Podcasts about tic32

In order to sustain their structure and metabolism, chloroplasts and other plastid types must import the majority of their proteins from the cytosol across the envelope membrane. Translocation of these precursor proteins across the double envelope membrane is achieved by two multimeric complexes - the so-called TOC and TIC complexes (Translocon at the Outer envelope of Chloroplast and Translocon at the Inner envelope of Chloroplast, respectively). N-terminal transit peptides essential for import of the precursor proteins are cleaved after their entry into the stroma. It was thus far believed that all of the different cytosolic precursor proteins would enter the chloroplast through the same, jointly acting TOC/TIC machineries. Recent evidence, however, suggests that multiple, regulated import pathways exist in plastids that involve different import machineries. Different combinations of TOC and TIC proteins were shown to establish different import sites in Arabidopsis thaliana with specificity for either photosynthetic proteins (the general import pathway) or non-photosynthetic „housekeeping“ proteins. Moreover, numerous non-canonical import pathways such as the import of Tic32 and AtQORH mediated by the yet unknown novel import pathway and the import via the secretory pathway were shown to exist. Proteomics studies have revealed the presence of a large number of plastid proteins lacking predictable N-terminal transit sequences for import. The import mechanism for the majority of these proteins has not been determined yet. Examples of the transit sequenceless precursor proteins are the chloroplast envelope quinone oxidoreductase homologue, AtQORH and the chloroplast inner envelope protein 32, Tic32. Both proteins are imported into the inner plastid envelope membrane by a non-canonical pathway (Toc159- and Toc75-independent) and without any proteolytic cleavage. In the present study not only the import characteristic of nine tentative ‘non-canonical’ chloroplast precursor proteins but also the new interactions between these precursor proteins and the proteins at the organellar surfaces were analyzed. Moreover, a non-canonical precursor protein without the classical transit peptide, the iron superoxide dismutase (FSD1) could be identified. Biochemical crosslinking experiments revealed that FSD1 interacts with new members of the Toc159 family in pea, namely PsToc132 and PsToc120. Using deletion mutants as well as a peptide scanning approach, regions of the precursor protein, which are involved in receptor binding could be defined. These are distributed across the entire sequence; surprisingly only the extreme N-terminus as well as a C-proximal domain turned out to be essential for targeting and import. En route into the plastid FSD1 engages components of the general import pathway, implying that in spite of the ‘non-canonical’ targeting information and recognition by a specific receptor, this precursor protein follows a similar way across the envelope as the majority of plastid precursor proteins.

Kernkodierte chloroplastidäre Proteine werden an cytosolischen Ribosomen synthetisiert und müssen posttranslational in Chloroplasten importiert werden. Die Translokation dieser Proteine erfolgt in einem hoch regulierten Prozess durch den Toc- und Tic-Komplex, die Proteintranslokationskomplexe in der äußeren bzw. inneren Hüllmembran der Chloroplasten. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass der Proteinimport in Chloroplasten in das Calcium-Netzwerk der Pflanzenzelle integriert ist. Hinweise darauf lieferte die Identifizierung einer bisher unbekannten Regulation des chloroplastidären Proteinimports durch Calcium/Calmodulin. Diese Regulation betrifft nur diejenigen Proteine, die eine abspaltbare N-terminale Präsequenz besitzen sowie Toc- und Tic-Komplex für ihre Translokation in Chloroplasten verwenden. Weitere Untersuchungen haben gezeigt, dass die Calcium/Calmodulin-Regulation des Proteinimprts auf Höhe des Tic-Komplexes einsetzt. Als Überträger dieser Regulation fungiert wahrscheinlich Tic32, eine Komponente des Tic-Komplexes, da die Affinitätschromatographie an Calmodulin-Agarose Tic32 als dominantes Calmodulin-Bindeprotein in der inneren Hüllmembran der Chloroplasten aufzeigte. Sowohl heterolog exprimiertes als auch natives Tic32 binden an Calmodullin nur in Anwesenheit von Calcium. Die Calmodulin-Bindungsdomäne in Tic32 liegt am proximalen C-Terminus zwischen Leu296 und Leu314. Tic32 kann ebenfalls NADPH binden, was eine Redoxregulation für dieses Protein nahelegt. Die Bindung von NADPH führt zur Unterbrechung der Interaktion von Tic110 mit Tic32, Tic62 und Tic44. Da sich NADPH und Calmodulin bei ihrer Bindung an Tic32 gegenseitig ausschließen, könnte Calmodulin die Bindung zwischen den Komponenten des Tic-Komplexes wiederherstellen. Zusammengenommen liefern diese Ergebnisse Hinweise darauf, dass sowohl die Redox- als auch die Calcium/Calmodulin-Regulation des Proteinimports in Chloroplasten auf Höhe des Tic-Komplexes stattfinden und dass die beiden Regulationen durch Tic32 vermittelt werden könnten.

Die Zusammensetzung und Arbeitsweise des Tic Komplexes ist noch ungeklärt. Tic110 ist die einzige von sieben Komponenten, die allgemein akzeptiert ist. Die Funktion und genaue Topologie des Proteins ist aber noch umstritten (Abb.3). Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Experimente zur Klärung der Topologie und Funktion des Proteins durchgeführt. Zum Einen wurde über ein CD-Spektrum eine alpha-helikale Sekundärstruktur für Tic110 gezeigt. Proteasebehandlung sowohl von Vesikeln der inneren Hüllmembran als auch von intakten Chloroplasten lassen vermuten, dass Bereiche von Tic110 in den Intermembranraum zeigen. Auf der anderen Seite weisen Affinitätschromatographieversuche mit dem C-Terminus von Tic110 darauf hin, dass das Protein im Stroma mit HSP93 und HSP70 interagiert. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass ein Teil des C-Terminus in den Intermembranraum ragt und ein anderer Teil ins Stroma. Ob im C-Terminus amphiphile Helices ausgebildet werden können, muss geklärt werden. Mengenmäßig ist Tic110 prominenter in der inneren chloroplastidären Hüllmembran vorhanden als Tic20, der andere „Kandidat“ für die Pore des Tic Komplexes. Im Vergleich zur Menge von Toc75, der Pore der äusseren Hüllmembran, ist Tic110 in ähnlichen Mengen vorhanden. Tic110 ist also ein geeigneter Kandidat, an der Porenbildung beteiligt zu sein. Desweiteren wurden Interaktionspartner vom N-Terminus von Tic110 gesucht. Dabei wurde ein 32 kDa Protein gefunden, dass große Homologien zu sogenannten „short-chain“ Dehydrogenasen aufweist. In der vorliegenden Arbeit wurde über Importversuche und Immunpräzipitationsexperimente eine Zugehörigkeit des Proteins zum Tic Komplex gezeigt. Die Komponente wurde Tic32 genannt. Tic32 ist eine funktionelle Dehydrogenase, deren Beteiligung während des Importprozesses noch zu klären bleibt. T-DNA Insertionslinien von Tic32 ergaben, dass das Protein für die für die Plastidenentwicklung essentiell ist. Da mit Tic32 neben Tic55 und Tic62 nun schon die dritte Tic Komponente gefunden wurde, die Redox Charakteristika aufweist, wurden verschiedene Importexperimente durchgeführt. Dafür wurden zwei chloroplastidäre FNR-Isologe und zwei chloroplastidäre Fd-Isologe in Chloroplasten importiert, deren Redoxzustand vor der Importreaktion mit verschiedenen Metaboliten oder Redoxkomponenten beeinflusst wurde. Sowohl nach Behandlung der Chloroplasten mit HAR, deamino-NAD, Oxalacetat und Kaliumhexacyanoferrat nimmt die Importeffizienz der FNR L2 Form stark ab. Auch für die Ferredoxin-Isologe ließ sich ein unterschiedliches Importverhalten feststellen, wenn auch nicht so eindeutig wie für die FNR-Isologe. Dieser Regulationsmechanismus muß nun in weiteren Experimenten genauer untersucht werden.