Podcasts about proteinimport

Tue, 7 May 2013 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/16016/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/16016/1/Eckers_Elisabeth.pdf Eckers, Elisabeth ddc:570, d

Die überwiegende Mehrzahl der chloroplastidären Proteine ist im Nukleus kodiert und muss folglich posttranslational in das Organell importiert werden. Der Transport dieser Vorstufenproteine in die Chloroplasten wird von zwei multimeren Proteinkomplexen bewerkstelligt, den Toc- (Translocon at the outer envelope of chloroplasts) und Tic- (Translocon at the inner envelope of chloroplasts) Komplexen. In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Aspekte des Proteinimports analysiert: (i) die Evolution des Proteintransports, (ii) die Importwege von Proteinen der inneren Hüllmembran und (iii) die Struktur und Funktion des Kanalproteins Tic110. Zur Untersuchung der Evolution des Proteinimports wurde die Translokation verschiedener Vorstufenproteine in Chloroplasten höherer Pflanzen mit der in Chloroplasten des Mooses Physcomitrella patens verglichen. Dabei wurden Kinetik, Energiebedarf und Prozessierung analysiert. Dies ermöglicht Aussagen über die Entwicklung des Proteintransports, da bekannt ist, dass die Zusammensetzung der Toc- und Tic-Komplexe in der nicht-vaskulären Pflanze P. patens Unterschiede zu den Importapparaten höherer Pflanzen aufweist. Es konnte verdeutlicht werden, dass die untersuchten Vorstufenproteine dennoch das gleiche Importverhalten in den analysierten Modelsystemen zeigen, was darauf hinweist, dass die Importwege trotz der Unterschiede in den Translokationskomplexen konserviert sind. Im weiteren Verlauf dieser Arbeit wurde der Import von Proteinen der inneren Hüllmembran analysiert, für welche zwei unterschiedliche Wege beschrieben wurden: im „conservative-sorting“-Weg werden die Proteine über die Toc- und Tic-Komplexe in das Stroma transportiert, wo das Erkennungssignal von der stromalen Prozessierungspeptidase vom maturen Protein getrennt wird, bevor anschließend die Insertion der Proteine in die Membran erfolgt. Beim „stop-transfer“-Weg dagegen stagnieren die Proteine auf Höhe des Translokationskanals der inneren Hüllmembran und werden von dort lateral in die Membran inseriert. Eine systematische Charakterisierung der Importwege hydrophober Proteine der inneren Membran in Chloroplasten von Pisum sativum bezüglich Energiebedarf, Nutzung von Rezeptorkomponenten, sowie Bildung löslicher Intermediate konnte zeigen, dass die Insertion der untersuchten Vorstufenproteine in die innere Hüllmembran mittels des „stop-transfer“-Weges erfolgt. Des Weiteren wurde die Struktur und Funktion des Kanalproteins der inneren Chloroplastenmembran - Tic110 - näher untersucht, wobei vor allem die Verankerung von Tic110 in die Membran von Interesse war. Tic110 besitzt zwei N-terminale, hydrophobe Transmembranhelices, welche für die Verankerung in die Membran verantwort-lich sind, sowie vier C-terminale, amphipatische Transmembrandomänen. In dieser Arbeit konnte mittels Sequenzanalyse ein konservierter Bereich am Ende der ersten amphipatischen Helix identifiziert werden, welcher ebenfalls maßgeblich an der Membranverankerung beteiligt ist. Eine Mutation dieser Domäne führt zu einer Konformationsänderung des Proteins, woraufhin es nicht mehr in der Lage ist, stabil in Membranen zu inserieren. Die Topologie von Tic110 macht deutlich, dass große Teile des Proteins sowohl in den Intermembranraum, als auch in das Stroma hineinragen, wohingegen die amphipatischen Transmembrandomänen den Translokationskanal bilden. In dieser Arbeit konnte ein künstliches Importsystem mittels in Liposomen rekonstituiertem Tic110 etabliert werden, wodurch nicht nur gezeigt werden konnte, dass Tic110 in der Lage ist, Vorstufenproteine zu binden, sondern auch, dass eine Translokation der Proteine erfolgen kann. Die Daten weisen auf eine bedeutende Rolle von Tic110 als Proteinimportkanal der inneren Hüllmembran hin.

Mitochondriales Hsp70 spielt eine wichtige Rolle bei der Biogenese und Funktion von Mitochondrien. Es ist essenziell für den Import, die Faltung und den Abbau mitochondrialer Proteine. Wie alle Hsp70-Proteine arbeitet mtHsp70 dabei mit Cochaperonen zusammen. In dieser Arbeit wurden neue Interaktionspartner von mtHsp70 identifiziert und funktionell charakterisiert. MtHsp70 ist die zentrale Komponente des Importmotors der TIM23-Translokase, der den ATP-abhängigen Transport von Proteinen über die Innenmembran der Mitochondrien vermittelt. Mit Tim14 und Mdj2 wurden in dieser Arbeit zwei Proteine des Importmotors als J-Cochaperone identifiziert. Sowohl Tim14 als auch Mdj2 wurden als MBP-Fusionsproteine aus E. coli gereinigt und stimulierten die ATPase-Aktivität von mtHsp70. Eine Variante von Tim14 mit einer Mutation im HPD-Motiv, die die Stimulation der ATPase-Aktivität von mtHsp70 durch Tim14 verhindert, konnte die Funktion von Tim14 in Hefezellen nicht übernehmen. Die Entdeckung von membranassoziierten J-Proteinen im Importmotor macht deutlich, dass mtHsp70 durch die Stimulation seiner ATPase-Aktivität effizient an ein importiertes Protein binden kann, sobald dieses die Translokationspore des TIM23- Komplexes verlässt. Ebenso wird die evolutionäre Konservierung zwischen dem Importmotor und bakteriellen Hsp70-Systemen ersichtlich. Der Importmotor der TIM23-Translokase ist aber eine Ausnahme unter den Hsp70-Systemen, da in diesem System mit Tim16 eine weitere, regulatorische Komponente identifiziert werden konnte. Tim16 ist ein J-ähnliches Protein, das selber keine stimulierende Wirkung auf die ATPase-Aktivität von mtHsp70 hat, aber die Stimulation von mtHsp70 durch Tim14 reguliert. Dies könnte einen unnötigen Verbrauch von ATP durch mtHsp70 in Abwesenheit eines Präproteins verhindern. Mit der Charakterisierung der J- und J-ähnlichen Proteine des Importmotors wurden wesentliche Erkenntnisse über die Funktionsweise des Importmotors geliefert. Ein bisher nicht bekanntes Protein wurde zusammen mit mtHsp70 aus S. cerevisiae gereinigt und anschließend biochemisch charakterisiert. Dieses Protein, Hep1, ist ein lösliches Protein der mitochondrialen Matrix. Es interagiert mit mtHsp70 in seiner nukleotidfreien und ADPgebundenen Form. Für diese Interaktion ist die ATPase-Domäne von mtHsp70 notwendig. Jedoch trägt vermutlich auch die PBD zur Bindung von mtHsp70 an Hep1 bei, da eine solche Bindung nur beobachtet werden konnte, wenn mtHsp70 sowohl die ATPase-Domäne als auch die PBD aufweist. Hep1 hat im Gegensatz zu den bekannten Cochaperonen keinen Einfluss auf den ATPase- Zyklus von mtHsp70. Allerdings aggregieren in Abwesenheit von Hep1 mitochondriale Hsp70-Proteine. Diese Aggregation ist irreversibel und führt zum Verlust der Funktion der mitochondrialen Hsp70-Proteine. Diese Beeinträchtigung führt wiederum zu Defekten in Prozessen, die funktionelle mitochondriale Hsp70-Proteine benötigen. So wurden in ∆hep1- Zellen Defekte im mitochondrialen Proteinimport und der Biogenese von Eisen-Schwefel- Clustern beobachtet. Aufgrund dieser Defekte zeigen ∆hep1-Zellen einen Temperatursensitiven Wachstumsphänotyp. Die Tendenz zur Aggregation ist spezifisch für mitochondriale Hsp70-Proteine, wobei besonders die nukleotidfreie Form von mtHsp70 betroffen ist. Im aggregierten Material ließ sich eine erhöhte Sensitivität der ATPase-Domäne gegenüber zugesetzter Protease feststellen, was auf eine Fehlfaltung dieser Domäne deutet. Es wurde eine Region in der ATPase- Domäne von mtHsp70 identifiziert, die zur Aggregation von mtHsp70 beiträgt. Durch Austausch dieser Region gegen die entsprechende Region aus DnaK, dem nächsten nicht mitochondrialen Verwandten von mtHsp70, konnte ein teilweise funktionsfähiges Hsp70- Protein hergestellt werden, dessen Löslichkeit nicht mehr von Hep1 abhängig ist. MtHsp70 aggregiert nur, wenn es sowohl die ATPase-Domäne als auch die PBD aufweist. Die Interdomänenkommunikation zwischen der ATPase-Domäne und der PBD von mtHsp70 scheint zur Ausbildung einer instabilen Konformation notwendig zu sein. Hep1 bindet an mtHsp70 in dieser Konformation und verhindert somit die Aggregation. Mit Hep1 wurde in dieser Arbeit ein neuer Typ von Interaktionspartnern mitochondrialer Hsp70-Proteine entdeckt. Es wirkt als Chaperon für dieses Hsp70-Proteine, indem es an sie bindet und deren Aggregation verhindert.

Kernkodierte chloroplastidäre Proteine werden an cytosolischen Ribosomen synthetisiert und müssen posttranslational in Chloroplasten importiert werden. Die Translokation dieser Proteine erfolgt in einem hoch regulierten Prozess durch den Toc- und Tic-Komplex, die Proteintranslokationskomplexe in der äußeren bzw. inneren Hüllmembran der Chloroplasten. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass der Proteinimport in Chloroplasten in das Calcium-Netzwerk der Pflanzenzelle integriert ist. Hinweise darauf lieferte die Identifizierung einer bisher unbekannten Regulation des chloroplastidären Proteinimports durch Calcium/Calmodulin. Diese Regulation betrifft nur diejenigen Proteine, die eine abspaltbare N-terminale Präsequenz besitzen sowie Toc- und Tic-Komplex für ihre Translokation in Chloroplasten verwenden. Weitere Untersuchungen haben gezeigt, dass die Calcium/Calmodulin-Regulation des Proteinimprts auf Höhe des Tic-Komplexes einsetzt. Als Überträger dieser Regulation fungiert wahrscheinlich Tic32, eine Komponente des Tic-Komplexes, da die Affinitätschromatographie an Calmodulin-Agarose Tic32 als dominantes Calmodulin-Bindeprotein in der inneren Hüllmembran der Chloroplasten aufzeigte. Sowohl heterolog exprimiertes als auch natives Tic32 binden an Calmodullin nur in Anwesenheit von Calcium. Die Calmodulin-Bindungsdomäne in Tic32 liegt am proximalen C-Terminus zwischen Leu296 und Leu314. Tic32 kann ebenfalls NADPH binden, was eine Redoxregulation für dieses Protein nahelegt. Die Bindung von NADPH führt zur Unterbrechung der Interaktion von Tic110 mit Tic32, Tic62 und Tic44. Da sich NADPH und Calmodulin bei ihrer Bindung an Tic32 gegenseitig ausschließen, könnte Calmodulin die Bindung zwischen den Komponenten des Tic-Komplexes wiederherstellen. Zusammengenommen liefern diese Ergebnisse Hinweise darauf, dass sowohl die Redox- als auch die Calcium/Calmodulin-Regulation des Proteinimports in Chloroplasten auf Höhe des Tic-Komplexes stattfinden und dass die beiden Regulationen durch Tic32 vermittelt werden könnten.

Die Translokase der mitochondrialen Außenmembran TOM-Komplex erkennt alle in Mitochondrien zu importierenden Proteine und vermittelt den Transfer in oder über die Membran. Der Mechanismus der Translokation ist allerdings bisher nur teilweise verstanden. Strukturelle Informationen über den TOM-Komplex können Fragen nach den Detailschritten beantworten helfen. Aus dem Schimmelpilz Neurospora crassa wurde der TOM-Komplex so aufgereinigt, dass Ausbeute und Reinheit strukturelle Untersuchungen mittels Proteinkristallographie ermöglichten. Kristalle des TOM-Komplexes wurden gewonnen und Beugungsexperimente durchgeführt. Die Auflösung der erhaltenen Kristalle des TOM-Komplexes war nicht ausreichend, um Aussagen über die Raumgruppe oder den strukturellen Aufbau des Komplexes treffen zu können. Deshalb wurde das Reinigungsverfahren weiter optimiert sowie eine Reihe von Mutanten des TOM-Komplexes untersucht. Bisher konnte jedoch keine Verbesserung der Beugungsdaten erreicht werden. Zu Beginn dieser Arbeit waren vier Untereinheiten des TOM-Core-Komplexes von N. crassa bekannt: Tom40, Tom22, Tom7 und Tom6. Im ansonsten vergleichbar aufgebauten TOM-Core-Komplex von S. cerevisiae war noch eine weitere Komponente Tom5 beschrieben worden. Daher wurde im Vorfeld der Kristallisationsexperimente die Zusammensetzung des N. crassa TOM-Komplexes massenspektrometrisch analysiert, wobei Tom5 als eine weitere Tom-Untereinheit in N. crassa identifiziert werden konnte. Aufgrund von Experimenten mit S. cerevisiae wurde eine Rolle des Tom5 im Proteinimport in Mitochondrien postuliert. Im Gegensatz hierzu hatte Tom5 in N. crassa keinen Einfluß auf den Proteinimport. Auch auf die Assemblierung des TOM-Komplexes und das Wachstum der Zellen wirkte sich eine Deletion von Tom5 in N. crassa nicht negativ aus. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen allerdings eine solche Funktion auch in Hefe als fraglich erscheinen. Vielmehr deuten die hier vorgelegten Befunde auf eine strukturelle Funktion von Tom5 bei der Stabilisierung des TOM-Komplexes hin. Um weitere neue Komponenten des Import- und Assemblierungsapparates der mitochondrialen Außenmembran zu finden, wurde eine massenspektrometrische Analyse der Proteine von isolierten Außenmembranvesikeln aus N. crassa durchgeführt. Hierbei wurde Mim1 als bisher unbekanntes Außenmembranprotein identifiziert. Mim1 liegt in einem 300 kDa-Komplex vor und es wurde eine essentielle Funktion von Mim1 bei der Assemblierung des TOM-Komplexes nachgewiesen.

6 Literatur Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Lokalisation und Funktion des Hsp70- Homologen, Ecm10, zu klären. Ecm10 wurde als drittes Hsp70-Protein neben Ssc1 und Ssq1 in der mitochondrialen Matrix lokalisiert. Es besteht eine hohe Sequenzähnlichkeit zwischen Ecm10 und Ssc1, woraus eine ähnliche Funktionsweise resultiert. Die teilweise Funktionsüberlappung konnte in ssc1-3 ∆ecm10-Zellen durch einen synthetischen Wachstumsphänotyp experimentell nachgewiesen werden. Ecm10, das kein abundantes Protein ist, konnte jedoch selbst nach Überexpression Ssc1 nicht funktionell ersetzen. Da keine endogenen Substrate für Ecm10 bekannt sind, wurde die Funktion von Ecm10 im Vergleich zu Ssc1 in vitro analysiert. Ecm10 kann bei Überexpression den Proteinimport in die Matrix auch ohne funktionelles Ssc1 vollständig wiederherstellen. Wie Ssc1 bindet Ecm10 über eine Wechselwirkung mit Tim44 an die zu translozierende Polypeptidkette. Weiterhin verfügt es über eine ATPase-Domäne, deren Aktivität über die Wechselwirkung mit Mge1 reguliert wird. Im Gegensatz zu Ssc1 scheint Ecm10 jedoch nur über eine verminderte Faltungsaktivität zu verfügen, wobei nicht geklärt ist, ob diese durch eine eingeschränkte Wechselwirkung mit dem Cochaperon Mdj1 erklärt werden kann. Welche Rolle die gezeigten Funktionalitäten unter physiologischen Bedingungen für Ecm10 spielen, bleibt weiterhin offen. Des Weiteren wurde die Sortierung polytoper Membranproteine der mitochondrialen Innenmembran untersucht. Dazu wurde auf zwei bitope Beispielproteine, Mrs2 und Yta10, zurückgegriffen. Beide verfügen über jeweils eine negativ geladene, von zwei Transmembrandomänen eingerahmte Intermembranraumdomäne, die jedoch unterschiedlich groß ist. Es konnte gezeigt werden, dass beide Proteine dem konservativen Sortierungsweg folgen, in dessen Verlauf ein lösliches Sortierungsintermediat von der Matrix aus in die Innenmembran inseriert wird. Dabei ist der Insertions- oder Exportschritt aus der Matrix im Vergleich zum Import in die Matrix in höherem Maße abhängig vom Membranpotential über die Innenmembran. In beiden Fällen erfolgte die Sortierung unabhängig von den bisher bekannten Insertionsfaktoren Oxa1 und Mba1, was auf die Existenz weiterer Insertionsfaktoren deuten könnte. Die Untersuchung der Ladungsverteilung innerhalb der Intermembranraumdomänen verschiedenster mitochondrialer Innenmembranproteine ergab eine eindeutige Bevorzugung von sauren Resten, was auf einen allgemeinen Sortierungsweg für solche Proteine hindeutet, die aus bakteriellen Vorläufern abgeleitet wurden.