Podcasts about proteinspots

Membranproteine als Mediatoren zwischen extrazellulären Reizen und intrazellulären Prozessen sind trotz ihrer enormen biologischen Bedeutung in Proteomstudien meist unterrepräsentiert. Die vorliegende Arbeit konzentriert sich auf die kartierende und quantitative Analyse des Membranproteoms am Beispiel der Modellorganismen Halobacterium salinarum und Natronomonas pharaonis. Grundlage war die Entwicklung einer optimierten Membranisolierung für halophile Archaea unter Beibehaltung hoher Salzkonzentrationen. Nach Zellaufschluss durch Beschallen wurden die so generierten Membranvesikel über Zuckergradienten-Dichtezentrifugation aufgereinigt. Es konnte gezeigt werden, dass hohe Salzkonzentrationen nicht nur zur Stabilisierung der Membran sondern auch der Membranproteinkomplexe notwendig sind. Für die Analyse von halophilen Membranproteinkomplexen wurde die Blue Native Elektrophorese-Technik etabliert und adaptiert, sodass salzhaltige Proben untersucht werden konnten. Anhand dieses Systems konnten z.T. unbekannte Proteininteraktionen nachgewiesen werden. Da integrale Membranproteine mit der klassischen 2D-Elektrophorese nicht getrennt werden können, wurde für die zweidimensionale gelbasierte Darstellung des Membranproteoms das 16-BAC/SDS-System etabliert und bezüglich Trennleistung optimiert. Die Identifizierung von Proteinsspots war für membranassoziierte Proteine mit der peptide mass fingerprinting Methode erfolgreich, diese Technologie ist jedoch für die Analyse von integralen Membranproteinen stark eingeschränkt. Deren Inventarisierung erfolgte über einen LC-MS/MS Ansatz. Die auch bei dieser Technik beobachteten Schwierigkeiten konnten darauf zurückgeführt werden, dass Peptide, die membranintegrale Bereiche repräsentieren, spezifisch an langkettigen reversed phase Materialien verloren gehen und sich daher einer Analyse entziehen. Aus diesem Grunde war die Abreicherung membranassoziierter Proteine während der Membranisolierung durch ein mildes Detergens entscheidend, sodass integrale Proteine angereichert und der Analyse zugeführt werden konnten. Durch einen 1D-SDS PAGE LC-MS/MS Ansatz wurden so 50% des vorhergesagten integralen Membranproteoms von H. salinarum und 32% des integralen Membranproteoms von N. pharaonis identifiziert. Damit war die Grundlage geschaffen, die Veränderungen im Membranproteom von H. salinarum, hervorgerufen durch unterschiedliches Energie- und Nahrungsangebot, zu untersuchen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde für die quantitative Membranproteomik erstmals die differenzielle Gelelektrophorese (DIGE) mit dem 16-BAC/SDS-System kombiniert. Diese gelbasierte Quantifizierungsstrategie ermöglicht nicht nur eine Übersicht über das Ausmaß der Regulation des gesamten Proteoms, sondern auch die Quantifizierung einzelner Proteinspots unabhängig von deren Identifizierung. Mit einer grundlegend anderen, massenspektrometrie-basierten Technologie wurden diese Ergebnisse verifiziert und erweitert. Theoretische Berechnungen zeigten, dass auch bei diesen Analysen die Quantifizierung integraler Membranproteine erschwert ist, da wesentlich weniger Peptide pro Protein als bei löslichen Proteinen für eine Quantifizierung zur Verfügung stehen. Sie zeigten aber auch, dass die Markierung freier Aminogruppen mit isotopenmarkierten Sonden, wie die Nicotinoylierung (ICPL), für Membranproteine erfolgreicher ist, als eine Cystein-basierte Markierungsstrategie. Mit Hilfe der ICPL-Technologie, die in dieser Arbeit erstmals für Membranproteine angewandt wurde, war es möglich am Beispiel von aerob und phototoph kultivierten Zellen für 155 Membranproteine quantitative Information zu erhalten, darunter 101 integrale Membranproteine. Das am stärksten regulierte Protein war, wie zu erwarten, das photosynthetisch aktive Protein Bacteriorhodopsin. Daneben konnten weitere am aeroben und anaeoben Energiemetabolismus beteiligte Proteine als reguliert identifiziert werden. Die insgesamt überraschend geringen Regulationen auf Ebene des Membranproteoms, welche sich sowohl aus der gelbasierten als auch bei der massenspektrometrie-basierten Analyse ergaben, könnten eine günstige Überlebensstrategie für Organismen in ökologische Nischen mit geringem selektivem Druck darstellen.

Nach der kompletten Sequenzierung des menschlichen Genoms im Rahmen des „Human Genome Project“ sind sich die Experten einig, dass die Forschung sich nun den Vorgängen der komplexen Regulationsnetzwerken auf der Proteinebene widmen muß. Die Proteomforschung bedient sich dabei der möglichst optimalen und quantitativen Auflösung von komplexen Proteingemischen. Um dies zu ereichen werden die Proteine mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese (2D-SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese) aufgetrennt. Im Rahmen der vorliegenden Promotion sollten am Beispiel ausgewählter relevanter Blutplasmaproteine das Phänomen der „ladder of spots“ untersucht werden. Dies sind Leitern von Proteinspots, die einem einzigen Protein zugeordnet werden können, sich jedoch in der ersten Dimension, der isoelektrischen Fokussierung (IEF) aufgrund ihrer Nettoladung unterscheiden und aufgetrennt werden. Vor allem in 2D-Gelen von Blutplasma sind eine ganze Reihe solcher Leitern zu beobachten, und in der Regel werden sie durch posttranslationale Modifikationen wie Glykosylierungen oder Phosphorylierungen verursacht. In der vorliegenden Arbeit konnte jedoch der Einfluss von Alterungsprozessen auf der Proteinebene nachgewiesen werden, der zu der Veränderung dieser Proteine in Form von Deamidierungen der Asparagin- und Glutaminaminosäuren beiträgt. Der Mechanismus der Alterung wurde ebenfalls genauer untersucht, da diese Art von Modifikationsreaktion in der Natur sowohl chemisch als auch enzymatisch ablaufen kann. Hier spielt natürlich auch die Art und Weise der Probenvorbereitung eine große Rolle bei möglichen posttranslationalen Modifikationen. Einen weiteren Schwerpunkt dieser Arbeit bildete die Klonierung eines der ausgewählten Proteine (ß2-Microglobulin) in E.coli mittels molekularbiologischer Techniken. Ziel der Klonierung war es festzustellen, zu welchem Zeitpunkt die zuvor entdeckten posttranslationale Modifikation im Rahmen der natürlichen Alterung von Proteinen auftritt.

Ziel dieser Arbeit war es, Veränderungen innerhalb weniger Stunden nach UV-B-Exposition auf Protein- und Transkriptionsebene bei 10-wöchigen Buchensämlingen Fagus sylvatica L. zu analysieren. Dazu wurden Buchensamen unter standardisierten Bedingungen angezogen und von dem Zeitpunkt der Keimung an unter einem UV-B/PAR-Verhältnis exponiert, das den natürlichen Umweltbedingungen sehr ähnlich ist. Die UV-B-Exposition der 10-wöchigen Buchensämlinge erfolgte in einer UV-B-Pflanzenkammer, die das Lichtspektrum des Sonnenlichts simulierte. Die in einer Zeitkinetik geernteten Primärblätter dienten als Ausgangsmaterial für die Daten in der vorliegenden Arbeit. Die 2D-PAGE der löslichen Gesamtproteine und in vitro translatierten Proteine wurde stets zweifach durchgeführt und jeweils die Gele mit der besten Auflösung als Einzelbestimmung ausgewertet. Die Untersuchungen auf Ebene des löslichen Gesamtproteins der Buche Fagus sylvatica L. erfolgten mittels einer Zeitkinetik über 1 Woche, wobei täglich 1 mal geerntet wurde. Die 2DPAGE Analyse ergab über die gesamte Zeitkinetik betrachtet 1 UV-B-induziertes Protein gegenüber der Starklicht-Kontrolle: Protein 28 (17 kDa; pI 6,8). Die 2D-Analysen auf löslicher Gesamtproteinebene stimmten mit den Daten auf in vitro Translationsebene überein, wobei die Effekte auf Transkriptionsebene wesentlich stärker waren. Insbesondere nach 3 und 6 h UV-B-Exposition konnten auf Transkriptebene eine 60%-ige und 90%-ige Reprimierung gezeigt werden. Diese Reprimierung war transient und auf Proteinebene in geringerem Ausmaß zeitlich verzögert nachzuweisen. Diese Daten gaben Hinweise dafür, daß bei der Buche Fagus sylvatica L. infolge UV-B-Exposition eine Regulation auf Transkriptionsebene stattgefunden hat und die drastische Reprimierung der Transkripte verschiedener Gene nur transient war. Da diese Effekte auf Proteinebene wesentlich schwächer waren, deutete das darauf hin, daß sich die Buchensämlinge innerhalb weniger Stunden an die UV-B-Exposition adaptierten. Auf in vitro Translationsebene gab es bei der Buche Fagus sylvatica L. 18 mRNAs, die unter Berücksichtigung der UV-B- und Starklicht-Tagesgänge direkt dem UV-B-Effekt zugeordnet werden konnten. Es wurde belegt, daß infolge erhöhter UV-B-Exposition 10 Transkripte neu vorhanden waren und die Transkripte von 8 Proteinen nicht mehr nachgewiesen werden konnten. Diesen charakteristischen Veränderungen unterlagen überwiegend saure und basische Proteine. Die Effekte waren zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Kinetik zu sehen (7 h, 10 h, 18 h, 28 h und 31 h nach Versuchsbeginn). Die DDRT-PCR wurde eingesetzt, um UV-B-vermittelte Antworten auf Genebene in Buchenblättern zu identifizieren. Bei den isolierten cDNAs wurden geringe Homologien verschiedener Buchenklone in der TIGR-Arabidopsis thaliana-EST-Datenbank gefunden: UV-Breprimierte Buchenklone zeigten Ähnlichkeiten zur Peroxidase, zur „DNA directed RNA-Polymerase alpha chain“ und zu einem „ara-3, ras-related GTP-binding protein“. Durch UV-B-Exposition induzierte Buchenklone wiesen Homologien zu dem „ABI-3“, zu dem „phytochrome regulated gene“ und zur Squalen-Synthase auf. Die Sequenzen dieser Buchenklone wurden zum ersten Mal beschrieben. Erstmals wurde ein ribosomaler Klon L37 bei der Buche beschrieben. Die L37 mRNA wurde aufgrund erhöhter UV-B-Exposition transient induziert. Bei erhöhter Ozon-Behandlung erreichte das Transkript dieses Klons zwei zeitlich voneinander getrennte Maxima; das zweite Maximum (am 3. Tag der Behandlung, 1,6-fache Induktion) ging mit sichtbaren Ozon- Schäden an den jungen Seitentrieben der Buche einher. Die Funktion dieses Proteins ist bisher noch unbekannt. Für eine direkte Zuordnung der isolierten Klone zu den Proteinspots auf der 2D-PAGE müßte eine Sequenzierung der Proteinspots erfolgen. Die Menge der Proteinspots für eine Proteinsequenzierung war jedoch nicht ausreichend. Über die TIGR-Arabidopsis thaliana-EST-Datenbank wurde erstmalig ein nach UV-BExposition induzierter Buchenklon isoliert, der hohe Homologien zum „nascent polypeptide associated complex alpha chain“ aufwies. Dieses Transkript wurde bereits nach 3 h UV-BExposition transient induziert. Der durch Ozon-Exposition reprimierende Effekt wurde durch die kombinierte UV-B/Ozon-Exposition aufgehoben. Die UV-B-vermittelte Induktion dieser zwei Buchenklone unterstützten die auf der 2D-PAGE Analyse resultierende Hypothese, daß die Regulation nach UV-B-Exposition vor allem auf Transkriptionsebene stattzufinden scheint. Die Daten der vorliegenden Arbeit ergaben folgende Schlußfolgerungen: Das Differentielle Display wurde eingesetzt, um infolge UV-B-Exposition differentielle cDNAs in Buchenblättern zu klonieren. Mittels der durchgeführten Northern-Blots wurde gezeigt, daß die Veränderungen auf Transkriptebene durch erhöhte UV-B-Exposition bedingt waren. Die vorliegenden Daten belegten, daß 6 verschiedene Transkripte infolge UV-B-Exposition transient induziert wurden. Diese überwiegenden transienten Veränderungen wurden ebenso durch die Untersuchungen mittels 2D-PAGE auf löslicher Gesamtprotein- und Transkriptebene bestätigt. Das bedeutet, daß innerhalb kurzer Zeit eine Anpassung der Buche an die veränderten Umweltbedingungen erfolgte. Möglicherweise kann dies durch die Anzucht der Buchensämlinge unter UV-B und Schwachlicht begründet werden. Diese Bedingungen sind jedoch umweltrelevant, da die Pflanze in jungen Jahren unter schattigen Lichtbedingungen heranwächst. In der vorliegenden Arbeit wurden infolge abiotischer Streßbehandlung (erhöhtes UV-B) erstmals 2 eindeutig transient induzierte differentielle Buchenklone isoliert: der ribosomale Klon L37 und der „nascent polypeptide associated complex alpha chain“ Klon. Die durchgeführten Northern-Blot Analysen zeigten, daß sich diese 2 Klone als Kandidaten für Molekulare Marker zum Nachweis frühzeitiger UV-B-vermittelter Änderungen auf Transkriptebene bei Fagus sylvatica L. eignen.