Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06

Wed, 28 Nov 2007 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/7762/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/7762/1/Petropoulos_Konstantin.pdf Petropoulos, Konstantin

This study focuses on one brown-colored representative of the green sulfur bacteria, Chlorobium sp. BS-1, that survives by means of anoxygenic photosynthesis even at very low light intensities. This unusual representative of the green sulfur bacteria lives in the chemocline of the Black Sea, which is located at 80 to 120 m depth, offering only 0.0005 % (winter) to 0.002 % (summer) of surface irradiance (0.00075 to 0.0022 µmol Quanta m-2 s-1). The Black Sea represents the world’s biggest anoxic water body, and it is permanently stratified. An overview of the habitat Black Sea and the research on phyotosynthetic bacteria in the Black Sea chemocline gives the article Anoxygenic phototrophic bacteria in the Black Sea chemocline (pages 53 ff.) In the second article, Physiology and phylogeny of green sulfur bacteria forming a monospecific phototrophic assemblage at 100 m depth in the Black Sea (pages 75 ff.), it is shown that Chl. sp. BS-1 represents a novel phylotype in the marine cluster of green sulfur bacteria and is the only detectable phylotype of green sulfur bacteria in the Black Sea chemocline. It was shown that Chl. sp. BS-1 is the first organism known to date which fixes 14CO2 under laboratory conditions even at light intensities as low as 0.015 µmol Quanta m-2 s-1 which is much lower than the light intensity in any typical habitat of green sulfur bacteria. Therefore it is the best adapted species to extremely low light intensities documented. The major adaptive mechanism to extremely low light intensities might be a significant change in the secondary homologs of the main photosynthetic pigment, bacteriochlorophyll e (BChl e). The dominance of farnesyl esters and the presence of four unusual geranyl ester homologs of BChl e were revealed by HPLC analysis in cells shifted from 3 to 0.1 µmol Quanta m-2 s-1. Together with in situ light measurements and in situ BChl e concentrations, the growth experiments allowed for the calculation of doubling times and significance of the photosynthetic activity for the carbon and sulfur cycle in the Black Sea chemocline. With doubling times of a minimum of 3.1 years (for summer light intensity) and the contribution of only 0.002 - 0.01 % to total sulfide oxidation in the chemocline Chl. sp. BS-1 represents the slowest growing population of green sulfur bacteria known to date and does not contribute significantly to the carbon or sulfur cycle. The article Subfossil DNA sequences of green sulfur bacteria as indicators for past water column anoxia in the Black Sea (page 119 ff.) gives insight into the history of the strain Chl. sp. BS-1 and the green sulfur bacteria in the Black Sea during the last few thousand years. The Black Sea today is considered as closest contemporary analogue to past sulfidic oceans and its biogeography over several thousand years is well documented in its stratified sedimentary record. Since the 16S rRNA gene sequence of Chl. sp. BS-1 might be a useful indicator for past photic zone anoxia, the presence of its fingerprints in past periods of the Black Sea was investigated. 16S rRNA gene sequences of green sulfur bacteria from samples of Black Sea sediments up to 7 m below seafloor were amplified and sequenced. Nine green sulfur bacterial 16S rRNA gene sequences were identified. Surprisingly, not only green sulfur bacterial fingerprints were found but also closely related species clustering at the basis of the green sulfur bacterial subtree, together with not yet cultured species detected all over the world. The new cluster was called “deep-branching green sulfur bacteria” though it was not possible to enrich live organisms with medium for photosynthetic green sulfur bacteria. The chemocline strain Chl. sp. BS-1, found in Units III, II and I (>9000 years b.p. until today), and two other sequences, found in sediments of Unit IIb (between 8200 yr. b.p. and 5000 yr.b.p) only, were the only two sequences clustering with the marine green sulfur bacteria. The other green sulfur bacterial sequences clustered with freshwater or low-salt adapted species, indicating an allochthonous introduction of these sequences to the Black Sea sediments. A long-distance transport of green sulfur bacteria even through oxygenated water is possible since the group has protective mechanisms agains oxygen intoxication. In the article An obligately photosynthetic bacterial anaerobe from a deep-sea hydrothermal vent (pages 105 ff.) a strain is presented which was enriched from beneath a deep sea hydrothermal vent, Chlorobium bathyomarinum GSB1. It was shown to resist more than 16 days of oxygenated medium. Since this strain was isolated only from the vicinity of a vent and was shown to depend on photosynthesis, it might survive photosynthetically by exclusively using geothermal radiation. It might be the first green sulfur bacterium which is adapted to light intensities even lower than in the Black Sea chemocline. A lot of newly obtained sequences during this study evoked the necessity of a phylogenetic analysis. The article Biodiversity and Phylogeny of the family Chlorobiaceae based on comparison of multiple genetic regions (pages 145 ff.) discusses the phylogenetic system of the green sulfur bacteria, which is to date not satisfactory with respect to resolution of the group. A new system is presented which is based on green sulfur bacterial sequences of isolated strains and environmental sequences from the NCBI database (www.ncbi.nlm.nih.gov). The 16S rRNA gene phylogenetic tree revealed the need for a revised phylogenetic system of green sulfur bacteria and showed a close correlation of ecology, i.e. the habitat of the respective species, and phylogeny. Consequently, functional genes might reflect the adaptation to different habitats better than 16S rRNA gene sequences. Three different markers were used for an alternative phylogenetic analysis: ITS (16S-23S rRNA intergenic spacer region), bchG, and sigma factor A, respectively. Only sigma factor A showed a significantly higher resolution of the phylogenetic system of green sulfur bacteria and should be considered as more powerful tool than the16S rRNA gene to classify green sulfur bacteria.

Bacterial interactions play a major role in nature, but are poorly understood, because of the lack of adequate model systems. Phototrophic consortia represent the most highly developed type of interspecific bacterial association due to the precise spatial arrangement of phototrophic green sulfur bacteria (GSB) around a heterotrophic central bacterium. Therefore, they are valuable model systems for the study of symbiosis, signal transduction, and coevolution between different bacteria. This thesis summarizes a series of laboratory experiments with the objective of elucidating the molecular, physiological and phylogenetical properties of the two bacterial partners in the symbiotic phototrophic consortium "Chlorochromatium aggregatum". The central bacterium of “C. aggregatum” had been identified as a Betaproteobacterium, however, it could not be characterized further due to the low amount of consortia in enrichment cultures. In this work a suitable method for enrichment and isolation of DNA of the central bacterium of "C. aggregatum" has been established using cesium chloride-bisbenzimidazole equilibrium density gradient centrifugation (Chapter 3). In density gradients, genomic DNA of the central bacterium of “C. aggregatum” formed a distinct band, which could be detected by real-time PCR. Using this method, the GC-content of the central bacterium was estimated to be 55.6%. Furthermore, its precise phylogenetic position was determined and it was shown to represent a novel and phylogenetically isolated lineage of the Comamonadaceae within the -subgroup of the Proteobacteria. Chapter 4 describes the detection of a new, highly diverse subcluster of Betaproteobacteria, which contains several central bacteria of phototrophic consortia. Genomic DNA of the central bacterium of “C. aggregatum” was enriched several hundred fold by employing a selective method for growth of consortia in a monolayer biofilm followed by a purification of the central bacterial genome by density gradient centrifugation. A combination of molecular methods revealed that two rrn operons of the central bacterium are arranged in a tandem fashion. This rare gene order was exploited to screen various natural microbial communities. A diverse and previously unknown subgroup of Betaproteobacteria was discovered in the chemocline of Lake Dagow, Eastern Germany. All 16S rRNA gene sequences recovered are related to that of the central bacterium of “C. aggregatum”. Phylogenetic analyses showed, that the central, chemotrophic symbionts of phototrophic consortia have a polyphyletic origin, just like their phototrophic counterparts. This indictates that not only different GSB but also different Betaproteobacteria have adapted to life in this type of symbiosis. Chapter 5 focuses on the isolation of the epibiont of “C. aggregatum” from a consortia enrichment culture and its description as Chlorobium chlorochromatii strain CaD. It represents a novel species within the genus Chlorobium and is characterized by physiological properties typical for GSB. However, the symbiotic strain differs from free-living GSB in the distribution of its chlorosomes and the presence of a conspicuous additional structure at the attachment-site to the central bacterium. Its capability to grow in pure culture indicates that it is not obligately symbiotic. The natural habitat of GSB and phototrophic consortia is the chemocline of stratified lakes. Therefore, the physiological response to oxygen exposure of the epibiont and the free-living GSB Chlorobium limicola has been investigated (Chapter 6). It was shown that GSB are able to survive oxygen exposure and have developed several strategies for oxygen detoxification. Genome annotation revealed the presence of several enzymes involved in oxygen detoxification in all currently sequenced GSB genomes. Phylogenetic analyses showed that most of these enzymes likely were present in the common ancestor of this group. The activity of some of those enzymes could be confirmed. Since carotenoids also act as antioxidants, the carotenoid composition of the epibiont was investigated. In contrast to all other GSB it lacks chlorobactene, the major carotenoid in green-coloured GSB. In addition, 7,8-dihydro--carotene has been identified in the epibiont as a novel carotenoid in nature. Substantial progress has been made in the course of this study not only with the establishment of a method facilitating genome sequencing of the central bacterium of “C. aggregatum”, but also with the developement of a molecular screening tool for central bacteria of phototrophic consortia. The resulting sequences will enable the direct comparison of the phylogeny of both bacterial partners in different phototrophic consortia and hence will provide the unique opportunity to assess for the first time the process of the coevolution of a bacteria-bacteria-symbiosis.

Thu, 22 Nov 2007 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8627/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8627/1/Torres_Galea_Patricia.pdf Torres Galea, Patricia ddc:500, ddc:570, Fakultät für Biologie

TRADD spielt als Adaptermolekül eine zentrale Rolle in der Signaltransduktion von LMP1 und TNF-Rezeptor 1. Während es allerdings durch den TNFR1 neben der Aktivierung verschiedener Signalwege auch zur Induktion von Apoptose und Nekrose kommt, handelt es sich bei LMP1 um ein Protein mit transformierendem Potential. Bei den jeweiligen TRADD-Bindestellen von LMP1 und TNFR1 handelt es sich um zwei strukturell vollkommen unterschiedliche Domänen. Und auch auf der Seite von TRADD wird die Bindung über zwei verschiedene Domänen vermittelt. Im Rahmen dieser Doktorarbeit sollte die Frage beantwortet werden, ob die TRADD-Bindestelle intrinsisch die biologischen Effekte der Signaltransduktion bestimmt oder ob diese durch den Rezeptorkontext festgelegt werden. Zur Beantwortung dieser Frage wurde in einem Domain Swapping Experiment die TRADD-Bindestelle des konstitutiv aktiven LMP1-TNFR1 sowie des TNFR1 gegen die putative TRADD-Bindestelle von LMP1 ausgetauscht. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass die Aminosäuren 370-386 die vollständige TRADD-Bindestelle von LMP1 umfassen. Weiter konnte gezeigt werden, dass diese Aminosäuren im LMP1-TNFR1- sowie im TNFR1-Kontext ausreichend sind, um den NF-κB und den JNK1 Signalweg zu aktivieren. Die Aktivierung des JNK1 Signalweges durch LMP1-TNFR1-CTAR2 verläuft unabhängig von TRAF2 und abhängig von TRAF6 und auch die Aktivierung des NF-κB Signalweges durch dieses Rezeptorkonstrukt verläuft TRAF6-abhängig. Damit konnte gezeigt werden, dass die LMP1-spezifischen Charakteristika der Signaltransduktion durch die TRADD-Bindestelle festgelegt und mit ihr zusammen übertragen werden. Obwohl die Aminosäuren 370-386 von LMP1 funktionell sind, sind sie auch im LMP1-TNFR1 sowie im TNFR1 Kontext nicht in der Lage Apoptose zu induzieren. Damit konnte im Rahmen dieser Doktorarbeit gezeigt werden, dass die Aminosäuren 370-386 von LMP1 intrinsisch und unabhängig vom Rezeptorkontext den nicht-apoptotischen Phänotyp der Signaltransduktion festlegen. Außerdem wurde im Rahmen dieser Doktorarbeit die Beteiligung von TRAF7 an der Signaltransduktion von LMP1 untersucht. Dazu wurde traf7 aus einer cDNA kloniert. Zusätzlich wurden verschiedene Deletionsmutanten sowie Fusionen mit dem fluoreszierenden Protein mRFP hergestellt. Es konnte eine Threonin-Phosphorylierung von TRAF7(1-383) nachgewiesen werden. Mittels Fluoreszenzmikroskopie konnte eine Lokalisierung von TRAF7 in vesikulären Strukturen beobachtet werden. Eine Mutante, der der RING- sowie der Zink-Finger fehlen, zeigte hingegen eine gleichmäßige zytosolische Verteilung. Außerdem konnte in dieser Doktorarbeit mit Hilfe von spezifischer siRNA gezeigt werden, dass TRAF7 an der Aktivierung des JNK1 Signalweges durch LMP1 beteiligt ist.

Für die Assemblierung des bakteriellen Flagellums müssen die externen Untereinheiten an ihren Bestimmungsort transportiert werden. Dies geschieht wie bei allen Gram-negativen Bakterien auch in Escherichia coli mit Hilfe des flagellären Typ III-Sekretionssystems (fTTSS). Dabei ist der flagelläre Exportapparat mit seinen cytoplasmatischen Komponenten FliH, FliI und FliJ von Bedeutung. Der Exportapparat ist im Basalkörper des Flagellums lokalisiert und liefert die Energie für den Export der Substrate, wie z. B. das Hakenkappenprotein FlgD und das Hakenprotein FlgE. Die Substrate benötigen ihrerseits ein Signal für die Erkennung durch den Exportapparat. Im Rahmen dieser Arbeit konnten Interaktionen zwischen den löslichen Komponenten FliH, FliI und FliJ des flagellären Typ III-Sekretionssystems von E. coli K12 festgestellt werden. Zudem wurden begonnene Arbeiten zur Lokalisation und Beschaffenheit einer Erkennungssequenz für den Exportapparat beim Substrat FlgD weitergeführt und auch das Substrat FlgE näher untersucht. Mit Hilfe der Affinitätschromatographie konnte ein Komplex, bestehend aus FliH, FliI und FliJ, aus dem Cytosol von E. coli BL21 (DE3) präpariert werden. Dafür wurden zuvor die Gene fliH, fliI und fliJ zusammen in den Vektor pASK-IBA 45 kloniert und dann exprimiert. Parameter für Interaktionen und Affinitäten zwischen zuvor einzeln präpariertem FliH, FliI und FliJ konnten mit Hilfe von isothermaler Titrationskalorimetrie (ITC) und Surface Plasmon Resonance (SPR) ermittelt werden. Unter Verwendung eines bereits etablierten Testsystems für das fTTSS in E. coli CC181-Mutanten konnte der Export der Hybridproteine FlgDPhoA bzw. FlgEPhoA untersucht werden. Dabei wurden von FlgD auch N- oder C-terminale Verkürzungen sowie auf Nukleotid- oder Aminosäureebene veränderte Sequenzen eingesetzt. Die Untersuchungen ergaben ein Signal für den Export des Hakenkappenproteins FlgD auf Proteinebene und nicht auf der Ebene der mRNA. Zudem konnte das Exportsignal auf die N terminalen 71 Aminosäuren von FlgD eingegrenzt und eine Bedeutung des möglichen zweiten Startcodons an Position 52 in flgD für den Export ausgeschlossen werden. FlgE wurde in seiner gesamten Länge vom fTTSS transportiert. Im Gegensatz zu FlgD führten jedoch alle C-terminalen Verkürzungen von FlgE zum Transportverlust.

Tue, 6 Nov 2007 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8980/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8980/1/Tobollik_Stephanie.pdf Tobollik, Stephanie

Mitglieder der evolutionär konservierten Oxa-Proteinfamilie wirken an der korrekten Insertion von integralen Membranproteinen in Bakterien, Mitochondrien und Chloroplasten mit. In den sehr proteinreichen Thylakoidmembranen der Chloroplasten höherer Pflanzen spielt das Oxa-Homolog Alb3 eine essentielle Rolle bei der Integration von LHC-Proteinen und weiteren Komponenten des Photosynthese-Apparates. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein weiteres Protein aus Arabidopsis identifiziert und als neues Mitglied der Oxa-Proteinfamilie beschrieben. Die experimentell gestützte Annotation zeigt, dass das Alb4-Protein eine zentrale 60KD_IMP-Domäne besitzt, welche für die Oxa-Proteine charakteristisch ist. Die Zugehörigkeit zur Oxa-Proteinfamilie konnte funktionell durch die Komplementation einer Hefe-oxa1-Mutante bestätigt werden. Immunologische und fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen konnten weiterhin zeigen, dass es sich bei Alb4 um ein chloroplastidäres Protein handelt, welches als integrales Membranprotein in den Thylakoiden lokalisiert ist. Durch die Analyse von T-DNA-Insertions- und RNAi-Linien konnte gezeigt werden, dass eine Reduktion des Alb4-Gehaltes zu vergrößerten und nicht länger linsenförmigen Chloroplasten führt, in denen die Thylakoidmembranen aufgelockerter erscheinen. Ein Verlust der Lebensfähigkeit konnte jedoch nicht beobachtet werden, selbst wenn der Alb4-Gehalt in den Chloroplasten der Pflanzen um mehr als 90% reduziert war. Im Vergleich zu Cyanobakterien besitzt die Thylakoidmembran von Arabidopsis mit Alb4 und Alb3 gleich zwei Oxa-Homologe. Möglicherweise ist nach der Umwandlung des cyanobakteriellen Endosymbionten zu einem eukaryotischen Organell diese Duplizierung nötig geworden, um sowohl die Ausbildung als auch den Erhalt der Thylakoidstruktur zu gewährleisten. Zusätzlich zur Identifizierung von Alb4 konnte durch Transkript-Analysen desweiteren gezeigt werden, dass auch der N-Terminale Teil des ehemaligen Genmodells F21J9.13 (Artemis, nun Alb4 und RWK1) für ein eigenständiges Gen kodiert. Das abgeleitete Protein aus dem N-terminalen Teil, RWK1, ähnelt dem Rezeptor-Teil von pflanzlichen Rezeptor-Kinasen, eine entsprechende Kinase-Domäne fehlt jedoch vollständig. RWK1 kommt in zwei Spleißvarianten vor, der für die meisten eukaryotischen mRNAs typische polyA-Schwanz fehlt jedoch beiden Varianten. RWK1 könnte als neuartiger Rezeptor ein weiteres Glied in der internen Kommunikationskette der Zelle bilden.

Late mitotic events are chiefly controlled by proteolysis of key regulatory proteins via the ubiquitin-proteasome pathway. In this pathway ubiquitin ligases modify substrates by attachment of ubiquitin (“ubiquitylation”), which usually results in their subsequent degradation by the 26S proteasome. The crucial ubiquitin ligase involved in late mitosis is the anaphase-promoting complex or cyclosome (APC/C). Among the many substrates of the APC/C is the anaphase inhibitor securin, whose destruction leads to activation of separase, which in turn triggers sister chromatid separation by proteolytic cleavage of cohesin. The APC/C also targets cyclin B1, an activating subunit of Cdk1 kinase, whose inactivation is a prerequisite for mitotic exit. The unstable APC/C substrates are often found in association with stable partner proteins. How single subunits of multi-protein complexes are selectively extracted and eventually degraded is largely unknown, but there is increasing evidence that additional factors assist to extract ubiquitin-carrying subunits from stable binding partners. One such factor is vertebrate p97 (Cdc48 in yeast), an abundant and highly conserved member of the AAA-ATPase family. It is involved in such diverse processes as transcriptional regulation, membrane fusion, and ER-associated protein degradation (ERAD). The unifying scheme in these seemingly unrelated functions is that p97 is able to “extract” preferentially ubiquitylated proteins from their environment. Roles of p97 in mitosis have recently emerged: p97 was reported to be required for spindle disassembly and for nuclear envelope reformation during mitotic exit in Xenopus. Furthermore, a genetic interaction between p97, separase and securin, as well as a requirement of p97 for separase stability, were discovered in fission yeast. Given these hints and the importance of ubiquitylation in both mitosis and p97 pathways, this study intended to elucidate additional mitotic roles of p97 in vertebrates. Towards this end, tools to interfere with p97 function in Xenopus egg extracts were developed. These included immunodepletion of the p97 adaptors Npl4, Ufd1 and p47 and addition of recombinant dominant-negative p97-mutants. ERAD, which could be established here for the first time in Xenopus egg extracts, was greatly impaired in the absence of p97 function. However, many aspects of mitosis were found to be unaffected. Importantly, p97’s proposed role in spindle disassembly was clearly falsified within this thesis. Furthermore, p97 was shown to be dispensable for activity and stability of vertebrate separase. Disassembly of the mitotic checkpoint complex, which prevents premature APC/C activation by sequestering its activator Cdc20, did also not require functional p97 despite its dependence on ubiquitylation of Cdc20. However, a novel function of p97 at fertilization was discovered. p97 was found to interact with nucleoplasmin, a histone-binding chaperone that catalyzes the exchange of sperm-specific basic proteins (SBPs) to histones. Indeed, interference with p97 function delayed sperm decondensation in Xenopus egg extracts, thereby confirming a novel role of this AAA-ATPase in sperm chromatin remodelling. In another project the role of securin in human cells was investigated. Human cells lacking securin had been reported to suffer from massive chromosome missegregation, which was in sharp contrast to the mild phenotype of securin knockout mice. In collaboration with the group of M. Speicher it could be demonstrated that chromosome losses in securin-/- cells are transient and give way to a stable segregation pattern after just a few passages. This was despite persisting biochemical defects such as reduced level and activity of separase. These data demonstrate that securin is dispensable for chromosomal stability in human cells.

Wed, 24 Oct 2007 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/16524/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/16524/1/Steinhaus_Susanne.pdf Steinhaus, Susanne ddc:570, ddc:500, Fakultät fü

Elaboration of a dendritic arbor and the extension of an axon define the neuronal shape and are the key morphological features defining neuronal maturation. How the process is molecularly regulated is only poorly understood. In this study we used the dorsal multidendritic arborization (md-da) neurons of the Drosophila embryonic Peripheral Nervous System(PNS) to address the question about the Roundabout (Robo) receptor protein function during dendrite field development. We identified Robo as one of the proteins involved in regulating the balance between dendritic branch elongation and new branch formation during dendritic arbor specification of the morphologically most complex, filling-in Class IV neuron of Drosophila PNS. To dissect the role of the Robo proteins during dendritogenesis, we performed detailed developmental analyses of dendrite field formation of md-da neurons and compared how dendrite morphogenesis differs in animals lacking Robo function or having too much of the protein in their sensory neurons. We observed that changing the function of Robo protein results in defects in the number and elongation of high order dendritic branches. With the help of cell-class specific genetic markers we also observed that Robo acts cell- class specifically and is required during dendrite field development of the morphologically most complex class of md-da neurons, Class IV. Based on MARCM (mosaic analyses with a repressible cell marker) rescue and expression pattern experiments we suggest that this function of Robo is cell-autonomous. By doing time-lapse analyses we assessed the mechanistic role of overexpressing Robo during dendrite field development. We could verify that this protein limits the elongation and new branch formation of fine dendritic processes of the Dorsophila Class IV neurons. We performed expression pattern analyses, ectopic expression experiments and MARCM experiments for slit and suggest that muscles and neurons themselves are possible sources for the ligand. There are few molecules known to mediate the activation of Robo via Slit in the growth cone of an axon. Among these are Dock, a SH2-SH3 adaptor protein and Ena, a member of the VASP family of proteins. Loss-of-function analyses for these two proteins suggest that Ena is acting downstream of Robo during the regulation of dendrite field development of md-da neurons. Finally we propose a model in which Robo responsiveness to Slit is down regulated via Robo2 during axon patterning of dorsal md- da neurons.

Der Hauptregulator der vaskulären Homöostase ist das Endothel, welches eine Vielzahl an vasoprotektiven Effekten ausübt. Die Integrität und Regulation des endothelialen Zellayers der Blutgefäße ist von großer Bedeutung bei physiologischen und pathologischen Prozessen. Die Basis dieser Phänomene ist in der dynamischen und exakt kontrollierten Regulation des Zytoskeletts begründet. Die wichtigsten Regulatoren des Zytoskeletts stellen die GTPasen der Rho-Familie und deren Effektoren dar. Im Rahmen dieser Doktorarbeit untersuchten wir in primären humanen Nabelschnurendothelzellen, eine neu in Erscheinung tretende Zytoskelettstruktur, der wir in Anlehnung an ähnliche Proteingruppierungen in monozytären Zellen den Namen HUVEC-Podosomen gaben. HUVEC-Podosomen sind aufgrund ihrer Komponenten mit klassischen Podosomen vergleichbar. Allerdings gibt es zwischen beiden Strukturen auch Unterschiede, denn während klassische Podosomen aus Ring und Kern bestehen, zeigen HUVEC-Podosomen eine zweischichtige Architektur. Wie wir weiterhin nachweisen konnten liegen Podosomen der Endothelzellen an der ventralen Plasmamembran und haben engen Kontakt mit der extrazellulären Matrix.. Somit fungieren sie, wie auch die klassischen Podosomen, als Adhäsionsstrukturen. Sie dienen aber nicht nur der Adhäsion, denn wie bei FITC-markierten Monolayer-Versuchen gezeigt werden konnte, haben sie auch eine proteolytische Aktivität, die insbesondere beim Matrixverdau und der daran anschließenden Migration von Bedeutung ist. Ferner können wir zeigen, daß HUVEC-Podosomen in ruhenden, konfluenten Zellayern nicht beobachtet werden können. Sie lassen sich aber in migratorischen (subkonfluent oder nach Verwundung) HUVEC, in hoher Anzahl und diversen ringförmigen Formationen, vorwiegend in Bereichen nahe dem Leitsaum nachweisen. Wie wir mit Hilfe von live cell imaging-Experimenten zeigen konnten, sind diese Strukturen hochdynamisch und breiten sich wellenartig mit einem weiten Radius innerhalb einer Zelle aus. Scheinbar dispergieren diese Formationen oder fusionieren mit der Zellplasma, wodurch sie die enthaltenen Proteine für viele andere zytoplasmatische oder membranöse Prozesse freigeben könnten. Durch Experimente, in denen Zytokine wie VEGF, bzw. Zytokin-produzierende Zellen wie Monozyten den HUVEC-Kulturen zugegeben wurden, konnten wir zeigen, daß diese die Bildung von Podosomen induzieren und sogar erheblich steigern. Unsere Arbeiten mit konstitutiv aktiven und dominant negativen GTPase-Mutanten zeigten weiterhin, daß diese bei der Organisation und Entstehung der HUVEC-Podosomen von entscheidender Bedeutung sind. Ferner konnte mit Hilfe von Mikroinjektionsversuchen von einer Teildomäne (A) des N-WASP-Proteins verifiziert werden, daß der Mechanismus zur Bildung der HUVEC-Podosomen eine Arp2/3-abhängige Aktinnukleation beinhaltet. Weiterhin ist die Bildung dieser Adhäsionsstrukturen auch von Src Tyrosinkinasen und PI3-Kinase abhängig. Eine der Komponenten von HUVEC-Podosomen ist das Markerprotein Drebrin. Drebrin kann nur in diesen Strukturen und an Zell-Zell-Kontakten in HUVEC detektiert werden. Mikroinjektionsversuche von diversen Konstrukten der unterschiedlichen Regionen von Drebrin zeigen, daß dieses Protein von großer Bedeutung für die Bildung und Struktur der HUVEC-Podosomen ist. Die einzelnen Protein-Protein-Interaktionen von podosomalen Komponenten untereinander und mit Drebrin wurden mit Hilfe von Immunpräzipitation getestet. Es ist uns jedoch nicht gelungen einen Drebrin-Interaktionspartner zu finden. Eine Interaktion von Drebrin konnten wir nur mit Drebrin selbst in Form einer Dimerisierung bzw. mit F-Aktin nachgeweisen. Es ist sehr wahrscheinlich, daß es sich bei HUVEC-Podosomen um ein multifunktionelles Organell handelt. Wie wir in dieser Arbeit darstellen, sind HUVEC-Podosomen Adhäsionsstrukturen. Sie können am häufigsten am Leitsaum detektiert werden, wobei ihre Generierung nur in Zellen mit migratorischen Phänotyp (in Zellen am Wundrand oder in subkonfluenten layern) detektiert werden kann. Beide Tatsachen sprechen dafür, daß HUVEC-Podosomen den Prozeß der Migration unterstützen. Zudem können diese Adhäsionsstrukturen die Matrix degradieren, wodurch sie so wiederum zur Migration aber auch invasiven Prozessen beitragen könnten. HUVEC-Podosomen könnten auch eine Funktion als Speicherform ihrer Komponenten ausüben. Sie fusionieren mit der Zellmembran und liefern so möglicherweise notwendige Proteine und Signale, die die Induktion von Protrusionen ermöglichen und so migratorische Prozesse unterstützen könnten. Durch die Involvierung u. a. von Drebrin, das an Zell-Grenzen detektiert werden kann, können HUVEC-Podosomen möglicherweise einen Einfluß auf Zell-Zell-Kontakte und Vorgänge wie Angiogenese ausüben. Dies bestätigt auch die Tatsache, daß Zytokine die Anzahl an Zellen erhöhen, die HUVEC-Podosomen generieren können und Vorgänge wie Wundheilung beschleunigt ablaufen lassen und so u. U. eine klinische Relevanz haben könnten.

Tue, 16 Oct 2007 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/7559/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/7559/1/Kreiner_Elisabeth.pdf Kreiner, Elisabeth ddc:500, ddc:570, Fakultät für Biologie

Die Familie der Sorting Nexine (SNX) umfasst 33 bekannte Mitglieder, jedoch ist der Funktionsmechanismus vieler Sorting Nexine bislang nicht aufgeklärt. Auf der Suche neuer Modulatoren der βAPP-Proteolyse konnte im Rahmen eines Expressionsklonierungs-Screens (Schobel et al., 2006) ein bislang nicht beschriebenes Protein, Sorting Nexin 33 (SNX33), als Aktivator der βAPP-Proteolyse identifiziert werden. SNX33 ist ein phosphoryliertes Protein, das ubiquitär exprimiert wird und zudem eine hohe Homologie zu den Proteinen SNX9 und SNX18 aufweist. SNX33 ist im Zytosol lokalisiert, kann jedoch auch Membran-assoziiert vorliegen. Es konnte gezeigt werden, dass Überexpression von SNX33 zu einer Inhibition Dynamin-abhängiger Endozytose und in Folge dessen zu einer etwa 50% -igen Reduktion der βAPP-Endozytose führt. Die von SNX33 induzierte Endozytosehemmung wird durch die SH3-Domäne des Proteins vermittelt. Im Rahmen dieser Doktorarbeit durchgeführte Koimmunpräzipitationsstudien zeigten, dass SNX33 mittels seiner SH3-Domäne mit Dynamin interagiert und auf diese Weise möglicherweise dessen Funktion moduliert. In Übereinstimmung mit den durchgeführten Zellkultur-Experimenten führte eine Überexpression von SNX33 im Modellorganismus Caenorhabditis elegans ebenfalls zu einem Dynamin-Funktionsverlust. Da SNX33 Expression zu einer generellen Inhibition Dynamin-abhängiger Endozytose führt, handelt es sich dabei nicht um einen spezifischen βAPP-Modulator. Konsequenz einer reduzierten βAPP-Internalisierung ist eine starke Zunahme der neurotrophen sAPPα-Bildung sowie - je nach verwendeter Zelllinie - ein leichter Anstieg bzw. eine geringe Reduktion der pathogenen sAPPβ-Generierung. Es konnte gezeigt werden, dass Überexpression der homologen Proteine SNX9 und SNX18 ebenfalls zu einer Zunahme der βAPP-Spaltung führt. Es handelt sich also um einen Effekt, der von der ganzen Sorting Nexin-Subgruppe (SNX33/SNX9/SNX18) vermittelt wird. Diese Beobachtung legt die Vermutung nahe, dass diese Funktion innerhalb dieser Subgruppe konserviert ist. Transfektion von SNX1 führte zu keiner Änderung der βAPP-Proteolyse, was bedeutet, dass dieser Effekt nicht von der gesamten Sorting Nexin-Familie vermittelt wird. Interessanterweise ist die Spaltung von βAPP besonders sensitiv bezüglich einer veränderten Endozytose-Rate, da die Proteolyse der Transmembranproteine L-Selektin und des Tumornekrosisfaktor-Rezeptors 2 (TNFR2) unter SNX33 Überexpressionsbedingungen nicht signifikant verändert war. Ein siRNA-vermittelter Knock-Down von SNX33 führte zu keiner generellen Endozytoseinhibition in HEK293 Zellen, es konnte keine veränderte βAPP-Endozytoserate beobachtet werden. Die Bildung von sAPPα- und sAPPβ war in Folge dessen unverändert. Auch ein lst-4/SNX33-Knock-Down in C. elegans führte überraschenderweise zu keiner Inhibition der Dynamin-Funktion, äußerte sich jedoch in einer Fehlfunktion der Insulin-Signaltransduktion. SNX33-Knock-Down in humanen Zellen brachte keine nachweisbare Beeinträchtigung des Insulinsignalweges mit sich, jedoch besteht die Möglichkeit, dass die Homologen SNX9 und SNX18 einen Verlust von SNX33 kompensieren können. Dabei gilt zu beachten, dass eine Funktionsübernahme durch homologe Proteine in C. elegans nicht möglich ist, da dieser Organismus nur ein einziges homologes Protein der SNX33/SNX9/SNX18-Subgruppe besitzt. Im Rahmen dieser Doktorarbeit präsentierten sowie diskutierten Daten zeigen, dass SNX33 in unterschiedliche zellulärer Prozesse involviert ist. SNX33 ist ein neu identifizierter Modulator der Zelle, der für zentrale Signalwege und Vorgänge, wie zum Beispiel der Insulinrezeptor-Signaltransduktion und Endozytose, von Bedeutung ist. Im Gegensatz zum Modellorganismus C. elegans kann im humanen Zellkultursystem ein durch siRNA induzierter Funktionsverlust von SNX33 durch die homologen Proteine SNX9 und SNX18 kompensiert werden.

In spite of strong evidence that the mammalian cell nucleus is a highly organized organelle, a consensus on basic principles of global nuclear architecture has not so far been achieved. The existence of major architectural features such as an organized interchromatin compartment and higher order organization of chromatin postulated by some of the models is questioned or even refused by the others. This study was set up to test predictions of the various model views after manipulating nuclear architecture by applying the induced formation of hypercondensed chromatin (HCC). This method leads to massive but completely reversible conformational changes of chromatin arrangements in living cell nuclei, but does not affect the cells survivability. Nuclear functions like transcription, replication and cell cycling were immediately stalled when HCC formation was induced, but were rapidly recovered upon recovery of normal chromatin configurations. The emerging pattern of HCC revealed a 3D network of interconnected chromosome territories. The surface of the emerging HCC bundles was the site of preceding activity like RNA transcription or DNA replication, which confirmed the existence of a distinct topological arrangement of functional processes with respect to the architecture of chromatin. This arrangement could further be demonstrated by analyzing the topography of defined chromatin modifications, showing that active chromatin is preferentially located at the HCC bundle surfaces, whereas inactive chromatin regions are preferentially found in the HCC bundle interior. The emerging patterns of HCC were further strikingly similar in consecutively repeated cycles of HCC formation and recovery, demonstrating a non-random but pre-existing and defined chromatin and interchromatin topography. All results of this study were obtained using confocal laser scanning microscopy. A protocol for deconvolution of confocal images was established to enhance confocal image quality to an extent sufficient for subsequent image analysis. In contribution to the present model views this study demonstrates: [1] That most chromatin exists in the form of higher-order sub-compartments ('~1 Mb chromatin domains') above the level of extended 30 nm fibers and [2] That an interchromatin compartment exists as a dynamic, structurally distinct nuclear compartment, which is functionally linked with the chromatin compartment. An updated chromosome territory-interchromatin compartment model on the basis of the gained results is presented at the end of this thesis together with an attempt to provide a comprehensive view linking ultrastructural with light microscopic insights.

Gene duplication is an opportunity for evolving new functions from the newer gene, but also has a disadvantage due to local gene-rearrangement effects and, if duplications are numerous, through alterations of genome size. Therefore, selection is playing a central role in determining the fate of a duplicate gene. Plants are known to harbor numerous gene families, and are thus an ideal system to test the fate of gene duplicates. This thesis tackles the tropinone-reductase like enzymes (further TRL) and the tau GSTs located upstream from this gene family. TRL enzymes are short-chain dehydrogenases that are involved in a reduction step downstream in the synthesis of tropane alkaloids in Solanaceae, important defense compounds of plants. The function of TRLs in Brassicaceae is not clear, since most of the plants in this family do not produce tropane alkaloids, but some have been associated with the oxidative-stress response. This gene family contains 80% of its members duplicated in tandem in Arabidopsis thaliana. We profited from this fact to isolate 12 TRL (+ pseudogenes) from this species, further six species of Brassicaceae (A. thaliana, A. lyrata, A. cebennensis, Capsella rubella, Boechera divaricarpa and Brassica rapa), and one species from a closely related plant family, Cleome spinosa. We tested the role that selection plays in maintaining large numbers of this gene family. We used phylogenetic methods to analyze non-coding sequence evolution and identified regulatory motifs. We analyzed non-coding sequence evolution. Microarray expression data from A. thaliana and qPCR for A. thaliana and A. lyrata were analyzed to detect divergence in the expression patterns of orthologs and paralogs. TRL genes follow a gene birth and death dynamics. More probable, they originated from non-equal recombination of tandem duplicated genes. Positive selection at the origin of the duplicated genes allowed these to acquire differential expression patterns, leading to the preservation of numerous TRLs. The analysis of coding and non-coding sequences shows them to display correlated evolution, particularly in species recently separated by speciation. We further tested for selection on the tau glutathione-S-transferases (GST) enzymes, adjacent 3' in the genome to TRLs. Tau GSTs are unique to plants and are involved in detoxification. Multiple copies of these enzymes will allow flexibility in substrate specificity, which is important for the detoxification function. We detected positive selection among paralogs of tau GSTs supporting their potential of functional diversity, but we also detected negative selection among paralogs and groups of orthologs, indicating that more often their functions are conserved.

Fri, 14 Sep 2007 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/7481/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/7481/1/Pattis_Isabelle.pdf Pattis, Isabelle

Wed, 12 Sep 2007 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/7427/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/7427/1/Shivalkar_Madhuri.pdf Shivalkar, Madhuri

This work is dedicated to studying natural variation in D. melanogaster at the DNA sequence and gene expression level. In addition I present a new version of the DNA polymorphism analysis program VariScan, which includes significant improvements. In CHAPTER 1 I describe a genome scan of single nucleotide polymorphism in two natural D. melanogaster populations (from Africa and Europe) on the third chromosome. Together with polymorphism data previously published for the X chromosome of the same populations, this allows a comparative study of the polymorphism patterns of the X chromosome and an autosome. The frequency spectrum of mutations and the patterns of linkage disequilibrium are investigated. The observed patterns indicate that there is a significant difference in the behavior of the two chromosomes, as has already been suggested by previous studies. To uncover the reasons for this a coalescent based maximum likelihood method is applied that incorporates the effects of demographic history and unequal sex ratios. For the African population the differential behavior of the chromosomes can be explained by its demographic history and an excess of females. In Europe, a population bottleneck and an excess of males alone cannot explain the patterns we observe. The additional action of positive selection in this population is proposed as a possible explanation. In CHAPTER 2 I investigate the variation in gene expression of the two aforementioned populations. Whole-genome microarrays are used to study levels of expression for 88% of all known genes in eight adult males from both populations. The observed levels of expression variation are equal in Africa and Europe, despite the fact that DNA sequence variation is much higher in Africa. This is evidence for the action of stabilizing selection governing levels of expression polymorphism. Supporting this view, genes involved in many different functions, and are therefore on strong selective constraint, show less variation than do genes with only few functions. The experimental design allows the search for genes which differ in their expression patterns between Europe and Africa and might therefore have undergone adaptive evolution. Detected candidates include genes putatively involved in insecticide resistance and food choice. Surprisingly, many genes over-expressed in Africa are involved in the formation and function of the flying apparatus. In CHAPTER 3 I present version 2 of the program VariScan. This program was designed to analyse patterns of DNA sequence polymorphism on a chromosomal scale. The functionality of the core analysis tool, the wavelet decomposition, is described. In addition, multiple improvements to the previous version are presented. The program now supports the “pairwise deletion” option. This is essential for analysing data at the chromosome scale, since such data often contains incomplete information. It is now possible to add outgroup information, which allows the calculation of additional statistics. Furthermore, the separate analysis of different predefined chromosomal regions is added as an option. To increase the user friendliness, a graphical user interface is now included as part of the software package. Finally, VariScan is applied to published and computer-generated data and the ability of the wavelet-based analysis to uncover chromosomal regions with interesting DNA polymorphism patterns is demonstrated.

Mitosis is the process by which sister chromatids are equally segregated into two daughter cells. Tight control in various events during mitotic progression is essential for maintaining chromosome stability. Mitotic kinases including Cyclin dependent kinase 1 (Cdk1) and Aurora family are required for regulating proper mitotic progression by phosphorylating mitotic substrates thereby, controlling their activities, localization or abundance. On the other hand, these mitotic kinases are modulated by de-novo synthesis, activators, phosphorylation and ubiquitin-dependent proteolysis. A thorough understanding of the function and regulation of mitotic kinases could further our knowledge on mitotic progression. In the first part of the thesis, we investigated the expression, localization and regulation of human Lats1 kinase, which is a close homologue of the yeast Dbf2 kinase family involved in the mitotic exit network (MEN). Despite the fact that Lats1 has been suggested to be a spindle protein that binds and inactivates Cdk1, we found that Lats1 is mainly cytoplasmic throughout the cell cycle by immunofluorescence microscopy. Both yeast two-hybrid and coimmunoprecipitation showed no significant interaction between Lats1 and Cdk1. Although Lats1 was highly phosphorylated during mitosis, no detectable kinase activity was observed. However, we identified Ste20 like kinase MST2 as the upstream regulator of human Lats1. Phosphorylation of Lats1 by Mst2 resulted in the activation of Lats1 kinase activity both in vivo and in vitro. This kinase-substrate relation was proven to be specific, as another distant Mst2 homolog, Mst4, did not possess this ability. Subsequent mass-spectrometry-based phosphosites analysis revealed that Mst2 phosphorylates Lats1 on more than five residues. Alanine mutations on Lats1T1079 and S909 impaired Lats1 kinase activity. Thus, we could not confirm the suggested role of Lat1 in mitosis. Instead, we show that similar to its Drosophila ortholog, Lats1 is involved in the Mst2 signaling pathway and might control developmentally regulated cell proliferation and apoptosis in mammals. In the second part of this thesis, we characterized hBora, a novel Aurora A interactor originally found in Drosophila. We show that hBora is upregulated and phosphorylated during mitosis. siRNA-mediated knockdown of hBora led to spindle formation defects and aneuploidy. hBora overexpression caused monoastral spindle formation and mislocalization not only of Aurora A but also Plk1. Further investigations showed that Cdk1 phosphorylation on hBoraSer252 leads to Plk1 binding and this may promote the SCF-mediated proteolysis of hBora. Indeed, Plk1 depletion led to an increase in hBora levels. Interestingly, the co-depletion of both hBora and Plk1 (to lower hBora levels in Plk1 depleted cells) rescued the localization of Aurora A to the centrosomes and bipolar spindle formation. Thus, we propose that hBora is a functional link between Plk1 and Aurora A and that by modulating the proteolysis of hBora, Plk1 could regulate Aurora A localization and activity. At the end, we also investigated the function of Aurora A and could show that Aurora A is required for centriole cohesion and centrosome separation.

Wed, 1 Aug 2007 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/7413/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/7413/1/Unterberger_Claudia.pdf Unterberger, Claudia ddc:500, ddc:570, Fakultät für Bi

Wed, 1 Aug 2007 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/7457/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/7457/1/Dorn_Tatjana.pdf Dorn, Tatjana ddc:570, ddc:500, Fakultät für Biologie

Zusammenfassung Das Epstein-Barr Virus nukleäre Antigen 2 (EBNA-2) ist ein Schlüsselprotein bei der Initiation und der Aufrechterhaltung der B-Zelltransformation nach einer EBV-Infektion. EBNA-2 reguliert die Genexpression von viralen und zellulären Genen und induziert so das physiologische Proliferationsprogramm der B-Zelle. Die DNA-Bindung erfolgt indirekt durch eine Interaktion mit zellulären Adapterproteinen, zu denen das CBF1 (C-promoter binding factor 1) Protein zählt. Mit dieser Arbeit sollte ein Beitrag zum Verständnis der bisher wenig untersuchten molekularen Mechanismen, über die EBNA-2 zelluläre Zielgene transaktiviert, geleistet werden. Die drei zellulären EBNA-2-Zielgene SLAMF1, DNASE1L3 und CCL3 wurden in dieser Arbeit exemplarisch untersucht. Die EBNA-2-Transaktivierung der drei Gene ist CBF1 abhängig. In allen drei Genen konnte erstmals eine EBNA-2-Bindung am Transkriptionsstart nachgewiesen werden. Erstmalig ist auch der Nachweis gelungen, dass EBNA-2 an intronständige CBF1-Bindestellen rekrutiert wird. Eine EBNA-2-Aktivierung führte in allen untersuchten Genen zur Rekrutierung der an Serin 5 phosphorylierten Polymerase II an den Transkriptionsstart, sowie auch zu CBF1-Bindestellen in Regionen, die distal zum Transkriptionsstart lokalisiert sind. Die Aktivierung der Genexpression korreliert in allen Fällen mit einer erhöhten Acetylierung der Histone H3 und H4, die nicht auf den Bereich des Transkriptionsstarts beschränkt war. Eine detaillierte Analyse des CCL3-Gens erwies, dass die DNA-Bindung von CBF1 durch EBNA-2 unterstützt wird. Des Weiteren zeigte sich, dass eine nahe dem Transkriptionsstart gelegene Region entscheidend zur EBNA-2 vermittelten Transaktivierung beiträgt und vermutlich nicht durch CBF1 vermittelt wird. Möglicherweise reguliert EBNA-2 nicht nur über eine Bindung an CBF1 die Transaktivierung eines Genes, sondern noch über einen zweiten Mechanismus, bei dem EBNA-2 direkt oder indirekt an den Transkriptionsstart oder in dessen unmittelbarer Nähe bindet. Zur Identifikation von Proteinen, die direkt an dem molekularen Mechanismus der EBNA-2-Transaktivierung beteiligt sind, wurde die „Tandem Affinity Purification“ (TAP-Reinigung) zur Aufreinigung nativer EBNA-2-Komplexe in B-Zellen etabliert. Durch eine anschließende massenspektrometrische Analyse konnten potentielle EBNA-2-Interaktionspartner identifiziert werden. Für das interessante Kandidatenprotein TFE3, ein Transkriptionsfaktor des Immunglobulinlokus, konnte bereits eine spezifische Anreicherung über EBNA-2 nachgewiesen werden.

The analysis of stable isotopes of oxygen from structural carbonate in archaeological human bone samples originating from an early medieval cemetery in the Alpine community of Volders, Austria were used to determine the utilization of higher altitudes for subsistence strategies. Varying ratios amongst the group indicate not only certain use of the mountain ecosystem but also probable events of immigration to the area from lower lying warmer regions, possibly related to work practices such as mining. The stable isotopes of carbon and nitrogen showed substantial variability in protein intake according to nitrogen ratios and reliance upon C3 plants and C3 herbivores. Demographic documentation which shows a 2:1 sex ratio in favor of males, suggests that this skeletal series might represent a work force settled in the area. Bioarchaeological examinations indicate that the population was physically active, healthy and superbly adapted to the rigors of the Alpine environment.

The cellular slime mold Dictyostelium discoideum contains a total number of 13 kinesins. Two of them, kinesins Kif3 and Kif5, represent the Kinesin-1 family (formerly conventional kinesins) in D. discoideum whose members are dimeric molecular motors that move as single molecules micrometer-long distances on microtubules by using the energy from ATP hydrolysis. In this study constructs of both kinesins were expressed in E. coli, purified, and tested in biochemical assays. A GFP-fusion protein of Kif3 revealed an overall cytoplasmic localization with accumulations that could not be assigned to a specific cellular structure or vesicle. Using immunofluorescence staining an association with the endoplasmic reticulum or mitochondria was ruled out. Full-length and truncated Kif3 motors were active in gliding and ATPase assays. They showed a strong dependence on ionic strength. Like the full-length motor, the truncated Kif3-592 motor (amino acids 1-592; comprising motor domain, neck and partial stalk) reached its maximum speed of around 2.0 µms-1 at a potassium acetate concentration of 200 mM. The velocity from the microtubule-gliding assay was confirmed using kinesin labeled with Q-Dots. The shortened Kif3-342 motor (amino acids 1-342; comprising motor domain, partial neck) and the Kif3-592 construct showed an ATP turnover comparable to the fungal Nkin motor. Kif3-full-length displayed less activity in ATPase assays, possibly resulting from tail-motor inhibition. Results from the duty ratio calculations and single-molecule gliding assays indicated that Kif3 is a processive enzyme. Overall, D. discoideum’s Kif3 revealed a closer similarity to fungal rather than animal kinesins. The truncated motor Kif5-476 (amino acids 1-476; comprising motor domain, neck and partial stalk) turned out to bind microtubules, but was immotile in gliding assays. Still, this construct, as well as the shorter variant Kif5-353 (amino acids 1-353; comprising motor domain), showed activity in ATPase assays, indicating that a significant portion of the isolated protein was active. Unlike Kif3, the Kif5 motor protein was sensitive to potassium-acetate concentrations exceeding 25 mM and lost its capability to bind microtubules with increasing ionic strength. D. discoideum knockout strains showed no apparent phenotype under standard culture conditions or during development. Merely a reduced growth speed was observed in submerged cultures of kif5-null cells. A GFP-Kif5 construct showed a strong accumulation in the cell’s peripheries, in agreement with previous reports. Microtubule recovery experiments after nocodazole treatment did not reveal any significant differences between wild type and knockout strains, arguing against an influence of Kif5 on microtubule organization.

Aspergillus fumigatus ist ein opportunistischer Krankheitserreger, der ubiquitär in der Umwelt vorhanden ist. Die schwerwiegende Krankheit, die er verursacht, ist die invasive Aspergillose, welche nur bei immungeschwächten Patienten auftritt und bis heute nur sehr schwierig zu diagnostizieren und zu heilen ist. Die Sporen von A. fumigatus können aufgrund ihrer geringen Größe bis in die Alveolen der Lunge gelangen. Dort bilden Makrophagen die erste Verteidigungslinie, indem sie die Sporen phagozytieren. Die Phagozytose ist Bestandteil der angeborenen Immunantwort und ein initialer Schritt bei der Bekämpfung von A. fumigatus-Sporen durch Makrophagen. Das Verstehen dieses Prozesses gewinnt durch die stetige Zunahme der Patienten mit invasiver Aspergillose immer größere Bedeutung und ist Gegenstand intensivster Forschung. Im Rahmen dieser Dissertation wurden die Interaktionen von murinen und humanen Makrophagen mit A. fumigatus-Sporen untersucht. Die Fragestellung wurde aus zwei unterschiedlichen Perspektiven betrachtet. Zum einen wurde die Oberfläche der A. fumigatus-Sporen analysiert; zum anderen wurden die Interaktionen von A. fumigatus mit phagozytierenden Zellen erforscht. Um die Phagozytose von A. fumigatus-Sporen in murinen und humanen Zellen genauer charakterisieren zu können, wurde in dieser Arbeit der so genannte „Biotin-Calcofluor Staining Assay“ (BCS-Assay) entwickelt. Mit Hilfe dieser Methode war es möglich, zwischen extra- und intrazellulären Sporen zu unterscheiden, ohne auf die Anwesenheit von Antikörpern angewiesen zu sein. Mit Hilfe von diversen Inhibitoren konnte der Mechanismus der Phagozytose genauer untersucht werden. So konnte gezeigt werden, dass die Aufnahme von A. fumigatus-Sporen ein Aktin-abhängiger Prozess ist und dass Makrophagen für die Phagozytose die Aktivierung der Phosphoinositid 3 Phosphat-Kinasen und von Tyrosin-Kinasen benötigen, insbesondere diejenigen der scr Familie. Butanedion Monoxim, ein Inhibitor der Myosinmotor-Aktivität, blockierte ebenfalls effizient die Sporenaufnahme. Die weiteren Untersuchungen der Phagozytoseprozesse von A. fumigatus-Sporen erfolgten u.a. mit Hilfe von Fluoreszenz- und elektronenmikroskopischer Aufnahmen. In der Immunfluoreszenz ließen sich Tyrosin-phosphorylierte Proteine in den Aufnahmestrukturen detektieren, und elektronenmikroskopische Aufnahmen infizierter Makrophagen zeigten so gennante „Ruffle“-Strukturen. Diese Tatsache deutet darauf hin, dass A. fumigatus-Sporen durch einen „Trigger“-ähnlichen Mechanismus aufgenommen werden. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurden die Rezeptoren der Phagozytose von A. fumigatus-Sporen charakterisiert. Die Ergebnisse von Meier und ihren Kollegen zeigten bereits, dass die Erkennung von A. fumigatus durch Makrophagen mittels Toll-like Rezeptor 2 und TLR4 erfolgt. In der vorliegenden Arbeit wurde nun auch der Frage nachgegangen, welche Rolle TLR2 und TLR4 bei der Phagozytose von A. fumigatus-Sporen spielen. Hierzu wurden aus den Mausstämmen C3H/HeN (WT), C3H/HeJ (TLR4-), C3H/HeN TLR2-/- (TLR2-) und C3H/HeJ TLR2-/- (TLR2-/4-) murine Peritonealmakrophagen mittels Peritoneallavage entnommen, mit A. fumigatus-Sporen infiziert und mit Hilfe des BCS-Assays ausgewertet. Es konnte gezeigt werden, dass Toll-like Rezeptor 2 und nicht Toll-like Rezeptor 4 für eine effiziente Phagozytose benötigt wird. Dieses Ergebnis ließ sich wiederum mit Hilfe eines anti TLR2-Antikörpers bestätigen, da dieser auch die Phagozytose von A. fumigatus-Sporen, aber nicht von Kontrollbeads blockieren konnte. Des Weiteren wurde untersucht, ob der von Brown und seinen Mitarbeitern entdeckte Dectin-1 Rezeptor ein potentieller Phagozytoserezeptor von A. fumigatus-Sporen ist (Brown et al., 2001). Es konnte gezeigt werden, dass Laminarin, ein lösliches ß 1-3 Glucan, die Phagozytose von A. fumigatus-Sporen durch Makrophagen blockierte. Außerdem ließ sich mit einem anti-Dectin-1 Antikörper die Phagozytose von A. fumigatus-Sporen in Makrophagen hemmen. Zudem ließ sich Dectin-1 mit diesem Antikörper in infizierten Makrophagen in der Immunfluoreszenz detektieren. Mit einem weiteren Antikörper konnte beta-1-3 Glucan, ein wichtiger Bestandteil der pilzlichen Zellwand, auf ruhenden Sporen detektiert werden. Es zeigte sich, dass die Menge an  1-3 Glucan eine wichtige Rolle bei der Eliminierung von A. fumigatus-Sporen spielt. Vergleiche zwischen ruhenden und angeschwollenen Sporen zeigten, dass angeschwollene Sporen, welche größere Mengen an ß 1-3 Glucan auf ihrer Oberfläche besitzen, effizienter phagozytiert werden können. Auch die A. fumigatus pksP-Mutante, welche mehr  1-3 Glucan auf ihrer Oberfläche besaß, wurde effizienter phagozytiert. Betrachtet man die intrazelluläre Signaltransduktionskaskade, so deuten die Daten darauf hin, dass die Dectin-1-gesteuerte Phagozytose von A. fumigatus-Sporen abhängig von der Syk-Kinase verläuft. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass Dectin-1 und TLR2 für eine effiziente Phagozytose von A. fumigatus-Sporen benötigt werden. Die Ergebnisse legen allerdings nahe, dass außer Dectin-1 und TLR 2 noch weitere Rezeptoren bei der Phagozytose von A. fumigatus-Sporen beteiligt sind. Ein genaues Verständnis der bei der Phagozytose ablaufenden Erkennungsprozesse und der nachgeschalteten Signaltransduktionskaskaden könnte in Zukunft ausgenutzt werden, um die Effiziens der Phagozytose auch in immungeschwächten Patienten zu erhöhen und sie so zu schützen.

The present work focused on the role of the cannabinoid receptor type 1 (CB1) in synaptic plasticity, memory and emotionality in mice. CB1 is abundantly expressed in the central nervous system and is mainly (if not exclusively) located on GABAergic and glutamatergic nerve cells. CB1 is a G-protein coupled receptor which is essentially inhibiting transmitter release from presynaptic GABAergic or glutamatergic nerve terminals. To differentiate between the physiological significance of CB1 expressed on glutamatergic and GABAergic nerve terminals, the studies included work with three different CB1-deficient mouse lines: A conventional knock-out mouse line (total-CB1- ko mice) with a deficiency of CB1 in the entire brain and two conditional knock-out mouse lines using the Cre/lox P recombination system, and leading to cell type specific deficiency of CB1 on GABAergic neurons (GABA-CB1-ko mice) or glutamatergic neurons (Glu-CB1-ko mice). As a common model for alterations in synaptic plasticity and hippocampus-dependent memory, we studied long-term potentiation in the hippocampus at first. The hippocampus is an essential brain structure being involved in spatial and episodic-like memory. We showed that there is an increase of hippocampal LTP in vivo at the perforant path-dentate gyrus granule cell synapse in total-CB1-ko mice, but failed to detect any difference in LTP levels for GABA-CB1-ko and Glu-CB1-ko mice. Also, short-term plasticity using a paired-pulse stimulation protocol is unchanged in the three mouse lines. Eventually, augmented theta rhythm that is believed to underlie enhanced cognitive abilities could not be found in total-CB1-ko mice. Our hypothesis of memory improvement in CB1-deficient mouse lines could not be verified in three tests for memory that are based on a spontaneous preference for novelty: The social recognition test, the object recognition test and the open field habituation test. We consequently tested the mice in two memory tasks that rely on an aversive test situation. In the water maze spatial discrimination task, again no differences could be assessed for acquisition of the task in total-CB1-ko and Glu-CB1-ko mice. Curiously, Glu-CB1-ko mice demonstrate more flexible behaviour in reversal learning indicating that CB1 on glutamatergic neurons may lead to perseverant and persistent behaviour. Eventually, we could show for the first time that there is a differential contribution of CB1 on either GABAergic neurons or glutamatergic neurons in the background contextual fear conditioning task. Here, mice were tested in the shock context and in a different context containing the grid floor as a similar aspect to the shock context, called grid context. GABA-CB1-ko mice reveal increased fearful behaviour specifically in the grid context. This might indicate an increased context generalisation and/or a feature learning strategy in GABA-CB1-ko mice. In contrast, Glu-CB1-ko mice display increased fearful behaviour specifically for the shock context, indicating a conjunctive learning strategy. Total-CB1-ko mice showed an increased fear response in both contexts, representing a mixed phenotype of Glu-CB1-ko and GABA-CB1-ko mice. Another novel finding confirming a large body of evidence is the fact that total-CB1-ko and Glu-CB1-ko mice manifest a deficit of extinction for the conditioned tone, providing first evidence that CB1 on glutamatergic neurons is essential for short-term extinction of auditory-cued fear memory. Any changes in memory performance might be obscured by altered emotionality in the knockout mouse lines. In classical tests for anxiety such as the elevated plusmaze and the light/dark box, we found a tendency of increased anxiety in total-CB1- ko and Glu-CB1-ko mice and a tendency of a decrease of anxiety in GABA-CB1-komice at most. Strikingly, we were able to show that CB1-ko and Glu-CB1-ko mice, in contrast to GABA-CB1-ko, avoid the open arms of the elevated plus-maze more than wildtype mice on a second exposure to the maze indicating an increased one-trial sensitisation. Furthermore remarkably, CB1-ko and Glu-CB1-ko mice showed increased anxiety-related behaviour whereas GABA-CB1-ko mice revealed an unchanged or anxiolytic phenotype in three different tests of emotionality: The open field test, the novel object exploration test and the novel juvenile exploration test. These tests were carried out under low and high light conditions. Here, as opposed to the elevated plus-maze and the light/dark box, the animals cannot retract from an aversive situation that is bright light in the testing environment which may cause sufficient activation of the endocannabinoid system thus leading to a detectable and profound phenotype in the animals. Interestingly, altered emotionality seems to depend on the averseness of the test situation, as CB1-ko and Glu-CB1-ko animals do not or only mildly differ from their wildtype littermates under lowly aversive conditions but show increased anxiety under highly aversive conditions in the aforementioned tests. This strongly suggests that the endocannabinoid system might dampen states of anxiety in highly aversive and stressful environments. More precisely, CB1 on GABAergic neurons rather leads to an anxiogenic effect, whereas CB1 on glutamatergic neurons prominently leads to an anxiolytic phenotype which we refer to as “the Yin and the Yang effect” of CB1 in emotionality. Altogether, our study illustrates the value of conditional mouse mutants for which celltype specific ablation of a gene of interest exist in order to understand the role of CB1 in synaptic plasticity, memory and emotionality. Our findings add another level of complexity to the picture of endocannabinoid action in fear and anxiety, which has to be considered if the endocannabinoid system is going to be exploited as a therapeutic target for the treatment of anxiety disorders.

The development of an organism from the fertilized zygote to a multicellular organism is a unidirectional process. It occurs in a spatially and temporally tightly controlled fashion. To understand how the genetic information is interpreted and how the cellular identity is inherited, are major challenges towards the understanding of developmental processes. Epigenetic marks like histone modifications, changes of the protein composition binding to DNA or the remodeling of nucleosomes have been shown to be important for the establishment of tissue-specific transcription profiles. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a method to investigate the association of proteins to specific genomic loci. In this study, I have established two protocols for ChIP analyses of Xenopus laevis embryos: the In Situ ChIP and the Douncer ChIP. In addition, I have generated several antibodies in collaboration with Dr. Elisabeth Kremmer (GSF München) for ChIP analyses, which were directed against the muscle determination factor MyoD and the Wnt/β-catenin signaling components Lef/Tcf transcription factors Lef1 and Tcf1. While optimizing of the ChIP protocols, I have analyzed successfully the binding of various transcription factors, chromatin remodeling enzymes and histone modifications on genomic loci of key developmental regulators. With the In Situ ChIP, I have shown that the serum response factor SRF interacts predominantly with the actively transcribed myoD gene. Together with other data, this result helps to define a specific role of SRF protein in the stable maintenance of myoD transcription, which is essential for proper muscle differentiation. With the Douncer ChIP protocol, a time course study has been performed in order to understand, when and which histone modification marks appear during muscle cell determination and differentiation on the myoD locus. The temporal and spatial distribution of the analyzed histone modification marks was correlated for the most part with the expected patterns. Furthermore, I have demonstrated that direct binding of the chromatin remodeler CHD4/Mi2-β to the 5' part of the sip1 gene in gastrula stage embryos. This interaction represents a crucial regulatory module, which determines the position along the animal-vegetal axis of the embryo, where the border between the mesodermal and neuroectodermal germ layer will be formed. These examples represent on of the very few successful ChIP applications for the endogenous proteins in young Xenopus embryos, and I hope that my protocols will turn out useful for future investigations of regulatory interactions in this vertebrate model organism.

Verschiedene Arbeiten der letzten Jahre konnten zeigen, dass sich in vielen, verschiedenen Zelltypen genreiches, transkriptionell aktives und früh replizierendes Chromatin bevorzugt im Inneren der Zellkerne aufhält, während das genarme, transkriptionell inaktive und spät replizierende Chromatin vorrangig an der Zellkernperipherie zu finden ist. Dennoch ist bislang noch nicht wirklich verstanden, welche der Chromatineigenschaften, wie die lokale Gendichte, die Expression oder die Replikationszeit, tatsächlich einen ausschlaggebenden Einfluss auf die räumliche Anordnung im Zellkern haben und welche dieser Eigenschaften nur aufgrund ihrer Korrelation mit diesen „dominanten“ Merkmalen eine spezifische Verteilung im Interphasekern aufweisen. Um dieses Problem zu untersuchen, stellten wir Pools aus BAC Klonen von HSA 11, 12, 18 und 19 für R-und G-Banden-spezifische Regionen, genreiche bzw. genarme Segmente sowie für hoch bzw. niedrig exprimierte Gene zusammen. Mit Hilfe der multicolor 3D-FISH Technik, Bildverarbeitung und computergestützter, quantitativer Auswertungen wurde die Lage dieser BAC Pools im Zellkern sowie ihre Anordnung bezüglich ihrer Chromosomenterritorien analysiert. Sowohl in den humanen Lymphozyten wie in den humanen Fibroblasten fanden wir den R-Banden Pool, den genreichen Pool sowie den Pool, der die hoch exprimierten Gene enthielt, weiter im Zellkerninneren als ihre jeweils korrespondierenden Pools (G-Banden, genarmer Pool, bzw. niedrig exprimierte Gene). Für jeden BAC Pool wurde mittels sorgfältiger Datenbankrecherche die mittlere lokale Gendichte, der mittlere GC Gehalt, die Replikationszeit sowie das mittlere Expressionsniveau bestimmt. Anschließend wurde eine Korrelationsanalyse dieser Parameter mit der berechneten mittleren, relativen Position der Pools im Zellkern durchgeführt. Die höchste Korrelation ergab sich für die Gendichte, während wir zeigen konnten, dass das Expressionsniveau, die Zuordnung zu einer R- oder G.Bande, sowie das Replikationstiming offensichtlich so gut wie keinen Einfluss auf die radiale Anordnung des Chromatins im Zellkern hat. Diese radiale Positionierung der verschiedenen Pools spiegelte sich auch in ihrer Anordnung bezüglich der Chromosomenterritorien wieder. Diese zeigen eine polare Anordnung in Bezug auf den Zellkern: Genreiche Segmente waren zum Mittelpunkt des Zellkerns hin orientiert, während die genarmen Segmente in der Hälfte des CTs zu finden waren, die sich in Richtung der Peripherie erstreckte. Etwas weniger deutlich ausgeprägt wurde diese Anordnung auch für die R-/G-Banden Pools sowie für die von der transkriptionellen Aktivität abhängigen Pools beobachtet. Dies spricht für eine deutliche strukturelle Transformation bei der Umwandlung der Metaphasenchromosomen zu den CTs der Interphase, die Territorien haben eine hohe Plastizität. Wir konnten bestätigen, dass die extrem genreiche und hoch transkriptionell aktive Region 11p15.5 oft weit aus ihrem CT herausragt. Ein ähnliches Verhalten konnte jedoch nicht für die ebenfalls sehr genreichen und transkriptionell aktiven Segmente des Chromosoms 12 beobachtet werden, was gegen die Annahme spricht, das dieses Phänomen des „looping outs“ ein typische Anordnung für Chromatinabschnitte mit solchen extremen Eigenschaften ist. Wir konnten ebenfalls keine Unterschiede für die Verteilung der BAC Pools der Chromosomen 12, 18 und 19 bezüglich der Oberfläche der CTs finden. R- und G-Banden, genreiche und genarme Segmente sowie hoch und niedrig exprimierte Gene scheinen gleichmäßig im gesamten Territorium verteilt zu sein. Die äußere, das CT einschließende Oberfläche scheint entgegen der Erwartung offensichtlich kein wichtiger Reaktionsort für besonders genreiche bzw. hoch exprimierte Sequenzen zu sein.

Chaperonins are highly allosteric double-ring ATPases that mediate cellular protein folding. ATP binding and hydrolysis control opening and closing of the central chaperonin chamber which transiently provides a protected environment for protein folding. During evolution, two distinct strategies to close the chaperonin chamber have emerged. Archaeal and eukaryotic chaperonins contain a built-in lid, whereas bacterial chaperonins use a ring-shaped cofactor as a detachable lid. The present work contributes to the current mechanistical understanding of group II chaperonins by unraveling key functions of the built-in lid. In addition to physically encapsulating the substrate, the lid-forming apical protrusions also play a key role in regulating chaperonin function and ensuring its activity as a “two-stroke” molecular machine. By comparative investigation of two distinct chaperonin systems, namely TRiC and Mm-Cpn, this study uncovers a remarkable degree of mechanistic and functional conservation between group II chaperonins from eukaryotic and archaeal origin, despite their evolutionary distance.

The filamentous cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120 (further referred to as Anabaena sp.) is a model system to study nitrogen fixation, cell differentiation, cell pattern formation and evolution of plastids. It is a multicellular photosynthetic microorganism consisting of two cell types, vegetative cells and nitrogen fixing heterocysts. This study focuses on the function and dynamics of the proteome of the Gram-negative outer membrane in Anabaena sp. with emphasis on cell differentiation and iron limitation. The newly developed methods for the membrane fractionation are presented, followed by analysis and comparison of the outer membrane proteomes of vegetative cells and heterocysts. The absence of major proteomic alterations in the outer membrane between two cell types, together with the presented data on GFP activity in mutant strains, experimentally support the previously proposed continuum of the outer membrane and the periplasm in Anabaena sp. filament. Also, somewhat different properties of the Anabaena sp. periplasm than in unicellular cyanobacteria are suggested. Furthermore, two common classes of the outer membrane -barrel proteins are analyzed closer. First, Alr2887 protein, as shown here, is a TolC homologue present in both cell types. Protein secretion through Alr2887 / TolC channel-tunnel is essential for the heterocysts maturation and the glycolipid layer formation. Furthermore, the inner membrane ABC transporter encoded by devBCA operon is proposed as component of the TolC efflux system in Anabaena sp. heterocysts. Second, phylogenetic analysis of the surprisingly abundant protein family of 24 TonB-dependent iron transporters in Anabaena sp. is presented. Five members of this family are detected in the outer membrane of vegetative cells under iron-repletion and two of them, All4026 and Alr0397, are explored closer. It is demonstrated that the function of these iron transporters is required for maintaining iron homeostasis of the filaments under iron-replete conditions. Consequently, their gene expression is constant and not enhanced by iron limitation. All4026 and Alr0397 have different specificity for siderophore substrates and in addition to iron transport, All4026 protein is capable of copper uptake and influence on copper homeostasis in Anabaena sp. as well.

Die vorliegende Arbeit vergleicht die detaillierten Strukturanalysen in der Retina von 4 Pavianarten mit den Untersuchungen in der Retina des Mantelpavians. Das Ziel dieser Arbeit ist es, tiefere Erkenntnisse über das Farbensehen des Mantelpavians zu erlangen. Die Anwendung moderner Messmethoden ist aus tierschutzrechtlichen Gründen bei den Pavianarten rar und nur in wenigen Fällen wurden in vitro-Untersuchungen durchgeführt. Die M- und L-Zapfendichte im Bereich 100 μm von der Fovea (79)(Krebs und Krebs, 1989), die S-Zapfendichte bei 1 Grad von der Fovea (84)(Marc und Sperling, 1977) und die Dichte der Ganglienzellen (80)(Fischer und Kirby, 1991) sind in der Retina des Grünen Pavians und Gelben Pavians gegenüber den Dichten in der menschlichen Retina leicht erhöht (51)(Curcio und Allen, 1990), (97)(Goodchild et al., 1996), (48)(Ahnelt, 1998). Die Zufallsverteilung bei den M- und L-Zapfen und die reguläre Verteilung bei den S-Zapfen haben der Gelbe Pavian und der Rote Pavian mit dem Menschen gemein (84)(Marc und Sperling, 1977), (83)(Martin et al., 2000). Der Grüne Pavian besitzt einen Visual streak (80)(Fischer und Kirby, 1991), der etwa die gleiche Form hat wie in der menschlichen Retina (51)(Curcio und Allen, 1990). Beim Gelben Pavian antworten die midget- und parasol- Ganglienzellen auf die erregenden KA-, AMPA-, NMDA-Rezeptoren und auf die hemmenden GABA-, GLY-Rezeptoren (85)(Zhou et al., 1994). Bis auf Untersuchungen an Müller-Zellen in der Mantelpavian-Retina, siehe Kap. 4.7.1 gibt es keine Veröffentlichung über das Sehsystem des Mantelpavians. In der Fovea wurden nur Zapfen und keine Stäbchen gezählt (87)(Reichenbach, 1999). Dieser Befund ist schlüssig mit der über alle Primaten getroffenen Aussage. Ein für elektrophysiologische Messungen nach der Methode FIS tauglicher portabler Versuchsaufbau wurde neu entwickelt. Messungen in medias res an 10 Mantelpavianen im Münchener Tierpark Hellabrunn belegen die hohe Qualität des Verfahrens. Die Methode FIS, die Entwicklung des Verfahrens, seine aufwendige Programmierung der Regelung und Auswertung werden in den Kap. 5, Kap. 7.2 und im Anhang Kap. 13 erläutert. Die Methode FIS erlaubt schnelle Messungen der ERG-Antworten mit hoher Auflösung im 10-9 m Bereich. Die daraus berechneten spektralen Empfindlichkeiten zeichnen sich durch gute Reproduzierbarkeit aus. Die spektralen Empfindlichkeiten können durch Summation von Absorptionskurven angenähert werden, wie ein Abgleich mit den nach der 96 9 Zusammenfassung / Summary Mikrospektralphotometrie gewonnenen Spektraldaten der Photopigmente beweist (82)(Bowmaker et al., 1991), siehe Kap. 7.2.3 und Kap. 7.3. Die Spektraldaten der Photopigmente der Mantelpaviane reihen sich in die Spektraldaten der Altweltaffen ein. Die Messungen der ERG-Antworten und die Berechnung der spektralen Empfindlichkeiten von 10 Mantelpavianen nach der Methode FIS bringen neue Ergebnisse über die Verteilung der S-, M- und L-Zapfen und über die Variation der L- zu M-Zapfenzahl bei den Pavianarten. Für die Mantelpavian-Retina beträgt die durchschnittliche prozentuale Verteilung der S-Zapfen ca. 5 Prozent, der M-Zapfen ca. 29 Prozent und der L-Zapfen ca. 66 Prozent, siehe Kap. 7.4. Die Werte zeigen eine ähnliche Verteilung der S-, M- und L-Zapfen wie sie in der menschlichen Retina beobachtet wird (18)(Sharpe et al. 1999b). In der Variation der L- zu M-Zapfenzahl zeichnet sich beim Mantelpavian eine Tendenz zu mehr L-Zapfen ab. Bei den Mantelpavian Weibchen wird eine Variation von 2,0:1 und bei den Mantelpavian- Männchen eine Variation von 2,4:1 bestimmt, siehe Kap. 7.5. Es gibt keinen großen Unterschied in der Variation der L- zu M-Zapfenzahl zwischen dem Geschlecht der Mantelpaviane. Bei den Altweltaffen existiert kein merklicher statistischer Unterschied im relativen Verhältnis der L- zu M-Zapfen-mRNA (58)(Deeb et al., 2000). Aus der Berechnung der spektralen Empfindlichkeiten bei den Mantelpavianen lassen sich eine klassische blau-gelb-Verschaltung und eine weitere Verschaltung ableiten, die aber näherer Prüfung bedarf. Das Ergebnis steht im Einklang mit der Zunahme des blau-gelb-Kanals gegenüber dem rot-grün-Kanal in der peripheren Retina (45)(Murray et al., 2006). In weiteren Forschungsvorhaben sollten bei den Pavianarten die Gegenfarbmechanismen der klassischen S-ON/(L+M)-OFF Zellen, SOFF/( L+M)-ON Zellen und weiterer Ganglienzelltypen untersucht werden, die zum Farbensehen beitragen könnten. Die neuen Ergebnisse über die Mantelpaviane geben weitere Impulse zu Untersuchungen offener Fragestellungen. Der Mantelpavian besitzt ein trichromatisches Farbensehen

Epstein-Barr Virus (EBV) is involved in several human malignancies via its latent gene products, which interact with cellular proteins and mimic discrete functions of cellular signalling pathways. Enigmatically, more than 90% of the human population carries this human tumour virus but virus-associated tumours are relatively rare. Most studies on EBV have been carried out in vitro and ex vivo on EBV-transformed human B cells or on human biopsies. Established in vivo model systems do not reflect the main aspects of EBV-associated diseases in humans. This limited tool set is the result of EBV’s inability to infect cells of non-human origin, which lack the surface receptor for EBV. My PhD work aimed at engineering a transgenic mouse, which carries a conditionally inactivated EBV genome. This study took advantage of the well-established techniques of mouse genetics in order to stably integrate the entire EBV genome into the murine genome. This approach would not only overcome the inability of EBV to infect animal cells but it would also permit to study the complete virus in an immunocompetent and easy-to-handle living organism. I undertook two routes to establish a transgenic mouse with the complete EBV genome inserted. One route was based on the site-specific integration into the hprt locus of murine embryonic stem cells. The other route engaged pronucleus microinjection of the EBV DNA into fertilized murine oocytes. In addition, the EBV genome was genetically manipulated prior to its introduction into murine cells. On the basis of the E.coli cloned EBV strain B95.8, I constructed a novel EBV mutant with unique features. This EBV targeting construct (InvTarg) allows conditional expression of EBV’s latent genes via a Cre/loxP system. Such approach prevents potentially adverse effects of EBV’s latent genes on embryonic development but allows their expression in almost any chosen cellular compartment for which specific Cre-expressing mice are available. The InvTarg recombinant EBV genome is 185 kb in size, based on a bacterial replicon, and therefore belonging to Bacterial Artificial Chromosomes (BACs). Two genetically modified and inversely oriented loxP sites were introduced in E.coli cells at the predetermined sites of the InvTarg, and the bracketed segment was inverted by Cre recombinase, disrupting transcription of almost all viral latent genes. In transgenic animals this inversion can be reverted and the latent genes can be re-activated at will by cross-breeding with Cre-expressing mouse (re-inversion). The ability of Cre to invert the big fragment was verified in infection experiments with human primary B cells. As expected, the ‘inverted’ EBV construct, such as InvTarg, failed to transform primary B cells, when the viral latent genes were not expressed. Despite sustained efforts, both gene delivery techniques did not lead to a transgenic mouse with the entire EBV genome inserted, but resulted in the integration of only subgenomic segments of the InvTarg recombinant EBV DNA. A number of technical problems were identified during this work, indicating more specific direction for further research. On the basis of the experience gained here, the project of an EBV transgenic mouse can be carried on. In addition, the InvTarg maxi-EBV conditional vector might be employed in other experimental conditions, like different cell types or distinct stages of cell differentiation, for studies on latent EBV genes.

Der Erfolg einer Gravidität hängt von einem komplexen Zusammenspiel molekularer Faktoren von Gameten, Embryonen und Feten mit ihrer maternalen Umgebung ab. Eine intakte embryo-maternale Kommunikation ist die Voraussetzung für die Entstehung und Aufrechterhaltung der Trächtigkeit. Von den molekularen Signalen, die an dieser Interaktion beteiligt sind, sind bis heute nur wenige bekannt. Für ein besseres Verständnis dieser molekularen Faktoren beim Rind wurden auf maternaler Seite embryo-induzierte Veränderungen des Endometriums am 18. Tag der Trächtigkeit auf Proteomebene untersucht. Diese so genannte Periimplantationsphase wurde anhand monozygoter Zwillinge analysiert. Jeweils einer der beiden Zwillinge erhielt einen Transfer zweier in vitro produzierter Blastozysten, der korrespondierende Zwilling bekam einen Scheintransfer und diente als nicht trächtige Kontrolle. Endometriumproben dreier Zwillingspaare wurden mit der zweidimensionalen Differenz-Gelelektrophorese (2D-DIGE) in Kombination mit der Minimalmarkierung untersucht. Um als biologisch relevant angesehen zu werden, mussten die Protein-Spots die folgenden strengen Kriterien erfüllen: Abundanzfaktor ≥ 2; Spots in allen Gelen vorhanden; Student’s t-Test p ≤ 0,01. Vier abundanzveränderte Protein-Spots konnten detektiert und mittels PMF und MALDI-TOF/TOF Analyse identifiziert werden: Die Isocitrate Dehydrogenase 1 (NADP+, soluble) spielt eine Rolle bei der Vorbereitung des Endometriums auf die Implantation. Acyl-CoA-binding Protein ist ein wichtiges Element des Steroidmetabolismus. Rho GDP Dissociation Inhibitor beta interagiert mit Proteinen der Rho-Familie, wobei Rho A an der Implantation beteiligt ist. 20 α Hydroxysteroid-Dehydrogenase ist am Progesteron-Metabolismus beteiligt. Die vier trächtigkeitsrelevanten Proteine lieferten interessante Kandidaten für weiterführende Untersuchungen. Die erfolgreiche Entstehung der Trächtigkeit basiert jedoch nicht nur auf der Vorbereitung der maternalen Umgebung, ebenso essentiell ist die präzise Entwicklung männlicher und weiblicher Gameten. Eine korrekte Eizellreifung stellt die Grundlage für eine erfolgreiche Befruchtung und die darauf folgende Embryonalentwicklung dar. Da in vivo eine Analyse der Oozytenmaturation nicht durchführbar ist, wurde auf der embryonalen Seite die In-vitro-Maturation (IVM) boviner Oozyten auf Proteomebene untersucht. Die IVM ist beim Rind eine routinemäßig durchgeführte Prozedur und der erste und limitierende Schritt für assistierte Reproduktionstechniken (ART) wie die In-vitro-Produktion (IVP) von Embryonen. Die Eizellreifung ist definiert als die Phase von der Vollendung der ersten Reifeteilung bis zur Metaphase der Meiose II. Oozyten wurden aus Ovarien präpariert und in vitro maturiert. Auf Proteomebene wurden ungereifte mit in vitro gereiften bovinen Oozyten verglichen. Aufgrund der Limitierung der Probenmenge (10 – 20 Oozyten pro Ovar = 0,9 – 1,8 µg Protein) wurde eine 2D-DIGE-basierte Analyse mit der ultra-sensitiven Sättigungsmarkierung durchgeführt. So konnten die quantitativen Analysen mit nur 0,5 µg Gesamtprotein pro 2D-Gel durchgeführt werden. Sechs unabhängige biologische Replikate von ungereiften bzw. gereiften Oozyten wurden analysiert. Die Auswertung der Analyse nach den oben genannten Kriterien ergab die Detektion von 38 abundanzveränderten Proteinen, von denen zehn mittels nano-LC-MS/MS Analyse eindeutig identifiziert werden konnten: Dihydrolipoamide S-Succinyltransferase und 6-Phosphogluconolactonase sind Enzyme des Energiemetabolismus. Translationally-controlled Tumor Protein könnte bei der Wiederaufnahme der Meiose eine Rolle spielen. Clusterin interagiert mit Komponenten des Komplementsystems und könnte eine Schutzfunktion vor Komplement-vermittelten Abbauprozessen haben. Peroxiredoxin-3 und Glutathion S-Transferase Mu5 sind in das Redox-System involviert. Durch den 2D-Gel-basierten Ansatz war es möglich, drei Formen der Glutathion S-Transferase zu detektieren. Elongation Factor 1 gamma und das Protein 14-3-3 ε sind in den Regulationsmechanismus des Maturation Promoting Factor (MPF) involviert. MPF ist ein Schlüsselenzym der Zellzykluskontrolle. Einige dieser abundanzveränderten Proteine, die während der IVM boviner Oozyten detektiert wurden, könnten wichtige Hinweise zur Optimierung bestehender in vitro Kultursysteme geben. Die abundanzveränderten Proteine, die in den hier durchgeführten 2D-basierten Analysen detektierten werden konnten, sind interessante Kandidaten für weitere, tiefer gehende Analysen im Zusammenhang mit der embryo-maternalen Kommunikation.

Das Humane-Herpesvirus-8 (HHV-8) gehört zu den Viren, die an der Entstehung von humanen Tumoren beteiligt sind. Die zugrunde liegenden onkogenen molekularen Mechanismen sind weitgehend unbekannt. Mit Hilfe der Arraytransfektion soll eine HHV-8-Expressionsbank auf die Induktion von mit HHV-8 assoziiert bekannten Transkriptionsfaktoren untersucht werden. Dabei wurde ein modulares Reportersystem entwickelt, das die Transkriptionsaktivierung von AP-1, NF?B und p53 in der Arraytransfektion erfassen kann. Durch das Reportersystem konnte mit Hilfe der Arraytransfektion die HHV-8-Thymidinkinase als den Transkriptionsfaktor p53 induzierend ermittelt werden. Die lytisch assoziierte HHV-8-Thymidinkinase konnte in zwei funktionell getrennte Domänen unterteilt werden. Einerseits in die bekannte C-terminale Domäne mit der biochemischen Kinasefunktion und andererseits in eine neu beschriebene N-terminale Domäne. Diese ca. 200 Aminosäuren lange N-terminale Proteindomäne war allein dafür verantwortlich, dass das endogene p53-Proteinlevel erhöht, p53 als Transkriptionsfaktor induziert und p53 an Serin-392 phosphoryliert wurde. Durch das anti-apoptotische HHV-8-Protein "latency-associated nuclear antigen" (LANA) 2 ließ sich die Transkriptionsaktivierung von p53 durch die HHV-8-Thymidinkinase inhibieren, aber nicht vollständig aufheben. Dadurch konnte gezeigt werden, dass die HHV-8-Thymidinkinase-Wirkung durch ein anderes HHV-8-Gen auf molekularer Ebene reguliert wird. Darüber hinaus war die N-terminale Domäne für die Veränderung der Zellmorphologie zu Zellinseln, Verminderung der Zellzahl und wahrscheinlich für die Depolarisation des mitochondrialen Potentials verantwortlich. Zusätzlich konnte in lytisch induzierten BCBL-1-Zellen gezeigt werden, dass das Transkriptionsverhalten der HHV-8-Thymidinkinase durch das viral-replikationsinhibierende Ganciclovir, in Abhängigkeit von der Inkubationsdauer, wahrscheinlich wenig oder gar nicht beeinflusst wird. Es ist daher zu vermuten, dass die HHV-8-Thymidinkinase das durch Ganciclovir nicht transkriptionsinhibierbare HHV-8-Gen ist, das durch die Umgehung viraler und zellulärer anti-apoptotischer molekularer Mechanismen den Zelltod in lytisch induzierten BCBL-1-Zellen auslösen kann. Diese Einflüsse einer Thymidinkinase sind für die humanen Gammaherpesviren einmalig und konnte für das homologe Gen des Epstein-Barr-Virus nicht beobachtet werden. Durch wahrscheinlich unterschiedliche subzelluläre Lokalisierungen wurde die Divergenz in der Funktion zusätzlich aufgezeigt. Die ermittelten Erkenntnisse dieser Arbeit können zur Entwicklung einer anti-viralen Therapie beitragen, die die lytische Vermehrung von HHV-8 begrenzt und somit die Entstehung von HHV-8 abhängigen Tumoren, wie das Kaposi-Sarkom, verhindern könnte. Zusätzlich gibt der Einfluss der HHV-8tk auf die Wirtszelle einen Einblick in die Interaktion des Virus mit dem Wirt und erlaubt wichtige Rückschlüsse auf das Zusammenspiel zellulärer und viraler molekularer Mechanismen für die Grundlagenforschung.

Das Epstein-Barr Virus (EBV) infiziert ruhende primäre humane B-Zellen und indu-ziert deren unbegrenzte Proliferation. Dieser Prozess der Wachstumstransformation stellt ein Modellsystem dar, das die pathogenen Mechanismen in der Tumorentsteh-ung widerspiegelt. Die Epstein-Barr Virus nukleären Antigene 3A und 3C (EBNA-3A und EBNA-3C) werden in Publikationen aus dem Zeitraum von 1993 bis 1996 als essentiell für den Prozess der B-Zellimmortalisierung eingestuft. In dieser Arbeit wurde mit einer neuen Technologie, der Maxi-EBV Methode, die Rolle der EBNA-3A und -3C Proteine erneut untersucht. Sowohl mit EBNA-3A negativen als auch mit EBNA-3C negativen Viren konnten erstmals Kulturen von infizierten B-Zellen etabliert werden. Während sich aus EBNA-3A negativen B-Zellkulturen Langzeitkulturen etablieren ließen, starben EBNA-3C negative B-Zellkulturen in der Regel nach 40-70 Tagen ab. Die Effizienz der B-Zellimmortalisierung von EBNA-3A negativen Viren war im Vergleich zur Wildtyp infizierten B-Zellen 24-fach, die der EBNA-3C negativen Viren 140-fach erniedrigt. Sowohl EBNA-3A negative, als auch EBNA-3C negative LCLs sind in ihrer Viabilität eingeschränkt, weisen jedoch unveränderte Zellteilungsraten auf. Die weitere Charakterisierung der EBNA-3A negativen LCLs ergab, dass diese eine Variante des viralen LMP1-Proteins exprimieren. Offen blieb, ob diese Variante das Auswachsen der EBNA-3A negativen B-Zellkulturen begünstigt hat. In der Folge wurden die EBNA-3A negativen LCLs zur Identifizierung von EBNA-3A-Zielgenen eingesetzt und zahlreiche aktivierte und reprimierte Kandidatengene identifiziert. Eines dieser Kandidatengene, Matrix-Metalloproteinase 7 (MMP-7), das durch EBNA-3A induziert wird, wurde im Rahmen dieser Arbeit validiert. Auch mit EBNA-3C negative Viren konnten wider Erwarten LCLs erzeugt werden, die für einen begrenzten Zeitraum in Kultur gehalten werden können. Aus dem Material eines Spenders war es auch möglich, EBNA-3C negative Langzeitkulturen zu etablieren. Die Mehrzahl der EBNA-3C negativen infizierten B-Zellkulturen durchlaufen jedoch zwischen Tag 40 und 70 eine Krise und sterben. Mit der Generierung eines konditionalen EBNA-3C Systems, durch Transfektion eines Tetrazyklin-regulierbaren EBNA-3C Expressionsvektors in frisch isolierte primäre B-Zellen und anschließender Infektion mit EBNA-3C negativen Viren, wurde ein neuer Weg geschaffen, um EBNA-3C-Funktionen zu untersuchen. Dieses 2-Schrittsystem kann nun im Prinzip für jede Virusmutante eingesetzt werden.

Many transcription factors integrate a variety of cellular stimuli to produce a transcriptional response. There is increasing evidence that the timing and kinetics of activation are crucial in determining specificity and strength of gene expression, however so far only few tools are available to address these questions in live cells and these have severe drawbacks, like very low signal strength, complicated handling, irreversibility and lack of good targeting properties.The Ca 2+- and cyclic adenosine monophosphat responsive element-binding protein (CREB) and the related ATF-1 and CREM are stimulus inducible transcription factors that link certain forms of cellular activity to changes in gene expression and are involved in differentiation, cancer, survival and neuronal plasticity. Using fluorescence resonance energy transfer (FRET) we here develop genetically encoded indicators that enable imaging activation of CREB family transcription factors due to phosphorylation of the critical serine 133 and subsequent recruitment of a coactivator in single live cells. The indicator for CREB activation due to phosphorylation (ICAP) consitsts of the kinase inducible domain (KID) of CREB fused together with the KIX of CREB binding protein (CBP) via a flexible linker, sandwiched between a cyan and a yellow variant of the green fluorescent protein. The specificity and reliability of ICAP as a measure for CREB activation was demonstrated first in the cuvette and then in the nucleus and mitochondria of HeLa cells. After that, we analyzed the properties of ICAP in primary hippocampal neurons, where we characterize different signaling pathways with distinct kinetics that lead to CREB activation. Furthermore, combining the imaging of CREB activation with calcium imaging we see a summation of CREB activation in neurons that can be achieved by appropriately timed depolarizing stimuli and occurs even when individual stimulations are separated by hours. Finally, sensors for the activation of ATF-1, CREM and the recruitment of P300, were introduced and preliminarily characterized. On the whole, these array of biosensors complement the toolbox for the investigation of the activation of the CREB family of transcription factors in living cells and organisms.

Jasmonate sind Phytohormone mit vielfältiger Wirkung in Entwicklung und Stressmanagement der Pflanzen. Über die Perzeption und Transduktion der Jasmonatsignale ist bisher kaum etwas bekannt. Unter Verwendung des synthetischen Jasmonat-Analogons 6-Azido-1-oxoindanoyl(14C)isoleucinmethylester (IndAz(14C)IleMe) als Radioligand wurde eine spezifische Bindestelle in Sojabohne (Glycine max) biochemisch charakterisiert, in der Erwartung, eine Bindestelle für Jasmonate zu beschreiben. Die IndAz(14C)IleMe-Bindung erwies sich als spezifisch, saturierbar und reversibel. Da es sich aber um eine niedrigaffine Bindestelle handelt und die Affinität verschiedener Jasmonate und synthetischer Indanoyl-Isoleucin-Konjugate nicht mit deren biologischer Aktivität in Sojabohne korreliert, dürfte es sich bei der IndAz(14C)IleMe-Bindestelle nicht um einen Jasmonatrezeptor handeln. Sowohl bei Jasmonaten als auch bei Indanoyl-Isoleucin-Konjugaten wurden Methylester gegenüber den entsprechenden freien Säuren bevorzugt gebunden. Ein Enzym, das den Liganden umsetzt, scheint nicht vorzuliegen, da die IndAz(14C)IleMe-Bindung kein pH-Optimum aufwies und keine Umsetzung des Liganden beobachtet wurde. Mit fortschreitendem Alter der Pflanze nahm die Bindungsaktivität zu. Die IndAz(14C)IleMe-Bindestelle kommt in verschiedenen höheren Pflanzenarten vor, war hauptsächlich in der Wurzel nachweisbar und wurde in der Zellwand lokalisiert. Da die Bindestelle weder mit Salzen noch mit Detergenzien extrahiert werden konnte, gegenüber Proteinase K, DTT, Periodat, Lipase, Cellulase, Hemicellulase, Pectinase und Pectolyase resistent und zu 50 % hitzestabil war, wird vermutet, dass ein in der Zellwand fest verankertes Protein vorliegt. Zu den intrazellulären Signalvermittlern von Pflanzen gehört Calcium, nicht nur im Cytosol, sondern auch im Zellkern. In transgenen Nicotiana tabacum BY-2-Zellen wurden mit Hilfe des Photoproteins Aequorin erstmals jasmonatinduzierte Änderungen der Calciumkonzentration in beiden Kompartimenten gezeigt. Auch ein Vertreter aus der Gruppe der Phytoprostane, Phytoprostan B1 Typ II, löste Calciumantworten in Cytosol und Zellkern aus. JA und OPDA induzierten unterschiedliche Calciumsignaturen, die sich jeweils aus einer cytosolischen Calciumantwort gefolgt von einem Calciumsignal im Zellkern zusammensetzten. Die Unterschiede in Form, Höhe und Kinetik der einzelnen Antworten lassen auf zwei verschiedene Signaltransduktionswege bei JA und OPDA schließen. MeJA war in beiden Kompartimenten inaktiv und demonstriert dadurch, dass MeJA nicht immer, wie häufig angenommen wird, wie JA wirkt. Durch das Isoleucin-Konjugat der JA (JA-Ile) wurde eine dritte Calciumsignatur ausgelöst, die sich von der JA-induzierten Calciumsignatur durch das Fehlen der JA-ähnlichen cytosolischen Calciumantwort unterscheidet. Dieser Befund lässt vermuten, dass die Unterscheidung von JA- und JA-Ile-Signalen möglicherweise auf Ebene des Calciums stattfindet. Eine Struktur-Aktivitätsanalyse mit Indanoyl-Isoleucin-Konjugaten bestätigte, dass die Konjugation mit Isoleucin zur Veränderung der Calciumsignatur führt. Die unkonjugierte 1-Oxoindan-4-carbonsäure (Ind) verhielt sich wie JA, das Konjugat Ind-Ile wie JA-Ile. Ferner wurde gezeigt, dass für die Induktion der Calciumantworten eine freie, negativ geladene Carboxylgruppe unerlässlich ist. Neben MeJA erwiesen sich JA-IleMe, Ind-IleMe und 3-(Nitro-methyl)-2-((Z)-pent-2-enyl)cyclopentanon als inaktiv. 6-substituierte Indanoyl-Isoleucin-Konjugate zeichnen sich durch verstärkte biologische Aktivität aus. Tatsächlich verlieh der Ethyl-Substituent dem IndEt-IleMe calciuminduzierende Aktivität im Zellkern. Bei den freien Säuren Ind-Ile und IndEt-Ile wurde aber keine Aktivitätssteigerung durch Substitution festgestellt. Die Untersuchung der Expression einiger JA-responsiver Gene zeigte, dass unter den Versuchsbedingungen, die die Induktion von Calciumantworten ermöglichten, keine jasmonatinduzierte Genexpression erfolgte. Sollten die beschriebenen Calciumsignale die Expression bestimmter Gene vermitteln, ist eine ausgewählte Gruppe von Genen zu erwarten, deren Expression eventuell einen besonderen physiologischen Zustand der Zellen erfordert.

EBV ist ätiologisch eng mit verschiedenen malignen Erkrankungen des Menschen verbunden Die meisten Erkenntnisse über die Funktionen viraler Proteine, die z. B. bei der B-Zell-Trans-formation eine Rolle spielen, stammen aus Zellkulturexperimenten, denen allerdings die Komponenten und die Komplexität eines lebenden Organismus fehlen, weswegen ein Tiermodell wünschenswert ist. Eine Möglichkeit nähere Informationen über die Machbarkeit eines Tiermodells zu bekommen, führt über die genetische Manipulation von embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) der Maus. Dazu wurde die genetische Information des Epstein-Barr Virus direkt in EBNA1-positive ES-Zellen der Maus einbracht und die Aufrechterhaltung des Gesamtgenoms als extrachromosomales Plasmid nachgewiesen werden. Die ES-Zellen wurden dann in vitro zu B-Zellen differenziert, um den transformierenden Phänotyp dieses Virus in murinen B-Zellen zu analysieren. Sowohl in den ES-Zellen als auch in den in vitro differenzierten B-Zellen wurde eine Expression der Gene LMP1 und LMP2A gefunden, nicht aber eine Expression des Gens EBNA2. Dieses Expressionsmuster ist charakteristisch für die Latenz II des Virus. Die viralen EBNA-Promotoren waren in beiden Zellarten aktiv, aber eine genaue Analyse ergab Hinweise auf Probleme bei der Transkription bzw. bei der mRNA-Prozessierung. Dies ist vermutlich der Grund für das Fehlen einer EBNA2-Genexpression.

The impact of histone lysine methylation as an essential epigenetic mechanismn for gene regulation has been demonstrated by numerous studies where it was functionally and structurally linked to euchromatin and heterochromatin.In this work the 3D architecture and spatial interrealtionships of different histone lysine methylation sites was investigated in various human cell types.

Fri, 22 Jun 2007 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/10253/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/10253/1/Cho_Won_Kyong.pdf Cho, Won Kyong ddc:570

Fri, 15 Jun 2007 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/10502/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/10502/1/Rastelli_Julia.pdf Rastelli, Julia ddc:570, ddc:500, Fakultät für Biologie

The development of the vascular network comprises tightly regulated processes, involving vasculogenesis and angiogenesis. The cells, which are mainly participating in these processes, are endothelial cells and vascular smooth muscle cells, the latter ones especially being important for the stability of blood vessels. Uncontrolled proliferation of VSMCs contributes crucially to the development of vascular disease, e.g. in the case of atherosclerosis. Two main initiator factors of these processes are Low Densitiy Lipoprotein (LDL) and Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB). For this reason, the VSMCs and the transcriptional regulation of their proliferation, in response to LDL and PDGF-BB, build an important target for therapeutical interventions. Sox17, a member of subgroup F of the Sox family proteins, was for the first time detected in vascular smooth muscle cells in different mouse tissues, like liver, brain, heart, lung, spleen and kidney in vivo and in human coronary artery smooth muscle cells in vitro. Moreover, a new possible protein complex, consisting of SOX17, KLF4 and EGR-1, was found in human coronary artery smooth muscle cells, as well as in 4 day old embryoid bodies. All members of this complex are induced by PDGF-BB, a growth factor which becomes activated in angiogenesis and pathological vascular conditions, stimulating the migration and proliferation of vascular SMCs. By this the complex might be involved in migration and proliferation of vascular SMCs, and moreover in pathological vascular conditions, like the progression of atherosclerosis. EGR-1 is known to be the key player in mediating the transcriptional responses to PDGF-BB and LDL and has already been implicated in progression of atherosclerosis. Because of the fact, that a complex, consisting of Sox17, Klf4 and Egr-1, was also observed to be formed in differentiating ES-cells (day 4), supports a broader role of this protein complex in the differentiation of cell-specific lineages during development, in particular vascular smooth muscle cells and endoderm lineages. The complex might have an inhibitory, as well as an activating role, as Sox17, Klf4, and Egr-1 are known to behave bifunctional. Besides, Sox17 seems to bind to -catenin during EB formation. At least this could be an indication for an involvement of the complex in modulating the wnt-signaling pathway during embryonic development.

Wed, 13 Jun 2007 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8057/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8057/1/Antonenka_Uladzimir.pdf Antonenka, Uladzimir ddc:500, ddc:570, Fakultät für

The natural design of the photosystems of plants and photosynthetic bacteria using chlorophylls (Chls) or bacteriochlorophylls (BChls) as photoreceptors are robust. The basic principles of the biological system of light-harvesting complex 2 (LH2) are studied with the use of natural and model sequences expressed in vivo in modified Rhodobacter (Rb) sphaeroides strains. Three aspects have been explored in the thesis: (1) BChl’s macrocycle-protein interactions, (2) BChl’s phytol-protein interactions underlying the structural and functional assembly of the pigment-protein complexes, and (3) LH2-lipid interactions and the role of these interactions in photosynthetic membrane morphogenesis. BChls’ macrocycle-protein interactions: Residues at the immediate BChl-B850/protein interface are found to have little effect on specifying the BChl-B850 array, and their light-harvesting activity in LH2. Nevertheless, these residues are important for the structural thermal stability. With the use of ‘rescue’ mutagenesis of the model BChl binding site, the hydrogen-bond between αSer -4 and the C131 keto carbonyl group of βBChl-B850 is shown to be a crucial motif for driving the assembly of model LH2 complex. Possibilities for residue modifications are limited in the β-subunits as compared to the α-subunits, which suggests that the two polypeptides have distinct roles in complex assembly. In the β-subunits, there are residues detected adjacent to the BChl-B850 site which are critical for the assembly of LH2. BChls’ phytol-protein interactions: Mutagenesis of residues closely interacting with the BChl-B850 phytol moiety result in the pronounced loss of BChl-B800 from LH2. Dephytylation of bound BChls within assembled LH2 to BChlides also resulted in the loss of BChl-B800 and destabilisation of LH2 structural assembly. Thus, the phytol chains were shown to be important for optimal pigment binding, especially for BChl-B800; which appears to be highly sensitive to the proper packing of the phytols. The pattern of phytol interactions with their surrounding environments are significantly different for α- and β-ligated (B)Chls. The phytols of β-ligated (B)Chls, as opposed to α-ligated (B)Chls, have ample and specific interactions with residues of the binding helix which may contribute to the tertiary interactions of helices. LH2-lipids interactions: Phospholipid determination of LH2 only expressing strains of Rb sphaeroides shows that the nonbilayer-forming phospholipid, phosphatidylethanolamine (PE) is present in elevated amounts in the intracytoplasmic membranes and in the immediate vicinity of the LH2 complex. In combination with βGlu -20 residue and the carotenoid headgroup at the N-terminus of the transmembrane β-helices is shown to influence the composition of lipids surrounding LH2. Specific local interactions between LH2 protein and lipids not only promote LH2 protein stability but appear to modulate the morphology of intracytoplasmic membranes. Based on these findings, the presence of LH2-lipid specificity is postulated. The approach of using model αβ-sequences with simplified pigment binding sites allows us to study the underlying factors involved in LH2 assembly and function. This gives rise to a better understanding of the interplay between BChl, apoproteins and membrane lipids in the assembly of a highly efficient light-harvesting complex in its native lipid-environment.

Fri, 1 Jun 2007 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/6974/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/6974/1/Arunyawat_Uraiwan.pdf Arunyawat, Uraiwan ddc:570, ddc:500, Fakultä

Wed, 23 May 2007 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/6930/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/6930/1/Zenner_Gerhardt.pdf Zenner, Gerhardt ddc:500, ddc:570, Fakul

Innerhalb des letzten Jahrhunderts intensiver Gedächtnisforschung ist es noch nicht gelungen, ein vollständiges und allgemein gültiges Modell für die Bildung von Langzeitgedächtnis zu entwickeln. Einige neuronale Moleküle, insbesondere Proteinkinasen und Transkriptionsfaktoren, scheinen hierbei in bestimmten Hirnregionen, deren Einbeziehung vom Lerntest abhängig ist, eine essentielle Bedeutung zu haben. Welche Rolle die lerninduzierte Neu-Expression von Genen (Transkription bzw. Translation) einnimmt, die als Teilprozesse der Konsolidierung postuliert werden, ist nach wie vor nicht eindeutig geklärt. Die Bedeutung dieser Teilprozesse wurde in dieser Arbeit bei Mäusen unter Verwendung von zwei hippokampusabhängigen Lerntests (auditorische trace-Konditionierung und kontextuelle Konditionierung) näher untersucht. Die drei hierbei im Vordergrund stehenden Aspekte waren die pharmakologische Validierung der Lerntests, der regionenspezifische Nachweis neuronaler Aktivierung und Untersuchungen zur Expression lernspezifischer Gene. Die pharmakologische Validierung der beiden Tests zeigte, dass durch lokale Gabe der translationshemmenden Substanz Anisomycin in den dorsalen Hippokampus zu verschiedenen Zeitpunkten vor und nach dem Lernereignis das Gedächtnis beeinträchtigt ist. Die proteinsyntheseabhängige Phase ist bei der kontextuellen Konditionierung spätestens nach einer Stunde abgeschlossen. Demgegenüber hatte die Hemmung der Transkription mit Amanitin auf keinen der beiden Tests Einfluss auf die Gedächtnisbildung. Die neuronale Aktivierung, die anhand der Induktion ausgewählter Immediate early genes (IEGs) im Hippokampus untersucht wurde, sollte indirekt Hinweise auf Genexpression liefern. Die IEGs waren im Gegensatz zur Literatur bei trace-Konditionierung schwach induziert (zif268 mRNA in CA1 und CA3) bzw. bei kontextueller Konditionierung nicht nachweisbar (c-Fos Protein in CA1). Um alternativ dazu die neuronale Aktivierung bezüglich einer erhöhten Proteinbiosyntheserate zu untersuchen, wurde eine Methode etabliert und validiert, die den Einbau der [35S]-markierten Aminosäuren Methionin und Cystein in neu synthetisierte Proteine regionenspezifisch darstellt (funktionelle Proteinbiosynthese). Hierbei zeigte sich in der Subregion CA1 des dorsalen Hippokampus eine erhöhte Proteinbiosyntheseaktivität nach kontextueller Konditionierung. Ein besonderer Vorteil der Methode besteht darin, dass mit Hilfe der Autoradiogramme funktionelle Netzwerke aufgezeigt werden können, indem Korrelationen in der Proteinbiosyntheseaktivität zwischen verschiedenen Hirnregionen auf deren funktionelle Einheit im Zusammenhang mit dem Lerntest verweisen. Unserer Erkenntnis nach ist das einer der ersten Befunde, womit bei Mäusen erfolgreich lernbedingte Veränderungen der Proteinbiosynthese unter Wahrung neuroanatomischer Auflösung dargestellt werden konnten. Die Untersuchungen zur lerninduzierten Expression spezifischer Gene erfolgten auf Ebene der Proteine, da bei der pharmakologischen Validierung der Lerntests nicht gezeigt werden konnte, dass Transkriptionsprozesse für die Gedächtnisbildung essentiell sind. Ausgehend von einem Standardprotokoll der zweidimensionalen Gelelektrophorese wurden unter Verwendung der radioaktiven Markierung von Proteinen mit [35S]-Methionin/Cystein Verbesserungen dieses Verfahrens hinsichtlich Sensitivität und signal-to-noise ratio erzielt. Mit dem verbesserten Verfahren konnte ein Protein gefunden werden, das nach kontextueller Konditionierung im Vergleich zu unbehandelten Tieren eine Veränderung der Nettoladung (Verschiebung des isoelektrischen Punktes) aufweist, was auf einen Unterschied in der posttranslationalen Modifikation schließen lässt. Quantitative Unterschiede wurden nicht gefunden. Dies ließe sich damit erklären, dass die Verfahren zu Proteinextraktion vor allem zytosolische Proteine berücksichtigen, membranständige Proteine jedoch weitgehend vernachlässigen. Zusammengefasst wurde im Rahmen dieser Arbeit ein Algorithmus etabliert, der sich auf vielfältige Art und Weise für Fragestellungen zur Charakterisierung lern- bzw. stressinduzierter Proteine unter Berücksichtigung neuroanatomischer Aspekte anwenden lässt. Berücksichtigt man, dass Anisomycin neben der Proteinsynthesehemmung auch andere zelluläre Prozesse beeinflusst, so fällt die vorliegende Arbeit kein abschließendes Urteil über die Rolle der Proteinbiosynthese bei hippokampusabhängigen Lernprozessen. Dies kann zu einem erheblichen Teil an der nichttopographischen Anatomie des Hippokampus liegen, so dass zukünftige Studien sich auf eng umrissene Hirnareale konzentrieren sollten.

AMF-exploiting myco-heterotrophic plants don't perform photosynthesis, but receive all essential nutrients, including carbon from arbuscular-mycorrhizal fungi. In scope of this thesis five new species of AMF-exploiting myco-heterotrophic plants were described. In another species the anatomy of the subterranean structures and the fungal colonisation pattern were investigated. The fungal hosts of eleven species from tropical Africa were identified by partial 18S rDNA sequence analysis.

Erkenntnisse zur funktionalen Zellkernarchitektur wurden bisher überwiegend an fixierten Zellen durch in situ Methoden erlangt. Durch Etablierung eines Lebendzell-Systems sollte überprüft werden, ob es möglich ist, ein einzelnes Transgen auf DNA-Ebene zu visualisieren und es bei seiner transkriptionellen Aktivierung zu beobachten. Das hier entwickelte „Gene Positioning System“ (GePS) nutzt das Lac-Operator/Lac-Repressor-GFP-System („Gene Tag“) als visualisierende Komponente, um das Indikatorgen auf DNA-Ebene sichtbar zu machen. Das Indikatorgen selbst basiert auf der induzierbaren Transkriptionseinheit von HIV-1, die spezifisch durch das virale Protein Tat aktiviert werden kann und die Transkription eines Reportergens (DsRed) kontrolliert. Im transient transfizierten Status konnte das Indikatorgen als Episom durch Bindung des „Gene Tags“ als punktförmiges Signal im Kern detektiert werden. In den etablierten und charakterisierten Zelllinien HeLa-Indi war dies durch Bindung des „Gene Tags“ an 64 Lac-Repressor-Bindungsstellen eines einzelnen Transgens nicht möglich. Die Etablierung der stabilen Zelllinien und die transiente Expression ermöglichten einen direkten Vergleich der Transkription von der integrierten und episomalen HIV-1 LTR. In beiden Fällen konnte eine spezifische Transkriptionsaktivierung durch Tat auf Protein- und RNA-Ebene beobachtet werden. Auch eine Tat-unabhängige Basisaktivität in Form von Volllänge-Transkripten konnte immer nachgewiesen werden, die in verschiedenen Zelllinien und dem episomalen Indikatorgen aber zu keiner nachweisbaren Proteinexpression führte. Die induzierte Expression des Indikatorgens des „GePS“ konnte darüber hinaus in wichtigen HIV-1 Zielzellen (CD4 positive Lymphozyten) gezeigt werden. Des Weiteren konnten Erkenntnisse über die Tat-induzierte, von der HIV-1 LTR ausgehenden Transkription und der Zusammenhang zum Spleißen gewonnen werden. Durch quantitative PCR wurde deutlich, dass sowohl im epsiomalen als auch integrierten Status erst durch die gesteigerte Transkription das Spleißen der Indikatorgen-RNA induziert wird, das Spleißen also co-transkriptionell stattfindet. Tat selbst spielt bei der Rekrutierung von Spleißfaktoren nur eine indirekte Rolle, da durch die transkriptionsdefiziente Mutante Tat(K41A) kein Spleißen initiiert wird. Durch verschiedene methodische Ansätze wurde versucht, die Frage der Chromatinzusammensetzung von nicht replizierenden Episomen in menschlichen Zellen zu beantworten. Weder durch eine Colokalisations-Untersuchung noch eine Chromatin IP konnte jedoch eine spezifische Assoziation des episomalen Indikatorgens mit dem Histon H3 nachgewiesen werden. Eine Bindung von Proteinen an die Episomen konnte am Beispiel von p50, einer Untereinheit des Transkriptionsfaktors NFκB, gezeigt werden. Für die produktive Replikation der Retroviren ist die Integration der proviralen DNA ins Genom der Wirtszelle nötig, jedoch konnte für HIV gezeigt werden, dass nicht integrierte zirkuläre HIV-DNA in sich nicht teilenden Zellen persistiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstützen die Vermutung, dass nicht integrierte retrovirale DNA transkribiert werden kann und dadurch die exprimierten Proteine Bedeutung für den Lebenszyklus von HIV und durch ihre Persistenz Einfluss auf die Wirtszellen haben können.

The development of dendrites leads to the establishment of cell-type specific morphology of dendritic trees that eventually determines the way in which synaptic information is processed within the nervous system. The aim of this study was to investigate dendritogenesis of Drosophila motion-sensitive Lobula Plate Tangential Cells (LPTCs) and to understand the role of cytoskeletal molecules in these developmental processes. I employed genetic techniques to obtain fluorescent labeling exclusively in the neurons of interest. In order to visualize the LPTCs confocal imaging was applied. Time point analysis allowed me to follow and describe the phases of LPTC differentiation in the intact Drosophila brain starting from the third instar larva throughout the pupal stages until adulthood. I determined the time when the initial growth of LPTC dendrites starts and showed it to be directional from the beginning. Additionally, I demonstrated that the phase of extensive dendritic growth and branching precedes reorganization processes that lead to establishment of the final architecture of LPTC dendritic trees. In parallel, I attempted to analyze the contribution of actin and tubulin in the shaping of the neurons. In these experiments actin-GFP localized to dendritic termini whereas tubulin-GFP was mainly observed in the primary dendritic branches. These data showed clear similarities between the cytoskeletal organization of LPTCs dendrites and vertebrate neurons. The discovery of the actin enrichment in dendritic termini made me conduct a set of experiments to test if these protrusions are the counterparts of vertebrate spines. I performed a thorough quantitative analysis of spine- like protrusions present on LPTC dendrites. Morphological features like the density and shape of the LPTC spine- like protrusions appeared to be comparable to hippocampal spines. Using immunohistochemical methods I demonstrated that LPTC spine-like protrusions are sites of synaptic contacts. The ultrastructural analysis supported the immunohistochemical data and showed that synaptic transmission takes place at the LPTC spine-like protrusions. Next, I tried to genetically modify these structures by generating LPTC mutant for genes which have vertebrate homologues known to alter spine morphology. I showed that dRac1 can modulate significantly the LPTC spine-like structure density. Finally, I tried to check if Drosophila LPTC spine-like structures are motile. To conclude, I showed an initial description of LPTC dendritogenesis and the subcellular localization of actin and tubulin in these neurons. The actin enriched spine-like structures detected on the LPTC dendrites are sites of synaptic contacts, thus resemble vertebrate spines.