Podcasts about tic110

Die überwiegende Mehrzahl der chloroplastidären Proteine ist im Nukleus kodiert und muss folglich posttranslational in das Organell importiert werden. Der Transport dieser Vorstufenproteine in die Chloroplasten wird von zwei multimeren Proteinkomplexen bewerkstelligt, den Toc- (Translocon at the outer envelope of chloroplasts) und Tic- (Translocon at the inner envelope of chloroplasts) Komplexen. In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Aspekte des Proteinimports analysiert: (i) die Evolution des Proteintransports, (ii) die Importwege von Proteinen der inneren Hüllmembran und (iii) die Struktur und Funktion des Kanalproteins Tic110. Zur Untersuchung der Evolution des Proteinimports wurde die Translokation verschiedener Vorstufenproteine in Chloroplasten höherer Pflanzen mit der in Chloroplasten des Mooses Physcomitrella patens verglichen. Dabei wurden Kinetik, Energiebedarf und Prozessierung analysiert. Dies ermöglicht Aussagen über die Entwicklung des Proteintransports, da bekannt ist, dass die Zusammensetzung der Toc- und Tic-Komplexe in der nicht-vaskulären Pflanze P. patens Unterschiede zu den Importapparaten höherer Pflanzen aufweist. Es konnte verdeutlicht werden, dass die untersuchten Vorstufenproteine dennoch das gleiche Importverhalten in den analysierten Modelsystemen zeigen, was darauf hinweist, dass die Importwege trotz der Unterschiede in den Translokationskomplexen konserviert sind. Im weiteren Verlauf dieser Arbeit wurde der Import von Proteinen der inneren Hüllmembran analysiert, für welche zwei unterschiedliche Wege beschrieben wurden: im „conservative-sorting“-Weg werden die Proteine über die Toc- und Tic-Komplexe in das Stroma transportiert, wo das Erkennungssignal von der stromalen Prozessierungspeptidase vom maturen Protein getrennt wird, bevor anschließend die Insertion der Proteine in die Membran erfolgt. Beim „stop-transfer“-Weg dagegen stagnieren die Proteine auf Höhe des Translokationskanals der inneren Hüllmembran und werden von dort lateral in die Membran inseriert. Eine systematische Charakterisierung der Importwege hydrophober Proteine der inneren Membran in Chloroplasten von Pisum sativum bezüglich Energiebedarf, Nutzung von Rezeptorkomponenten, sowie Bildung löslicher Intermediate konnte zeigen, dass die Insertion der untersuchten Vorstufenproteine in die innere Hüllmembran mittels des „stop-transfer“-Weges erfolgt. Des Weiteren wurde die Struktur und Funktion des Kanalproteins der inneren Chloroplastenmembran - Tic110 - näher untersucht, wobei vor allem die Verankerung von Tic110 in die Membran von Interesse war. Tic110 besitzt zwei N-terminale, hydrophobe Transmembranhelices, welche für die Verankerung in die Membran verantwort-lich sind, sowie vier C-terminale, amphipatische Transmembrandomänen. In dieser Arbeit konnte mittels Sequenzanalyse ein konservierter Bereich am Ende der ersten amphipatischen Helix identifiziert werden, welcher ebenfalls maßgeblich an der Membranverankerung beteiligt ist. Eine Mutation dieser Domäne führt zu einer Konformationsänderung des Proteins, woraufhin es nicht mehr in der Lage ist, stabil in Membranen zu inserieren. Die Topologie von Tic110 macht deutlich, dass große Teile des Proteins sowohl in den Intermembranraum, als auch in das Stroma hineinragen, wohingegen die amphipatischen Transmembrandomänen den Translokationskanal bilden. In dieser Arbeit konnte ein künstliches Importsystem mittels in Liposomen rekonstituiertem Tic110 etabliert werden, wodurch nicht nur gezeigt werden konnte, dass Tic110 in der Lage ist, Vorstufenproteine zu binden, sondern auch, dass eine Translokation der Proteine erfolgen kann. Die Daten weisen auf eine bedeutende Rolle von Tic110 als Proteinimportkanal der inneren Hüllmembran hin.

Most chloroplast proteins are encoded for in the nucleus and have to be transported into the organelle after translation in the cytoplasm. The TOC and TIC machineries (Translocon at the Outer/Inner envelope membrane of Chloroplasts) mediate the import of these proteins across the chloroplast membranes. The major aim of this work was to characterize two TIC translocon components: Tic110, the main protein translocation channel in the inner envelope, and Tic20, which was proposed to also form a protein import channel. After a detailed study of Tic110, a topological model could be established, demonstrating that the protein is inserted into the membrane with two hydrophobic and four amphipathic helices, placing residues both to the intermembrane space and to the stromal side. The presence of highly conserved cysteine residues and experiments demonstrating that Tic110 possess a redox active disulfide bridge, which could be reduced by stromal thioredoxins in vitro, indicated that Tic110 might be a possible target for thioredoxin regulation. To explore which cysteines are involved in disulfide bridge formation, mutations were generated for conserved cysteines in Tic110. As a result, Cys492 and Cys890 were identified as possible candidates. To define the functional role of disulfide bridge(s), components of the TIC motor complex were overexpressed and purified and their interaction was analysed with Tic110 via different approaches. The second part of this work focuses on the channel activity of Tic20. Although both Tic110 and Tic20 are clearly important for plant viability and preprotein translocation, there were neither electrophysiological nor biochemical data supporting that Tic20 can form a channel. After inserting the heterologously overexpressed and purified protein into liposomes, swelling assays and electrophysiological measurements provided the first experimental evidence for the channel activity of Tic20, being a cation selective channel with a pore size of about 8-14 Å. Therefore, it was concluded that the TIC translocon consists of at least two distinct translocation channels: Firstly, Tic110 forms the main translocation pore and therefore facilitates import of most of the chloroplast-targeted preproteins. Secondly, Tic20 might be specifically required for the translocation of some possibly essential proteins. To gain further insight into the structure and function of both proteins, preliminary tests were performed for crystallization in lipidic phases. The large sample of grown crystals observed under different conditions will presumably enable to crystallize these proteins and resolve their crystal structures in the future.

Most of the proteins localized in the chloroplast inner envelope membrane are synthesized on cytosolic ribosomes with a cleavable N-terminal chloroplast transit peptide. Most of them reach their final localization via the so called general import pathway consisting of the Toc complex at the chloroplast outer envelope membrane and the Tic complex at the chloroplast inner envelope membrane. Recent studies characterized precursor proteins which are targeted into the chloroplast inner envelope membrane by two different import pathways. The first route, called “conservative sorting”, was described for Tic40 and Tic110, which prior to inner envelope membrane insertion reach the stroma. The second route, called “stop-transfer” was proposed for ARC6, which is arrested at the level of the inner envelope membrane and probably laterally inserted into the lipid bilayer. Taking into consideration both import mechanisms we characterized import pathways of nine chloroplast inner envelope membrane proteins containing cleavable transit peptides and a different number of hydrophobic -helices. On the basis of the results observed in the stromal processing assays as well as results obtained in the pulse-chase experiments, within investigated precursor proteins two classes could be distinguished. The first class consisted of precursors processed once to their mature forms, i.e. containing a “single” transit peptide, whereas the second class consisted of precursors processed twice to the intermediate and the mature form, i.e. containing a bipartite transit peptide. In the processing of almost all precursor proteins stromal processing peptidase (SPP) was involved. Most probably at least one protein containing a bipartite transit peptide was also processed by another peptidase present not in the stromal compartment. We showed that despite of the differences in the number of hydrophobic transmembrane segments and different types of transit peptides, all investigated proteins had similar import properties. Their import was dependent on outer envelope membrane receptors and mediated by the general import pathway at least in the initial import phase. All investigated proteins required energy for import. 200 M ATP was sufficient for proteins used in this study to achieve the maximal import rate. Interestingly, neither intermediates nor mature proteins were extractable from the membrane by urea treatment and all proteins seemed not to possess a soluble import intermediate. Therefore we claim that all investigated precursor proteins were imported via the “stop-transfer” pathway. Moreover, most probably at least some components of the Tic complex were involved in the transport of precursor proteins at the level of the inner envelope membrane and the process was Ca2+/calmodulin regulated.

Import of a hybrid construct consisting of the transit sequence of SSU, the N-proximal part of mature Tic110 and the mature SSU into chloroplasts led to the appearance of a soluble stromal import intermediate and the proposal that Tic110 might use a re-export pathway from the stroma to the inner envelope membrane. For full length Tic110 no soluble intermediate has been observed yet. One of the goals of this work was to investigate the import pathway of Tic110 in more detail. In this research the soluble stromal intermediate of Tic110 was observed, its re-export to the membrane was followed, and finally, the intermediate was isolated and co-immunoprecipitated with the stromal chaperones Hsp93, Hsp70 and to a lesser extent Cpn60. The obtained results indicate that Tic110, as proposed, uses a re-export pathway (conservative sorting) during its import into the chloroplast inner envelope membrane. Tic110 also requires stromal chaperones for achieving its native conformation, prior to the insertion into the inner envelope membrane. The pathway for targeting to the intermembrane space of chloroplasts had not been intensively studied yet. For this reason, the analysis of two intermembrane space localized proteins was conducted: Tic22, a 22 kDa Tic-complex protein component, and MGD1, synthase of MGDG, the most abundant galactolipid in nature. Both proteins are nuclear-encoded and synthesized on cytosolic ribosomes with a cleavable N?terminal chloroplast targeting presequence. Tic22 was found to be associated with the outer face of the inner envelope membrane, as well as with the inner face of the outer envelope membrane, even though at a lower level. MGD1 was proposed to be associated with one of the envelopes by weak electrostatic interactions. Import properties of Tic22 and MGD1 and the localization of MGD1 were investigated in this research. Results presented in this thesis show that import of MGD1 is dependent on, and that of Tic22 is enhanced by, but not dependent on, addition of external ATP. Both preproteins need thermolysin sensitive components on the chloroplast surface for successful import. Chemical crosslinking and immunoprecipitation have demonstrated that Tic22 and MGD1 interact with the components of the Toc translocon of the chloroplast outer envelope during their translocation. Import competition experiments showed that both proteins use the Toc machinery of the general import pathway. Therefore, proteins targeted to the intermembrane space seem to use the same translocation mode across the outer envelope as stromal proteins.

Kernkodierte chloroplastidäre Proteine werden an cytosolischen Ribosomen synthetisiert und müssen posttranslational in Chloroplasten importiert werden. Die Translokation dieser Proteine erfolgt in einem hoch regulierten Prozess durch den Toc- und Tic-Komplex, die Proteintranslokationskomplexe in der äußeren bzw. inneren Hüllmembran der Chloroplasten. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass der Proteinimport in Chloroplasten in das Calcium-Netzwerk der Pflanzenzelle integriert ist. Hinweise darauf lieferte die Identifizierung einer bisher unbekannten Regulation des chloroplastidären Proteinimports durch Calcium/Calmodulin. Diese Regulation betrifft nur diejenigen Proteine, die eine abspaltbare N-terminale Präsequenz besitzen sowie Toc- und Tic-Komplex für ihre Translokation in Chloroplasten verwenden. Weitere Untersuchungen haben gezeigt, dass die Calcium/Calmodulin-Regulation des Proteinimprts auf Höhe des Tic-Komplexes einsetzt. Als Überträger dieser Regulation fungiert wahrscheinlich Tic32, eine Komponente des Tic-Komplexes, da die Affinitätschromatographie an Calmodulin-Agarose Tic32 als dominantes Calmodulin-Bindeprotein in der inneren Hüllmembran der Chloroplasten aufzeigte. Sowohl heterolog exprimiertes als auch natives Tic32 binden an Calmodullin nur in Anwesenheit von Calcium. Die Calmodulin-Bindungsdomäne in Tic32 liegt am proximalen C-Terminus zwischen Leu296 und Leu314. Tic32 kann ebenfalls NADPH binden, was eine Redoxregulation für dieses Protein nahelegt. Die Bindung von NADPH führt zur Unterbrechung der Interaktion von Tic110 mit Tic32, Tic62 und Tic44. Da sich NADPH und Calmodulin bei ihrer Bindung an Tic32 gegenseitig ausschließen, könnte Calmodulin die Bindung zwischen den Komponenten des Tic-Komplexes wiederherstellen. Zusammengenommen liefern diese Ergebnisse Hinweise darauf, dass sowohl die Redox- als auch die Calcium/Calmodulin-Regulation des Proteinimports in Chloroplasten auf Höhe des Tic-Komplexes stattfinden und dass die beiden Regulationen durch Tic32 vermittelt werden könnten.

Die Zusammensetzung und Arbeitsweise des Tic Komplexes ist noch ungeklärt. Tic110 ist die einzige von sieben Komponenten, die allgemein akzeptiert ist. Die Funktion und genaue Topologie des Proteins ist aber noch umstritten (Abb.3). Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Experimente zur Klärung der Topologie und Funktion des Proteins durchgeführt. Zum Einen wurde über ein CD-Spektrum eine alpha-helikale Sekundärstruktur für Tic110 gezeigt. Proteasebehandlung sowohl von Vesikeln der inneren Hüllmembran als auch von intakten Chloroplasten lassen vermuten, dass Bereiche von Tic110 in den Intermembranraum zeigen. Auf der anderen Seite weisen Affinitätschromatographieversuche mit dem C-Terminus von Tic110 darauf hin, dass das Protein im Stroma mit HSP93 und HSP70 interagiert. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass ein Teil des C-Terminus in den Intermembranraum ragt und ein anderer Teil ins Stroma. Ob im C-Terminus amphiphile Helices ausgebildet werden können, muss geklärt werden. Mengenmäßig ist Tic110 prominenter in der inneren chloroplastidären Hüllmembran vorhanden als Tic20, der andere „Kandidat“ für die Pore des Tic Komplexes. Im Vergleich zur Menge von Toc75, der Pore der äusseren Hüllmembran, ist Tic110 in ähnlichen Mengen vorhanden. Tic110 ist also ein geeigneter Kandidat, an der Porenbildung beteiligt zu sein. Desweiteren wurden Interaktionspartner vom N-Terminus von Tic110 gesucht. Dabei wurde ein 32 kDa Protein gefunden, dass große Homologien zu sogenannten „short-chain“ Dehydrogenasen aufweist. In der vorliegenden Arbeit wurde über Importversuche und Immunpräzipitationsexperimente eine Zugehörigkeit des Proteins zum Tic Komplex gezeigt. Die Komponente wurde Tic32 genannt. Tic32 ist eine funktionelle Dehydrogenase, deren Beteiligung während des Importprozesses noch zu klären bleibt. T-DNA Insertionslinien von Tic32 ergaben, dass das Protein für die für die Plastidenentwicklung essentiell ist. Da mit Tic32 neben Tic55 und Tic62 nun schon die dritte Tic Komponente gefunden wurde, die Redox Charakteristika aufweist, wurden verschiedene Importexperimente durchgeführt. Dafür wurden zwei chloroplastidäre FNR-Isologe und zwei chloroplastidäre Fd-Isologe in Chloroplasten importiert, deren Redoxzustand vor der Importreaktion mit verschiedenen Metaboliten oder Redoxkomponenten beeinflusst wurde. Sowohl nach Behandlung der Chloroplasten mit HAR, deamino-NAD, Oxalacetat und Kaliumhexacyanoferrat nimmt die Importeffizienz der FNR L2 Form stark ab. Auch für die Ferredoxin-Isologe ließ sich ein unterschiedliches Importverhalten feststellen, wenn auch nicht so eindeutig wie für die FNR-Isologe. Dieser Regulationsmechanismus muß nun in weiteren Experimenten genauer untersucht werden.