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Natronomonas pharaonis is an archaeon adapted to two extreme conditions: high salt concentration and alkaline pH. It has become one of the model organisms for the study of extremophilic life. Here, we present a genome-scale, manually curated metabolic reconstruction for the microorganism. The reconstruction itself represents a knowledge base of the haloalkaliphile's metabolism and, as such, would greatly assist further investigations on archaeal pathways. In addition, we experimentally determined several parameters relevant to growth, including a characterization of the biomass composition and a quantification of carbon and oxygen consumption. Using the metabolic reconstruction and the experimental data, we formulated a constraints-based model which we used to analyze the behavior of the archaeon when grown on a single carbon source. Results of the analysis include the finding that Natronomonas pharaonis, when grown aerobically on acetate, uses a carbon to oxygen consumption ratio that is theoretically near-optimal with respect to growth and energy production. This supports the hypothesis that, under simple conditions, the microorganism optimizes its metabolism with respect to the two objectives. We also found that the archaeon has a very low carbon efficiency of only about 35%. This inefficiency is probably due to a very low P/O ratio as well as to the other difficulties posed by its extreme environment.

The aerobic, haloalkaliphilic archaeon Natronomonas pharaonis is able to survive in salt-saturated lakes of pH 11. With genome-wide shotgun proteomics, 886 soluble proteins (929 proteins in total) of the theoretical Natronomonas pharaonis soluble proteome consisting of 2187 proteins have been confidentially identified by MS/MS. By comparing the identified proteins of Natronomonas pharaonis with homologues of other organisms, both extreme diversity between halophiles and occasional extraordinary sequence conservation to proteins from unrelated species were observed, substantiating genetic exchange between organisms that are evolutionary nearly unrelated to cope with several extreme conditions. Alternative and largely overlapping open reading frames (called overprinting) could not be identified in the genome of neither Natronomonas pharaonis nor Halobacterium salinarum, leading to the conclusion that in halophiles, not more than one protein can be produced from the same genomic sequence stretch. In the second part of this work, analyses on both the transcriptional and translational level have been performed on the halophilic archaeon Halobacterium salinarum, to gain insights into its lifestyle changes leading to cell response when challenged by heat shock. Thereby, quantitative proteomic data obtained from two different approaches regarding the labeling method (ICPL; SILAC), the fractionation of the protein or peptide mixtures (2DE; 1DE-LC), the mass spectrometric analysis (MALDI-TOF/TOF; ESI Q-TOF), and the choice of the growth medium (complex; synthetic) were integrated with data from whole-genome DNA microarrays, real-time quantitative PCR (RTqPCR), and Northern analyses. A number of genes congruently displayed substantial induction after heat shock on both the transcript and protein level as in the case of the thermosome, two AAA-type ATPases, a Dps-like ferritin protein (DpsA), a hsp5-type molecular chaperone, and the transcription initiation factor tfbB. In contrast, the dnaK operon (hsp70) did not exhibit any significant upregulation in either of the approaches. Some genes encoding enzymes of the TCA cycle, of pathways flowing into the latter, and of pathways leading to pyrimidine synthesis, were only translationally induced. Finally, differential transcriptional induction of the transcription initiation factors tfbB and tfbA, determined by RTqPCR, led to the conclusion that they may regulate genes by reciprocal action. The multiplicity of proteomics and transcriptomics methods are complementing one another, covering a bigger area on the one hand, but also confirming some unexpected findings.

Membranproteine als Mediatoren zwischen extrazellulären Reizen und intrazellulären Prozessen sind trotz ihrer enormen biologischen Bedeutung in Proteomstudien meist unterrepräsentiert. Die vorliegende Arbeit konzentriert sich auf die kartierende und quantitative Analyse des Membranproteoms am Beispiel der Modellorganismen Halobacterium salinarum und Natronomonas pharaonis. Grundlage war die Entwicklung einer optimierten Membranisolierung für halophile Archaea unter Beibehaltung hoher Salzkonzentrationen. Nach Zellaufschluss durch Beschallen wurden die so generierten Membranvesikel über Zuckergradienten-Dichtezentrifugation aufgereinigt. Es konnte gezeigt werden, dass hohe Salzkonzentrationen nicht nur zur Stabilisierung der Membran sondern auch der Membranproteinkomplexe notwendig sind. Für die Analyse von halophilen Membranproteinkomplexen wurde die Blue Native Elektrophorese-Technik etabliert und adaptiert, sodass salzhaltige Proben untersucht werden konnten. Anhand dieses Systems konnten z.T. unbekannte Proteininteraktionen nachgewiesen werden. Da integrale Membranproteine mit der klassischen 2D-Elektrophorese nicht getrennt werden können, wurde für die zweidimensionale gelbasierte Darstellung des Membranproteoms das 16-BAC/SDS-System etabliert und bezüglich Trennleistung optimiert. Die Identifizierung von Proteinsspots war für membranassoziierte Proteine mit der peptide mass fingerprinting Methode erfolgreich, diese Technologie ist jedoch für die Analyse von integralen Membranproteinen stark eingeschränkt. Deren Inventarisierung erfolgte über einen LC-MS/MS Ansatz. Die auch bei dieser Technik beobachteten Schwierigkeiten konnten darauf zurückgeführt werden, dass Peptide, die membranintegrale Bereiche repräsentieren, spezifisch an langkettigen reversed phase Materialien verloren gehen und sich daher einer Analyse entziehen. Aus diesem Grunde war die Abreicherung membranassoziierter Proteine während der Membranisolierung durch ein mildes Detergens entscheidend, sodass integrale Proteine angereichert und der Analyse zugeführt werden konnten. Durch einen 1D-SDS PAGE LC-MS/MS Ansatz wurden so 50% des vorhergesagten integralen Membranproteoms von H. salinarum und 32% des integralen Membranproteoms von N. pharaonis identifiziert. Damit war die Grundlage geschaffen, die Veränderungen im Membranproteom von H. salinarum, hervorgerufen durch unterschiedliches Energie- und Nahrungsangebot, zu untersuchen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde für die quantitative Membranproteomik erstmals die differenzielle Gelelektrophorese (DIGE) mit dem 16-BAC/SDS-System kombiniert. Diese gelbasierte Quantifizierungsstrategie ermöglicht nicht nur eine Übersicht über das Ausmaß der Regulation des gesamten Proteoms, sondern auch die Quantifizierung einzelner Proteinspots unabhängig von deren Identifizierung. Mit einer grundlegend anderen, massenspektrometrie-basierten Technologie wurden diese Ergebnisse verifiziert und erweitert. Theoretische Berechnungen zeigten, dass auch bei diesen Analysen die Quantifizierung integraler Membranproteine erschwert ist, da wesentlich weniger Peptide pro Protein als bei löslichen Proteinen für eine Quantifizierung zur Verfügung stehen. Sie zeigten aber auch, dass die Markierung freier Aminogruppen mit isotopenmarkierten Sonden, wie die Nicotinoylierung (ICPL), für Membranproteine erfolgreicher ist, als eine Cystein-basierte Markierungsstrategie. Mit Hilfe der ICPL-Technologie, die in dieser Arbeit erstmals für Membranproteine angewandt wurde, war es möglich am Beispiel von aerob und phototoph kultivierten Zellen für 155 Membranproteine quantitative Information zu erhalten, darunter 101 integrale Membranproteine. Das am stärksten regulierte Protein war, wie zu erwarten, das photosynthetisch aktive Protein Bacteriorhodopsin. Daneben konnten weitere am aeroben und anaeoben Energiemetabolismus beteiligte Proteine als reguliert identifiziert werden. Die insgesamt überraschend geringen Regulationen auf Ebene des Membranproteoms, welche sich sowohl aus der gelbasierten als auch bei der massenspektrometrie-basierten Analyse ergaben, könnten eine günstige Überlebensstrategie für Organismen in ökologische Nischen mit geringem selektivem Druck darstellen.