Podcasts about su5614

Bei etwa 30 % der Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) können aktivierende Mutationen der Rezeptortyrosinkinase FLT3 gefunden werden. Damit ist FLT3 eines der am häufigsten mutierten Gene in der AML. Die Mutationen treten in zwei Regionen des FLT3-Rezeptors auf: Längenmutationen (FLT3-LM) in der juxtamembranösen Region (24 %) und Punktmutationen der Aktivationsschleife der zweiten Tyrosinkinasedomäne (FLT3-TKD-Mutationen; 7 %). FLT3-Mutationen verleihen Ba/F3-Zellen Unabhängigkeit von Interleukin-3. In einem Knochenmarktransplantationsmodell der Maus erzeugen FLT3-LM ein myeloproliferatives Syndrom und in Zusammenwirken mit PML-RARα eine akute Promyelozytenleukämie. Darüber hinaus scheint das Auftreten von FLT3-LM bei Patienten mit einer schlechteren Prognose assoziiert zu sein. In dieser Arbeit wurden AML-Zelllinien und durch FLT3-Mutationen transformierte Ba/F3-Zellen mit dem kleinmolekularen PTK-Inhibitor SU5614 behandelt. SU5614 induziert selektiv Wachstumsarrest, Zellzyklusarrest und Apoptose in Ba/F3-Zellen und leukämischen Zelllinien, die FLT3-Mutationen tragen. Darüber hinaus hebt SU5614 die antiapoptotische und wachstumsfördernde Wirkung von FLT3-Ligand (FL) in FL-abhängigen Zellen auf. In Zelllinien, die keinen aktivierten FLT3-Rezeptor tragen, zeigte die Substanz keine zytotoxische Wirkung. Auf biochemischer Ebene hemmt SU5614 die Hyperphosphorylierung des FLT3-Rezeptors und seiner Downstream-Targets STAT3, STAT5 und MAPK, sowie die Expression der STAT5-Zielgene BCL-XL und p21. Es konnte somit demonstriert werden, dass das Indolinonderivat SU5614 ein potenter Hemmstoff von mutiertem FLT3 und Wildtyp-FLT3 ist. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass Zelllinien leukämischen Ursprungs, die endogen FLT3-Mutationen exprimieren, selektiv empfindlich gegenüber SU5614 sind. Diese selektive und potente Zytotoxizität von FLT3-Inhibitoren impliziert den klinischen Einsatz solcher Inhibitoren als zusätzliche molekulare Therapiemöglichkeit bei Patienten mit akuter myeloischer Leukämie und FLT3-Mutationen.

The hallmark of hematopoietic stem cells (HSC) is their ability of self-renewal and differentiation into multiple hematopoietic cell lineages. Although the molecular network controlling stem cell fate decisions is largely unknown, multiple studies have attributed a key role to transcription factors in this developmental process. In this context the family of homeobox genes was characterized as ‘master genes’ of this early hematopoietic development. The identification of new genes involved in normal and leukemic hematopoiesis and the development of therapies against deregulated processes in hematopoiesis are the major goals in experimental and clinical hematology. . The identification of new genes involved in normal and leukemic hematopoiesis and the development of therapies against deregulated processes in hematopoiesis are the major goals in experimental and clinical hematology. Therefore, the focus of this thesis was the characterization of two novel putative regulatory proteins of early human hematopoiesis, the hematopoietic PBX-interacting protein (HPIP) and the human Vent-like Homeobox gene (VENTX2) and to investigate to the activity of the FLT3 protein kinase inhibitor SU5614 on leukemic blast from AML patient samples. Using complex in vitro assays we analyzed the impact of constitutive expression of HPIP and VENTX2 on stem cell and early human hematopoietic development. To detect clonal progenitor cells primary and secondary colony-forming-unit (CFC) assays were performed. In addition the in vitro equivalent of HSC long-term culture initiating cells were detected with the (LTC-IC) assay. We were able to show that the constitutive expression of HPIP can rapidly lead to increased numbers of cells detected on the level of committed clonogenic progenitor cells and LTC-ICs. In addition, the production of CFC per LTC-IC is markedly enhanced when cord blood (CB) cells are transduced with HPIP as compared to the control. Notably, besides its effect on maintenance of primitive hematopoietic progenitor cells, constitutive expression of HPIP did not block terminal hematopoietic differentiation. Additional we could show that the constitutive expression of HPIP leads to an increase of myeloid cells in transplanted NOD/SCID mice. These data characterize HPIP as a novel regulator of the early human hematopoietic stem cell, demonstrating that its constitutive expression has a notable impact on self renewal and differentiation of human hematopoietic stem cells. In vitro and in vivo analyses shed light on the understanding to the function of the homeobox gene VENTX2. On the level of the most primitive hematopoietic progenitors we could not observe a significant increase in the frequency of HSCs. Furthermore, the number of colonies generated per LTC-IC did not significantly differ between the VENTX2 arm and the control arm. A strong effect was obtained on the level of clonogenic progenitor cells. VENTX2 increased the production of myeloid cells 1.7-fold in comparison to the control. Secondary replating assay confirmed the amplificatory effect of VENTX2 transduced cells in the number of secondary G-CFU indicating that VENTX2 promote myeloid lineage differentiation. Interestingly, on the level of clonogenic progenitors VENTX2 expression resulted in a significantly decreased growth of erythroid colonies by 4.2-fold compared to the control suggesting that constitutive expression of VENTX2 may inhibit early erythroid differentiation. This inhibition did not occur on the level of primitive hematopoietic cells detected by Limiting Dilution LTC-IC assay where VENTX2 increased within a 2.2 fold compared to the control. The observation that VENTX2 overexpression drives CD34+ to differentiate into myeloid lineage was additional proved by in vivo experiments. In NOD/SCID mice VENTX2 induced a 3-fold increase in the proportion of CD15+ mature myeloid cells within the GFP-positive compartment compared to the control. A 7-fold increase was observed in the total of CD38+ GFP+ cells in comparison to the MIG mice control (p

Aktivierende Mutationen in Rezeptortyrosinkinasen spielen eine wichtige Rolle in der Pathogenese solider und hämatologischer Neoplasien, wie der akuten myeloischen Leukämie (AML). Im Rahmen dieser Arbeit wurden bislang nicht-charakterisierte Mutationen der Protoonkogene c-KIT und FLT3, die in der AML auftreten, in Zellkulturmodellen auf ihr transformierendes Potential hin untersucht. In-frame-Mutationen in Exon 8 des c-KIT-Gens, die aus kleinen Deletionen mit oder ohne Insertionen im extrazellulären Bereich bestehen, treten nahezu ausschließlich in Core-binding-Faktor-Leukämien auf und verschlechtern die Prognose der betroffenen Patienten. Drei repräsentative Exon-8-Mutationen wurden stabil in IL-3-abhängigen Ba/F3-Zellen exprimiert. Sie führten zur Hyperaktiverung des Rezeptors nach Ligandenstimulation, was sich in verstärkter Proliferation und Resistenz gegenüber Apoptose äußerte. In Rezeptor-Crosslinking-Experimenten zeigte eine repräsentative Exon-8-Mutante spontane und erhöhte liganden-induzierte Dimerisierung. Die biologischen Effekte konnten anhand einer erhöhten Phosphorylierung des nachgeordneten Signalmoleküls Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK) bestätigt werden. Im Gegensatz dazu hatte der FLT3-D324N-Single-Nukleotid-Polymorphismus, der in 6.4% von De-novo-AML-, 9.0% von CML- und 4.5% von ALL-Patientenproben detektiert wurde, keinerlei Auswirkungen auf die Prognose von AML-Patienten und wurde auch bei Kontrollpersonen gefunden (1.5%). Er wies keine funktionellen Unterschiede zu Wildtyp-FLT3 hinsichtlich Rezeptorphosphorylierung, Proliferation oder Apoptoseresistenz auf. Im Gegensatz zu Exon-8-Mutationen besitzen KIT-Mutationen in der Aktivierungsschleife, die – wie hier gezeigt wurde- die Prognose von Patienten mit günstigem Karyotyp verschlechtern, Resistenz gegenüber dem PTK-Inhibitor Imatinib. Zwei dem Imatinib nicht-verwandte Inhibitoren – PKC412 und SU5614 – wurden auf die Ansprechbarkeit von KIT-D816V getestet. Nur PKC412 war in der Lage, das spontane Wachstum von KIT-D816V-transduzierten Ba/F3-Zellen und die Rezeptorautophosphorylierung in HEK 293T-Zellen zu inhibieren. PKC412 führte überdies in den Ba/F3-Zellen zu einem deutlichen G0/G1-Arrest. Die beschriebenen In-vitro-Versuche können zwar einen ersten Einblick in die Rolle der untersuchten Mutationen in der AML bieten, tiefergehende Modelle sind jedoch vonnöten, um das Verständnis der Krankheitsentstehung in diesem Kontext zu erhöhen.

Aktivierende Mutationen in der juxtamembranösen Region (FLT3-Längenmutationen, FLT3-LM; FLT3- Interne Tandemduplikation, FLT3-ITD) und der Tyrosinkinase-Domäne (FLT3-TKD, FLT3-D835) von FLT3 stellen die häufigsten genetischen Alterationen in der AML dar und definieren eine klinisch-prognostische-Subgruppe in der AML. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei neue Mutationen in FLT3 identifiziert und charakterisiert. Die erste Mutation (FLT3-840GS) wurde in zwei Patientenproben nachgewiesen. Moleculargenetisch stellte diese eine Längenmutation in Exon 20 dar, und war durch eine 6 bp-grosse Insertion bzw. Glycin+Serin Insertion in der Aktivierungsschleife der katalytischen Domäne zwischen den Kodons 840 und 841 nahe der Aktivierungsschleife verursacht. Die zweite Mutation, eine aktivierende Punktmutation in der JM-Region von FLT3 (FLT3-V592A) wurde in den AML-Zelllinien MonoMac 6 und MonoMac 1 identifiziert. Die funktionelle Analyse ergab, dass diese Mutanten eine konstitutive Tyrosinphosphorylierung aufweisen und zu einem IL-3 unabhängigem Wachstum in Ba/F3 Zellen führen, welches durch einen spezifischen Proteintyrosinekinase (PTK) Inhibitor gehemmt werden konnte. Diese Ergebnisse zeigen, dass neben den bisher beschriebenen noch weitere aktivierende Mutationen in der JM- und der katalytischen Domäne in FLT3 Gen existieren. Die weiteren Untersuchungen zeigten, dass verschiedene FLT3-TKD (D835) Mutationen eine deutlich unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber selektiven FLT3 PTK Inhibitoren aufwiesen. Weiter wurde gezeigt, dass durch kontinuierliche Exposition von FLT3-ITD transformierten Leukämiezellen mit dem FLT3 PTK Inhibitor SU5614 in vitro resistente Mutanten generiert werden können. Die molekulare und funktionelle Charakterisierung dieser SU5614-resistenten Zelllinien (Ba/F3 FLT3-ITDR1-4) ergab, dass spezifische Mutationen in der TKD-Domäne ursächlich für die Inhibitorresistenz verantwortlich waren. Die FLT3-ITD-R1-4 Zellen wiesen somit Doppelmutationen im FLT3-Gen (LM + TKD) auf und waren durch eine 7-26-fach höhere IC50 gegenüber dem Inhibitor gekennzeichnet. Solche Doppelmutanten von FLT3 wurden mittels in- vitro- Mutagenese generiert und rekapitulieren in Ba/F3 Zellen den SU5614-resistenten Phänotyp. Diese Ergebnisse zeigen, dass prä-existierende oder erworbene FLT3-TKD Mutationen Resistenzen gegenüber FLT3-PTK Inhibitoren in vitro induzieren können. Diese Befunde stellen die molekulare Basis für zelluläre Resistenzen gegenüber FLT3-PTK Inhibitoren bei Patienten mit AML dar.