Podcasts about halobacterium

Zoe Ceballos introduces us to a member of the Domain Archaea that lives in a very extreme habitat - salt at saturating concentration (> 5 molar). Halobacterium and its obligate halophile relatives have evolved a salt-dependent lifestyle, unlike virtually all other cellular lifeforms.

This episode: Fecal microbiota transplants work just as well when taken in pill form as when delivered through a tube! Download Episode (10.5 MB, 11.5 minutes) Show notes: Microbe of the episode: Halobacterium halobium News item Journal Paper: Kao D, Roach B, Silva M, Beck P, Rioux K, Kaplan GG, Chang H-J, Coward S, Goodman KJ, Xu H, Madsen K, Mason A, Wong GK-S, Jovel J, Patterson J, Louie T. 2017. Effect of Oral Capsule- vs Colonoscopy-Delivered Fecal Microbiota Transplantation on Recurrent Clostridium difficile Infection: A Randomized Clinical Trial. J Am Med Assoc 318:1985–1993. Other interesting stories: Protein that can form prions important for protecting mice from influenza (paper) Figuring out how bacteria in fruit flies kill only males Healthy skin microbes could help treat eczema Good gut microbe is very comfortable with immune system Archaea in bogs could be good microbes for plants too (paper)   Email questions or comments to bacteriofiles at gmail dot com. Thanks for listening! Subscribe: Apple Podcasts, RSS, Google Play. Support the show at Patreon, or check out the show at Twitter or Facebook

Thu, 21 Oct 2010 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/12937/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/12937/1/Schwarz_Christoph.pdf Schwarz, Christoph ddc:540, ddc:500, Fakultät für Chemi

The effective uptake of inorganic phosphate by cells from the environment depends on specific transport systems. In bacteria, these uptake systems are well characterized and most species contain both secondary transporters as well as primary uptake systems belonging to the ABC-family of transporters. Under phosphate starvation, genes coding for high-affinity phosphate transporters are induced in bacteria as well as in eukarya. In E. coli these are genes of the phosphate-specific transport via Pst or the Glycerol-3-phosphate-specific transporter, Ugp. Archaea possess the PHO stimulon, which induces numerous genes in response to phosphate limitation. So far this stimulon has only been described for Halobacterium salinarum R1. The genome of H. salinarum encodes ABC transporters resembling the Pst and Ugp systems of E. coli which are upregulated under Pi-limited conditions. In this study, the gene expression and function of the phosphate dependent operons pst1, pst2 and ugp of H. salinarum were investigated. First, it was shown that the three operons (pst1, pst2 und ugp) are transcribed as one polycistronic unit. The respective promoters are located upstream of the first ORF (open reading frame) of the operons, and transcription start sites (TSS) were mapped. Two TSSs were found for the pst1 operon, and are utilized in a phosphate dependent manner. Through an unknown regulation mechanism, the cell switches transcription of pst1 mRNA to either a transcript with or without a 60 nt long leader sequence. The transcripts of the pst2 and ugp operons have no 5’UTRs, regardless of phosphate concentration. Using a Ppst1-bgaH reporter system, it was observed that the transcripts with or without a leader sequence have different translation efficiencies. The transcript without a 5‘UTR had a 150-fold higher translation efficiency than the transcript with a 5‘UTR. It was concluded that the expression of the pst1 operon is modulated through a post-transcriptional regulation mechanism. To our knowledge, this is the first identified archaeal protein-coding operon that is transcribed by alternative promoters. The differences in phosphate dependent gene expression of the pst1, pst2 and ugp operons were investigated using the bgaH reporter system. Under phosphate saturated conditions, the expression of the pst2 operon is stronger compared to the expression of the pst1 operon, whereas under phosphate limited conditions, pst1 operon expression is highly induced. This assay system also identified the TATA boxes of the pst1 and pst2 promoters as well as AT-rich motifs, named P boxes. Mutations in the P box, with the consensus ATATWWW , reduced the promoter activity of both the pst1 and pst2 promoters. The results indicated that the TATA-2 box of the pst1 promoter has an impact on the phosphate dependent promoter activity under phosphate limited conditions and could be used as a P box. In the second part of the study, the proposed functions of the transporters Pst1, Pst2 and Ugp and the kinetic parameters were determined. Different knockout mutants were constructed, and these showed that the Pst transporters had different phosphate affinities. It was concluded from the results that the binding proteins PstS1 and PstS2 can interact with both transporters. The phosphate transport systems Pst1 and Pst2 are used differently. Under phosphate saturated conditions the cell operates mainly with the lower-affinity Pst2 transporter. If phosphate becomes limiting in the environment, predominantly the high-affinity transporter Pst1 is induced. This process is regulated on the transcriptional as well as on the post-transcriptional level. Furthermore, it was shown that a deletion of the Pst1 transporters leads to a loss of phosphate-directed chemotaxis under Pi-stress. This result confirms the importance of the Pst1 transporter under phosphate limited conditions. In related studies, growth experiments showed that the Ugp transporter is the only transporter for glycerol-3-phosphate in H. salinarum. In addition, the search for a regulatory protein that is involved in the regulation of the genes of the PHO stimulon did not reveal any likely candidates, but it was shown that deletion of the pst1 operon leads to an induction of the pst2 operon.

Archaea combine bacterial with eukaryotic features to regulate cellular processes. While initiation of transcription resembles the eukaryotic RNA-Polymerase II apparatus, transcriptional regulation is predominantly bacteria-like. In this work the gene expression profile of amino acid metabolism and metal dependent processes in Halobacterium salinarum R1 was elucidated. To gain insights into transcriptional regulatory processes, microarray technology was used as a global approach. Genes encoding certain DNA binding proteins were deleted and/or overexpressed, to compare the expression pattern of the deletion- and overexpression strains, respectively, with the parental strain R1. For a better understanding of metal dependent processes H. salinarum was grown under iron starvation and compared to cells grown under normal conditions. For the investigation of metal dependent processes the DNA binding proteins SirR and TroR were chosen. To determine a possible function of the regulator protein, conclusions were drawn from a comparison of the deletion mutants ∆sirR and ∆troR, respectively, with the parental strain. SirR (staphylococcal iron regulator repressor) was shown to repress the expression of a Fe(II)/Mn(II) dependent ABC-transporter in the presence of iron. In accordance with this data the same transport operon was shown to be induced under iron starvation. Furthermore, TroR (transport related operon) was shown to repress the expression of a Mn(II)-dependent ABC-transporter. In addition, TroR induces the gene expression of the metal dependent regulator gene idr2, which represses together with iron siderophor synthesis genes. To study the amino acid metabolism in H. salinarum Lrp (leucine-responsive regulatory protein) proteins were chosen, because in both archaea and bacteria Lrp is connected to the coordination of amino acid metabolism. To take a closer look on Lrp-homologs further investigation were performed with lrp and lrpA1. Both genes are located next to genes, encoding proteins involved in amino acid metabolism. Possible Lrp target genes were identified by either constructing lrp and lrpA1 deletion mutants or overexpressing the two genes. Microarray analysis revealed that Lrp functions as a global regulator of transcription. Lrp activates the gene expression of the glutamine synthetase gene glnA, regulates the peptide- and phosphate transport, as well as the central intermediary metabolism, and activates the expression of the transcriptional regulator sirR. By the control of sirR gene expression through Lrp correlation between amino acid metabolism and metal dependent processes could be demonstrated. In contrast to Lrp, LrpA1 regulates gene expression of less genes, amongst them the aspartate transaminase gene aspB3, so that further studies were focussed on the gene regulation of aspB3. The second part of this work examines with specific protein-DNA interactions. Prior to interaction studies, RACE-analysis was used to determine 5´UTR and 3´UTR of certain transcripts. To perform protein-DNA binding studies LrpA1 and TroR were recombinantly expressed in Escherichia coli. A DNA-binding assay adapted to halophilic conditions revealed manganese dependent binding of TroR to its own promoter region. LrpA1 was also shown to bind to the lrpA1 promoter region, as well as an aspartate dependent binding to the aspB3 promoter region. CD-spectroscopy experiments could prove that the interaction between L-aspartate and LrpA1 stabilizes the secondary structure of the protein. To gain more insights into the LrpA1 and L-aspartate dependent aspB3 gene expression, northern blot analysis were performed, that showed an induction of the aspB3 transcription in the absence of L- aspartate. This occurs either in a medium lacking aspartate or after aspartate is metabolized in the stationary phase. At the same time, an induction of the lrpA1 gene expression was observed. This can be illustrated in a model that postulates a reciprocal regulation of the lrpA1 and aspB3 gene expression.

Halobacterium salinarum is a bioenergetically flexible, halophilic microorganism that can generate energy by respiration, photosynthesis, and the fermentation of arginine. In a previous study, using a genome-scale metabolic model, we have shown that the archaeon unexpectedly degrades essential amino acids under aerobic conditions, a behavior that can lead to the termination of growth earlier than necessary. Here, we further integratively investigate energy generation, nutrient utilization, and biomass production using an extended methodology that accounts for dynamically changing transport patterns, including those that arise from interactions among the supplied metabolites. Moreover, we widen the scope of our analysis to include phototrophic conditions to explore the interplay between different bioenergetic modes. Surprisingly, we found that cells also degrade essential amino acids even during phototropy, when energy should already be abundant. We also found that under both conditions considerable amounts of nutrients that were taken up were neither incorporated into the biomass nor used as respiratory substrates, implying the considerable production and accumulation of several metabolites in the medium. Some of these are likely the products of forms of overflow metabolism. In addition, our results also show that arginine fermentation, contrary to what is typically assumed, occurs simultaneously with respiration and photosynthesis and can contribute energy in levels that are comparable to the primary bioenergetic modes, if not more. These findings portray a picture that the organism takes an approach toward growth that favors the here and now, even at the cost of longer-term concerns. We believe that the seemingly "greedy" behavior exhibited actually consists of adaptations by the organism to its natural environments, where nutrients are not only irregularly available but may altogether be absent for extended periods that may span several years. Such a setting probably predisposed the cells to grow as much as possible when the conditions become favorable.

The aerobic, haloalkaliphilic archaeon Natronomonas pharaonis is able to survive in salt-saturated lakes of pH 11. With genome-wide shotgun proteomics, 886 soluble proteins (929 proteins in total) of the theoretical Natronomonas pharaonis soluble proteome consisting of 2187 proteins have been confidentially identified by MS/MS. By comparing the identified proteins of Natronomonas pharaonis with homologues of other organisms, both extreme diversity between halophiles and occasional extraordinary sequence conservation to proteins from unrelated species were observed, substantiating genetic exchange between organisms that are evolutionary nearly unrelated to cope with several extreme conditions. Alternative and largely overlapping open reading frames (called overprinting) could not be identified in the genome of neither Natronomonas pharaonis nor Halobacterium salinarum, leading to the conclusion that in halophiles, not more than one protein can be produced from the same genomic sequence stretch. In the second part of this work, analyses on both the transcriptional and translational level have been performed on the halophilic archaeon Halobacterium salinarum, to gain insights into its lifestyle changes leading to cell response when challenged by heat shock. Thereby, quantitative proteomic data obtained from two different approaches regarding the labeling method (ICPL; SILAC), the fractionation of the protein or peptide mixtures (2DE; 1DE-LC), the mass spectrometric analysis (MALDI-TOF/TOF; ESI Q-TOF), and the choice of the growth medium (complex; synthetic) were integrated with data from whole-genome DNA microarrays, real-time quantitative PCR (RTqPCR), and Northern analyses. A number of genes congruently displayed substantial induction after heat shock on both the transcript and protein level as in the case of the thermosome, two AAA-type ATPases, a Dps-like ferritin protein (DpsA), a hsp5-type molecular chaperone, and the transcription initiation factor tfbB. In contrast, the dnaK operon (hsp70) did not exhibit any significant upregulation in either of the approaches. Some genes encoding enzymes of the TCA cycle, of pathways flowing into the latter, and of pathways leading to pyrimidine synthesis, were only translationally induced. Finally, differential transcriptional induction of the transcription initiation factors tfbB and tfbA, determined by RTqPCR, led to the conclusion that they may regulate genes by reciprocal action. The multiplicity of proteomics and transcriptomics methods are complementing one another, covering a bigger area on the one hand, but also confirming some unexpected findings.

Tue, 9 Dec 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/10208/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/10208/1/Schlesner_Matthias.pdf Schlesner, Matthias ddc:540, ddc:500, Fakultät für Chemie und Pharmazie

Mon, 17 Mar 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9276/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9276/1/Staudinger_Wilfried.pdf Staudinger, Wilfried ddc:500, ddc:540, Fakult

Basierend auf der Genomsequenz von H. sal. R1 wurde ein genspezifischer Gesamt-Genom-DNA-Mikroarray konstruiert. Hierzu wurden für jeden ORF des Genoms ORF-spezifische Oligonukleotide abgeleitet und zur spezifischen Amplifizierung der Genabschnitte mittels PCR eingesetzt. Nach Amplifizierung und Reinigung der Genabschnitte deckten die Produkte über 97% des halobakteriellen Genoms ab. Zur Konstruktion des Gesamt-Genom-DNA-Mikroarrays wurde jede spezifische Gensonde in fünffacher Wiederholung auf den DNA-Array aufgebracht. Auf diese Weise wurde ein DNA-Mikroarray erstellt, der mit einer Gesamtzahl von 13545 genspezifischen Sonden, das bisher dichteste Raster eines archaealen DNA-Mikroarrays aufweist. Durch parallele genomweite Genexpressionsanalyse in H. sal. R1, wurde der Vergleich zwischen aerobem und phototrophem Wachstum in drei umfassenden DNA-Mikroarrayexperimenten gezogen. Die Mikroarrayexperimente wurden mit dem so genannten „common reference“ Experimentdesign durchgeführt, bei dem eine Mischung aller RNA-Proben eines Experiments als Referenz bei den Hybridisierungen dient. Als weitere Vorraussetzung zur späteren statistischen Datenanalyse wurden die Transkriptomexperimente alle vier- bis fünfmal in unabhängigen Experimenten wiederholt. Die Wahl der Referenz und die Anzahl der unabhängigen biologischen Replikate haben die Basis geschaffen, die erhobenen Expressionsdaten mit Hilfe des R/MAANOVA Paktes der flexiblen und leistungsstarken statistischen Programmoberfläche R auszuwerten. Eine leistungsstarke und flexible Programmoberfläche zur Datenanalyse war unerlässlich, denn mit steigender Komplexität eines Transkriptomexperiments, steigt auch die Anzahl der notwendigen Wiederholungen und damit einhergehend die Gesamtzahl der auszuwertenden Datenpunkte. Für ein durchgeführtes Zeitreihenexperiment vom Wechsel aerobes zu phototrophem Wachstum mit sechs Zeitpunkten, fallen ca. 384.000 Datenpunkte an, für deren Vorder- und Hintergrundwerte die statistischen Kennwerte berechnet werden mussten. Ein solcher statistischer Kennwert ist der so genannte p-Wert, der die Signifikanz eines Ergebnisses widerspiegelt. Auf der Basis dieser signifikanten p-Werte ist eine Liste von 242 Kandidatengenen erstellt worden, die als differentiell exprimiert angesehen werden. Ein Anteil von 54.5% dieser differentiell exprimierten Gene weist kein homologes Protein oder Funktion auf. Diese Tatsache, birgt die Chance sowohl die Existenz dieser ORFs, als auch ihre Funktion aufzuklären. In diesem Zusammenhang wurden für die hypothetischen ORFs OE3107F und OE3136F Deletionsmutanten hergestellt und näher charakterisiert. Dabei wurde festgestellt, dass die Deletionsmutanten R1D3107 und R1D3136 im Vergleich zum WT-Stamm H. sal. R1 deutliche Unterschiede in ihrer Pigmentzusammensetzung aufweisen. Beide Deletionsstämme weisen z.B. einen geringeren Gehalt an Bakteriorhodopsin auf. Somit hat die neu etablierte Methode der DNA-Mikroarray basierten Genexpressionsanalyse dazu beigetragen, zwei bisher unbekannte Kandidaten der Regulation der Expression des Bakteriorhodopsins in H. sal. R1 zu identifizieren. Durch zellfreie in vitro Expression des Gens OE3136F wurde ein möglicher Ansatz zur näheren Charakterisierung und Funktionsaufklärung aufgezeigt. Neben der Herstellung von Deletionsmutanten und deren Charakterisierung, wurde durch die Anwendung einer weiteren Datenanalyse mittels PCA (Hauptkomponentenanalyse) und dem Ansatz die erhobenen Transkriptomdaten auf Stoffwechselwegen abzubilden, zwei weitere denkbare Wege aufgezeigt, aus den ermittelten Expressionsdaten mehr Informationen zu erhalten. Die Ergebnisse aller Transkriptomexperimente für H. sal. R1 stimmen mit den Ergebnissen früherer Arbeiten überein und durch unabhängige Methoden wie RT-PCR, Nothern-Blot-Analysen und Proteomvergleich konnten die Resultate der Expressionsanalysen eindeutig verifiziert werden. Die Konstruktion und Herstellung der H. sal. R1 Gesamtgenom-Mikroarrays und Ausarbeitung eines Standardprotokolls zur Versuchsdurchführung, bilden die Grundlage aller Transkriptomexperimente der Arbeitsgruppe. Daneben ermöglicht die Schaffung einer bioinformatischen Infrastruktur zur statistisch signifikanten Auswertung der DNA-Mikroarray-Hybridisierungsergebnisse die Erstellung einer Transkriptomdatenbank, die durch Anknüpfung an die bereits vorhandene HaloLex-Datenbank jedem Nutzer für weitere Mikroarray-Experimente mit anderer Fragestellung in leichter Form zur Verfügung steht. Abschließend kann gesagt werden, dass die DNA-Mikroarray basierende Transkriptomanalyse von H. sal. R1 dazu beigetragen hat das Wissen über den Prozess der Anpassung an das phototrophe Wachstum zu erweitern. Die in der Arbeit erhobenen Daten bilden die Grundlage einer Datensammlung, die es zu einem späteren Zeitpunkt ermöglichen wird, über viele verschiedene Experimente hinweg neue Co-Regulationen von Genen zu erfassen und damit neue Gene und Verknüpfungen zwischen Stoffwechselwegen schnell und einfach zu detektieren. Die vorliegende Arbeit kann als Ausgangspunkt für genomweite funktionelle Charakterisierung haloarchaealer Genexpression und ihrer Regulation angesehen werden. Dieser Punkt ist im Hinblick auf die wachsende Bedeutung der Systembiologie von entscheidender Wichtigkeit, denn nur auf der Basis von soliden experimentellen Ergebnissen können Modelle aufgestellt und verbessert werden.

Flavins are physiologically relevant cofactors that catalyze various redox and light-induced reactions. Due to a high intrinsic reactivity, these compounds are found tightly bound to proteins with the chemistry of the flavin either narrowed to a defined reaction channel (flavoenzymes) or reduced to (almost) non-reactivity (flavin binding and carrier proteins). Lumichrome is a product of flavin photodegradation. In spite of the structural similarity to flavins, lumichrome has electronic properties which differ from flavins, preventing this compound from any physiological relevance as a cofactor. The interest in lumichrome is basically focussed on its role as a photosensitizing compound. Lumichrome is excited by the absorption of visible light and relaxes by transferring electrons or electronic energy to surrounding substrates and oxygen, exerting an unspecific toxic effect on the cellular environment. Dodecin is a dodecameric flavin binding protein comprising a novel ligand binding fold. It incorporates dimers of ligands arranged in antiparallel manner within each of the six identical binding pockets. In this thesis, structure and function of dodecin from the archaeal organism Halobacterium salinarum are reported. X-ray structural investigations supplemented with functional data revealed that this protein is an unspecific binder of flavins and binder of the flavin-like compound lumichrome. Dissociation constants were obtained in the nanomolar to micromolar range and found to correlate positively with the ligand size. The preference of dodecin for the small ligands lumichrome and lumiflavin is described as a gated ligand binding mode, based on the low plasticity of the dodecin binding pocket which sterically restricts the bulkier ligands from arranging the flavin aromatic subunit in a high affinity position. Site directed mutagenesis of the halophilic dodecin allowed to spread the idea of dodecin as a small ligand binding particle among homologous proteins. These mutational studies could moreover show that the halophilic type of dodecins is outstanding in additionally exhibiting a high affinity for riboflavin. The stabilization of the ribityl chain by an H-bond network to a single residue was found to suspend restrictions of the gated ligand binding mode and to enable H. salinarum dodecin to exhibit multiple (high) affinity. In Western-Blot and RT-PCR analysis of the dodecin expression level, it could be demonstrated that after a short lag period dodecin is constitutively expressed in light and in dark. In the late stationary phase, a clear influence of dodecin on the riboflavin cellular concentrations could be observed. While high levels of riboflavin were found in H. salinarum wild type cells, in cells of the dodecin deficient strain riboflavin cellular concentrations were depressed. Lumichrome concentrations on the other hand were unaffected from dodecin; however; increased concentrations of lumichrome were found in light, according to a photolytic degradation of riboflavin. In vivo data fully agreed with the deductions from the dodecin structural and functional investigations. Dodecin is a riboflavin binding and carrier protein (RfBP). Its function is to store riboflavin under non-favorable environmental conditions while preventing this flavin from photodegradation. The lumichrome-collecting property represents an extra-feature which allows binding of lumichrome if degradation of riboflavin occurs in order to protect the cellular environment from high amounts of this photo-toxic compound.

Die vorliegende Arbeit diente der funktionellen Charakterisierung der Zwei-Komponenten Systeme (ZKS) des halophilen Archaeons Halobacterium salinarum. Von der Existenz mehrerer Histidinkinasen (HK) und Antwortregulatoren (RR) neben dem Chemotaxis-ZKS CheA/CheY weiss man nur aufgrund der Sequenzierung des Genoms. Folglich fehlten bislang funktionelle Beschreibungen dieser Proteine. Die vorgelegte Dissertation begann, diesen Mangel zu beheben. Den Laborversuchen war eine bioinformatische Bestandsaufnahme vorgeschaltet, welche die Sensordomänen der HK, die Effektordomänen der RR und die konservierten ZKS-Domänen beider Proteinklassen nach greifbaren Anhaltspunkten durchforstete. Diese Rasterfahndung vermochte jedoch nur bescheidene Hinweise auf die Funktionen und Wechselwirkungen der HK und RR zu erbringen. Die praktischen Arbeiten zur funktionellen Charakterisierung der halobakteriellen ZKS basierten auf zwei unterschiedlichen Strategien. Der erste Ansatz bestand in dem Versuch einer Funktionszuordnung über die Applikation eines Phosphatmangels, dem alle bislang daraufhin untersuchten Prokaryoten durch eine exklusiv ZKS gesteuerte, differentielle Genexpression entgegenwirken. Im zweiten Ansatz wurde mit OE3855R eine der wenigen HK, deren Primärsequenz einen Hinweis auf die Proteinfunktion lieferte, eingehend biochemisch analysiert. Für die Phosphatmangelversuche musste zunächst geprüft werden, bei welchem Nährstoffangebot H. salinarum in eine Unterversorgung gerät. Den Experimenten zufolge limitiert ein Phosphatgehalt von weniger als 0,5mM im Medium die finale Wachstumsdichte. Die mangelhafte Phosphatversorgung induziert das Gen aph, was zu einer verstärkten Produktion und Sekretion des Enzyms Alkalische Phosphatase führt. Mikroarray-Analysen und RT-qPCR-Experimente deckten auf, dass das halobakterielle Pho-Regulon mehrere ABC-Transportsysteme und verschiedene sekretierte Enzyme umfasst. Über die somit stark verbesserten Phosphataufnahmefähigkeiten hinaus ändert sich die Transkription einer Vielzahl weiterer Gene, wobei es sich wahrscheinlich um sekundäre Effekte handelt. Während der Hungerphase verbraucht H. salinarum drei Viertel seines intrazellulären Phosphatspeichers. Die massive Abnahme des Phosphatvorrats ist nicht nur die Folge der Mangelversorgung, sondern gleichzeitig verantwortlich für die Induktion des Pho-Regulons. Das zuständige Regulatorprotein wurde bislang nicht enttarnt. Durch Konstruktion mehrerer Deletionsstämme konnten klassische ZKS als Signaltransduktoren überraschenderweise ausgeschlossen werden. Die Induktion von Proteinen mit Homologien zu DNA bindenden Bereichen von Transkriptionsfaktoren und zu dem regulatorischen Mediatorprotein PhoU deutet auf einen alternativen Regelkreis hin. Dieser wäre exklusiv für Archaea, da solche PhoU-Chimären ausschließlich in archaealen Genomen zu finden sind. Von der Anpassung des Proteininventars abgesehen orientieren H. salinarum-Zellen ihre Bewegungen an einem Phosphatgradienten. Diese Chemotaxis wird durch Phosphatmangel induziert und durch das Zwei-Komponenten System CheA-CheY vermittelt. Erstmals in einem Archaeon gezeigt, wird die Phosphattaxis von H. salinarum ausschließlich von anorganischem Phosphat ausgelöst. Laut Primärsequenzanalyse besitzt die Histidinkinase OE3855R eine Häm bindende PAS-Domäne (PAS3855) und könnte daher einen Sauerstoffsensor darstellen. Eine heterologe Expression von PAS3855 sollte dieser Hypothese Substanz verleihen. Das exprimierte Polypeptid enthielt geringe Mengen eines Kofaktors, der mittels Absorptionsspektroskopie und LC-MS-Analyse als Häm des Typs B identifiziert wurde. Auf Basis dieses Wissens erfolgte die Rekonstitution der Domäne mit HämB, was die Bildung eines Tetramers induzierte. Die spektroskopische Analyse entlarvte große Ähnlichkeiten zwischen den elektronischen Zuständen der zentralen Häm-Eisenionen von PAS3855 und dem Häm bindenden Redoxsensorprotein Dos aus E. coli. Da die Reduktion von FeIII- zu FeII-PAS3855 die Oligomerisierung der Domäne von einem Tetramer zu einem Dimer veränderte, lag eine redoxabhängige Signalfunktion der Histidinkinase OE3855R nahe. Die Deletion des kodierenden Gens führte zu keinem erkennbaren Phänotyp, weshalb zum gegenwärtigen Zeitpunkt keine Aussage getroffen werden kann, ob diese HK in vivo tatsächlich als Redox- oder auch Sauerstoffsensor fungiert.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden unterschiedliche Proteomstudien an Halobacterium salinarum durchgeführt, die sich generell in drei unabhängige Themenblöcke unterteilen lassen. Zunächst erfolgte die Erfassung des cytosolischen Proteoms auf standardisierten 2-D Gelen. Hierfür wurde die Auftrennung auf sogenannten Zoom-Gelen aufgrund der engen pI-Verteilung halobakterieller Proteine etabliert. Die erschöpfende Analyse der so aufgetrennten Proteine wurde mit der peptide mass fingerprinting Methode im Hochdurchsatzverfahren durchgeführt. So konnten so 40% des zugänglichen cytosolischen Proteininventars identifiziert und auf Referenz 2-D Gelen kartiert werden. Des Weiteren konnten die massenspektrometrischen Proteinidentifizierungen zur intensiven Verbesserung der in vielen Fällen nicht eindeutigen Genomannotation herangezogen werden. Durch die Korrelationsanalyse von experimentellen und theoretischen pI-Werten konnten weitere Annotationsfehler behoben werden. Das Zusammenspiel von Genomik und Proteomik erlaubte die Identifizierung eines Bereichs ehemaliger Plasmid DNA, die in das Chromosom eingewandert ist. Weiter konnte für ein Plasmid gezeigt werden, dass dieser ehemalig chromosomale DNA und somit eine Reihe wichtiger und essentieller Gene enthält und deshalb eher als zweites Chromosom angesehen werden sollte. Nach der Inventarisierung folgten Analysen zur differentiellen Expression cytosolischer Proteine in Abhängigkeit unterschiedlicher Wachstumszustände. Hierbei wurde das aerobe Wachstum unter Standardbedingungen mit Wachstum unter Mangelbedingungen wie in synthetischem Medium oder unter anaeroben phototrophen Bedingungen verglichen. Bei der Analyse dieser Zustände mittels 2-DE konnten nur wenig regulierte Proteine identifiziert werden. Generell stellte sich die 2-DE aufgrund schwankender Reproduzierbarkeit und des geringen dynamischen Bereichs der gewählten Färbemethode für diese vergleichenden Analysen als wenig geeignet heraus. Die Verwendung isotopenmarkierter Sonden erlaubte hingegen einen detaillierten Einblick in die Regulationen auf Proteomebene unter besagten Bedingungen. Mit dem methodischen Ansatz der 1D-SDS PAGE LC-MALDI-TOF/TOF Analyse konnten von einem beträchtlichen Teil (ca. 40%) des cytosolischen Proteoms Regulationsinformationen erhalten werden. Auch hier zeigte sich, dass unter anaeroben phototrophen Bedingungen überraschend wenige Proteine reguliert werden müssen, damit sich der Organismus auf diese Lebensbedingung einstellen kann. Wachstum unter Nährstoffmangel in synthetischem Medium induziert überwiegend Proteine der Aminosäure- und Nukleotid-Biosynthese sowie Proteine, die am Proteinschutz und der Glykolyse beteiligt sind. Unter Standardwachstum wurden Proteine als induziert identifiziert, die bei nicht ausreichendem Vorhandensein wachstumslimitierend wirken würden. Dies waren hauptsächlich Enzyme der Thiamin und Cobalamin Biosynthese sowie des Peptid-Transportes und -Abbaues. Auch die CO2-Fixierung und die nachfolgende Gluconeogenese sind induziert. Durch die Verwendung unterschiedlicher Proteomik Ansätze konnte am Ende der Großteil der cytosolischen Proteine von H. salinarum identifiziert werden. Es scheinen nahezu alle chromosomalen Proteine auch unter Standard Wachstumsbedingungen expremiert zu werden, was starke Regulationen der Proteinkonzentrationen in Abhängigkeit unterschiedlicher Lebensbedingungen nicht notwendig macht. Der Organismus kann sich so schnell ohne großen energetischen Aufwand an wechselnde Lebensbedingungen anpassen. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde das Ausmaß der Proteinphosphorylierung in H. salinarum untersucht. Hierbei konnten zunächst über radioaktive in vivo Markierung phosphattragende Proteine identifiziert werden. Ebenfalls gelang es, die ersten halobakteriellen Serin und Threonin Phosphorylierungsstellen zu identifizieren. Generell zeigte sich jedoch, dass das Ausmaß der Proteinphosphorylierung in H. salinarum eher gering ist. Bei den identifizierten Phosphorylierungen handelte es sich ausschließlich um katalytische Zwischenprodukte. Für die Existenz von regulativen Ser/Thr oder Tyr Proteinphosphorylierungen waren keine eindeutigen Hinweise zu finden. Weiter gelang es, eine Vielzahl von N-terminal acetylierten Proteinen als eine weitere Form der posttranslationalen Modifikationen zu identifizieren.

Halophilic archaea inhabit hypersaline environments and share common physiological features such as acidic protein machineries in order to adapt to high internal salt concentrations as well as electron transport chains for oxidative respiration. Surprisingly, nutritional demands were found to differ considerably amongst haloarchaeal species, though, and in this project several complete genomes of halophilic archaea were analysed to predict their metabolic capabilities. Comparative analysis of gene equipments showed that haloarchaea adopted several strategies to utilize abundant cell material available in brines such as the acquisition of catabolic enzymes, secretion of hydrolytic enzymes, and elimination of biosynthesis gene clusters. For example, metabolic genes of the well-studied Halobacterium salinarum were found to be consistent with the known degradation of glycerol and amino acids. Further, the complex requirement of H. salinarum for various amino acids and vitamins in comparison with other halophiles was explained by the lack of several genes and gene clusters, e.g. for the biosynthesis of methionine, lysine, and thiamine. Nitrogen metabolism varied also among halophilic archaea, and the haloalkaliphile Natronomonas pharaonis was predicted to apply several modes of N-assimilation to cope with severe ammonium deficiencies in its highly alkaline habitat. This species was experimentally shown to possess a functional respiratory chain, but comparative analysis with several archaea suggests a yet unknown complex III analogue in N. pharaonis. Respiratory chains of halophilic and other respiratory archaea were found to share similar genes for pre-quinone electron transfer steps but show great diversity in post-quinone electron transfer steps indicating adaptation to changing environmental conditions in extreme habitats. Finally, secretomes of halophilic and non-halophilic archaea were predicted proposing that haloarchaea secretion proteins are predominantly exported via the twin-arginine pathway and commonly exhibit a lipobox motif for N-terminal lipid anchoring. In N. pharaonis, lipoboxcontaining proteins were most frequent suggesting that lipid anchoring might prevent protein extraction under alkaline conditions. By contrast, non-halophilic archaea seem to prefer the general secretion pathway for protein translocation and to retain only few secretion proteins by N-terminal lipid anchors. Membrane attachment was preferentially observed for interacting components of ABC transporters and respiratory chains and might further occur via postulated C-terminal anchors in archaea. Within this project, the complete genome of the newly sequenced N. pharaonis was analysed with focus on curation of automatically generated data in order to retrieve reliable gene prediction and protein function assignment results as a basis for additional studies. Through the development of a post-processing routine and expert validation as well as by integration of proteomics data, a highly reliable gene set was created for N. pharaonis which was subsequently used to assess various microbial gene finders. This showed that all automatic gene tools predicted a rather correct gene set for the GC-rich N. pharaonis genome but produced insufficient results in respect to their start codon assignments. Available proteomics results for N. pharaonis and H. salinarum were further analysed for posttranslational modifications, and N-terminal peptides of haloarchaeal proteins were found to be commonly processed by N-terminal methionine cleavage and to some extent further modified by N-acetylation. For general function assignment of predicted N. pharaonis proteins and for enzyme assignment in H. salinarum, similarity-based searches, genecontext methods such as neighbourhood analysis but also manual curation were applied in order to reduce the number of hypothetical proteins and to avoid cross-species transfer of misassigned functions. This permitted to reliably reconstruct the metabolism of H. salinarum and N. pharaonis. Generated metabolic data were stored in a newly developed metabolic database that also integrates experimental data retrieved from the literature. The pathway data can be assessed as coloured KEGG maps and were combined with data resulting from transcriptomics and proteomics techniques. In future, expert-curated reaction entries of the created metabolic database will be a valuable source for the design of metabolic experiments and will deliver a reliable input for metabolic models of halophilic archaea.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Proteome von H. salinarum untersucht, die nach zellulären Kompartimenten unterschieden wurden in (1) das Flagellarmotor-Proteom (2) das Cytosolproteom und (3) das Membranproteom. Die Untersuchung des Flagellarmotors erfolgte hauptsächlich auf struktureller Basis mittels Elektronenmikroskopie. Es konnte eine Struktur mit zwei übereinanderliegenden Ringen isoliert werden, die beide an eine Flagelle gebunden sind. Aus weiteren Aufnahmen und Größenkorrelationen wurde ein Modell zum Flagellarmotor entworfen, welches eine Rotation beider Ringe beinhaltet. An diese Doppelringstruktur sind mehrere Flagellen über einen Hook gebunden, was dieses Modell damit vom bakteriellen Flagellarmotor unterscheidet. Bei der Untersuchung des Cytosolproteoms konnten insgesamt 840 Proteine mittels MALDI-MS-Fingerprint identifiziert werden, was einer Identifizierungsrate von 38% des löslichen Proteoms entspricht (Identifizierungsrate aller löslichen Proteine größer 20 kD: 61%). Es wurde eine massenkompatible Silberfärbung optimiert und ein semi-manuelles Verfahren zur in-Gel Spaltung entwickelt, mit dem 800 Proteine/Tag enzymatisch gespalten werden können. Für die anschließende Identifizierung wurde ein Standardprotokoll für die Proben- und Matrixpräparation entwickelt, welches sich im Vergleich zu anderen automatischen Präparationen als zuverlässiger und sensitiver gezeigt hat. Im Verlauf dieser Arbeit wurde von der Bioinformatikgruppe (Dr. F. Pfeiffer) das web-basierte HALOLEX-System entwickelt, welches als Ziel die vollständige Erfassung aller Fakten zu H. salinarum hat. Die generierten Daten (Gele, Proteinidentifizierungen, MALDI-Peaks, MS/MS-Peaks) werden innerhalb dieser Oberfläche zugänglich gemacht und erlauben detaillierte Nachanalysen. Für das Membranproteom wurde gezeigt, dass der etablierte Zellaufschluss mittels Niedrigsalz-Dialyse zu einer erheblichen Kontamination mit löslichen Proteinen führt. Ein Aufschluss unter Hochsalzbedingungen mit anschließender Dichtegradienten-Zentrifugation reinigt die Membran, jedoch dissoziiert die Zellmembran bei anschließender Niedrigsalz-Behandlung in hohem Maße in nicht pelletierbare Fragmente. Eine optimierte Membranaufarbeitung unter ständigen Hochsalzbedingungen, Dichtegradienten-Zentrifugation, Delipidierung und Solubilisierung in einer Detergenzienmischung (Triton X-100/ASB-14) führte bei anschließender zweidimensionaler Trennung (IEF/SDS) zur Identifizierung von fast ausschließlich peripheren Membranproteinen. Mit einer fluoreszenzmarkierten Membranfraktion konnte gezeigt werden, dass der Verlust von integralen Membranproteinen auf einer nahezu quantitativen Präzipitation der Membranproteine an derem pI beruht. Eine pI-unabhängige Strategie wurde mittels BAC/SDS etabliert, die speziell bei H. salinarum zu einer guten Proteinauftrennung führt. Die Identifizierung eines 13 TM-Antiporters (0,22 TM/kD, GRAVY +0,74) als dominantestes Protein dieser Membranfraktion zeigt die Anwendbarkeit dieses Systems. In einem Vergleich von Membranfraktionen aus aerob und phototroph gewachsenen Kulturen konnten so Unterschiede des Expressionsniveaus von Membranproteinen nachgewiesen werden. Aus theoretischen Berechnungen der vorhergesagten Membranproteine zeigte sich weiterhin, dass bei tryptischer Spaltung nicht ausreichend Peptid-Fragmente generiert werden, um mittels MALDI-Fingerprint-Analyse identifiziert zu werden. Diese (H. salinarum spezifische) Problematik kann mittels MS/MS umgangen werden. Bei der Kombination aus 1-D Gel und LC/MS/MS konnten schließlich 114 integrale Membranproteine identifiziert werden, was 20% des integralen Membranproteoms entspricht.

Wed, 21 Apr 2004 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/2995/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/2995/1/Oppawsky_Christoph.pdf Oppawsky, Christoph ddc:540, ddc:500, Fakultät für Chemie und Pharmazie

Röntgenographische Untersuchung des L-Intermediats in Halorhodopsin

Wed, 12 Feb 2003 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/798/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/798/1/Schaer_Andreas.pdf Schaer, Andreas ddc:540, ddc:500, Fakultät für Chemie

In der vorliegenden Arbeit wird die Isolierung, die Kristallisation und die Röntgenstrukturanalyse der lichtgetriebenen Anionenpumpe Halorhodopsin (HR) aus Halobacterium salinarum vorgestellt. Aufbauend auf die 3-dimensionale Struktur von HR und von Bakteriorhodopsin (BR) wird ein Modell des Ionentransportes (Protonen und Halidionen) in archaealen Ionenpumpen entwickelt, welches die unterschiedliche Spezifität und Vektorialität dieser Retinalproteine mit Rücksicht auf die bekannten biochemischen Daten erklärt. Eine quantitative Analyse der Chromophorenkonformation im HR-Grundzustand (Resonanz-Raman-Spektroskopie) sowie lichtinduzierter Veränderungen (UV/VIS- und FTIR-Spektroskopie) vervollständigt die Beschreibung der HR-Kristalle und ermöglich die Durchführung weitergehender Strukturanalysen zum Anionentransport in HR.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion ausgesuchter Aminosäuren in der archaealen Protonenpumpe Bacteriorhodopsin (BR) bei der Entstehung der zweidimensional kristallinen Purpurmembran (PM) in Halobacterium salinarum untersucht. Mittels gerichteter Mutagenese wurden aromatische Gruppen (W12, Y64, W80) gegen andere Reste ausgetauscht und die mutierten Gene homolog exprimiert. Die Tryptophanmutationen hatten dabei eine drastische Störung der PM-Bildung zur Folge, was auf wichtige Wechselwirkungen mit Lipidmolekülen schließen ließ. Insbesondere der Tryptophanrest W80, der mit dem Phythanylrest eines Glykolipids im Zentrum des Trimers wechselwirkt, zeigte seine essentielle Bedeutung für die PM-Bildung. Eine Abhängigkeit der PM-Bildung von der vorhandenen BR-Menge und Wachstumsphase konnte beim Wildtyp (WT) ausgeschlossen werden. Gefrierbruchelektronenmikroskopische Aufnahmen von ganzen Zellen zeigten bei der Mutante BR-W12I zahlreiche kleinere kristalline Bereiche auf der Oberfläche, während die Zellen mit BR-W80I nahezu keine geordneten Flächen aufwiesen. Mit Hilfe von Rotationsdiffusionsmessungen in Vesikeln und Elektronenspinresonanz(ESR)-Spektroskopie von spinmarkierten Cysteinmutanten wurde eine Zunahme der Mobilität der markierten Seitenketten und des mittleren Abstands der BR-Moleküle nachgewiesen. Lichtinduzierte Proteinvernetzung zeigte eine deutliche Auflockerung der kristallinen Struktur der mutierten BR-Moleküle in der Zellmembran, vor allem bei BR-W80I. Die Funktion von BR als Protonenpumpe wurde durch die Mutationen nicht beeinträchtigt, ebenso wurde keine durch die PM bewirkte höhere Photophosphorylierungsrate in den Zellen nachgewiesen, weshalb eine Begünstigung dieser Prozesse als Erklärung für die in vivo- Kristallisation ausgeschlossen wurde. Der Einfluß der Mutationen auf die spektroskopischen Eigenschaften war vergleichsweise gering. Jedoch bot die Abnahme der Lichtadaptationsfähigkeit und Zunahme des Anteils an inaktiven 9- und 11-cis-Retinalisomeren in lichtadaptierten Proben eine plausible Erklärung für die Bildung der kristallinen PM. Die Bildung des 9-cis-Isomeren führt zur Spaltung der Bindung zwischen Retinal und dem Protein. Dies wurde durch Belichtung von Zellen mit BR-W80I nachgewiesen, die innerhalb weniger Stunden ihren aktiven Chromophor in BR verloren. Demnach wird durch die kristalline Anordnung von BR die thermoreversible Isomerisierung von all-trans- zu 13-cis-Retinal so stark bevorzugt, dass die funktionelle Stabilität des Proteins gewährleistet ist. Dies erklärt den evolutionären Vorteil des kristallinen Form des BR als Purpurmembran. Das Vorkommen von zweidimensionalen Kristallen von Halorhodopsin (HR) mit hexagonaler Ordnung im Überexpressionsstamm D2 wurde mittels Gefrierbruchelektronenmikroskopie nachgewiesen. Eine ähnliche Anordnung wurde in 3D-Kristallen gefunden, die im Rahmen dieser Arbeit durch Aufreinigung des Proteins und Kristallisation in kubischen Lipidphasen erhalten wurden (Kolbe et al., 2000). Damit wurde gezeigt, dass in den 3D-Kristallen von HR die gleiche Anordnung wie in der Zellmembran auftreten kann. Dies ließ auch auf eine physiologische Relevanz des Palmitatmoleküls schließen, das im Innern des HR-Trimers in der Kristallstruktur gefunden wurde. Die Affinität dieser Fettsäure zu HR wurde durch Markierung der Zellen mit 3H-Palmitat untersucht. Aus diesen Experimenten ging hervor, dass die Affinität der Palmitinsäure zu HR im Vergleich zu BR nicht höher ist. Eine BR-Mutante, die in einer nichtkristallinen Anordnung vorlag, wurde als Kontrolle verwendet. Es wurde ein Vektor konstruiert, der die Klonierung und homologe Expression von Genen für lösliche Proteine als Fusionsprotein am C-terminus von BR ermöglicht. Dies wurde mit dem Gen für das Ferredoxin von H. salinarum erfolgreich durchgeführt. Die rasche Aufreinigung der entstandenen PM mittels Zentrifugation in einem Saccharosedichtegradienten führte zu einer einfachen Abtrennung von einem Großteil anderer Proteine. Durch Einführung spezifischer Proteaseschnittstellen wurde auch eine Spaltung des Fusionsproteins ermöglicht. Die Koexpression löslicher Proteine mit BR in der PM bietet enorme Vorteile aufgrund der hohen Expressionsrate des Bacterioopsingens (bop), der Induzierbarkeit des bop-Promoters, die einfache Aufreinigung und der Möglichkeit zur Expression von Mutanten von essentiellen Genen ohne deren vorherige Deletion. Die Eignung dieses Systems für die einfache Isolierung von löslichen Proteinen als Fusionsprotein mit BR wurde im Rahmen dieser Arbeit bestätigt.

Sun, 1 Jan 1984 12:00:00 +0100 https://epub.ub.uni-muenchen.de/3238/1/3238.pdf Kaiser, Wolfgang; Zinth, Wolfgang; Franz, M. A.; Polland, Hans-Joachim ddc:530, Physik