Podcasts about intermembranraum

In dieser Rubrik gibt es Podcast-Folgen für den Biologie-Unterricht. Diese Folge behandelt die Atmungskette. Die Atmungskette ist der letzte Prozess beim oxidativen Glukose-Abbau. Dabei entsteht der Großteil des ATPs. Die Elektronen (ursprünglich aus der Glukose) werden vom NADH bzw. FADH2 in mehreren Schritten unter Wasser-Bildung auf Sauerstoff übertragen. Die freiwerdende Energie wird zum Aufbau eines Protonengradienten genutzt. Die Protonen fließen vom Intermembranraum des Mitochondriums durch das Enzym ATPase zurück in den Matrix-Raum. Die ATPase stellt dabei ATP her. Achtung: Stoffwechsel! Es wird ziemlich kompliziert und es ist hilfreich, wenn man das Unterrichtsmaterial vor sich liegen hat. Viel Spaß! Weitere Infos auf www.BIOfunk.net

Mon, 9 Sep 2013 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/17416/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/17416/1/Gross_Dominik.pdf Groß, Dominik

Die überwiegende Mehrzahl der chloroplastidären Proteine ist im Nukleus kodiert und muss folglich posttranslational in das Organell importiert werden. Der Transport dieser Vorstufenproteine in die Chloroplasten wird von zwei multimeren Proteinkomplexen bewerkstelligt, den Toc- (Translocon at the outer envelope of chloroplasts) und Tic- (Translocon at the inner envelope of chloroplasts) Komplexen. In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Aspekte des Proteinimports analysiert: (i) die Evolution des Proteintransports, (ii) die Importwege von Proteinen der inneren Hüllmembran und (iii) die Struktur und Funktion des Kanalproteins Tic110. Zur Untersuchung der Evolution des Proteinimports wurde die Translokation verschiedener Vorstufenproteine in Chloroplasten höherer Pflanzen mit der in Chloroplasten des Mooses Physcomitrella patens verglichen. Dabei wurden Kinetik, Energiebedarf und Prozessierung analysiert. Dies ermöglicht Aussagen über die Entwicklung des Proteintransports, da bekannt ist, dass die Zusammensetzung der Toc- und Tic-Komplexe in der nicht-vaskulären Pflanze P. patens Unterschiede zu den Importapparaten höherer Pflanzen aufweist. Es konnte verdeutlicht werden, dass die untersuchten Vorstufenproteine dennoch das gleiche Importverhalten in den analysierten Modelsystemen zeigen, was darauf hinweist, dass die Importwege trotz der Unterschiede in den Translokationskomplexen konserviert sind. Im weiteren Verlauf dieser Arbeit wurde der Import von Proteinen der inneren Hüllmembran analysiert, für welche zwei unterschiedliche Wege beschrieben wurden: im „conservative-sorting“-Weg werden die Proteine über die Toc- und Tic-Komplexe in das Stroma transportiert, wo das Erkennungssignal von der stromalen Prozessierungspeptidase vom maturen Protein getrennt wird, bevor anschließend die Insertion der Proteine in die Membran erfolgt. Beim „stop-transfer“-Weg dagegen stagnieren die Proteine auf Höhe des Translokationskanals der inneren Hüllmembran und werden von dort lateral in die Membran inseriert. Eine systematische Charakterisierung der Importwege hydrophober Proteine der inneren Membran in Chloroplasten von Pisum sativum bezüglich Energiebedarf, Nutzung von Rezeptorkomponenten, sowie Bildung löslicher Intermediate konnte zeigen, dass die Insertion der untersuchten Vorstufenproteine in die innere Hüllmembran mittels des „stop-transfer“-Weges erfolgt. Des Weiteren wurde die Struktur und Funktion des Kanalproteins der inneren Chloroplastenmembran - Tic110 - näher untersucht, wobei vor allem die Verankerung von Tic110 in die Membran von Interesse war. Tic110 besitzt zwei N-terminale, hydrophobe Transmembranhelices, welche für die Verankerung in die Membran verantwort-lich sind, sowie vier C-terminale, amphipatische Transmembrandomänen. In dieser Arbeit konnte mittels Sequenzanalyse ein konservierter Bereich am Ende der ersten amphipatischen Helix identifiziert werden, welcher ebenfalls maßgeblich an der Membranverankerung beteiligt ist. Eine Mutation dieser Domäne führt zu einer Konformationsänderung des Proteins, woraufhin es nicht mehr in der Lage ist, stabil in Membranen zu inserieren. Die Topologie von Tic110 macht deutlich, dass große Teile des Proteins sowohl in den Intermembranraum, als auch in das Stroma hineinragen, wohingegen die amphipatischen Transmembrandomänen den Translokationskanal bilden. In dieser Arbeit konnte ein künstliches Importsystem mittels in Liposomen rekonstituiertem Tic110 etabliert werden, wodurch nicht nur gezeigt werden konnte, dass Tic110 in der Lage ist, Vorstufenproteine zu binden, sondern auch, dass eine Translokation der Proteine erfolgen kann. Die Daten weisen auf eine bedeutende Rolle von Tic110 als Proteinimportkanal der inneren Hüllmembran hin.

Die autosomal dominante Optikusatrophie ist mit Mutationen in dem Gen OPA1 assoziiert. OPA1 kodiert eine konservierte mitochondriale Dynamin-ähnliche GTPase. Das Ortholog von OPA1 in S. cerevisiae ist Mgm1. Mgm1 liegt im Intermembranraum der Mitochondrien assoziiert mit der Innenmembran in zwei Proteinisoformen vor: der langen (l-Mgm1) und der kurzen Isoform (s-Mgm1). Beide Isoformen sind für den Erhalt der mitochondrialen Morphologie und der mitochondrialen DNA erforderlich. l-Mgm1 wird von der mitochondrialen Rhomboidprotease Pcp1 durch limitierte N-terminale Proteolyse in s-Mgm1 umgesetzt. OPA1 ist ebenfalls für den Erhalt normaler mitochondrialer Morphologie in Säugetierzellen erforderlich. Zusätzlich reguliert es die Freisetzung von Cytochrom c während der Apoptose. Insgesamt acht Transkriptionsvarianten von OPA1 sind bekannt, die durch alternatives Spleißen der N-terminal gelegenen Exons 4, 4b und 5b entstehen. Auf Proteinebene ließen sich bis zu fünf OPA1-Proteinisoformen unterschiedlicher Größe voneinander abgrenzen. Die Proteinisoformen liegen zum einen Teil membranverankert in der Innenmembran und zum anderen Teil peripher mit der Innenmembran assoziiert im Intermembranraum der Mitochondrien vor. Die vorliegende Dissertation beschäftigt sich mit der Biogenese der verschiedenen OPA1-Proteinisoformen. Hierzu wurden OPA1-Transkriptionsvarianten in Hefe heterolog exprimiert. OPA1 wird in Hefe ähnlich wie in Säugetierzellen prozessiert. Die Prozessierung erfolgt N-terminal, an mehreren Stellen und schrittweise. Die menschliche mitochondriale Rhomboidprotease PARL kann Pcp1 in der Hefe voll komplementieren, aber weder Pcp1 noch PARL prozessieren OPA1. In PARL-/--Mauszellen wird OPA1 normal prozessiert. In der Hefe ist die Prozessierung von OPA1 von den Untereinheiten Yta10 und Yta12 der mitochondrialen AAA-Protease der Matrix (m-AAA-Protease) abhängig. Durch Expression der Untereinheiten der menschlichen m-AAA-Protease, Paraplegin und AFG3L2, lässt sich die Prozessierung von OPA1 in yta10yta12 rekonstituieren. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Biogenese von Mgm1/OPA1 nicht vollständig von der Hefe bis zu Säugetieren konserviert ist. Der Austausch der prozessierenden Protease könnte in Verbindung mit einem Mechanismus zur Qualitätssicherung der Mitochondrien in Metazoa stehen.

Nahezu alle mitochondrialen Proteine sind im Zellkern kodiert und werden im Zytosol synthetisiert. Die Komplexe, die den Import von Außenmembran-, Innenmembran- und Matrixproteinen katalysieren, sind relativ gut untersucht. Der Import von Proteinen des mitochondrialen Intermembranraums ist dagegen weniger gut verstanden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Importmechanismus für lösliche Intermembranraumproteine untersucht, die durch konservierte Cysteinmotive charakterisiert sind. Nach Mia40 konnte Erv1 als zweite Komponente dieses Importweges identifiziert werden. Mia40 interagiert mit neu importierten Intermembranraumproteinen mit konservierten Cysteinmotiven über Disulfidbrücken. Die Ausbildung dieser Disulfidbrücken ist essentiell für den Import der Proteine. Erv1 interagiert direkt mit Mia40 und erhält es im oxidierten, aktiven Zustand. Nur Oxidiertes Mia40 wirkt als Importrezeptor, der ein gemischtes Disulfid mit neu importierten Proteinen bildet. Durch Isomerisierung überträgt Mia40 seine Disulfidbrücke schließlich auf das Substratprotein, was zur Reduktion von Mia40 und zur stabilen Faltung des Substratproteins führt. Um importkompetentes Mia40 zu regenerieren, muss die Oxidation von Mia40 durch Erv1 erfolgen. Da in früheren Arbeiten reduziertes Tim13 in vivo nachgewiesen wurde, wurde in dieser Arbeit untersucht, ob sich möglicherweise ein Reduktionsschritt an den Mia40-Erv1-abhängigen Importprozess anschließt. Das Intermembranraumprotein Hot13 wurde zuvor als Assemblierungsfaktor für die kleinen Tim-Proteine beschrieben. Im Rahmen dieser Arbeit konnte aber keine Reduktaseaktivität von Hot13 nachgewiesen werden. Hot13 ist allerdings in der Lage, die Oxidation von Mia40 wahrscheinlich durch die Bindung von Zink zu unterstützen. Die Oxidation des metallfreien Mia40 wird so vereinfacht. Auf der Suche nach einer Reduktase im mitochondrialen Intermembranraum wurden zwei neuartige Glutaredoxine identifiziert, Grx6 und Grx7. Grx6 und Grx7 wurden allerdings im cis-Golgi-Apparat lokalisiert und konnten somit für den Importprozess in Mitochondrien ausgeschlossen werden. Dennoch sind sie aufgrund der Lokalisation im sekretorischen Transportweg von besonderem Interesse und ihre Glutaredoxinaktivität konnte in vitro nachgewiesen werden.

Die Zusammensetzung und Arbeitsweise des Tic Komplexes ist noch ungeklärt. Tic110 ist die einzige von sieben Komponenten, die allgemein akzeptiert ist. Die Funktion und genaue Topologie des Proteins ist aber noch umstritten (Abb.3). Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Experimente zur Klärung der Topologie und Funktion des Proteins durchgeführt. Zum Einen wurde über ein CD-Spektrum eine alpha-helikale Sekundärstruktur für Tic110 gezeigt. Proteasebehandlung sowohl von Vesikeln der inneren Hüllmembran als auch von intakten Chloroplasten lassen vermuten, dass Bereiche von Tic110 in den Intermembranraum zeigen. Auf der anderen Seite weisen Affinitätschromatographieversuche mit dem C-Terminus von Tic110 darauf hin, dass das Protein im Stroma mit HSP93 und HSP70 interagiert. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass ein Teil des C-Terminus in den Intermembranraum ragt und ein anderer Teil ins Stroma. Ob im C-Terminus amphiphile Helices ausgebildet werden können, muss geklärt werden. Mengenmäßig ist Tic110 prominenter in der inneren chloroplastidären Hüllmembran vorhanden als Tic20, der andere „Kandidat“ für die Pore des Tic Komplexes. Im Vergleich zur Menge von Toc75, der Pore der äusseren Hüllmembran, ist Tic110 in ähnlichen Mengen vorhanden. Tic110 ist also ein geeigneter Kandidat, an der Porenbildung beteiligt zu sein. Desweiteren wurden Interaktionspartner vom N-Terminus von Tic110 gesucht. Dabei wurde ein 32 kDa Protein gefunden, dass große Homologien zu sogenannten „short-chain“ Dehydrogenasen aufweist. In der vorliegenden Arbeit wurde über Importversuche und Immunpräzipitationsexperimente eine Zugehörigkeit des Proteins zum Tic Komplex gezeigt. Die Komponente wurde Tic32 genannt. Tic32 ist eine funktionelle Dehydrogenase, deren Beteiligung während des Importprozesses noch zu klären bleibt. T-DNA Insertionslinien von Tic32 ergaben, dass das Protein für die für die Plastidenentwicklung essentiell ist. Da mit Tic32 neben Tic55 und Tic62 nun schon die dritte Tic Komponente gefunden wurde, die Redox Charakteristika aufweist, wurden verschiedene Importexperimente durchgeführt. Dafür wurden zwei chloroplastidäre FNR-Isologe und zwei chloroplastidäre Fd-Isologe in Chloroplasten importiert, deren Redoxzustand vor der Importreaktion mit verschiedenen Metaboliten oder Redoxkomponenten beeinflusst wurde. Sowohl nach Behandlung der Chloroplasten mit HAR, deamino-NAD, Oxalacetat und Kaliumhexacyanoferrat nimmt die Importeffizienz der FNR L2 Form stark ab. Auch für die Ferredoxin-Isologe ließ sich ein unterschiedliches Importverhalten feststellen, wenn auch nicht so eindeutig wie für die FNR-Isologe. Dieser Regulationsmechanismus muß nun in weiteren Experimenten genauer untersucht werden.

Die Biogenese von Mitochondrien erfordert den Import von Präproteinen aus dem Cytosol in die mitochondrialen Subkompartimente. Der TIM23-Komplex der mitochondrialen Innenmembran ist für die Translokation von Präproteinen über die Innenmembran verantwortlich und vermittelt darüber hinaus die Insertion von Proteinen in die Innenmembran. Tim23 weist zwei funktionell unterscheidbare Domänen auf: Eine N-terminale hydrophile Rezeptordomäne im Intermembranraum und einen hydrophoben C-terminalen Bereich. Das phylogenetisch verwandte Tim17 ist ein sehr hydrophobes Protein, welches vier Transmembrandomänen ausbildet, die von zwei kurzen Enden im Intermembranraum flankiert werden. Die hydrophoben Bereiche von Tim17 und Tim23 bilden vermutlich den kanalbildenden Teil der Translokase. In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion von Tim17 bei der Translokation von Präproteinen über die Innenmembran untersucht. Es konnte eine kurze N-terminale Sequenz von 11 Aminosäureresten identifiziert werden, welche für die Funktionalität der TIM23-Translokase essentiell ist. Die Deletion dieser Sequenz beeinflusst die Integrität der bekannten Untereinheiten der TIM23-Translokase nicht, führt jedoch zu einer starken Beeinträchtigung der Translokation von Präproteinen über die mitochondriale Innenmembran. Durch gezielte Alanin-Punktmutagenese konnten zwei konservierte Aspartatreste in der Tim17-Sequenz identifiziert werden, welche für den Translokationsdefekt verantwortlich sind. Die Analyse weiterer Mutanten in Tim17 mit einzelnen oder wechselseitig ausgetauschten geladenen Aminosäureresten im Intermembranraum legen nahe, dass die konservierten negativen Ladungen in Tim17 mit den positiv geladenen Präsequenzen interagieren und dadurch die Translokation von Präproteinen durch den TIM23-Komplex regulieren. Diese Ergebnisse geben einen Einblick in eine Präprotein-abhängige Regulation der TIM23-Translokase über ein mögliches "Öffnen" und "Schließen" des Translokationskanals via Tim17. Die meisten Proteine der mitochondrialen Innenmembran, die als Präproteine mit mitochondrialen Präsequenzen im Cytosol synthetisiert werden, erreichen die Innenmembran auf einem von zwei alternativen Sortierungswegen: Dem "Stop-Transfer-Weg", auf dem Präproteine während der Translokation durch den TIM23-Komplex arretiert und lateral in die Innenmembran inseriert werden und dem Weg der "Konservativen Sortierung", auf dem die Proteine über Intermediate in der mitochondrialen Matrix in die Innenmembran inseriert werden. Folglich müssen diese Proteine entsprechende Sortierungssignale aufweisen, die entweder die laterale Membraninsertion (Stop-Transfer-Proteine) oder die die Translokation in die Matrix (konservativ sortierte Proteine) durch die TIM23-Translokase vermitteln. Das Sortierungsverhalten von mitochondrialen Innenmembranproteinen mit N-terminalen Präsequenzen, die zunächst für die initiale Translokation des N-Terminus der Proteine sorgen, wird von den Transmembrandomänen bestimmt. Um den Einfluss der Transmembrandomänen auf den Sortierungsweg zu untersuchen, wurden die entsprechenden Domänen von Stop-Transfer sortierten Proteinen und konservativ sortierten Proteinen wechselseitig ausgetauscht. In den chimären Proteinen bestimmten jeweils die eingeführten Transmembrandomänen das Sortierungsverhalten. Eine Untersuchung dieser Transmembrandomänen zeigte zwei systematische Unterschiede: Transmembrandomänen, die die konservative Sortierung vermitteln, weisen eine zumeist moderate Hydrophobizität auf und enthalten zumeist Prolinreste. Dagegen sind Stop-Transfer vermittelnde Transmembrandomänen typischerweise stärker hydrophob und frei von Prolinresten. Die Einführung von Prolinresten in die Transmembrandomänen von ursprünglich Stop-Transfer sortierten Proteinen führte zu deren Translokation in die Matrix. Umgekehrt führte die Mutagenese von Prolinresten in Transmembrandomänen ursprünglich konservativ sortierter Proteine zu deren Arretierung in der Innenmembran. Die Anwesenheit von Prolinresten in den Transmembrandomänen bestimmt demnach den Sortierungsweg dieser Innenmembranproteine. Zukünftige Studien werden zeigen, wie diese Sortierungssignale, welche eventuell eine von Prolinresten gebrochene hydrophobe Helix darstellen, von der TIM23-Translokase erkannt und entsprechend umgesetzt werden. Die Bedeutung von Prolinresten in Transmembrandomänen von konservativ sortierten Proteinen konnte durch Mutagenese sowohl in vitro als auch in vivo gezeigt werden. Diese Erkenntnis sollte sowohl in Vorhersagen von Proteinsortierungswegen als auch bei der zukünftigen Entwicklung mitochondrialer Proteine für gentherapeutische Ansätze zur Behandlung mitochondrialer Erkrankungen berücksichtigt werden.

Die Innenmembran von Mitochondrien besitzt zwei Translokasen für den Import von Proteinen. Der TIM23-Komplex vermittelt die Translokation über und in die Innenmembran, der TIM22-Komplex inseriert Proteine mit mehreren hydrophoben Segmenten in die Innenmembran. Im Rahmen dieser Arbeit sollten Komponenten dieser Translokationsmaschinerien in N. crassa und S. cerevisiae identifiziert und charakterisiert werden. In N. crassa waren zu Beginn der Arbeit im Vergleich zu S. cerevisiae nur wenige Komponenten der TIM-Translokasen bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden die Proteine Tim22, Tim54 und Tim44 in N. crassa identifiziert. Dies wurde entweder durch die Verwendung degenerierter Primer in PCR-Reaktionen mit cDNA aus N. crassa oder durch Durchmustern von Datenbanken erreicht. Die identifizierten Proteine des TIM22-Komplexes wurden bezüglich ihrer Lokalisation und Topologie untersucht. Es handelt sich bei Tim22 um ein Membranprotein der inneren mitochondrialen Membran mit vier Transmembranhelices, das sowohl den N- als auch den C-Terminus in den Intermembranraum exponiert. Tim54 ist ebenso in der inneren mitochondrialen Membran lokalisiert und besitzt nur eine Transmembranhelix. Der größte Teil des Proteins liegt im Intermembranraum, nur wenige Aminosäurereste befinden sich in der mitochondrialen Matrix. Ferner wurde der TIM22-Komplex von N. crassa charakterisiert. Dazu zählten die Untersuchungen der beteiligten Komponenten, der Komplexgröße und der Stabilität des Komplexes. In N. crassa besteht der TIM22-Komplex aus den Komponenten Tim22, Tim54, Tim9 und Tim10, die einen etwa 350 kDa großen Komplex bilden. Für spätere funktionelle Untersuchungen wurde der TIM22-Komplex bzw. Tim22 alleine gereinigt. Beides wurde in Lipidvesikel rekonstituiert. Dieses Verfahren bietet die Grundlage für Untersuchungen in einem definierten experimentellen System, wie Proteine der Carrier-Familie in Lipidmembranen inseriert werden. In S. cerevisiae wurde mit Tim16 eine neue Komponente des mitochondrialen Importmotors des TIM23-Komplexes identifiziert. Dies konnte durch Koreinigung mit einer weiteren Komponente des Importmotors, Tim14, erreicht werden. Die strukturelle Vorhersage für Tim16 ähnelt stark der des J-Proteins Tim14. Tim16 fehlt allerdings das für die Funktion von J-Proteinen essentielle HPD-Motiv. Tim16 ist in der mitochondrialen Matrix lokalisiert und peripher mit der inneren mitochondrialen Membran assoziiert. Durch Depletion von Tim16 wird der Import von Substraten in Mitochondrien beeinträchtigt, die vom mitochondrialen Importmotor abhängig sind. Durch Koimmunopräzipitationen und Quervernetzungsexperimente wurde Tim16 als neue Komponente des mitochondrialen Importmotors der TIM23-Translokase definiert. Funktionell spielt Tim16 eine große Rolle für die Integrität des Importmotors. Die genaue Struktur des Importmotors, seine Regulation und dessen Dynamik im Zuge der Translokation von Präproteinen muss in zukünftigen Experimenten geklärt werden.

Morphologie und Dynamik der Mitochondrien spielen eine wichtige Rolle für die Vererbung der Organellen und die korrekte Ausübung ihrer physiologischen Pflichten. Über die molekularen Mechanismen, die der Gestaltgebung und Dynamik der Mitochondrien zugrunde liegen, ist relativ wenig bekannt. In der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae als Modellorganismus wurden einige Proteine identifiziert – das Verständnis vieler Prozesse, wie z. B. Fusion, Teilung und Bewegung der Mitochondrien, stellt jedoch nach wie vor eine Herausforderung für die zellbiologische Forschung dar. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde ein innovativer Ansatz verfolgt, um neue mitochondriale Morphologiekomponenten in S. cerevisiae zu identifizieren. Dabei wurde eine Stammsammlung verwendet, die Deletionsmutanten sämtlicher nicht-essentieller Hefegene enthält. Diese Stämme wurden systematisch durch Fluoreszenzmikroskopie nach Mutanten durchsucht, die eine veränderte mitochondriale Morphologie aufweisen. Dadurch konnte die Anzahl der bekannten Proteine, die einen Einfluss auf die mitochondriale Morphogenese besitzen, von bis dato neun auf 24 erhöht werden. Fünf der neuen Komponenten, von denen zehn bislang gänzlich uncharakterisiert waren, wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit entdeckt. Für eine eingehende Analyse im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit, wurden die beiden neuentdeckten Proteine Mdm31 und Mdm32 ausgewählt. Diese beiden Proteine sind Mitglieder einer neuen Proteinfamilie und liegen als höhermolekulare Proteinkomplexe in der mitochondrialen Innenmembran vor, die transient miteinander interagieren. Die Topologie von Mdm31 und Mdm32, deren Hauptteil im Intermembranraum liegt, ist ein Hinweis auf eine mögliche Kooperation der beiden Proteine mit Komponenten der mitochondrialen Außenmembran. Deletionsmutanten von MDM31 und MDM32 weisen sphärische Riesenmitochondrien auf, deren Motilität drastisch reduziert ist. Durch diesen Motilitätsdefekt kommt es zu einem verringerten Transport der Mitochondrien in die Tochterzellen bei der Zytokinese. Darüber hinaus ist das mitochondriale Genom in Δmdm31- und Δmdm32-Stämmen instabil und geht nach längerem Wachstum auf fermentierbaren Kohlenstoffquellen in einem Teil der Zellen verloren. Ferner ist die Struktur der Nukleoide, in denen die mitochondriale DNA verpackt ist, in diesen Stämmen verändert. Während man in Wildtyp-Zellen 10-15 Nukleoide beobachtet, weisen die Mitochondrien der Deletionsstämme ein oder zwei riesige diffuse DNA-Stukturen auf. Diese strukturellen Veränderungen der Mitochondrien und das Verhalten des mitochondrialen Genoms in den Δmdm31- und Δmdm32-Deletionsmutanten weisen Ähnlichkeiten zu Zellen auf, denen die Außenmembranproteine Mmm1, Mdm10, Mdm12 oder Mmm2 fehlen. Die Deletion von MDM31 oder MDM32 in Kombination mit MMM1, MDM10, MDM12 oder MMM2 ist synthetisch letal, d. h. die Doppelmutanten sind nicht lebensfähig. Dies ist ein Hinweis darauf, dass die beteiligten Komponenten eine Funktion in demselben zellulären Prozess spielen. Wahrscheinlich führt die Addition der Effekte, die die Einzeldeletionen auf die Struktur und Motilität der Mitochondrien haben, zur kompletten Hemmung der Vererbung der Organellen. Damit sind Mdm31 und Mdm32 die ersten mitochondrialen Innenmembranproteine, für die ein funktioneller Zusammenhang mit Komponenten der mitochondrialen Außenmembran bei der Vererbung und strukturellen Integrität der Mitochondrien gezeigt werden konnte. Ferner sind sie die ersten Proteine der mitochondrialen Innenmembran, die Einfluss auf die Struktur und Stabilität des mitochondrialen Genoms nehmen.

In S. cerevisiae bilden Mitochondrien ein tubuläres Netzwerk, für dessen Erhaltung ein Gleichgewicht aus Fusions- und Teilungsprozessen notwendig ist. Mgm1 ist ein Dynamin-ähnliches Protein in Mitochondrien, das an der mitochondrialen Fusion beteiligt ist. Es kommt in einer großen Isoform (l-Mgm1) von 97 kD und einer kleinen Isoform (s-Mgm1) von 84 kD vor. In der vorliegenden Arbeit sollte die Biogenese dieser beiden Isoformen und ihre Rolle in der Erhaltung der mitochondrialen Morphologie und der mitochondrialen DNA geklärt werden. Beide Isoformen konnten im Intermembranraum von Mitochondrien lokalisiert werden. Durch Immunpräzipitation und N-terminale Sequenzierung wurden die N-Termini beider Isoformen identifiziert. l-Mgm1 besitzt an seinem N-Terminus ein hydrophobes Segment. Mit diesem Segment ist es in der inneren mitochondrialen Membran verankert. s-Mgm1, dem dieses Segment fehlt, ist peripher membranassoziiert. Die Rhomboid-ähnliche Protease Pcp1 in der mitochondrialen Innenmembran ist für die Prozessierung von Mgm1 zu s-Mgm1 verantwortlich. Die Deletion von PCP1 führt zur Fragmentierung und Aggregation der Mitochondrien und zum Verlust der Respirationskompetenz und der mitochondrialen DNA. Dieser Phänotyp ist von dem der Deletion von MGM1 nicht zu unterscheiden. Der Phänotyp der Deletion von PCP1 ist eine direkte Konsequenz der fehlenden Mgm1–Prozessierung und des Fehlens von s-Mgm1. Darüber hinaus ist die Bildung beider Isoformen in ungefähr gleicher Menge für die volle Funktionalität von Mgm1 erforderlich. Für die koordinierte Bildung beider Isoformen ist eine konservierte Abfolge von zwei hydrophoben Segmenten am N-Terminus von Mgm1 erforderlich. Das weiter C-terminal gelegene hydrophobe Segment enthält die Spaltstelle für Pcp1. Die Hydrophobizität des N-terminalen Segments determiniert hingegen das Mengenverhältnis beider Isoformen. Dabei führt verringerte Hydrophobizität zur vermehrten Bildung von s-Mgm1, während erhöhte Hydrophobizität die Bildung von s-Mgm1 fast vollständig verhindert. Die intermediäre Hydrophobizität der Wildtyp-Sequenz ist kritisch für die koordinierte Bildung beider Isoformen im Verhältnis von ungefähr 1:1. Die Bildung von s-Mgm1 hängt weiterhin von einem funktionalen Importmotor und einer hinreichend hohen ATP–Konzentration in der mitochondrialen Matrix ab. l-Mgm1 kann dagegen ATP-unabhängig und unabhängig vom Importmotor gebildet werden. Diese Daten führten zum Modell der alternativen Topogenese von Mgm1. Demnach dient das erste hydrophobe Segment als Stopp-Transfer-Signal im TIM17/TIM23-Translokationskomplex. Laterale Insertion dieses Segments in die mitochondriale Innenmembran führt zur Bildung von l-Mgm1. Die Überwindung dieses Translokationsarrests führt zum weiteren Import bis das zweite hydrophobe Segment mit der Spaltstelle die Innenmembran erreicht. Dort entsteht durch Pcp1-Spaltung s-Mgm1. Der weitere Import und damit die Pcp1-Prozessierung sind abhängig von ATP und einem funktionalen Importmotor. Die Bildung von l-Mgm1 und s-Mgm1 sind kompetierende Prozesse. Störungen in diesem kompetitiven Gleichgewicht (veränderte Hydrophobizität des ersten hydrophoben Segments, nicht funktionaler Importmotor, niedrige ATP–Konzentration in der Matrix) führen zu Verschiebungen im Verhältnis beider Mgm1-Isoformen und zur Fragmentierung und Aggregation der Mitochondrien. Daher stellt der Mechanismus der alternativen Topogenese eine Möglichkeit dar, wie der bioenergetische Zustand der Mitochondrien auf molekularer Ebene an die mitochondriale Struktur gekoppelt sein könnte. Auf diese Weise könnte in Mitochondrien, deren bioenergetischer Status z.B. aufgrund von Mutationen in der mitochondrialen DNA, wie sie durch oxidativen Stress entstehen, gestört ist, die Bildung von s-Mgm1 verringert sein. Möglicherweise führt das dazu, dass die betroffenen Mitochondrien nicht mehr effizient fusionieren und so aus dem mitochondrialen Netzwerk ausgeschlossen werden. Der Mechanismus der alternativen Topogenese würde in diesem Fall gegen geschädigte mitochondriale DNA selektionieren und so deren Vererbung unterbinden.

Die TIM22-Translokase in der mitochondrialen Innenmembran vermittelt die Insertion von polytopen Innenmembranproteinen mit internen Signalsequenzen wie der mitochondrialen Metabolit-Carrier. Dabei unterstützt eine Gruppe von strukturell verwandten Proteinen mit charakteristischem Metallbindungsmotiv (Cys4-Motiv) die Passage der hydrophoben Vorstufenproteine über den Intermembranraum. Dies sind in der Hefe Tim9, Tim10 und Tim12 sowie Tim8 und Tim13. Die Familie dieser kleinen Tim-Proteine ist evolutionär konserviert. Im Menschen wurden sechs Mitglieder dieser Proteinfamilie identifiziert: Tim9, Tim10a und Tim10b sowie DDP1, DDP2 und Tim13. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Komponenten der TIM22-Translokase der Säugetiere strukturell und funktionell charakterisiert. Bei ihnen handelt es sich ebenfalls um mitochondriale Intermembranraumproteine. Sie sind in der Lage, mittels der vier konservierten Cysteinreste ein Zn2+-Ion zu binden und damit vermutlich eine Zinkfinger-Struktur auszubilden. Mutationen, die zu einem Verlust des DDP1 Proteins führen, sind die Ursache für das Mohr-Tranebjaerg Syndrom, einer neurodegenerativen Erkrankung, die sich im Wesentlichen durch Taubheit und Dystonie auszeichnet. Eine Punktmutation im DDP1-Gen, die zu einem Austausch eines der konservierten Cysteine führt (DDP1C66W), verursacht den Verlust der Zinkbindungskapazität und resultiert in einem fehlgefalteten, instabilen Protein. Es wurde gezeigt, dass das mutierte DDP1 nicht mehr in der Lage ist, mit seinem Partnerprotein Tim13 zu interagieren und keinen funktionellen DDP1-Tim13 Komplex ausbilden kann. Die menschlichen Proteine der Tim9 und Tim10-Gruppen, Tim9, Tim10a und Tim10b sind wie ihre homologen Hefeproteine in zwei hetero-oligomeren Komplexen organisiert, einem 70 kDa-Komplex bestehend aus Tim9 und Tim10a sowie einem 450 kDa Tim9-10a-10b-Komplex. Beide Komplexe sind fest mit der Innenmembran assoziiert. Tim10b zeigt eine geringere Sequenzhomologie zu Hefe-Tim10 als Tim10a. Es liegt genauso wie Tim12 nur in dem hochmolekularen Komplex vor und weist die stärkste Membranassoziation auf. Es zeigt damit strukturelle Ähnlichkeit zu Tim12. Aufgrund der Membranassoziation der kleinen TIM-Komplexe entfällt aber wahrscheinlich die Funktion des Tim12 als Vermittler zwischen dem löslichen Komplex und der Membran. Tim9, Tim10a und Tim10b sind wie die Hefe-Proteine am Import von mitochondrialen Carriern beteiligt. Die Bindung an Translokationsintermediate von Carrier-Vorstufenproteinen erfolgt in Abhängigkeit von zweiwertigen Kationen wie Zn2+. Die Struktur des TIM22-Komplexes weist signifikante Unterschiede zu der aus der Hefe bekannten Organisation auf. Humanes Tim22 ist im Vergleich zu Hefe-Tim22 wenig konserviert. Es liegt kein stabiler Komplex vor, der Tim22 und die kleinen Tim-Proteine enthält. Sie befinden sich vermutlich in dynamischer Interaktion mit Tim22, die wahrscheinlich nur während der Translokation eines Vorstufenproteins auftritt. Bisher ist kein Komplexpartner des humanen Tim22 bekannt. Homologe zu Tim54 und Tim18, den membranintegralen Komplexpartnern des Tim22, wurden in menschlichen Datenbanken nicht identifiziert. Aufgrund der veränderten strukturellen Organisation ist das menschliche Tim22 nicht in der Lage, mit den Proteinen aus der Hefe funktionell zu kooperieren. Es hat vermutlich eine Anpassung an veränderte Substratspezifizitäten stattgefunden, die auch die Beteiligung weiterer bisher unidentifizierter Komponenten der TIM22-Translokase einschließen könnte. Ein neues Intermembranraumprotein menschlicher Mitochondrien, Cmi1, ist an der Biogenese der kleinen Tim-Proteine beteiligt. Eine Überexpression im Hefesystem führt zur signifikanten Erhöhung der Proteinmengen von kleinen Tim-Proteinen im mitochondrialen Intermembranraum. Cmi1 unterstützt vermutlich die rasche stabile Faltung der neu importierten kleinen Tim-Proteine. Da Cmi1 in der Lage ist, Metall-Ionen zu binden vermittelt es möglicherweise den Transfer von Zink-Ionen.

Im Rahmen dieser Arbeit konnte in Saccharomyces cerevisiae ein neuer Translokationsapparat der mitochondrialen Außenmembran identifiziert werden, der TOB-Komplex (topogenesis of mitochondrial outer membrane beta-barrel proteins). Dieser wird für den Import und die Insertion von mitochondrialen beta-Barrel-Proteinen, wie Porin und Tom40, benötigt. In Eukaryoten kommen beta-Barrel-Membranproteine nur in der Außenmembran von Mitochondrien und Chloroplasten vor; in Prokaryoten nur in der Außenmembran von Gram-negativen Bakterien. Die essenzielle Untereinheit des TOB-Komplexes ist Tob55, das in allen eukaryotischen Genomen präsent ist, aber auch in allen Gram-negativen Bakterien Homologe aufweist. Der TOB-Komplex weist eine molekulare Masse von 220-250 kDa auf und enthält neben Tob55 das nicht-essenzielle Protein Mas37. Dieses ist als peripheres Membranprotein auf der Außenseite der Außenmembran lokalisiert. Die Funktion von Mas37 ist unklar, eine stabilisierende Wirkung auf den TOB-Komplex erscheint möglich. Der TOB-Komplex enthält einen ionenleitenden Kanal. Elektronenmikroskopische Aufnahmen weisen zylindrische Partikel mit einem Durchmesser von 15 nm auf, die eine Kavität von 7-8 nm Durchmesser enthalten. Zusätzlich scheint diese eine zentrale Masse zu enthalten, die möglicherweise von der löslichen N-terminalen Domäne von Tob55 gebildet wird. Diese könnte eine Funktion bei der Regulation des Kanalzugangs ausüben. Tob55 wird von dem offenen Leserahmen YNL026w kodiert und ist ein integrales beta-Barrel-Außenmembranprotein. Die N-terminale Domäne ist im Intermembranraum lokalisiert, während der C-terminale Bereich die membranintegrierte beta-Barrel-Struktur ausbildet. Tob55 ist ein essenzielles Protein für S. cerevisiae und ist somit neben Tom40 das zweite essenzielle Außenmembranprotein. Depletion von Tob55 in vivo führt zum spezifischen Verlust der mitochondrialen beta-Barrel-Membranproteine Porin, Tom40 und Mdm10. Mdm10 konnte als neues mitochondriales beta-Barrel-Protein identifiziert werden. Außenmembranproteine die durch alpha-Helices verankert sind, waren bei der Depletion von Tob55 nicht beeinträchtigt. Tob55 ist für den Import der beta-Barrel-Membranproteine essenziell. Es interagiert mit frühen Importintermediaten der beta-Barrel-Vorstufen, nicht jedoch mit assemblierten beta-Barrel-Proteinen. Vor Interaktion mit Tob55 müssen die beta-Barrel-Vorstufen zuvor mittels des TOM-Komplexes die Außenmembran überqueren. Interaktion der TOM-assoziierten beta-Barrel-Vorstufen mit Tob55 ist für die vollständige Translokation über den TOM-Komplex notwendig. Ein lösliches Intermediat im Intermembranraum scheint nicht vorzukommen. Anschließend erfolgt die Tob55-vermittelte Insertion von der Innenseite der Außenmembran in die Lipidschicht. Ob der TOB-Komplex aktiv an der Faltung der beta-Barrel-Vorstufen in eine insertionskompetente Konformation beteiligt ist oder die Ausbildung der beta-Barrel-Struktur innerhalb der TOB-Kavität stattfindet, ist bisher nicht bekannt. Da Mitochondrien von einem endosymbiotischen bakteriellen Vorläufer abstammen, haben sich offenbar essenzielle Elemente des Biogeneseapparates von beta-Barrel-Membranproteinen während der Evolution erhalten.

Wed, 3 Dec 2003 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/1624/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/1624/1/lutz_thomas.pdf Lutz, Thomas ddc:570, ddc:500,

Die Fusion von Mitochondrien und deren Membranen ist ein Prozess, der für die Aufrechterhaltung der Mitochondrienmorphologie essentiell ist. Da Mitochondrien von zwei verschiedenen Membranen begrenzt werden, müssen dabei insgesamt vier Membranen auf koordinierte Weise miteinander verschmelzen. Fzo1 ist eine zentrale Komponente der mitochondrialen Fusionsmaschinerie in der Außenmembran. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob Fzo1 die Fusion der Außenmembranen mit der Fusion der Innenmembranen koordiniert. Darüber hinaus sollten neue Komponenten identifiziert werden, die für die Fusion von Mitochondrien wichtig sind. Fzo1 besitzt zwei Transmembrandomänen, welche die Außenmembran durchqueren. Es exponiert sowohl den Amino- als auch den Carboxyterminus ins Cytosol. Ein kurzes Segment im Intermembranraum ist für die Lokalisation von Fzo1 in Kontaktstellen zwischen Außen- und Innenmembran verantwortlich. Mutationen in diesem Segment führen zum Verlust der Assoziation von Fzo1 mit der Innenmembran und zum Verlust der Funktion des Proteins. Diese Beobachtungen bilden die Grundlage für ein Modell, in dem die Fusionsmaschinerie Kontakte zwischen den beiden Membranen ausbildet und so die koordinierte Fusion der vier mitochondrialen Membranen vermittelt. Mdm30 ist eine neue Komponente, die für die Fusion von Mitochondrien benötigt wird. Mdm30 besitzt ein F-Box-Motiv. Dieses Motiv findet sich in Untereinheiten von SCF-Komplexen, einer vielseitigen Klasse von Ubiquitin-Ligasen. Δmdm30-Mutanten haben fragmentierte und aggregierte Mitochondrien. Die Mitochondrien der Δmdm30-Zellen können nur fusionieren, wenn gleichzeitig die Teilung von Mitochondrien blockiert wird. Durch die Deletion des MDM30-Gens kommt es bei erhöhten Temperaturen zum Verlust der mitochondrialen DNA. Mdm30 bestimmt die Struktur der Mitochondrien, indem es die Fzo1-Proteinmenge reguliert.

6.1. Die PH-Domäne als Paratop Die Pleckstrin-homologe (PH-) Domäne des humanen Cytohesin-1 besteht aus einem Proteingerüst sowie vier längeren Loops. Von diesen weisen drei in eine Richtung und bilden eine komplexe, flexible Oberflächenstruktur aus. Sollte man diese Oberflächenstruktur durch Mutation der Loops als Bindungstasche (Paratop) für Epitope von Schlüsselmolekülen etablieren können, wäre ein breiter Einsatz der PH-Domäne als Wirkstoff oder spezifisches Nachweisreagenz interessant, zumal sie sich in E. coli mit hohen Ausbeuten cytoplasmatisch löslich exprimieren läßt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß sich die drei Loops verändern lassen, ohne daß die PH-Domäne ihre Struktur verliert; von daher eignet sich die PH-Domäne als Proteingerüst. Sie wurde insgesamt in 29 Aminosäurepositionen mit einem neuartigen Verfahren gewichtet randomisiert, indem an jeder Position die Wildtyp-Aminosäure bevorzugt wird. In Anbetracht der Zahl randomisierter Positionen sollte damit gegenüber einer ungewichteten Randomisierung kein Verlust an Komplexität für die Bibliothek zu befürchten sein, durch den möglichen Erhalt lokaler und nicht lokaler Wechselwirkungen aber die Zahl stabiler (damit exprimierbarer und selektierbarer) Mutanten deutlich erhöht werden. Die Randomisierung erfolgte dabei mit drei Oligodesoxynukleotiden, die in den randomisierten Positionen jeweils eine definierte Basenverteilung aufweisen. Zur Klonierung einer Bibliothek wurden sie im dazu entwickelten Verfahren der „asymmetrischen PCR-Reaktion“ eingesetzt und daraufhin zu einem in drei Segmenten randomisierten DNA-Fragment assembliert. Mit dieser Strategie konnten 6 · 107 Mutanten erzeugt werden. (Aus deutlich kleineren Bibliotheken anderer Proteine ließen sich bereits bindende Mutanten isolieren.) Die randomisierten Mutanten der PH-Domäne wurden im phage-display-Verfahren zur Selektion gegen drei Zielsubstanzen eingesetzt. Danach konnten ausschließlich Deletionsmutanten und Mutanten mit stop-Codons nachgewiesen werden, die keine Expression von PH-Domänen erlauben. Zurückgeführt wird dieses Ergebnis auf die schlechten Transporteigenschaften der PH-Domäne bei der Translokation in das Periplasma von E. coli, weshalb nicht auf bindende Paratope aus der Bibliothek selektiert werden konnte. Nach Verbesserung der Translokationseigenschaften von PH-Domänen sollte sich das phage-display-Verfahren zur Selektion bindender Mutanten fortsetzen lassen. 6.2. Die PH-Domäne als Substrat für Translokationen Die im phage-display-Verfahren eingesetzten M13-Bakteriophagen assemblieren in der inneren Membran von E. coli. Dies setzt die Translokation der mit dem g3-Protein fusionierten PH-Domäne in das Periplasma voraus. Die geringe periplasmatische Expression bei mehrheitlich aberranten Prozessierungen im Bereich des Signalpeptids und die geringe Darstellung auf der Phagenoberfläche veranlaßten zur Translokationsoptimierung der PH-Domäne. Während der allgemeine sekretorische Transportmechanismus von E. coli durch die beteiligten Membranproteine strukturell und funktionell gut verstanden ist, sind die Eigenschaften und Voraussetzungen für die Translokation von Substratproteinen (mit Signalpeptid als Präprotein bezeichnet) bislang weniger gut charakterisiert. Der „translokationskompetente“ Zustand beschreibt die Präproteine nur phänomenologisch. Für die schlechte Translokation wurden mehrere biochemische und biophysikalische Eigenschaften der PH-Domäne in Betracht gezogen und verschiedene Mutanten hergestellt, die demzufolge eine verbesserte Translokationseigenschaft aufweisen sollten. Dabei erwies sich weder die Verringerung der thermodynamischen Stabilität noch das engineering ausgewählter, spezifischer Sequenzelemente als translokationsbegünstigend. Wird dagegen durch Einführung neuer N- und C-Termini sowie der Verbrükkung der ursprünglichen Termini mit einem Linker die Topologie verändert, können bei zwei dieser sogenannten Circularpermutanten bis zu 30-fach höhere Expressionsausbeuten im Periplasma erzielt werden. Die Circularpermutation wurde damit erstmalig erfolgreich im rationalen Proteindesign angewendet. Die vorliegenden Ergebnisse legen nahe, daß die Mutanten der PH-Domäne vor der Translokation in einem nativ-ähnlichen Zustand gefaltet vorliegen und zur Translokation entfaltet werden müssen. Das in dieser Arbeit vorgeschlagene „Kräftemodell“ erklärt die verbesserte Translokation der Circularpermutanten CP X.6. gegenüber dem Wildtyp. Danach ist die maximale Kraft zur Entfaltung des Proteins die translokationslimitierende Größe, was sich mit Hilfe von Einzelmolekül-Kraft-Spektroskopie weiter untersuchen ließe. Wie sich die Mutationen an der PH-Domäne bei weiteren Transportprozessen auswirken, wurde beim mitochondrialen Import analysiert. Die untersuchten Mutanten zeigten unabhängig von ihrer thermodynamischen Stabilität und ihrer periplasmatischen Expression eine Unterbrechung des Imports. Ursache dafür ist eine Peptidsequenz von 27 Aminosäuren, die sich mit Hilfe der Circularpermutanten eindeutig identifizieren läßt. Sie führt bei der Circularpermutante CP 2.6. zu einer stabilen Expression im Intermembranraum und beim Wildtyp sowie bei der Circularpermutante CP 2.7. zu einem Verharren in der inneren Membran. Bei Mitochondrien konnte zuvor noch nie eine importunterbrechende Peptidsequenz nachgewiesen werden. Sie sollte sich zur stabilen Expression von Proteinen im Intermembranraum einsetzen lassen. In der (modellierten) Raumstruktur der PH-Domäne interagieren 19 der 27 Aminosäuren in einem Faltblatt/turn/Faltblatt-Motiv. Sie könnten als stabile Subdomäne den Import unterbrechen. Diese Interpretation ergänzt ein Modell zur Translokation von Präproteinen, wonach das Präprotein vom Intermembranraum schrittweise durch die innere Membran (bzw. den TIM-Komplex) in die Matrix diffundiert und dort arretiert wird. Dadurch wird die Rückdiffusion verhindert. Die Unterbrechung des weiteren Imports währt solange, bis aufgrund des thermodyamischen Gleichgewichts die Peptidsequenz vor der Membran entfaltet vorliegt und dann in die Matrix diffundieren kann. Ergänzende Experimente zum mitochondrialen Import sind in Vorbereitung. In dieser Arbeit konnte die PH-Domäne mit ihren Mutanten somit als Substrat für die Untersuchung von Transportprozessen etabliert werden. Die zukünftige Anwendung dieser Mutanten auf weitere Transportsysteme liegt dabei auf der Hand. Die Bibliothek randomisierter PH-Domäne wird in Kooperation mit anderen Arbeitskreisen zur Selektion spezifisch bindender und inhibierender Mutanten eingesetzt.

Programmierter Zelltod oder Apoptose ist essentiell für die Entwicklung und Homöostase mehrzelliger Organismen. Störungen in der Regulierung dieser Prozesse können zu zahlreichen Erkrankungen führen, unter anderem zu Autoimmunerkrankungen und Krebs. In den letzten Jahren konnte in zahlreichen Arbeiten gezeigt werden, daß Mitochondrien eine wichtige Rolle bei der Steuerung der Apoptoseprozesse spielen. So wird Cytochrom c, ein Protein aus dem mitochondrialen Intermembranraum, durch einen pro-apoptotischen Stimulus als ein Caspase-Aktivierungsfaktor ins Cytosol freigesetzt. In der vorliegenden Arbeit wird die initiale Charakterisierung eines neuen murinen Proteins (mDAP-3) beschrieben. mDAP-3 wurde identifiziert bei dem Versuch molekulare Marker der Nierenentwicklung mit Hilfe einer modifizierten „differential display“ Polymerase Kettenreaktion zu finden. Die 1,7 kb große mDAP-3 mRNA kodiert für ein ca. 45 kDa großes Protein, das als funktionelles Motiv eine ATP/GTP-Bindungsstelle (P-Loop) besitzt. Die Analyse der Aminosäurensequenz von mDAP-3 ergab eine 81 %ige Identität zu dem humanen DAP-3 (Death Associated Protein 3), einem positiven Apoptose Mediator. Northern-Blot-Analyse von 20 µg Gesamt-RNA aus 11 Organen adulter Mäuse zeigte eine abundante mDAP-3 Expression in Niere, Herz, Leber, Thymus, Muskel, Milz, Darm und Bauch, mit einem Expressionsmaximum in Testis. Eine geringe bis fast fehlende Expression konnte in der Lunge und im Ovar gezeigt werden. Die Überexpression eines mDAP-3/EGFP Fusionproteins in murinen Mesangialzellen (MMC) führte zu einer Apoptoseinduktion bei 27,6% ± 2,6% (n=3) der Zellen gegenüber einer Apoptose Inzidenz von 11,9% ± 2,8% bei MMCs die mit einem Kontrollvektor transfiziert wurden. Die pro-apoptotische Funktion von mDAP-3 ist dabei abhängig von der Funktionalität des P-Loops. Die Überexpression eines P-Loop mutierten mDAP-3/EGFP Fusionproteins führte zu keiner Apoptoseinduktion. Sowohl das murine als auch das humane DAP-3 bleiben während der Apoptose intra-mitochondrial und werden nicht in das Cytosol freigesetzt. Für die Untersuchung der intrazellulären Lokalisation von mDAP-3 wurde ebenfalls das mDAP-3/EGFP-Fusionsprotein verwendet. Murine-Tubuluszellen (MTC) zeigten nach Transfektion mit dem Fusionsprotein ein punktiertes Signal im Fluoreszenz-Mikroskop. Im Gegensatz dazu zeigten Zellen nach Transfektion mit dem EGFP-Expressionsvektor alleine das für EGFP typische diffuse, zytosolische Fluoreszenzsignal. Sowohl im Fluoreszenz-Mikroskop als auch im konfokalen Laser-Scann-Mikroskop lokalisierte mDAP-3/EGFP zusammen mit einem mitochondrialen Farbstoff, jedoch nicht mit einem lysosomalen. Diese Ergebnisse weisen auf eine mitochondriale Lokalisation von mDAP-3 hin. Zellfraktionierungen bestätigten die mitochondriale Lokalisation von mDAP-3. Das endogene mDAP-3 Protein konnte nur in der mitochondrialen Fraktion, nicht jedoch in der endoplasmatischen Reticulum- oder der zytosolischen-Fraktion, nachgewiesen werden. Proteinase-K-Behandlung isolierter Mitochondrien führte zu keiner Reduktion der mDAP-3 Proteinmenge im Western-Blot. Dies ließ auf eine intra-mitochondriale Lokalisation von mDAP-3 schließen. Digitonin-Behandlung isolierter Mitochondrien zeigte eine Freisetzung von mDAP-3 aus den Mitochondrien bei relativ hohen Digitonin Konzentrationen (0,3%). Ganz im Gegensatz dazu wurde Cytochrom c bereits bei 0,075% Digitonin freigesetzt. Diese Daten weisen auf eine mDAP-3 Lokalisation in der mitochondrialen Matrix hin. Da die DAP-3 Proteinfamilie in Eukaryonten sehr konserviert ist und auch in nichtapoptotischen Organismen wie S. cerevisiae vertreten ist, muß DAP-3 eine weitere Funktion neben der pro-apoptotischen besitzen. Um die Rolle von DAP-3 näher zu definieren wurde eine Disruption des mDAP-3 Hefe-Orthologs YGL129c (yDAP-3) durchgeführt. Die yDAP-3 Nullmutanten zeigten keinen Wachstumsverlust auf nicht fermentierbaren Kohlenstoffquellen wie Glycerol oder Lactat. Dies deutet darauf hin, daß yDAP-3 für die mitochondriale Atmung nicht zwingend notwendig ist. Allerdings zeigten Hefen bei einer yDAP-3 Disruption einen signifikanten und progressiven Verlust ihrer mitochondrialen DNA (mtDNA) (46% in ∆yDAP-3 vs. 3% im Wildtyp). Dieser Verlust der mtDNA, der auf eine Funktion von yDAP- 3 für die mitochondriale Biogenese hinweist, ließ sich durch eine Transfektion der ∆yDAP-3 Hefen mit dem murinen DAP-3 teilweise verhindern. Damit konnte bewiesen werden, daß die Funktion, die DAP-3 für die Biogenese der Mitochondrien ausübt, unter Eukaryonten konserviert ist. Diese Daten identifizieren mDAP-3 als einen der ersten pro-apoptotischen Faktoren der mitochondrialen Matrix. Weiterhin kann eine duale Funktion für die Mitglieder der DAP-3 Proteinfamilie postuliert werden. Zum Einen spielen sie eine wichtige, evolutionär konservierte Rolle für die Biogenese von Mitochondrien, zum Anderen besitzen sie in mehrzelligen Organismen eine zusätzliche pro-apoptotische Funktion.

Ziel dieser Arbeit war es, den Import von Carrierproteinen über die TIM22-Translokase näher zu charakterisieren. Die Arbeit befasst sich mit der funktionellen Charakterisierung von drei neuen Komponenten des TIM22-Komplexes, Tim9, Tim10 und Tim12. Insbesondere wurde der Import des AAC-Vorstufenproteins über den TOM-Komplex zum TIM22-Komplex in die mitochondriale Innenmembran untersucht. Tim9, Tim10 und Tim12 sind Untereinheiten der TIM22-Translokase, die im Intermembranraum lokalisiert sind. Sie liegen in zwei hexameren Komplexen vor, dem TIM9⋅10-Komplex und dem TIM9⋅10⋅12-Komplex. Der TIM9⋅10-Komplex liegt löslich im Intermembranraum vor, während der TIM9⋅10⋅12-Komplex peripher mit dem TIM22- Komplex assoziiert ist. Dieser vermittelt die membranpotentialabhängige Insertion von Präproteinen mit internen Importsignalen in die mitochondriale Innenmembran. Tim9, Tim10 und Tim12 sind strukturell verwandt und in der Lage, mittels konservierter Cysteinreste ein Zinkfinger-Motiv auszubilden. Die Interaktion der AAC-Vorstufe mit dem TIM9⋅10- und dem TIM9⋅10⋅12-Komplex wird vermutlich durch die Wechselwirkung der Zinkfinger mit der Carrier-Signatur vermittelt. Diese ist in allen Mitgliedern der mitochondrialen Carrier-Familie konserviert. Der Import des AAC erfolgt in definierten Stufen: Das Vorstufenprotein wird im Cytosol synthetisiert (Stufe I) und bindet an Rezeptoren des TOM-Komplexes (Stufe II). Der AAC wird zum Importkanal geleitet und teilweise über die Außenmembran transloziert (Stufe IIIa). Die vollständige Translokation wird durch die Interaktion des dritten Moduls des AAC mit dem TOM-Komplex verhindert. Segmente des AAC, die in den Intermembranraum exponiert sind, binden an den hexameren TIM9⋅10-Komplex. Jeder der drei Module kann mit dem TIM9⋅10-Komplex interagieren. Nachfolgend wird das Vorstufenprotein auf den TIM9⋅10⋅12- Komplex auf der Außenseite der Innenmembran übertragen. Der dritte Modul bleibt noch fest an den TOM-Komplex gebunden. Es enthält das Signal für die membranpotentialabhängige Insertion des AAC in die Innenmembran. Für die Freisetzung des AAC aus dem TOM-Komplex und seine Membraninsertion sind sowohl ein Membranpotential als auch die Rekrutierung eines funktionellen TIM22-Komplexes an die Kontaktstelle zwischen Außenund Innenmembran erforderlich.