis-ZKS CheA/CheY weiss man nur aufgrund der Sequenzierung des Genoms. Folglich fehlten bislang funktionelle Beschreibungen dieser Proteine. Die vorgelegte Dissertation begann, diesen Mangel zu beheben. Den Laborversuchen war eine bioinformatische Bestandsaufnahme vorgeschaltet, welche die Sensordomänen der HK, die Effektordomänen der RR und die konservierten ZKS-Domänen beider Proteinklassen nach greifbaren Anhaltspunkten durchforstete. Diese Rasterfahndung vermochte jedoch nur bescheidene Hinweise auf die Funktionen und Wechselwirkungen der HK und RR zu erbringen. Die praktischen Arbeiten zur funktionellen Charakterisierung der halobakteriellen ZKS basierten auf zwei unterschiedlichen Strategien. Der erste Ansatz bestand in dem Versuch einer Funktionszuordnung über die Applikation eines Phosphatmangels, dem alle bislang daraufhin untersuchten Prokaryoten durch eine exklusiv ZKS gesteuerte, differentielle Genexpression entgegenwirken. Im zweiten Ansatz wurde mit OE3855R eine der wenigen HK, deren Primärsequenz einen Hinweis auf die Proteinfunktion lieferte, eingehend biochemisch analysiert. Für die Phosphatmangelversuche musste zunächst geprüft werden, bei welchem Nährstoffangebot H. salinarum in eine Unterversorgung gerät. Den Experimenten zufolge limitiert ein Phosphatgehalt von weniger als 0,5mM im Medium die finale Wachstumsdichte. Die mangelhafte Phosphatversorgung induziert das Gen aph, was zu einer verstärkten Produktion und Sekretion des Enzyms Alkalische Phosphatase führt. Mikroarray-Analysen und RT-qPCR-Experimente deckten auf, dass das halobakterielle Pho-Regulon mehrere ABC-Transportsysteme und verschiedene sekretierte Enzyme umfasst. Über die somit stark verbesserten Phosphataufnahmefähigkeiten hinaus ändert sich die Transkription einer Vielzahl weiterer Gene, wobei es sich wahrscheinlich um sekundäre Effekte handelt. Während der Hungerphase verbraucht H. salinarum drei Viertel seines intrazellulären Phosphatspeichers. Die massive Abnahme des Phosphatvorrats ist nicht nur die Folge der Mangelversorgung, sondern gleichzeitig verantwortlich für die Induktion des Pho-Regulons. Das zuständige Regulatorprotein wurde bislang nicht enttarnt. Durch Konstruktion mehrerer Deletionsstämme konnten klassische ZKS als Signaltransduktoren überraschenderweise ausgeschlossen werden. Die Induktion von Proteinen mit Homologien zu DNA bindenden Bereichen von Transkriptionsfaktoren und zu dem regulatorischen Mediatorprotein PhoU deutet auf einen alternativen Regelkreis hin. Dieser wäre exklusiv für Archaea, da solche PhoU-Chimären ausschließlich in archaealen Genomen zu finden sind. Von der Anpassung des Proteininventars abgesehen orientieren H. salinarum-Zellen ihre Bewegungen an einem Phosphatgradienten. Diese Chemotaxis wird durch Phosphatmangel induziert und durch das Zwei-Komponenten System CheA-CheY vermittelt. Erstmals in einem Archaeon gezeigt, wird die Phosphattaxis von H. salinarum ausschließlich von anorganischem Phosphat ausgelöst. Laut Primärsequenzanalyse besitzt die Histidinkinase OE3855R eine Häm bindende PAS-Domäne (PAS3855) und könnte daher einen Sauerstoffsensor darstellen. Eine heterologe Expression von PAS3855 sollte dieser Hypothese Substanz verleihen. Das exprimierte Polypeptid enthielt geringe Mengen eines Kofaktors, der mittels Absorptionsspektroskopie und LC-MS-Analyse als Häm des Typs B identifiziert wurde. Auf Basis dieses Wissens erfolgte die Rekonstitution der Domäne mit HämB, was die Bildung eines Tetramers induzierte. Die spektroskopische Analyse entlarvte große Ähnlichkeiten zwischen den elektronischen Zuständen der zentralen Häm-Eisenionen von PAS3855 und dem Häm bindenden Redoxsensorprotein Dos aus E. coli. Da die Reduktion von FeIII- zu FeII-PAS3855 die Oligomerisierung der Domäne von einem Tetramer zu einem Dimer veränderte, lag eine redoxabhängige Signalfunktion der Histidinkinase OE3855R nahe. Die Deletion des kodierenden Gens führte zu keinem erkennbaren Phänotyp, weshalb zum gegenwärtigen Zeitpunkt keine Aussage getroffen werden kann, ob diese HK in vivo tatsächlich als Redox- oder auch Sauerstoffsensor fungiert.

Die Zusammensetzung und Arbeitsweise des Tic Komplexes ist noch ungeklärt. Tic110 ist die einzige von sieben Komponenten, die allgemein akzeptiert ist. Die Funktion und genaue Topologie des Proteins ist aber noch umstritten (Abb.3). Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Experimente zur Klärung der Topologie und Funktion des Proteins durchgeführt. Zum Einen wurde über ein CD-Spektrum eine alpha-helikale Sekundärstruktur für Tic110 gezeigt. Proteasebehandlung sowohl von Vesikeln der inneren Hüllmembran als auch von intakten Chloroplasten lassen vermuten, dass Bereiche von Tic110 in den Intermembranraum zeigen. Auf der anderen Seite weisen Affinitätschromatographieversuche mit dem C-Terminus von Tic110 darauf hin, dass das Protein im Stroma mit HSP93 und HSP70 interagiert. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass ein Teil des C-Terminus in den Intermembranraum ragt und ein anderer Teil ins Stroma. Ob im C-Terminus amphiphile Helices ausgebildet werden können, muss geklärt werden. Mengenmäßig ist Tic110 prominenter in der inneren chloroplastidären Hüllmembran vorhanden als Tic20, der andere „Kandidat“ für die Pore des Tic Komplexes. Im Vergleich zur Menge von Toc75, der Pore der äusseren Hüllmembran, ist Tic110 in ähnlichen Mengen vorhanden. Tic110 ist also ein geeigneter Kandidat, an der Porenbildung beteiligt zu sein. Desweiteren wurden Interaktionspartner vom N-Terminus von Tic110 gesucht. Dabei wurde ein 32 kDa Protein gefunden, dass große Homologien zu sogenannten „short-chain“ Dehydrogenasen aufweist. In der vorliegenden Arbeit wurde über Importversuche und Immunpräzipitationsexperimente eine Zugehörigkeit des Proteins zum Tic Komplex gezeigt. Die Komponente wurde Tic32 genannt. Tic32 ist eine funktionelle Dehydrogenase, deren Beteiligung während des Importprozesses noch zu klären bleibt. T-DNA Insertionslinien von Tic32 ergaben, dass das Protein für die für die Plastidenentwicklung essentiell ist. Da mit Tic32 neben Tic55 und Tic62 nun schon die dritte Tic Komponente gefunden wurde, die Redox Charakteristika aufweist, wurden verschiedene Importexperimente durchgeführt. Dafür wurden zwei chloroplastidäre FNR-Isologe und zwei chloroplastidäre Fd-Isologe in Chloroplasten importiert, deren Redoxzustand vor der Importreaktion mit verschiedenen Metaboliten oder Redoxkomponenten beeinflusst wurde. Sowohl nach Behandlung der Chloroplasten mit HAR, deamino-NAD, Oxalacetat und Kaliumhexacyanoferrat nimmt die Importeffizienz der FNR L2 Form stark ab. Auch für die Ferredoxin-Isologe ließ sich ein unterschiedliches Importverhalten feststellen, wenn auch nicht so eindeutig wie für die FNR-Isologe. Dieser Regulationsmechanismus muß nun in weiteren Experimenten genauer untersucht werden.

Yersinien sind auf Grund ihres spezifischen Typ III-Proteinsekretionssystems (TTSS) in der Lage, nach Anlagerung an Zellen bakterielle Virulenzproteine in das Innere der Wirtszelle zu translozieren. Dies führt zu einer Zellparalyse und bei Makrophagen zum Zelltod. Eines der translozierten Virulenzproteine ist YopP/J, das die Signalwege der mitogenaktivierten Proteinkinasen (MAPK) sowie des Transkriptionsfaktors NF-kB in der Wirtszelle inhibiert. Es wird angenommen, dass YopP/J zur Familie der Cystein-Proteasen zählt. Es zeigt Homologien zu AvrRXV/AvrBst von Xanthomonas campestris, welches eine dem apoptotischen Zelltod vergleichbare sogenannte „Hypersensitive Reaktion (HR)“ bei Pflanzen auslösen kann. Die Bakterien der enteropathogenen Spezies Yersinia enterocolitica, welche nach oraler Aufnahme im terminalen Ileum durch M-Zellen in die Lymphfollikel der Peyerschen Plagues wandern, werden anhand ihrer Oberflächen-(O)- und Geißel-(H)-Antigene in verschiedene Serotypen unterteilt. Unsere Studien haben gezeigt, dass sich einzelne Y. enterocolitica-Serotypen in der Apoptoseinduktion bei Makrophagen unterscheiden. In der vorliegenden Arbeit wurde den Mechanismen der Apoptoseinduktion durch die verschiedenen Y. enterocolitica-Serotypen nachgegangen. Zunächst konnte YopP für die unterschiedlichen Apoptose-Effekte verantwortlich gemacht werden. Durch DNA-Austausch und der anschließenden Modifikation einzelner Aminosäuren zwischen YopP von Y. enterocolitica-Serotyp O8 und Y. enterocolitica-Serotyp O9 konnte Arginin (R) an Position 143 als essentielle AS der Effektordomäne von YopPO8 definiert werden. YopP von Y. enterocolitica-Serotyp O9 und Y. enterocolitica-Serotyp O3 besitzt an dieser AS-Position Serin (S). YopPO8 vermittelt deutlich stärker Apoptose als YopPO9 und YopPO3. Der erhöhten Apoptoseinduktion durch YopPO8 geht eine effiziente Unterdrückung der NF-kB-Aktivierung vorraus. Die Inhibition des antiapoptotischen NF-kB-Signalwegs durch YopP scheint Voraussetzung für die Apoptoseinduktion durch Yersinia zu sein. Des weiteren wurde in dieser Arbeit mit Hilfe des Hefe-2-Hybrid-Systems nach neuen unbekannten intrazellulären YopP-Interaktionspartner gesucht. Aus einer Maus-Milz-cDNA-Genbank konnten 22 potentielle YopP-Interaktionspartner isoliert werden. In in vitro-Bindungsstudien konnte bis zum jetzigen Zeitpunkt eine Interaktion von YopP mit vier Proteinen (PP2Ac, FWD2, eEf1bb, Smad1) bestätigt werden. Weiterführende Bindungs- und Funktionsanalysen werden noch durchgeführt. Die möglichen Auswirkungen dieser Interaktionen werden diskutiert. Die durchgeführten Studien erbrachten zudem Hinweise auf eine Modifikation von YopP in der Wirtszelle. Darüberhinaus konnte mit Hilfe des Hefe-2-Hybrid-Systems der Interaktionsbereich von YopP mit seinem Zielprotein IKKb eingeschränkt werden. Die durchgeführten Bindungsanalysen mit IKKb-Deletionsmutationen weisen auf eine Bindung von YopP an den IKKb-N-Terminus hin. Das Ergebniss wurde durch in vitro-Bindungsstudien bestätigt. Unter anderem scheint Alanin an IKKb-Position 120 die Interaktion mit YopP zu bestimmen. So konnten im Rahmen dieser Doktorarbeit unterschiedliche Aspekte der Wechselwirkung von Y. enterocolitica YopP mit der Wirtszelle und Wirtszellproteinen analysiert werden. Diese Studien tragen zum besseren Verständnis der Immunmodulation durch pathogene Bakterien bei.

Bei der kongenitalen stationären Nachtblindheit (CSNB) handelt es sich um eine klinisch und genetisch heterogene Erkrankung, die durch eine seit Geburt vorhandene nichtprogres-sive Nachtblindheit und verminderte Sehschärfe gekennzeichnet ist. Bei der x–gekoppelten Form (xlCSNB) sind zudem ein Nystagmus sowie Strabismus bei normalem Augenhinter-grund beschrieben. Aus elektrophysiologischer und psychophysischer Sicht lassen sich da-bei zwei Varianten unterscheiden. Eine Form, bei der keine Stäbchenfunktion mehr nachweisbar ist (CSNB1, komplette CSNB) sowie eine Form, bei der noch eine Reststäb-chenfunktion erhalten ist (CSNB2, inkomplette CSNB). Der Genort für die inkomplette Form war vor Beginn dieser Arbeit zwischen die Marker DXS722 und DXS255 auf Xp11.23 gekoppelt worden. Im Rahmen eines Projektes von Arbeitsgruppen aus München und Jena konnten in dieser Region zahlreiche neue Gene identifiziert werden, u. a. das CACNA1F-Gen. CACNA1F liegt auf den Cosmiden PO37 und MO111 und besteht aus 48 Exons mit einer codierenden Sequenz von 5901 Nukleotiden. Diese codieren für ein Protein von 1966 Aminsäuren Länge und einem Molekulargewicht von 219,5 kDa. Mit der Northern-Blot Hybridisierung ließ sich ausschließlich in retinalem Gewebe eine Bande nachweisen. Ver-gleichende Sequenzanalysen bestätigten die Annahme, dass CACNA1F für eine neue a 1-Untereinheit eines transvers-tubulären, spannungsabhängigen, Dihydropyridin-sensitiven Ca 2+ -Kanals vom L-Typ codiert. Aufgrund dieser Homologien und im Hinblick auf die Tatsache, dass als Pathogenese der CSNB2 eine fehlerhafte Neurotransmission vermutet wurde, wurde CACNA1F als Kandidatengen für CSNB2 in Betracht gezogen. Ziel dieser Arbeit war es, der Frage nachzugehen, ob es sich bei CACNA1F um das bei CSNB2 mutierte Krankheitsgen handelt und ob sich die vermutete genetische Heterogeni-tät von CSNB1 und CSNB2 eindeutig bestätigen lässt. Zudem sollte untersucht werden, ob es sich bei CSNB2 und der ÅIED-verwandten Form, einer Augenerkrankung, die ausge-prägte klinische und elektrophysiologische Gemeinsamkeiten mit CSNB2 aufweist, um al-lelische Erkrankungen handelt. Die Identifizierung des CACNA1F-Gens erlaubt es zudem, weitere retinale Störungen, die in dieselbe Region kartiert wurden, spezifisch auf Mutatio-nen in diesem Gen zu untersuchen, um eine Allelität auszuschließen bzw. zu bestätigen

In dieser Arbeit wurden vier Gene aus T. versicolor isoliert und charakterisiert, die an der Kupferversorgung des Trans-Golgi-Netzwerks, in dem Laccase mit Kupfer beladen wird,beteiligt sind. Die zwei Kupferpermease-Gene cupA und cupB (copper uptake permease) konnten durch Komplementation der S. cerevisiae Deletionsmutanten ∆ctr1 bzw. ∆cup5 mit einer T. versicolor cDNA-Bank isoliert werden. Die aus den beiden Genen abgeleiteten Proteinsequenzen zeigen strukturelle Homologien zu den Proteinen aus der Ctr-Familie und weisen ein in dieser Familie konserviertes MxxxM-Motiv auf. Die Expression beider Gene wird in T. versicolor durch Kupfermangel induziert und durch Kupfergabe reprimiert. Das Gen für das cytosolische Kupferchaperon TahA (Trametes ATX1 homolog) wurde mittels PCR mit degenerierten Primern isoliert. TahA zeigt deutliche Homologie zu Atx1 aus S. cerevisiae, HAH1 aus dem Menschen und CCH aus A. thaliana. TahA kann in Hefe Atx1 funktionell ersetzen: sowohl als Kupfertransportprotein zur im Golgi lokalisierten Kupfer-ATPase Ccc2, als auch bei der Entgiftung von reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS). Der Promotor des tahA-Gens enthält Motive, die im Promotor der durch Kupfer regulierten Gene Metallothionein (CUP1) und Cu/Zn-Superoxiddismutase (SOD1) aus S. cerevisiae konserviert sind. Das tahA-Gen wird unter erhöhten Kupferkonzentrationen (>0,25 µM) exprimiert und unter Kupfermangel reprimiert. Es unterscheidet sich somit in der Regulation deutlich vom ATX1-Gen, das unter Eisenmangel und oxidativem Stress induziert wird. Das Gen für die im Golgi-Netzwerk lokalisierte Kupfer-P-Typ-ATPase, ctaA (copper transport ATPase), wurde durch die funktionelle Komplementation einer Hefe ∆ccc2-Mutante mit einer T. versicolor cDNA-Bank isoliert. Dadurch wurde zugleich die physiologische Funktion des Proteins bei der Kupferversorgung des Golgi-Netzwerks gezeigt. CtaA weist deutliche Homologien zu den bekannten Kupfer-P-Typ-ATPasen aus dem Menschen (MNKP und WNDP), aus A. thaliana (RAN1) und S. cerevisiae (Ccc2) auf. CtaA enthält alle wichtigen Motive, die für die Kupfertransport- und ATPase-Funktionen in allen anderen Kupfer-P-Typ-ATPasen konserviert sind. Durch die deregulierte Koexpression von tahA und ctaA in S. cerevisiae sowie in T. versicolor konnte eine im Vergleich zum Wildtypstamm bis zu achtfach höhere Laccase-Expression erreicht werden. Dies zeigt, dass die Überexpression von Genen, die an der Versorgung des sekretorischen Systems mit Kupfer beteiligt sind, ein Mittel darstellt, um die Expression von sekretierten, kupferabhängigen Enzymen zu steigern. Durch Anzucht von T. versicolor unter Kupfermangel wurde eine Apo-Form der Laccase hergestellt und gereinigt, die kein für blaue Oxidasen typisches Absorptionsmaximum bei 600 nm besaß und die kaum Aktivität aufwies. AAS-Untersuchungen zeigten, dass weniger als ein Kupferion pro Laccase-Molekül in dieser Proteinpräparation vorhanden war. Durch die in vitro Beladung dieser Apo-Laccase mit Kupfer konnte die Enzymaktivität wiederhergestellt werden. Die Bedingungen hierfür waren ein niedriger pH-Wert,reduzierende Bedingungen und das Vorhandensein von NaCl. Eine spontane Beladung der Laccase im Golgi scheint daher ohne Mitwirkung eines weiteren Faktors möglich zu sein.

Biochemische Untersuchungen beschreiben NC2 als einen Transkriptionsrepressor, welcher stabil an das TATA-Box bindende Protein (TBP) bindet. Die spezifische Bindung von NC2 an TBP inhibiert die weitere Anlagerung der generellen Transkriptionsfaktoren TFIIA und TFIIB und führt dadurch zur Unterbrechung der Bildung des Initiationskomplexes. NC2 besteht aus zwei Untereinheiten, NC2a und NC2b, die starke Homologien zu den Histonen H2A bzw. H2B aufweisen. Alle Erkenntnisse zu Beginn dieser Arbeit basierten auf Beobachtungen, die in vitro erhalten wurden. Unklar sind die Funktionen von NC2 in der Zelle. Die Aufgabe dieser Arbeit bestand darin, ein in vivo-Modellsystem zu etablieren. Als Modellorganismus wurde die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae ausgewählt. Hefe hat zwei Proteine, die stark homolog zum menschlichen NC2 sind. Beide sind essentiell für das vegetative Wachstum von Hefe. Für Plasmid-Austausch-Experimente wurden Hefestämme konstruiert, bei denen die chromosomalen Gene für NC2a und NC2b durch Wildtyp-Kopien auf einem URA3-Plasmid ersetzt wurden. Mit Hilfe einer negativen Selektion gegen das URA3-Gen in Anwesenheit von 5-FOA gelang es, die humanen NC2a- und NC2b-Gene als episomale Kopien in Hefe stabil einzubringen. So zeigte sich unter anderem, daß die beiden humanen NC2-Untereinheiten, sowohl einzeln in Kombination mit ihrem Dimerisierungspartner aus Hefe als auch gemeinsam in Form des menschlichen binären Komplexes, fähig waren, die physiologische Funktion ihres Gegenstückes aus Hefe zu übernehmen. Das gleiche System wurde auch eingesetzt, um Deletionsmutanten der humanen NC2-Gene in vivo zu untersuchen. Es wurde festgestellt, daß in beiden NC2-Untereinheiten die Domänen, welche für die in vivo-Funktion notwendig sind, die vom Mensch zur Hefe konservierten Regionen enthalten. Ein wesentlicher Teil dieser Arbeit bestand darin, spontane Suppressoren einer limitierenden NC2-Funktion in vivo zu isolieren und Suppressoren mit genomischen Punktmutationen zu charakterisieren. Gefunden wurde eine Punktmutation in der großen Untereinheit (Toa1) des Hefe-TFIIA, welche einen einzigen Aminosäure-Austausch von Valin zu Phenylalanin verursacht. Hefezellen, die diese Suppressor-Mutation in Toa1 (mt- Toa1) tragen, weisen einen Kälte-sensitiven Phänotyp auf und sind trotz fehlender NC2-Gene lebensfähig. Die biochemischen Eigenschaften des rekombinanten Proteins der Suppressor-Mutante wurden durch Gelretardations-, Footprinting- und in vitro Transkriptionsexperimente untersucht. Das Protein mt-Toa1 war in der Lage, stabile TFIIA-Komplexe zusammen mit der kleinen Untereinheit Toa2 auszubilden und die Rekrutierung von TBP an die TATA-Box auf dem Promotor zu unterstützen. Allerdings zeigten weitere Untersuchungen der Suppressor-Mutante, daß der ternäre Komplex aus mt-yTFIIA, TBP und DNA weniger stabil ist. Hinweise darauf gab die reduzierte Menge an Protein-DNA-Komplexen im Fall von mtyTFIIA in Gelretardationsexperimenten unter sättigenden Bedingungen. Das mt-yTFIIA verlor zugleich seine Antirepressionsaktivität in in vivo-Transkriptionsexperimenten in Anwesenheit von NC2. Die Isolierung und Charakterisierung der Suppressor-Mutante von NC2 lieferten zum ersten Mal den Beweis, daß die Genregulation in vivo eine präzise Balance zwischen positiv und negativ wirkenden Aktivitäten erfordert. Gleichzeitig bestätigen sie die in vitro Beobachtungen, insbesondere das Gleichgewicht zwischen TFIIA und NC2 in der Kompetition um das TATA-bindende Protein TBP. Eine weitere Aufgabe der Arbeit waren Mutagenese-Studien von humanem NC2 in vivo und in vitro. Innerhalb des Histone-Fold-Motives beider NC2-Untereinheiten wurden Punktmutanten isoliert, die ihre essentielle Funktion in der Hefezelle vollständig verloren haben. Es konnten Mutanten identifiziert werden, die Einfluß auf das Wachstum der Hefe mit dem Verlust der in vitro-Aktivität korrelierten. Die Charakterisierung dieser Mutanten lieferte erste Hinweise auf funktionelle Oberflächen von NC2, die für die ternäre Komplexbildung (NC2-TBP-DNA) und die Repressionsfunktion wichtig sind. Zusammengefaßt schafft die vorliegende Arbeit einen Einblick in die NC2-Funktion in der Zelle und erweitert unser Verständnis über den molekularen Mechanismus der Transkriptionsregulation während der Initiation der Klasse II-Transkription.

Ziel dieser Arbeit war es, Veränderungen innerhalb weniger Stunden nach UV-B-Exposition auf Protein- und Transkriptionsebene bei 10-wöchigen Buchensämlingen Fagus sylvatica L. zu analysieren. Dazu wurden Buchensamen unter standardisierten Bedingungen angezogen und von dem Zeitpunkt der Keimung an unter einem UV-B/PAR-Verhältnis exponiert, das den natürlichen Umweltbedingungen sehr ähnlich ist. Die UV-B-Exposition der 10-wöchigen Buchensämlinge erfolgte in einer UV-B-Pflanzenkammer, die das Lichtspektrum des Sonnenlichts simulierte. Die in einer Zeitkinetik geernteten Primärblätter dienten als Ausgangsmaterial für die Daten in der vorliegenden Arbeit. Die 2D-PAGE der löslichen Gesamtproteine und in vitro translatierten Proteine wurde stets zweifach durchgeführt und jeweils die Gele mit der besten Auflösung als Einzelbestimmung ausgewertet. Die Untersuchungen auf Ebene des löslichen Gesamtproteins der Buche Fagus sylvatica L. erfolgten mittels einer Zeitkinetik über 1 Woche, wobei täglich 1 mal geerntet wurde. Die 2DPAGE Analyse ergab über die gesamte Zeitkinetik betrachtet 1 UV-B-induziertes Protein gegenüber der Starklicht-Kontrolle: Protein 28 (17 kDa; pI 6,8). Die 2D-Analysen auf löslicher Gesamtproteinebene stimmten mit den Daten auf in vitro Translationsebene überein, wobei die Effekte auf Transkriptionsebene wesentlich stärker waren. Insbesondere nach 3 und 6 h UV-B-Exposition konnten auf Transkriptebene eine 60%-ige und 90%-ige Reprimierung gezeigt werden. Diese Reprimierung war transient und auf Proteinebene in geringerem Ausmaß zeitlich verzögert nachzuweisen. Diese Daten gaben Hinweise dafür, daß bei der Buche Fagus sylvatica L. infolge UV-B-Exposition eine Regulation auf Transkriptionsebene stattgefunden hat und die drastische Reprimierung der Transkripte verschiedener Gene nur transient war. Da diese Effekte auf Proteinebene wesentlich schwächer waren, deutete das darauf hin, daß sich die Buchensämlinge innerhalb weniger Stunden an die UV-B-Exposition adaptierten. Auf in vitro Translationsebene gab es bei der Buche Fagus sylvatica L. 18 mRNAs, die unter Berücksichtigung der UV-B- und Starklicht-Tagesgänge direkt dem UV-B-Effekt zugeordnet werden konnten. Es wurde belegt, daß infolge erhöhter UV-B-Exposition 10 Transkripte neu vorhanden waren und die Transkripte von 8 Proteinen nicht mehr nachgewiesen werden konnten. Diesen charakteristischen Veränderungen unterlagen überwiegend saure und basische Proteine. Die Effekte waren zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Kinetik zu sehen (7 h, 10 h, 18 h, 28 h und 31 h nach Versuchsbeginn). Die DDRT-PCR wurde eingesetzt, um UV-B-vermittelte Antworten auf Genebene in Buchenblättern zu identifizieren. Bei den isolierten cDNAs wurden geringe Homologien verschiedener Buchenklone in der TIGR-Arabidopsis thaliana-EST-Datenbank gefunden: UV-Breprimierte Buchenklone zeigten Ähnlichkeiten zur Peroxidase, zur „DNA directed RNA-Polymerase alpha chain“ und zu einem „ara-3, ras-related GTP-binding protein“. Durch UV-B-Exposition induzierte Buchenklone wiesen Homologien zu dem „ABI-3“, zu dem „phytochrome regulated gene“ und zur Squalen-Synthase auf. Die Sequenzen dieser Buchenklone wurden zum ersten Mal beschrieben. Erstmals wurde ein ribosomaler Klon L37 bei der Buche beschrieben. Die L37 mRNA wurde aufgrund erhöhter UV-B-Exposition transient induziert. Bei erhöhter Ozon-Behandlung erreichte das Transkript dieses Klons zwei zeitlich voneinander getrennte Maxima; das zweite Maximum (am 3. Tag der Behandlung, 1,6-fache Induktion) ging mit sichtbaren Ozon- Schäden an den jungen Seitentrieben der Buche einher. Die Funktion dieses Proteins ist bisher noch unbekannt. Für eine direkte Zuordnung der isolierten Klone zu den Proteinspots auf der 2D-PAGE müßte eine Sequenzierung der Proteinspots erfolgen. Die Menge der Proteinspots für eine Proteinsequenzierung war jedoch nicht ausreichend. Über die TIGR-Arabidopsis thaliana-EST-Datenbank wurde erstmalig ein nach UV-BExposition induzierter Buchenklon isoliert, der hohe Homologien zum „nascent polypeptide associated complex alpha chain“ aufwies. Dieses Transkript wurde bereits nach 3 h UV-BExposition transient induziert. Der durch Ozon-Exposition reprimierende Effekt wurde durch die kombinierte UV-B/Ozon-Exposition aufgehoben. Die UV-B-vermittelte Induktion dieser zwei Buchenklone unterstützten die auf der 2D-PAGE Analyse resultierende Hypothese, daß die Regulation nach UV-B-Exposition vor allem auf Transkriptionsebene stattzufinden scheint. Die Daten der vorliegenden Arbeit ergaben folgende Schlußfolgerungen: Das Differentielle Display wurde eingesetzt, um infolge UV-B-Exposition differentielle cDNAs in Buchenblättern zu klonieren. Mittels der durchgeführten Northern-Blots wurde gezeigt, daß die Veränderungen auf Transkriptebene durch erhöhte UV-B-Exposition bedingt waren. Die vorliegenden Daten belegten, daß 6 verschiedene Transkripte infolge UV-B-Exposition transient induziert wurden. Diese überwiegenden transienten Veränderungen wurden ebenso durch die Untersuchungen mittels 2D-PAGE auf löslicher Gesamtprotein- und Transkriptebene bestätigt. Das bedeutet, daß innerhalb kurzer Zeit eine Anpassung der Buche an die veränderten Umweltbedingungen erfolgte. Möglicherweise kann dies durch die Anzucht der Buchensämlinge unter UV-B und Schwachlicht begründet werden. Diese Bedingungen sind jedoch umweltrelevant, da die Pflanze in jungen Jahren unter schattigen Lichtbedingungen heranwächst. In der vorliegenden Arbeit wurden infolge abiotischer Streßbehandlung (erhöhtes UV-B) erstmals 2 eindeutig transient induzierte differentielle Buchenklone isoliert: der ribosomale Klon L37 und der „nascent polypeptide associated complex alpha chain“ Klon. Die durchgeführten Northern-Blot Analysen zeigten, daß sich diese 2 Klone als Kandidaten für Molekulare Marker zum Nachweis frühzeitiger UV-B-vermittelter Änderungen auf Transkriptebene bei Fagus sylvatica L. eignen.