Podcasts about helices

Die Zusammensetzung und Arbeitsweise des Tic Komplexes ist noch ungeklärt. Tic110 ist die einzige von sieben Komponenten, die allgemein akzeptiert ist. Die Funktion und genaue Topologie des Proteins ist aber noch umstritten (Abb.3). Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Experimente zur Klärung der Topologie und Funktion des Proteins durchgeführt. Zum Einen wurde über ein CD-Spektrum eine alpha-helikale Sekundärstruktur für Tic110 gezeigt. Proteasebehandlung sowohl von Vesikeln der inneren Hüllmembran als auch von intakten Chloroplasten lassen vermuten, dass Bereiche von Tic110 in den Intermembranraum zeigen. Auf der anderen Seite weisen Affinitätschromatographieversuche mit dem C-Terminus von Tic110 darauf hin, dass das Protein im Stroma mit HSP93 und HSP70 interagiert. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass ein Teil des C-Terminus in den Intermembranraum ragt und ein anderer Teil ins Stroma. Ob im C-Terminus amphiphile Helices ausgebildet werden können, muss geklärt werden. Mengenmäßig ist Tic110 prominenter in der inneren chloroplastidären Hüllmembran vorhanden als Tic20, der andere „Kandidat“ für die Pore des Tic Komplexes. Im Vergleich zur Menge von Toc75, der Pore der äusseren Hüllmembran, ist Tic110 in ähnlichen Mengen vorhanden. Tic110 ist also ein geeigneter Kandidat, an der Porenbildung beteiligt zu sein. Desweiteren wurden Interaktionspartner vom N-Terminus von Tic110 gesucht. Dabei wurde ein 32 kDa Protein gefunden, dass große Homologien zu sogenannten „short-chain“ Dehydrogenasen aufweist. In der vorliegenden Arbeit wurde über Importversuche und Immunpräzipitationsexperimente eine Zugehörigkeit des Proteins zum Tic Komplex gezeigt. Die Komponente wurde Tic32 genannt. Tic32 ist eine funktionelle Dehydrogenase, deren Beteiligung während des Importprozesses noch zu klären bleibt. T-DNA Insertionslinien von Tic32 ergaben, dass das Protein für die für die Plastidenentwicklung essentiell ist. Da mit Tic32 neben Tic55 und Tic62 nun schon die dritte Tic Komponente gefunden wurde, die Redox Charakteristika aufweist, wurden verschiedene Importexperimente durchgeführt. Dafür wurden zwei chloroplastidäre FNR-Isologe und zwei chloroplastidäre Fd-Isologe in Chloroplasten importiert, deren Redoxzustand vor der Importreaktion mit verschiedenen Metaboliten oder Redoxkomponenten beeinflusst wurde. Sowohl nach Behandlung der Chloroplasten mit HAR, deamino-NAD, Oxalacetat und Kaliumhexacyanoferrat nimmt die Importeffizienz der FNR L2 Form stark ab. Auch für die Ferredoxin-Isologe ließ sich ein unterschiedliches Importverhalten feststellen, wenn auch nicht so eindeutig wie für die FNR-Isologe. Dieser Regulationsmechanismus muß nun in weiteren Experimenten genauer untersucht werden.

Im Rahmen dieser Arbeit konnte in Saccharomyces cerevisiae ein neuer Translokationsapparat der mitochondrialen Außenmembran identifiziert werden, der TOB-Komplex (topogenesis of mitochondrial outer membrane beta-barrel proteins). Dieser wird für den Import und die Insertion von mitochondrialen beta-Barrel-Proteinen, wie Porin und Tom40, benötigt. In Eukaryoten kommen beta-Barrel-Membranproteine nur in der Außenmembran von Mitochondrien und Chloroplasten vor; in Prokaryoten nur in der Außenmembran von Gram-negativen Bakterien. Die essenzielle Untereinheit des TOB-Komplexes ist Tob55, das in allen eukaryotischen Genomen präsent ist, aber auch in allen Gram-negativen Bakterien Homologe aufweist. Der TOB-Komplex weist eine molekulare Masse von 220-250 kDa auf und enthält neben Tob55 das nicht-essenzielle Protein Mas37. Dieses ist als peripheres Membranprotein auf der Außenseite der Außenmembran lokalisiert. Die Funktion von Mas37 ist unklar, eine stabilisierende Wirkung auf den TOB-Komplex erscheint möglich. Der TOB-Komplex enthält einen ionenleitenden Kanal. Elektronenmikroskopische Aufnahmen weisen zylindrische Partikel mit einem Durchmesser von 15 nm auf, die eine Kavität von 7-8 nm Durchmesser enthalten. Zusätzlich scheint diese eine zentrale Masse zu enthalten, die möglicherweise von der löslichen N-terminalen Domäne von Tob55 gebildet wird. Diese könnte eine Funktion bei der Regulation des Kanalzugangs ausüben. Tob55 wird von dem offenen Leserahmen YNL026w kodiert und ist ein integrales beta-Barrel-Außenmembranprotein. Die N-terminale Domäne ist im Intermembranraum lokalisiert, während der C-terminale Bereich die membranintegrierte beta-Barrel-Struktur ausbildet. Tob55 ist ein essenzielles Protein für S. cerevisiae und ist somit neben Tom40 das zweite essenzielle Außenmembranprotein. Depletion von Tob55 in vivo führt zum spezifischen Verlust der mitochondrialen beta-Barrel-Membranproteine Porin, Tom40 und Mdm10. Mdm10 konnte als neues mitochondriales beta-Barrel-Protein identifiziert werden. Außenmembranproteine die durch alpha-Helices verankert sind, waren bei der Depletion von Tob55 nicht beeinträchtigt. Tob55 ist für den Import der beta-Barrel-Membranproteine essenziell. Es interagiert mit frühen Importintermediaten der beta-Barrel-Vorstufen, nicht jedoch mit assemblierten beta-Barrel-Proteinen. Vor Interaktion mit Tob55 müssen die beta-Barrel-Vorstufen zuvor mittels des TOM-Komplexes die Außenmembran überqueren. Interaktion der TOM-assoziierten beta-Barrel-Vorstufen mit Tob55 ist für die vollständige Translokation über den TOM-Komplex notwendig. Ein lösliches Intermediat im Intermembranraum scheint nicht vorzukommen. Anschließend erfolgt die Tob55-vermittelte Insertion von der Innenseite der Außenmembran in die Lipidschicht. Ob der TOB-Komplex aktiv an der Faltung der beta-Barrel-Vorstufen in eine insertionskompetente Konformation beteiligt ist oder die Ausbildung der beta-Barrel-Struktur innerhalb der TOB-Kavität stattfindet, ist bisher nicht bekannt. Da Mitochondrien von einem endosymbiotischen bakteriellen Vorläufer abstammen, haben sich offenbar essenzielle Elemente des Biogeneseapparates von beta-Barrel-Membranproteinen während der Evolution erhalten.

Zusammenfassung 1. Das für das Proteolipid aus Methanocaldococcus jannaschii kodierende Gen atpK wurde in E. coli DH5alpha und in dem Minizell-Produzenten E. coli DK6 exprimiert. Das Genprodukt wurde durch radioaktive Markierung nachgewiesen. 2. Aus den Membranen der thermophilen, hydrogenotrophen methanogenen Archaea M. jannaschii, Methanothermobacter thermautotrophicus, Methanothermobacter marburgensis sowie aus den Membranen des mesophilen, methylotrophen methanogenen Archäons Methanosarcina mazei Gö1 wurden mit Chloroform/Methanol die Proteolipide der A1AO-ATPasen und die MtrD-Untereinheiten der Methyltetrahydromethanopterin:CoenzymM-methyl-transferase extrahiert. Die einzelnen Peptide wurden mittels N-terminaler Sequenzierung identifiziert. 3. Durch MALDI-TOF-Analyse wurde die molekulare Masse des maturen Proteolipids aus M. jannaschii zu 21316 Da und 21183 Da (Methionin-freie Form) bestimmt. Zusammen mit der Gensequenz konnte daraus gefolgert werden, daß es sich um eine triplizierte Form des bakteriellen 8-kDa Proteolipids handelt, also 3 Haarnadel-Domänen ausweist. Die ionentranslozierenden Carboxylate sind nur in Haarnadel 2 und 3 konserviert. Bei einer angenommenen Anzahl von 24 Helices im c-Oligomer bedeutet das, daß ein Ionen/ATP-Verhältnis von 2,7 für die Synthese von ATP ausreichen würde. 4. Die Proteolipide aus M. thermautotrophicus und M. marburgensis besitzen duplizierte Proteolipide. Die aktiven Carboxylat-Reste sind im Gegensatz zu den bisher bekannten duplizierten Proteolipiden der V1VO-ATPasen in beiden Haarnadeln konserviert. 5. Die archäellen A1AO-ATPasen-Operone der Pyrococcen enthalten ebenfalls Gene, die für duplizierte Proteolipide kodieren. Allerdings sind die für die Ionentranslokation essentiellen Carboxylat-Reste wie in den Proteolipiden der V-Typ-ATPasen nur in der zweiten Haarnadel vorhanden. Die Abtrennung der A1AO- und V1VO-ATPasen muß daher vor der Entwicklung der Eukaryonten erfolgt sein. 6. Sequenzanalysen haben gezeigt, daß das Proteolipid-Gen aus Methanopyrus kandleri dreizehnmal so groß wie das aus Bakterien ist. Es kodiert für ein Protein mit 13 Haarnadel-Domänen. Die Ionenbindstelle ist in jeder Haarnadel konserviert. 7. Alle heute bekannten Formen der Proteolipide der V- und F-ATPasen waren schon in den Archaea enthalten. Die Vielfalt an Proteolipid-Größen und -Formen der archäellen ATPasen läßt vermuten, daß sie ein Reservoir an Möglichkeiten darstellen, aus denen die V1VO- und F1FO-ATPasen gespeist wurden. 8. Durch Sequenzvergleich mit den Na+-translozierenden Proteolipiden der bakteriellen F1FO-ATPasen wurde auch in den Proteolipiden der A1AO-ATPasen ein Na+-Bindemotiv identifiziert. Es lautet: P/S/T-XXX-Q/E (Motiv I in Helix eins), ET/S (Motiv II in Helix zwei). 9. Aus Membranen von Sulfolobus acidocaldarius und M. jannaschii wurden durch Chloroform/Methanol Lipide extrahiert, anschließend wurde aus diesen Lipiden Liposomen hergestellt, in die die A1AO-ATPase aus M. jannaschii rekonstituiert wurde. Die Synthese von ATP konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. 10. Die ATPase-Gene ahaE, ahaC, ahaF, ahaA, ahaB, ahaD und ahaG wurden in den Fusionsvektor pMal kloniert und in Escherichia coli exprimiert. Die Fusionsproteine wurden aus dem Zellextrakt isoliert und zur Immunisierung von Kanninchen eingesetzt. Die erhaltenen Antiseren gegen die ATPase-Untereinheiten AhaA, AhaB, AhaC und AhaE waren spezifisch und wurden für die Analysen dieser Arbeit eingesetzt. 11. Das für die gesamte A1AO-ATPase kodierende Operon ahaHIKECFABDG des methanogenen Archäons Methanosarcina mazei Gö1 wurde in den Expressionsvektor pVSBAD2 hinter den ara-Promotor kloniert. Das Konstrukt wurde pRT1 genannt. 12. Die auf pRT1 lokalisierten Gene wurden heterolog in E. coli DK8 exprimiert. Die A1AO-ATPase war in E. coli membran-assoziiert und funktionell. Die spezifische ATPase-Aktivität an Membranen von E. coli DK8 betrug 150 mU/mg Protein. 13. DCCD und der für archäelle ATPasen spezifische Inhibitor DES hemmten das Enzym. Die I50-Wert betrugen 0,5 mM/mg Protein, beziehungsweise 200 nmol/mg Protein. 14. Die Synthese von AhaA, AhaB, AhaC, AhaE, AhaH, AhaK, und zum ersten Mal auch des gesamten AhaI, konnten nachgewiesen werden. Gegen AhaF, AhaD und AhaG lagen keine funktionellen Antikörper vor.