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Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2020.09.24.311530v1?rss=1 Authors: Jing, Y., Montano, J. L., Levy, M. J., Lopez, J., Kung, P.-P., Richardson, P., Krajewski, K., Florens, L., Washburn, M., Meier, J. L. Abstract: Chemical proteomics provides a powerful strategy for the high-throughput assignment of enzyme function or inhibitor selectivity. However, identifying optimized probes for an enzyme family member of interest and differentiating signal from background remain persistent challenges in the field. To address this obstacle, here we report a physiochemical discernment strategy for optimizing chemical proteomics based on the Coenzyme A (CoA) cofactor. First, we synthesize a pair of CoA-based Sepharose pulldown resins differentiated by a single negatively charged residue, and find this change alters their capture properties in gel-based profiling experiments. Next, we integrate these probes with quantitative proteomics and benchmark analysis of 'probe selectivity' versus traditional 'competitive chemical proteomics'. This reveals the former is well-suited for the identification of optimized pulldown probes for specific enzyme family members, while the latter may have advantages in discovery applications. Finally, we apply our anionic CoA pulldown probe to evaluate the selectivity of a recently reported small molecule N-terminal acetyltransferase inhibitor. These studies further validate the use of physical discriminant strategies in chemoproteomic hit identification and demonstrate how CoA-based chemoproteomic probes can be used to evaluate the selectivity of small molecule protein acetyltransferase inhibitors, an emerging class of pre-clinical therapeutic agents. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info

A purification process for the monclonal anti-CD4 antibody MAX.16H5 was developed on an analytical scale using (NH&SO, precipitation, anion-exchange chromatography on MonoQ or Q-Sepharose, hydrophobic interaction chromatography on phenyl- Sepharose and gel filtration chromatography on Superdex 200. The purification schedule was scaled up and gram amounts of MAX.16H5 were produced on corresponding BioPilot columns. Studies of the identity, purity and possible contamination by a broad range of methods showed that the product was highly purified and free from contaminants such as mouse DNA, viruses, pyrogens and irritants. Overall, the analytical data confirm that the monoclonal antibody MAX.16H5 prepared by this protocol is suitable for human therapy.

The conditions that permit the interaction of immediate-early proteins of murine cytornegalovirus (MCMV) with DNA were studied. Chromatography of extracts from infected cells on MCMV DNA cellulose and calf thymus DNA cellulose showed that pp89, the regulatory major immediate-early protein, interacts with DNA and dissociates at salt concentrations between 0.3 and 0.6 M NaCl. pp76, a cleavage product of pp89, and additional minor ie1 proteins eluted already at low ionic strength. Cellular DNA-binding factors were required for association of pp89 with DNA. These factors were identified as core histones. Chromatography of IE proteins on histone-Sepharose in the absence of DNA revealed a high-binding affinity that was resistant to 2 M NaCl. These results suggest that pp89 has no direct DNA-binding activity. A role for an amino acid sequence homology in the N-terminal region of pp89 with histone H2B in the pp89-histone-DNA Interaction is discussed.

Human urinary kallikrein was purified by gel filtration on Sephacryl S-200 and affinity chromatography on aprotinin-Sepharose, followed by ion exchange chromatography on DEAE-Sepharose. In dodecylsulfate gel electrophoresis two protein bands with molecular weights of 41,000 and 34,000 were separated. The amino acid composition and the carbohydrate content of the kallikrein preparation were determined; isoleucine was identified as the only aminoterminal amino acid. The bimolecular velocity constant for the inhibition by diisopropyl fluorophosphate was determined as 9±2 l mol–1 min–1. The hydrolysis of a number of substrates was investigated and AcPheArgOEt was found to be the most sensitive substrate for human urinary kallikrein. Using this substrate an assay method for kallikrein in human urine was developed. It was shown by radioimmunoassay that pig pancreatic kallikrein can be absorbed in the rat intestinal tract. Furthermore, in dogs the renal excretion of glandular kallikrein from blood was demonstrated by radioimmunological methods.

Zum Aufbau einer spezifischen radioimmunologischen Bestimmungsmethode von Thyroxin-bindendem Globulin (TBG) im Serum wurde eine reine TBG-Präparation hergestellt. Die erste Anreicherung des TBG aus humanem Poolplasma um den Faktor 640 wurde mit einer Affinitätschromatographie über Sepharose 4-B erreicht, an die Trijodthyronin (T3) kovalent gebunden war. Die weitere Reinigung mit einer Gesamtanreicherung um einen Faktor von 4500 erfolgte über Anionenchromatographie (QAE- und DEAE-Sephadex A-50) und Affinitätschromatographie mit Concanavalin A (ConA-Sepharose). Die Wiederfindung von TBG über alle Schritte lag bei 20%. Das isolierte TBG, das in der Disc-Elektrophorese in drei verschiedenen Polyacrylamidkonzentrationen bei zwei verschiedenen pH-Werten (pH 7,0 und pH 8,9) als eine homogene Bande zur Darstellung kam, band Thyroxin (T4) oder Trijodthyronin (T3) äquimolar. Als Zeichen einer Mikroheterogenität kamen beim isoelectric focusing im pH-Bereich von 4,0–4,5 drei Banden zur Darstellung. Der indirekt ermittelte Zuckeranteil der TBG-Präparation betrug 15%. Diese TBG-Präparation wurde zur Immunisierung von Kaninchen und zur125Jod-Markierung mit der Chloramin-T-Methode benutzt. Die Präzision des Radioimmunoassay von TBG von Tag zu Tag war mit einem Variationskoeffizienten von 4,3% gut. Die Verdünnungskurven aller bisher geprüften Serumproben — auch bei quantitativen TBG-Varianten — lagen auf der Kalibrierstandardkurve: Hinweise auf eine immunologische Heterogenität des TBG ergaben sich damit nicht. Bei Kontrollpersonen mit einem mittleren TBG-Spiegel von 23,0±4,0 mg/l (x±s) zeigte sich eine zweigipflige Altersabhängigkeit der TBG-Konzentrationen im Serum: In den ersten vier postnatalen Lebenswochen fanden sich die höchsten TBG-Spiegel, die bis zum generationsfähigen Alter abfielen, um jenseits des 50. Lebensjahres wieder anzusteigen. Nach Abschluß der Perinatalphase bestand eine signifikante Korrelation zwischen dem Gesamt-T4 und TBG. Der T4/TBG-Quotient war altersunabhängig konstant (3,2±0,7;x±s) und folglich der geeignete diagnostische Parameter. Ein Geschlechtsunterschied der TBG-Spiegel fand sich in keinem Lebensalter, ebenso konnten keine zyklischen Schwankungen bei Frauen im generationsfähigen Alter nachgewiesen werden. Der bekannte Anstieg der TBG-Spiegel unter Oestrogeneinfluß konnte bei Frauen (Antiovulantien und Gravidität) und bei Männern (Fosfestrol) quantitativ bestätigt werden. Umgekehrt konnte ein Abfall der TBG-Spiegel bei therapeutisch induziertem Oestrogenmangel (Danazol) erstmals aufgezeigt werden. Bei primären Schilddrüsenfunktionsstörungen fanden sich keine signifikanten Änderungen der TBG-Spiegel, auch nicht bei direktem Vergleich zwischen Hyperthyreose (20,0±3,5 mg/l) und Hypothyreose (21,6±7,0 mg/l). Veränderte T4/TBG-Quotienten spiegeln bei diesen Erkrankungen folglich die von der Norm abweichende Schilddrüsenfunktion wider. Von diesen Schilddrüsenfunktionsstörungen lassen sich an Hand der normalen T4/TBG-Quotienten alle Zustände mit erhöhten bzw. erniedrigten Gesamt-T4-Spiegeln abgrenzen, die primär auf einer quantitativen Änderung der TBG-Spiegel beruhen.