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Händewaschen schützt vor Viren; Kann man verlieren lernen?; Brauchen wir wirklich Milch?; Klimawandel bedroht Weinanbau; Impfung gegen Coronaviren; Chaperone: Anstandsdamen in der Zelle; Heuschreckenplage in Nordost-Afrika; Digital Leben - Datenschutz auch nach dem Tod; Moderation: Marija Bakker.

Es sind besondere Momente, wenn mit einem wissenschaftlichen Dogma gebrochen wird. Und so einen Moment erlebten Forscher, als sie feststellten: Proteine bringen sich nicht von alleine in Form, sie brauchen Chaperone. Michael Lange hat nachgefragt. Von Michael Lange.

In unseren Zellen findet das Leben statt. Was passiert da so alles, und wie kannst du dir das vorstellen.

Cronobacter sakazakii ist ein ubiquitäres Gram-negatives Stäbchenbakterium, das neben anderen Lebensmitteln vor allem in Milchpulver vorkommt und insbesondere bei Neonaten zu nekrotisierender Enterocolitis (NEC), Bakteriämie und Meningitis führen kann. Trotz der umfangreichen Forschung der letzten Jahre ist nach wie vor wenig über die Pathogenese von Cronobacter spp. sowie potentielle Virulenzfaktoren bekannt. Um neue Erkenntnisse über Pathogenitätsmechanismen von C. sakazakii zu erhalten, wurden in dieser Arbeit 28 Transposoninsertionsmutanten des klinischen Isolats C. sakazakii ES5 in drei unterschiedlichen Zelllinien auf ihre Fähigkeit an die eukaryotischen Zellen zu adhärieren, in sie einzudringen und in ihnen zu proliferieren, untersucht. Die inaktivierten Gene dieser Mutanten codieren für Proteine des Energiestoffwechsels, der Zellwand und des Biofilms, der Motilität der Bakterien und der Carotinoidbiosynthese. Angelehnt an den in vivo Infektionsweg von C. sakazakii - orale Infektion des Organismus, primäre lokale Infektion im Darm, systemische Infektion über die Invasion in Makrophagen und schließlich das Überschreiten der Blut-Hirn-Schranke und die Infektion des Gehirns - wurden für die Studie Caco-2 Darmepithelzellen, RAW-264.7 Makrophagen-Zellen sowie HBMEC Hirnendothelzellen ausgewählt. Beim Screening aller drei Zelllinien konnte festgestellt werden, dass die Flagellenstruktur betreffende Mutationen bei C. sakazakii ES5 zu fast 100%iger Attenuation der Invasion der Wirtszellen führen. Dies lässt auf die Bedeutung der Flagellen als Pathogenitätsfaktor schließen. Bedingt sein könnte die Attenuierung durch die verminderte Motilität der Bakterien, durch die instabile Interaktion von Flagellen mit den eukaryotischen Zellen selbst oder möglicherweise durch die fehlende Sekretion von Virulenzfaktoren durch das Typ-III-Flagellen-Sekretionssystem. Weiterführende Untersuchungen zu der Motilität der Transposoninsertionsmutanten zeigten, dass die Flagellenfunktion bei C. sakazakii ES5 durch Suppression reguliert zu sein scheint, da die bei C. sakazakii ES5 vorhandene Hemmung des Flagellen-vermittelten Swimmings im Weichagar z.B. unter Zugabe von steril filtriertem Überstand einer C. sakazakii ES5-Kultur wieder aufgehoben werden konnte. Des Weiteren fielen zwei Mutanten mit verminderter Serumresistenz durch reduzierte Virulenz auf, sowie eine Mutante, deren unterbrochenes Gen für einen putativen Reifungsfaktor der 30S-Untereinheit der Ribosomen codiert. Bei diesen drei Mutanten könnten die inaktivierten Gene für potentielle Virulenzfaktoren codieren und sollten näher untersucht werden. Transposonmutanten aus der orthologen Gruppe für Energiestoffwechsel zeigten ebenfalls eine verminderte Invasion. Diese Stämme hatten bei der biochemischen Charakterisierung der Metabolisierung definierter Kohlenstoffquellen bei den Aminosäuren und den Zwischenprodukten des Intermediärstoffwechsels ein vom Wildtyp ES5 abweichendes Metabolisierungsmuster. Die Unterbrechungen im Citratzyklus führten z.B. zur schwächeren Verstoffwechselung von L-Glutamat, dafür wurde L-Asparagin besser als Substrat verwertet. Somit konnte die Fähigkeit zur Anpassung durch Umstellung des Metabolismus bei C. sakazakii ES5 bestätigt werden. Weiterhin ergab der Vergleich des Kohlenstoff-Metabolismus von Cronobacter spp. mit dem von Salmonella enterica sv. Typhimurium einige interessante Unterschiede: C. sakazakii konnte im Gegensatz zu S. Typhimurium eine Vielzahl in der Umwelt vorkommender C-Quellen zur Energiegewinnung nutzen, was darauf schließen lässt, dass das ubiquitäre Bakterium Cronobacter spp. ursprünglich mit Pflanzen assoziiert war. Glucose-6-Phosphat, ein wichtiges Stoffwechselzwischenprodukt, das bei pathogenen Enterobacteriaceae neben Glucose und Mannose intrazellulär als die bevorzugte Kohlenstoffquelle gilt, wurde von C. sakazakii dagegen in vitro nicht metabolisiert. Es bleibt zu klären, ob C. sakazakii in der Lage ist, intrazellulär seinen Stoffwechsel umzustellen und Glucose-6-Phosphat als C-Quelle zu nutzen. C. sakazakii ist ein gelb pigmentiertes Bakterium und synthetisiert die Pigmente über Carotinoid-Biosynthese. In den Infektionsversuchen zeigte sich, dass pigmentlose Mutanten in der Invasion von RAW-264.7-Zellen attenuiert sind. In diesem Zusammenhang konnte auch festgestellt werden, dass bei der de novo Carotinoid-Synthese das CrtY-Protein (Lycopin-ß-Cyclase) die ß-Cyclisierung von Lycopin zu ß-Carotin ausführt. Nach Komplementierung der crtY-Mutante zeigte sich erneut die wildtypische gelbe Pigmentierung der Bakterienkolonien von C. sakazakii ES5crtY::Tn5/pUC19-crtY, anstatt der pinken Koloniefärbung der Mutante. Die Reduzierung der Invasion in HBMEC-Zellen um mehr als 30% konnte durch die Komplementation des crtY-Gens aufgehoben werden: die konstitutive Expression des Gens führte zu einem Invasionswert von 122% des Wildtyps. Im Rahmen dieser Arbeit konnten durch Infektionsexperimente in drei Zelllinien der Infektionsweg von C. sakazakii ES5 nachgestellt, neue potentielle Virulenz-assoziierte Faktoren identifiziert und die Fähigkeit der spezifischen Anpassung an das intrazelluläre Milieu als ein wichtiges Pathogenitätsmerkmal bestätigt werden.

Die Biogenese eukaryotischer Ribosomen ist ein streng kontrollierter, dynamischer Prozess, der ein komplexes räumliches und zeitliches Zusammenspiel vieler verschiedener Proteine erfordert. Dabei wird zunächst ribosomale DNA mit Hilfe der RNA-Polymerase I im Nukleolus transkribiert. Das daraus resultierende rRNA-Vorläufer-Molekül wird anschließend umfassend prozessiert und modifiziert. Gleichzeitig assemblieren ribosomale Proteine mit der reifenden rRNA, um präribosomale Partikel zu bilden, die für weitere Reifungsschritte ins Nukleoplasma und Cytoplasma transportiert werden. Zum Verständnis des ribosomalen Reifungsprozesses haben bislang vor allem genetische und biochemische Studien in der Bäckerhefe beigetragen. In Säugerzellen sind dagegen die Komponenten der Ribosomenbiogenese wenig charakterisiert, und insbesondere unser Wissen über die Regulationsmechanismen ist lückenhaft. Die posttranslationale Modifikation mit dem ubiquitinähnlichen SUMO-Protein reguliert eine Vielzahl wichtiger zellulärer Prozesse. SUMO-spezifische Isopeptidasen der SENP-Familie katalysieren die Abspaltung von SUMO von Zielproteinen und kontrollieren damit das Gleichgewicht zwischen Modifikation und Demodifikation. Vorarbeiten zu dieser Arbeit haben eine entscheidende Rolle für die SUMO-Isopeptidase SENP3 während der nukleolären Schritte der Ribosomenbiogenese gezeigt. Allerdings waren die Substrate von SENP3 bei diesem Prozess weitgehend unbekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein SENP3-assoziierter Proteinkomplex bestehend aus den Komponenten PELP1, TEX10 und WDR18 aufgereinigt. Als weitere Bindungspartner von PELP1 wurden außerdem MDN1 und LAS1L identifiziert. Durch RNAi-vermittelte Depletionsexperimente in Zellkultur konnte gezeigt werden, dass PELP1, TEX10 und WDR18, sowie die assoziierten Proteine MDN1 und LAS1L, ebenso wie SENP3 für die Reifung der 28S rRNA und den nukleolären Export der großen ribosomalen Untereinheit erforderlich sind. PELP1 und LAS1L wurden als SENP3-sensitive SUMOSubstrate charakterisiert. Darüberhinaus konnte gezeigt werden, dass das Gleichgewicht zwischen Sumoylierung und Desumoylierung die subnukleäre Lokalisierung des Komplexes kontrolliert. Sumoylierung führt zum Ausschluss aus dem Nukleolus, während Desumoylierung die nukleoläre Kompartimentierung fördert. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, dass der Komplex aus den Proteinen PELP1, TEX10 und WDR18 die Ribosomenbiogenese reguliert. Außerdem deuten sie darauf hin, dass dessen SUMO-abhängige subzelluläre Verteilung Ablauf und Koordination der Ribosomenreifung kontrolliert.

Die Biogenese von Ribosomen ist Voraussetzung für die Neusynthese von Proteinen und somit auch für Zellwachstum unabdingbar. In den Nukleoli der Zellen muss eine Vielzahl von Ribosomenbiogenese-Faktoren funktionell reguliert und koordiniert werden, damit reife 40S- und 60S- ribosomale Untereinheiten entstehen. Die vorliegende Arbeit geht der Frage nach, wie das nucleostemin (nst) Gen an dem zellulären Prozess der Ribosomenbiogenese partizipiert. Zur Beantwortung dieser Frage wurden mehrere Punkt- und Deletionsmutanten von nst kloniert, exprimiert und zuerst auf ihren intrazellulären Lokalisationsphänotyp hin überprüft. Dabei wurde festgestellt, dass die vorwiegend nukleoläre Lokalisation von NST durch den N-Terminus des Proteins, bestehend aus der basischen- und Coiled-Coil Domäne, vermittelt und durch zirkulär permutierte GTP-Bindemotive reguliert wird. Die Überexpression der nst Mutanten verursachte des Weiteren keine nukleoplasmatische Translokation des nukleolären Stressdetektorproteins Nucleophosmin (B23). Ein weiterer Überexpressionsphänotyp des nst Wildtyp-Gens ist eine signifikante Proliferationserhöhung in p53-positiven Zellen. Ein knock-down von nst resultiert in einer deutlichen Proliferationsinhibition von p53 positiven- als auch p53 negativen Zellen und einem p53 vermittelten G1/S-Phase Zellzyklusarrest. Auf Ebene der ribosomalen RNA induziert die temporäre Herabregulation von nst einen 32S-rRNA-Prozessierungsdefekt, welcher in verringerten de novo prozessierten 28S rRNA Mengen resultiert. In einem miRNA/siRNA basierten knock-down knock-in Experiment wurde der N-Terminus des Proteins zudem als minimale Funktionseinheit identifiziert: die Expression einer Mutante, bestehend aus der basischen und Coiled Coil Domäne, konnte den durch RNAi induzierten 32S-rRNA-Prozessierungsdefekt kompensieren. Der N-Terminus von NST sedimentiert zudem in einem Sucrose-Gradienten in Wildtyp-ähnlicher Manier, im Gegensatz zu einer NST Proteinvariante, welcher dieser Teil des Proteins fehlt. Eine Interaktion des NST-Proteins mit dem PeBoW-Komplex oder dem p53 Regulator Hdm-2 konnte nicht gezeigt werden. Diese Arbeit beschreibt somit NST als 32S rRNA-Prozessierungsfaktor und definiert den N-Terminus des Proteins als minimale Funktionseinheit während der Ribosomenbiogenese.

Während der Zellproliferation müssen Zellwachstum und Zellteilung koordiniert werden. Die Kopplung erfolgt in der Hefe durch einen Komplex aus Nop7p, Erb1p und Ytm1p, der sowohl an der Ribosomenbiogenese als auch an der Kontrolle der DNA-Replikation beteiligt ist. Die homologen Proteine Pes1, Bop1 und WDR12 werden in Säugern von Zielgenen des Transkriptionsfaktors c-Myc, einem zellulären Onkoprotein, kodiert. In dieser Arbeit wurde die Existenz eines evolutionär konservierten Komplexes aus Pes1, Bop1 und WDR12 (PeBoW-Komplex) in Säugern belegt. Dabei wurde gezeigt, dass Bop1 als zentrales Protein des Komplexes agiert und die Interaktion von Pes1 und WDR12 vermittelt. Die Integrität des Komplexes ist wesentlich für seine Funktion. Die Depletion einzelner Komponenten sowie die Überexpression des integrierenden Proteins Bop1 hemmen die Reifung der Vorläufer-rRNA der großen ribosomalen Untereinheit sowie die Proliferation der Zellen. Bop1-Überexpression führt zur Ausbildung von zwei Subkomplexen aus Bop1 und Pes1 bzw. Bop1 und WDR12. Während der Bop1/Pes1-Subkomplex als Teil der pre-Ribosomen im Nukleolus lokalisiert, wird WDR12 durch Bop1-Überexpression im Zytoplasma gehalten und fehlt im Nukleolus zur Ausbildung eines funktionellen PeBoW-Komplexes. Pes1 und WDR12 können unabhängig in den Nukleolus translozieren, während Bop1 dafür die Interaktion mit Pes1 benötigt. Untersuchungen zur Stabilität der einzelnen PeBoW-Komponenten zeigten, dass monomeres Bop1 extrem instabil ist, durch Inkorporation in den PeBoW-Komplex aber vor Abbau geschützt wird. Möglicherweise werden hierdurch interne PEST-Sequenzen in Bop1 maskiert. Die Menge an Bop1 ist somit abhängig von der Anwesenheit von Pes1 und WDR12. Die gegenseitige Abhängigkeit der Stabilität aller drei PeBoW-Komponenten konnte in weitergehenden Experimenten gezeigt werden. Schließlich wurde untersucht, ob der PeBoW-Komplex die Ribosomenbiogenese mit der DNA-Replikation über Interaktion mit dem ORC-Komplex, wie in der Hefe beschrieben, koordiniert. Mit Hilfe der BiFC-Methode konnte eine Interaktion von Pes1 mit Orc6, eines Faktors des ORC-Komplexes, gezeigt werden. Die koordinierende Funktion des PeBoW-Komplexes für Zellwachstum und Zellproliferation scheint von der Hefe bis zum Menschen stark konserviert zu sein.

Der größte Teil der chloroplastidäre Protein werden an zytosolischen Ribosomen synthetisiert und posttranslational in den Chloroplasten importiert. Einige dieser Proteine können in ihrem N-terminalen Transitpeptid von einer bislang unbekannten Proteinkinase phosphoryliert werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnten drei bislang nur bioinformatisch beschriebene Proteinkinasen identifiziert werden, welche spezifisch chloroplastidäre Vorstufenproteine in ihrem Transitpeptid phosphorylieren. Die Proteinkinase At2g17700 wurde aus Arabidopsis-thaliana-Rosettenblätter chromatographisch angereichert und massenspektroskopisch identifiziert. Die Proteinkinasen At4g35780 und At4g38470 wurden durch einen Abgleich mit dem Proteom von Arabidopsis thaliana identifiziert. Die Übereinstimmung auf Proteinebene zu At2g17700 beträgt zwischen 58-77%. Die cDNA der Enzyme wurde kloniert und die entsprechenden Proteine heterolog exprimiert. Alle drei rekombinanten Proteinkinasen phosphorylieren eine Reihe von chloroplastidären Vorstufenproteinen. Die Substratspezifität der drei Proteinkinasen zeigt deutliche Unterschiede bei den jeweiligen Vorstufenproteinen. Mitochondrielle Vorstufenproteine werden von den drei Proteinkinasen nicht phosphoryliert. Die Phosphorylierung von pSSU und pHcf136 durch die drei Proteinkinasen findet spezifisch in der N-terminalen Transitsequenz der Proteine statt. Die Proteinkinasen At2g17700 und At4g35780 weisen vergleichbare Transkriptmengen in allen Pflanzengeweben auf. Das Gen der Proteinkinase At4g38470 hat gegenüber den anderen beiden Enzymen ein durchschnittlich höheres mRNA Expressionsniveau und scheint vornehmlich in den Wurzel und den Wurzelanlagen exprimiert zu werden. Die Analyse von T-DNA-Insertionslinien für die Proteinkinasen At2g17700 und At4g35780 hat erste Hinweise erbracht, dass diese Enzyme auch für die Vorstufenprotein-Phosphorylierung in vivo verantwortlich sind. Die Phosphorylierung von pSSU durch Blattextrakt, gewonnen aus den jeweiligen Mutanten, ist um bis 60% reduziert. Aus Wildtyp-Pflanzen gewonnenes Blattextrakt lässt sich mit Antiserum gegen rekombinantes At2g17700 um 50% in seiner pSSU-Phosphorylierung depletieren. Bei den drei Proteinkinasen handelt es sich um eine Proteinfamilie, die vermutlich für die Vorstufenprotein-Phosphorylierung von Chloroplastenproteinen verantwortlich ist. Differenzen in der Substratspezifität und in den mRNA-Expressionslevel weisen auf unterschiedliche Aufgaben der drei Kinasen in der Zelle hin.

Im ersten Teil dieser Arbeit, der sich mit der Untersuchung der Bindung zytosolischer Chaperone am ribosomalen Polypeptid-Austrittstunnel beschäftigt, wurde die ribosomale Untereinheit Rpl25p, die in unmittelbarer Nähe des Polypeptid-Austrittstunnels liegt, als Bindestelle für zytosolische Chaperone, wie den naszente Ketten-assoziierten Komplex (NAC) identifiziert. Auch das Hsp70-Chaperon, Ssb1/2p, wurde in Assoziation mit Rpl25p gefunden. Diese Bindung wurde jedoch nicht näher untersucht. Bei der Etablierung einer Methode zur effizienten Anreicherung von Ribosomen aus Zellextrakten, mittels Präzipitation über einen Epitop-tag an einer ribosomalen Untereinheit, wurde beobachtet, dass ein 3HA-Epitop an Rpl25p, im Gegensatz zu einem 6HA-Epitop an der selben Stelle und an einer anderen ribosomalen Untereinheit, Rpl4ap, im entsprechenden Hefestamm Wachstums- und Translationsdefekte hervorruft. Co-Präzipitationsversuche ergaben, dass sowohl die Assoziation des generellen Hsp70-Chaperons Ssb1/2p, als auch von NAC mit Ribosomen im RPL25-3HA-Hintergrund stark reduziert ist und lieferten damit eine mögliche Erklärung für die beobachteten Defekte. Durch Two-Hybrid-Interaktionen und Co-Präzipitationsexperimente mit immobilisiertem MBP-Rpl25p und Zellextrakten, bzw. gereinigten Chaperonen, konnte gezeigt werden, dass der naszente Ketten-assoziierte Komplex NAC spezifisch, über den N-Terminus der -Untereinheit Egd1p, an Rpl25p bindet. Untersuchungen bezüglich der physiologischen Bedeutung der, nur in der Hefe vorhandenen, alternativen -Untereinheit Btt1p, zeigten, sowohl im Two-Hybrid, als auch in Bindeexperimenten mit Zellextrakten oder gereinigtem Btt1p, dass auch Btt1p direkt mit Rpl25p interagiert. Die starke Sequenzhomologie der N-Termini der -Untereinheiten, führte zu dem Schluss, dass auch Btt1p über seinen N-Terminus an Rpl25p bindet. Egd1p ist jedoch die vorwiegend im Komplex vorliegende -Untereinheit. In Abwesenheit von Egd1p wird die Expression von Btt1p stark erhöht, um das Fehlen dieser Untereinheit zu kompensieren. Sequenzhomologien zwischen Rpl25p und seinem Homolog Rl23p aus E. coli sollten als Ausganspunkt für die Identifizierung der Bindestelle zytosolischer Chaperone, wie NAC und Ssb1/2p an Rpl25p dienen. Versuche, Rpl25p funktionell durch Rl23p zu komplementieren, zeigten jedoch, dass weder Rl23p, noch ein chimäres Protein, in dem ein 50 Aminosäuren langer N terminaler Anhang aus Rpl25p an das E. coli-Protein fusioniert wurde, die Funktion von Rpl25p in der Hefe übernehmen können. Alternativ wurde ein konserviertes Aminosäuremotiv von Rpl25p mutiert, das im E. coli-Protein als Bindestelle für das Chaperon Triggerfaktor dient und dessen Veränderung die Bindung von Triggerfaktor an Rl23p stark reduziert. Die Veränderung dieses Motivs in Rpl25p bedingte zwar eine Reduktion der Bindung von Egd1p an Rpl25p, hatte jedoch keinen Effekt auf die Assoziation von Ssb1/2p mit Rpl25p. Daraus wurde gefolgert, dass nicht dieses Motiv allein für die Bindung zytosolischer Chaperone an Rpl25p verantwortlich ist. Dieser Befund führte außerdem zu der Spekulation, dass die Bindung von Egd1p und Ssb1/2p an Ribosomen durch verschiedene Bindestellen an Rpl25p vermittelt sein könnte. Im zweiten Teil der Arbeit, sollte der Beitrag, den einzelne Untereinheiten des Gim-Komplexes, GimC, zur Interaktion mit den Hauptsubstraten Aktin, α- und -Tubulin leisten untersucht werden. Dazu wurden für jede Untereinheit Verkürzungsmutanten hergestellt, denen die C- und N-terminalen hydrophoben Bereiche fehlen, die diese Wechselwirkung wahrscheinlich vermitteln. Im Gegensatz zu den zuvor untersuchten Deletionsmutanten, beeinträchtigen diese den Komplexaufbau nicht und erlauben daher direkte Rückschlüsse auf die Funktion der jeweiligen veränderten Untereinheit. Die Mutanten wurden zunächst einzeln bezüglich ihrer Sensitivität gegenüber LatrunculinA und Benomyl, Chemikalien, die das Aktin-, bzw. Tubulin-System der Zellen beeinflussen, in vivo charakterisiert. Des Weiteren wurde die Kinetik der Aktinfaltung bei ausgesuchten Mutanten (gim2NTCT, gim5NTCT) gemessen. Diese in vivo Experimente gaben erste Hinweise darauf, dass nicht alle GimC-Untereinheiten für die Bindung jedes Substrats gleich wichtig sind, sondern, in Abhängigkeit vom Substrat, unterschiedliche Rollen spielen. Zum Beispiel scheint die Interaktion mit den Tubulinen vor allem von Gim5p abhängig zu sein, während die anderen Untereinheiten dazu einen geringen (Gim1p, Gim2p, Gim3p) oder gar keinen (Gim4p, Gim6p) Beitrag leisten. Auch bei der Interaktion mit Aktin spielt Gim5p, neben Gim2p, eine tragende Rolle. In diesem Fall führt auch die Verkürzung von Gim3p oder Gim4p zu leichten Defekten, wogegen eine Veränderung von Gim1p oder Gim6p keine Auswirkungen hat. Um diese Ergebnisse durch weiterführende Experimente in vitro validieren zu können, wurde eine Strategie entwickelt, die es erlaubt, den Gim-Komplex und verschiedene Mischformen davon effizient in der Hefe zu exprimieren und daraus zu reinigen. Zu diesem Zweck wurde ein Plasmidsortiment geschaffen, das die starke Überproduktion des Wildtyp-Komplexes und von Mutanten, mit einer, oder bis zu sechs verkürzten Untereinheiten, unter Kontrolle des Kupfer-Promotors ermöglicht. Zur Reinigung dieser Komplexe aus der Hefe wurde ein bestehendes Protokoll abgewandelt und optimiert. Die Substrate, Aktin, α- und -Tubulin, wurden nach heterologer Expression in E. coli in Form von inclusion bodies gewonnen. Mit Hilfe dieser gereinigten Komponenten wurden der Wildtyp-Komplex und ausgewählte Mutanten, bei denen die α-Untereinheiten Gim2p oder Gim5p alleine oder Gim2p und Gim5p zusammen verkürzt waren, bezüglich ihrer Fähigkeit getestet, die Aggregation denaturierten Aktins in vitro zu verhindern. Es zeigte sich, dass die Verkürzung der Gim2p-Untereinheit die Aktinbindung nur wenig beeinträchtigt, wogegen eine Veränderung der Gim5p-Untereinheit eine starke Reduktion gegenüber dem Wildtyp bewirkt. Die entsprechende Doppelmutante ist schließlich nicht mehr in der Lage, die Aggregation denaturierten Aktins zu verhindern. Dieses Ergebnis konnte durch Translationsexperimente bestätigt werden, bei denen die verschiedenen Gim-Komplexe bezüglich ihrer Fähigkeit getestet wurden, de novo synthetisiertes Aktin in Lösung zu halten. Auch hier hatte die Veränderung von Gim2p nur einen geringen Effekt, während eine Verkürzung von Gim5p zu einer drastischen Anreicherung des neu-synthetisierten Aktins in der unlöslichen Proteinfraktion führte. In diesen Experimenten wurde erstmals auch der Beitrag dieser Untereinheiten zur Interaktion von GimC mit α-Tubulin untersucht. Hier zeigte sich, dass alleine die Verkürzung der Gim5p-Untereinheit ausreicht, um die Wechselwirkung von GimC mit diesem Substrat komplett zu verhindern.

Kernkodierte chloroplastidäre Proteine werden an cytosolischen Ribosomen synthetisiert und müssen posttranslational in Chloroplasten importiert werden. Die Translokation dieser Proteine erfolgt in einem hoch regulierten Prozess durch den Toc- und Tic-Komplex, die Proteintranslokationskomplexe in der äußeren bzw. inneren Hüllmembran der Chloroplasten. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass der Proteinimport in Chloroplasten in das Calcium-Netzwerk der Pflanzenzelle integriert ist. Hinweise darauf lieferte die Identifizierung einer bisher unbekannten Regulation des chloroplastidären Proteinimports durch Calcium/Calmodulin. Diese Regulation betrifft nur diejenigen Proteine, die eine abspaltbare N-terminale Präsequenz besitzen sowie Toc- und Tic-Komplex für ihre Translokation in Chloroplasten verwenden. Weitere Untersuchungen haben gezeigt, dass die Calcium/Calmodulin-Regulation des Proteinimprts auf Höhe des Tic-Komplexes einsetzt. Als Überträger dieser Regulation fungiert wahrscheinlich Tic32, eine Komponente des Tic-Komplexes, da die Affinitätschromatographie an Calmodulin-Agarose Tic32 als dominantes Calmodulin-Bindeprotein in der inneren Hüllmembran der Chloroplasten aufzeigte. Sowohl heterolog exprimiertes als auch natives Tic32 binden an Calmodullin nur in Anwesenheit von Calcium. Die Calmodulin-Bindungsdomäne in Tic32 liegt am proximalen C-Terminus zwischen Leu296 und Leu314. Tic32 kann ebenfalls NADPH binden, was eine Redoxregulation für dieses Protein nahelegt. Die Bindung von NADPH führt zur Unterbrechung der Interaktion von Tic110 mit Tic32, Tic62 und Tic44. Da sich NADPH und Calmodulin bei ihrer Bindung an Tic32 gegenseitig ausschließen, könnte Calmodulin die Bindung zwischen den Komponenten des Tic-Komplexes wiederherstellen. Zusammengenommen liefern diese Ergebnisse Hinweise darauf, dass sowohl die Redox- als auch die Calcium/Calmodulin-Regulation des Proteinimports in Chloroplasten auf Höhe des Tic-Komplexes stattfinden und dass die beiden Regulationen durch Tic32 vermittelt werden könnten.

Ein essenzieller Schritt in der Biogenese der Mitochondrien ist der Import von Vorstufenproteinen aus dem Zytosol in die mitochondrialen Subkompartimente. Viele Proteine inserieren hierbei von der Matrixseite aus in die Innenmembran. Das Innenmembranprotein Oxa1 spielt dabei eine sehr wichtige Rolle. Im Rahmen dieser Arbeit wurde Mba1 als eine weitere mitochondriale Komponente identifiziert, welche für die effiziente Proteininsertion benötigt wird. Wie Oxa1 interagiert auch Mba1 spezifisch sowohl mit mitochondrialen Translationsprodukten, als auch mit konservativ sortierten kernkodierten Proteinen während ihrer Insertion in die Innenmembran. Obwohl Oxa1 und Mba1 in ihrer Funktion und Substratspezifität überlappen, können beide unabhängig von einander agieren. Somit ist Mba1 Teil der mitochondrialen Proteinexportmaschinerie und die erste identifizierte Komponente eines Oxa1-unabhängigen Insertionsweges in die mitochondriale Innenmembran. Des Weiteren wurde das Protein Oxa1 in Bezug auf Architektur und Funktionsweise näher untersucht. Hierzu wurde das Oxa1-Protein aus N. crassa Mitochondrien isoliert und charakterisiert. Das Protein bildet einen homooligomeren Komplex, welcher in Dodecylmaltosid eine Größe von 200-300 kDa zeigt. Der gereinigte Komplex lässt sich in künstliche Lipidvesikel rekonstituieren und ist in der Lage die Modellproteine ATPase8 und Oxa143-200 zu inserieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde somit zum ersten Male gezeigt, dass Oxa1 alleine in der Lage ist, Proteine in Membranen zu inserieren. Das gereinigte Oxa1-Protein zeigt in elektrophysiologischen Messungen kanalbildende Aktivitäten. Die Kanalcharakteristika von Oxa1 unterscheiden sich abhängig von der Stimulation. Wird die Leitfähigkeit durch eine hohe Spannung (U > 70 mV) angeregt, erhält man ein Strommuster, welches ein sehr schnelles „Flackern“ zeigt. Werden hingegen isolierte mitochondriale Ribosomen bei niedriger Spannung (U = 20 mV) zugesetzt, zeigen sich langsam schaltende Poren. Somit scheint Oxa1 in zwei unterschiedlichen Modi zu arbeiten, je nachdem ob es posttranslational kernkodierte Proteine oder kotranslational mitochondrial kodierte Proteine in die Membran inseriert.

Sat, 1 Jan 1972 12:00:00 +0100 https://epub.ub.uni-muenchen.de/7185/1/7185.pdf Neupert, Walter; Michel, Rainer

Sat, 1 Jan 1972 12:00:00 +0100 https://epub.ub.uni-muenchen.de/7186/1/7186.pdf Michel, Rainer; Neupert, Walter