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Dr. Christoph Terkamp, Bereichsleiter Endokrinologie an der Medizinischen Hochschule Hannover, diskutiert mit Heiner Wedemeyer drei für den gastroenterologischen Alltag wichtige Punkte: Wie muss bei einer geplanten Endoskopie eine Steroidsubstitution bei Patienten mit Nebennierenrindeninsuffizienz erfolgen? Wann ist ein Pausieren von SGLT-2 Inhibitoren bei gastroenterologischen Patienten notwendig? Und kann eine Sedierung für eine Endoskopie bei Therapie mit Inkretinmimetika (GLP-1-Rezeptoragonisten) unproblematisch durchgeführt werden?
In diesem Podcast spreche ich mit der Präventionsmedizinerin Dr. med. Kira Kubenz. Die erfahrene Longevity-Expertin arbeitet mit arbeitet mit Prof. Dr. med. Dr. phil. Kriegsmann zusammen mit dem ich letzte Woche über verschiedene Gentests sprechen durfte (den Link zu dem Interview findet ihr unten). Heute gehen wir noch etwas tiefer in die Materie und besprechen, konkret über die verschiedenen Präventionsmöglichkeiten und -tests. Dr. med. Kira Kubenz ist Allgemeinmedizinerin mit Ausbildung in Psychosomatik, Suchtmedizin, Ernährungsmedizin, Naturheilverfahren, Präventionsmedizin und lehrt an der Dresden International University. Über folgende Bereiche der Präventionsmedizin sprechen wir in dieser Folge: Vorbeugen und aufschieben vom Herzinfarktrisiko, Thromboserisiko, Fettstoffwechselstörung, Diabetes, Muskelschwund, Diabetes Typ 2, Adipositas, Osteoporose, Alzheimer Präventive Ernährungspläne auf Grundlage individueller Analysen Nahrungsmittelunverträglichkeiten (Histamine, Gluten,…) und die Möglichkeit sie genetisch zu bestimmen. Unterschied zwischen Genetik und Epigenetik Vitamine und Nährstoffhaushalt Hormone im Bereich der Präventionsmedizin Pharmakogenetik: Was sind die vier Stoffwechseltypen und wie verstoffwechseln sie Medikamente? (Extensive Metabolizer, Intermediatyp, Pur-Metabolizer, Ultra-Metabolizer) Was ist ein pharmakogenetischer Notfallpass und wofür ist er sinnvoll? Welche genetischen Besonderheiten kann es bei der Einnahme verschiedener Medikamente geben? Konkret sprechen wir unter anderem über folgende Medikamente: Schmerzmittel (wie Imbuprofen, Tramal, uvm.) Malariaprophylaxe (Malarone) Protonenpumpenhemmer (PPI), Magensäureblocker (Pantoprazole) Blutfettsenker (Rosuvastatin) Tamoxifen, Krebsmedikamente Blutdrucksenker, Betablocker (Sartane, Bisoprolol, Metoprolol) Anti-Depressiva Weitere Informationen zu Dr. med. Kira Kubenz findest du hier: www.praxiskubenz.de Weiterführende Informationen zu CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19 Substraten, Inhibitoren und Induktoren finden Sie in der konstant aktualisierten "Drug Interaction Database" der Abteilung für klinische Pharmakologie der Universität Indiana. Diese Datenbank ist abrufbar unter: https://drug-interactions.medicine.iu.edu/MainTable.aspx Prof. Dr. med. Dr. phil. Kriegsmann zu den verschiedenen Möglichkeiten der Gentests: https://link.stayoung.de/STY-106 Du interessierst dich für Gesunde Langlebigkeit (Longevity) und möchtest ein Leben lang gesund und fit bleiben, dann folge mir auch auf den sozialen Kanälen bei Instagram, TikTok, Facebook oder Youtube. https://www.instagram.com/nina.ruge.official https://www.tiktok.com/@nina.ruge.official https://www.facebook.com/NinaRugeOffiziell https://www.youtube.com/channel/UCOe2d1hLARB60z2hg039l9g Disclaimer: Ich bin keine Ärztin und meine Inhalte ersetzen keine medizinische Beratung. Bei gesundheitlichen Fragen wende dich bitte an deinen Arzt/deine Ärztin. STY-113
In dieser Episode erörtern Hans-Dieter Höltje und Bernd Rupp den Mediator Histamin sowie dessen Inhibitoren an den Rezeptorsubtypen H1 und H2. Außerdem diskutieren sie Protonenpumpenhemmer, die H2-Antihistaminika als Ulkustherapeutika ablösten.
Der reisende Onkologe Harald Müller-Huesmann begrüßt in der heutigen Podcast-Folge Jens Kisro aus Lübeck. Ausgehend von beeindruckenden Ergebnissen der ADAURA-Studie zur Therapie des nicht-kleinzelligen Lungenkarzinoms (NSCLC) sprechen die beiden Onkologen über den Einsatz von Tyrosinkinase-Inhibitoren in der ärztlichen Praxis. Die Durchführung adjuvanter Therapien bleibe häufig Aufgabe niedergelassener Onkologinnen und Onkologen, was deren Arbeitsbelastung zusätzlich erhöhe. Die Nachsorge nicht mehr aktiv zu behandelnder Krebspatienten sieht Kisro zunehmend in der Hand von Hausärztinnen und Hausärzten.Im Laufe der Unterhaltung werden zudem Fragen zum Personalwesen und zur Nachwuchsförderung aufgeworfen. Der aktuelle Ärztemangel in Deutschland mag besorgniserregend sein, doch gleichzeitig besteht die Chance, die Work-Life-Balance für zukünftige Ärztegenerationen zu verbessern und ihnen attraktivere Perspektiven zu bieten.Abschließend wird in Chicago ein Blick auf die Hämatologie geworfen: Auch hier werden in Zukunft Checkpoint-Inhibitoren in der First-Line-Therapie des Hodgkin-Lymphoms erwartet.Melden Sie sich für E-Mail-Benachrichtigungen an, um keine neue Folge zu verpassen. Klicken Sie hier und gelangen Sie zum Roche-Podcast-Portal. Das Fachportal von Roche finden Sie hier.
Andreas Hartkopf (Ulm) bespricht in der dritten Folge gleichermaßen gynäkologisch-onkologische Schwerpunkt-Themen sowie hämato-onkologische Highlights. Klar ist für ihn und Harald Müller-Huesmann (Paderborn), dass der Europäische Krebskongress massiv an Bedeutung gewinnt. Denn trotz dessen, dass noch alle an die DESTINY-Breast03-Studie und Standing Ovations in Chicago denken – in Paris werden ebenfalls bedeutsame Ergebnisse präsentiert. Erstmalig wurden Daten zum Gesamtüberleben bei familiär-bedingtem Brust-und Eierstockkrebs vorgestellt: hoch effektiv wirken hier die PARP-Inhibitoren. Und auch für niedergelassene Hämato-Onkolog:innen gab es darüber hinaus eine großartige Session: oral SERDs (=selektive Östrogen-Rezeptor-Down-Regulatoren) sorgen für weiteren Optimismus. -----Diskutieren Sie Montagabend, den 12.09.2022 ab 19:00 Uhr, live mit ausgewiesenen Expert:innen die Highlights des Europäischen Krebskongresses zum Mammakarzinom und den gynäkologischen Tumoren via Zoom! https://go.roche.com/gyn_wrapup
Wäre bei Roger G. vor zehn Jahren das metastasierende Melanom entdeckt worden, hätte er kaum überlebt. Doch dank der neuartigen Therapie mit Checkpoint-Inhibitoren haben sich seine Tumoren mittlerweile zurückgebildet; er führt ein weitgehend normales Leben. «Die Checkpoint-Inhibitoren unterstützen das Immunsystem dabei, gegen den Krebs zu kämpfen», erklärt sein behandelnder Arzt Prof. Alfred Zippelius vom Universitätsspital Basel. Immuntherapien finden heute immer breitere Anwendung. Und doch ist noch viel Forschung notwendig, um Nebenwirkungen zu reduzieren und zu prüfen, wieso sie bei gewissen Patienten durchschlagenden Erfolg haben und bei anderen nicht.
Birgit Augustin berichtet über die Forschung, die Wirkstoffe und Medikamente im Kampf gegen das Corona-Virus sucht.
SGLT2-Inhibitoren gelten als die neuen Alleskönner in der Inneren Medizin. Ursprünglich als orale Antidiabetika für Patient:innen mit Typ-2-Diabetes gedacht, zeigten sich in Studien positive Nebeneffekte auf Nieren und Herz. Daraufhin wurden verschiedene weitere Untersuchungen veranlasst, um diese positiven Effekte zu bestätigen. Denn seit in den 90er-Jahren ähnlich beeindruckende nephro- und kardioprotektive Effekte bei ACE-Hemmern und AT1-Rezeptorantagonisten nachgewiesen werden konnten, waren keine neuen, das renale Outcome bei Typ-2-Diabetiker:innen verbessernden Wirkstoffe gefunden worden. Daraufhin wurde das Interesse vor allem von Internist:innen geweckt. In unserer Podcastfolge zu SGLT2-Inhibitoren beschreiben wir anhand von 7 Studien den Weg vom oralen Antidiabetikum bis hin zur Zulassung von Dapaglifozin als Mittel bei Herzinsuffizienz mit reduzierter Ejektionsfraktion im November 2020. Wir beantworten unter anderem die Fragen: Wie wirken SGLT2-Inhibitoren eigentlich? Können auch Nicht-Diabetiker:innen von den nephro- und kardioprotektiven Effekten profitieren? Und wird es weitere Zulassungserweiterungen geben?
‚Dapagliflozin‘ nun auch bei Niereninsuffizienz erfolgreich. Weitere Informationen: https://www.escardio.org/The-ESC/Press-Office/Press-releases/DAPA https://www.escardio.org/The-ESC/Press-Office/Press-releases/DAPA
Weniger Gichtanfälle bei Diabetes mellitus II. Weitere Informationen: https://annals.org/aim/article-abstract/2758844/assessing-risk-gout-sodium-glucose-cotransporter-2-inhibitors-patients-type Dieser Podcast-Service wird ihnen ermöglicht mit freundlicher Unterstützung von Bronchipret®
EASD in Barcelona brachte neue Daten. Weitere Informationen: https://www.thelancet.com/journals/landia/article/PIIS2213-8587%2816%2930398-9/fulltext https://www.easd.org/virtualmeeting/home.html#!resources/pcsk9-and-diabetes-what-is-currently-known
Seit der Entwicklung von ACE-Hemmern und AT-1-Rezeptor-Antagonisten, die einen nephoprotektiven Effekt aufweisen, gab es keine relevanten Fortschritte in der medikamentösen Nephroprotektion bei Typ-2-Diabetikern. Die CREDENCE-Studie konnte nun protokollgerecht frühzeitig beendet werden, da die Ergebnisse so überzeugend waren - bahnt sich hier eine Revolution an?
Ein Podcast zu was, wozu und warum Protease-Inhibitoren. Banales und Außergewöhnliches zum Thema Protease-Inhibitoren in diesem kleinen kurzen Vortrags-Podcast. Eine Ausgabe des Naturheilkunde Podcasts von und mit Sukadev Bretz, Yogalehrer bei Yoga Vidya. Anmerkung: Gesundheitliche Informationen in diesem Podcast sind nicht gedacht für Selbstdiagnose und Selbstbehandlung, sondern Gedankenanstöße aus dem Gebiet der Naturheilkunde. Bei eigener … „Protease-Inhibitoren“ weiterlesen
SGLT2-Inhibitoren sind in aller Munde - wir fassen die EMPA-REG-Studie für euch zusammen und diskutieren aktuelle Evidenz zu SGLT2-Hemmern.
Audiovortrag mit dem Inhalt Protease-Inhibitoren. Höre einiges über Protease-Inhibitoren in diesem kurzen Improvisations-Vortrags-Podcast. Diese Audioshow ist eine Ausgabe des Naturheilkunde Podcast. Sie ist ursprünglich aufgenommen als Diktat für einen Lexikonbeitrag im Yoga Wiki Bewusst Leben Lexikon von Yoga Vidya. Sukadev, Leiter vom Yoga Vidya e.V. interpretiert hier das Wort bzw. den Ausdruck Protease-Inhibitoren vom einem YogaBlickwinkel aus. Zum ganzheitlichen Yoga kann man auch die Theorie von Karma und Reinkarnation dazu zählen. Protease-Inhibitoren kommt aus Themengebieten wie Physiologie, Ernährung, Fasten, Diät, Medizin. Vielleicht interessierst du dich auch für eine Ausbildung Energetisches Heilen. Hast du ergänzende Einsichten und Kenntnisse? Schreibe es doch in die Kommentare. Anmerkung: Gesundheitliche Informationen in diesem Podcast sind nicht gedacht für Selbstdiagnose und Selbstbehandlung, sondern Gedankenanstöße. Bei eigener Erkrankung brauchst du Arzt oder Heilpraktiker.
Audiovortrag mit dem Inhalt Protease-Inhibitoren. Höre einiges über Protease-Inhibitoren in diesem kurzen Improvisations-Vortrags-Podcast. Diese Audioshow ist eine Ausgabe des Naturheilkunde Podcast. Sie ist ursprünglich aufgenommen als Diktat für einen Lexikonbeitrag im Yoga Wiki Bewusst Leben Lexikon von Yoga Vidya. Sukadev, Leiter vom Yoga Vidya e.V. interpretiert hier das Wort bzw. den Ausdruck Protease-Inhibitoren vom einem YogaBlickwinkel aus. Zum ganzheitlichen Yoga kann man auch die Theorie von Karma und Reinkarnation dazu zählen. Protease-Inhibitoren kommt aus Themengebieten wie Physiologie, Ernährung, Fasten, Diät, Medizin. Vielleicht interessierst du dich auch für eine Ausbildung Energetisches Heilen. Hast du ergänzende Einsichten und Kenntnisse? Schreibe es doch in die Kommentare. Anmerkung: Gesundheitliche Informationen in diesem Podcast sind nicht gedacht für Selbstdiagnose und Selbstbehandlung, sondern Gedankenanstöße. Bei eigener Erkrankung brauchst du Arzt oder Heilpraktiker.
Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 06/06
Fri, 4 Mar 2016 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/19229/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/19229/1/Ratzke_Elfrun_A.pdf Ratzke, Elfrun Almuth
Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 06/06
Das größte Problem für HIV-infizierte Personen ist die Tatsache, dass die Infektion nicht „geheilt“ werden kann und die Betroffenen ihr Leben lang infiziert bleiben. Deshalb erfordert die HIV Infektion die dauerhafte Anwendung von Therapien, die das Virus an der Replikation hindern und damit die „Viruslast“ im Körper möglichst gering halten. Die optimale Bekämpfung der HIV-Infektion wären Wirkstoffkombinationen die sowohl die Produktion des Virus durch persistent infizierte Reservoirs als auch die Neuinfektion von HIV-Zielzellen unterbinden. Interessanterweise sind einige zelluläre Faktoren bekannt, die in die HIV-Replikation eingreifen und der HIV-Produktion entgegenwirken können. Ein Beispiel für solche HIV-Restriktionsfaktoren sind die Risp/ Fam21 Proteine, die mit dem HIV Rev Protein interagieren und so vermutlich seine regulatorische Funktion hemmen können. Frühere Untersuchungen an persistent HIV-infizierten Astrozyten belegten einen Zusammenhang zwischen der Expressionsstärke von Risp/ Fam21 und der Hemmung der HIV Produktion in diesen Zellen. In dieser Arbeit wurde mit Hilfe der quantitativen PCR Analyse gezeigt, dass risp/ fam21 Gene in unterschiedlichen Stärken in menschlichen Zellen exprimiert werden. Zur Modulation der Risp/ Fam21 Expression in diesen als auch anderen für HIV relevanten Zellen wurde ein lentivirales Vektorsystem etabliert. In akut infizierten T-Zellen wurde kein Einfluss der Risp/ Fam21-Modulation auf die HIV-Infektion gefunden, was die Theorie nahelegt, dass Risp/ Fam21 Proteine nur in persistent infizierten Zellen wie den o.g. Astrozyten eine Aktivität zeigen könnten. Um neue Inhibitoren der akuten HIV-Infektion gesunder Zellen zu identifizieren, wurde die medizinische Heilpflanze Cistus incanus (Ci) im Hinblick auf ihre anti-HIV Aktivität getestet. Bei dieser Pflanze handelt es sich um eine sehr polyphenolreiche Pflanze und Polyphenole stellen eine interessante Klasse an HIV-Inhibitoren dar. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass Präparate aus Ci die Infektion von Zellen hemmen, indem sie spezifisch an die Virusoberfläche binden und die Anheftung der Viren an die Zielzellen verhindern. Präparate aus Ci inhibieren ein sehr breites Spektrum an verschiedenen HIV-Laborstämmen und –Patientenisolaten.
Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 05/06
Wed, 22 Jul 2015 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/18742/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/18742/1/Hellenbrand_Tim.pdf Hellenbrand, Tim ddc:540, ddc:500, Fak
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 17/19
Thu, 23 Oct 2014 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/17897/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/17897/1/Ailer-Maerzluft_Galina.pdf Ailer-Märzluft, Galina
Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 05/06
Um den Wirkmechanismus verschiedener Krebstherapeutika aufzuklären bzw. besser zu verstehen wurden in der vorliegenden Arbeit deren Wirkungen auf Zelllinien untersucht. Hierfür wurde die Wirkung verschiedener kommerziell erhältlicher und einiger Roche-eigener Kinaseinhibitoren auf Leukämiezelllinien untereinander und mit der Wirkung von FLT3-siRNAs verglichen. Die Auswirkungen von Behandlungen mit anti-CD20- und anti-BCR-Antikörper wurden an Lymphomzelllinien analysiert. Für die FLT3-Inhibition konnte gezeigt werden, dass die Vorhersagen zur Spezifität aus der Display-Technologie in vier von fünf Fällen tendenziell richtig waren. In einem mehrstufigen Verfahren wurden verschiedene Eigenschaften der Inhibitoren getestet: Hemmung der Phosphorylierung von rekombinanter FLT3-Kinase, Hemmung der zellulären Phosphorylierung der Wildtyp-FLT3-Kinase, Hemmung der Phosphorylierung von FLT3 mit der ITD-Mutation. So konnte für die Substanzen VX-680, CHIR-265 und RKI-1 eine FLT3-Hemmung als primärer Wirkmechanismus in einer Zelllinie mit FLT3-ITD ausgeschlossen werden. Für die kommerziell erhältlichen Inhibitoren Sorafenib, CFI-2 und CFI-3 sowie die neue Substanz RKI-3 konnte bestätigt bzw. gezeigt werden, dass sie FLT3 / FLT3-ITD in biochemischen und zellulären Testsystemen spezifisch hemmen können. Die Expressionsprofilierung erwies sich für die Klärung dieser Fragestellung nur als bedingt geeignet, da die Expressionsmuster der Behandlungen mit verschiedenen Inhibitoren untereinander trotz unterschiedlicher Wirkungsweisen funktionell stark übereinstimmten. In diesen Profilen zeichnete sich bereits nach vierstündiger Behandlung ein Zellzyklusarrest ab, und im weiteren Verlauf wurden sie von Expressionsänderungen aus dem Umfeld der Apoptose dominiert. Die Inhibitoren konnten jedoch hinsichtlich der FLT3-Hemmung relativ zu einander aufgrund der Übereinstimmung mit dem Muster der Behandlung mit FLT3-siRNAs eingeordnet werden. Aus den bei beiden Behandlungsarten übereinstimmend deregulierten Genen wurden zeitabhängige FLT3-Inhibitionssignaturen abgeleitet.Die Untersuchungen zum Wirkmechanismus von Typ I anti-CD20-Antikörpern zeigten, dass der Signalweg downstream von CD20 in den getesteten Zelllinien zumindest teilweise mit dem der BCR-Aktivierung identisch ist. Obgleich die Übereinstimmung der BCR-Aktivierungsmuster der verschiedenen Zelllinien verhältnismäßig gering war, konnte gezeigt werden, dass die Transkriptionsmuster der Behandlungen mit anti-CD20- bzw. anti-BCR-Antikörpern untereinander in großen Teilen übereinstimmten. Zwei der besonders schnell und stark induzierten Gene waren CCL3 und CCL4. Die Kinase SYK ist als Signalüberträger downstream des BCR bekannt. Die Induktion der Cytokine CCL3 und CCL4 konnte durch SYK-Hemmung mittels spezifischer Inhibitoren und das siRNA-vermittelte Stilllegen von SYK deutlich vermindert werden. Somit deuten die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, dass SYK auch im Signalweg von CD20 eine wichtige Rolle spielt. Durch die Behandlung von NHL-Zelllinien mit anti-CD20-Antikörpern wie Rituximab oder LT20 wird demzufolge eine zelluläre Antwort ausgelöst, die einer BCR-Aktivierung ähnelt.
Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 05/06
mGAT1 ist der im zentralen Nervensystem am weitesten verbreitete GABA-Transporter. In der vorliegenden Dissertation wird ein Screeningkonzept von Oximbibliotheken auf neue potente und selektive mGAT1-Inhibitoren vorgestellt. Die Bibliotheken wurden durch Umsetzung verschiedener Hydroxylaminderivate und jeweils einer Aldehydbibliothek bestehend aus vier verschiedenen Aldehyden unter geeigneten Bedingungen generiert. Diese eingestellten Bibliotheken wurden nach Verdünnung mittels MS-Bindungsassays gescreent und die potentesten Bibliotheken anschließend in Dekonvolutionsexperimenten untersucht, um herauszufinden, welche Oxime für die hohe Bindungsaffinität der Bibliothek gegenüber mGAT1 verantwortlich waren. Diese Oxime wurden nachsynthetisiert und deren Bindungsaffinitäten und inhibitorischen Potenzen gegenüber mGAT1 bestimmt. Auf diesem Weg konnte eine Serie neuer mGAT1-Inhibitoren mit Binungsaffinitäten im niedrigen nanomolaren Bereich ermittelt werden. Ein Oxim erzielte die höchste inhibitorische Potenz, die für einen mGAT1-Inhibitor bisher in einem GABA-Uptake-Assay ermittelt werden konnte.
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 16/19
Mesenchymale Stammzellen (MSCs) besitzen eine Vielzahl einzigartiger Eigenschaften, hierunter ihr Differenzierungs- und immunregulatorisches Potenzial, die sie sehr interessant für die biomedizinische Forschung machen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es zu untersuchen, welche Mechanismen der immunmodulierenden Wirkung der MSCs zugrunde liegen. Zu diesem Zweck wurden mesenchymale Stammzellen aus dem Knochenmark von 5-16 Wochen alten Balb/c-Mäusen isoliert und in der Zellkultur expandiert. Das Oberflächenmarkerprofil der Zellen wurde durch Durchflusszytometrie (FACS) charakterisiert und die Expression potenziell immunsuppressiver Faktoren durch ELISA, Reverse Transkriptase-PCR beziehungsweise Western-Blot bestimmt. Für die Untersuchung der MSC-vermittelten Immunmodulation wurde ein Proliferationsassay etabliert, in dem Lymphozyten aus C57Bl/6-Mäusen durch das Mitogen ConA stimuliert und mit den murinen MSCs kokultiviert wurden. Durch die Zugabe spezifischer Inhibitoren gegen TGFβ, die Prostaglandin E2-Synthese (Indomethacin), den HGF-Rezeptor und den Adenosinrezeptor (SCH58261) wurde die Vermittlung der immunmodulierenden Effekte durch die MSCs untersucht. In der Studie konnte eine reine Population muriner MSCs mit charakteristischen Oberflächenmarkern (CD29, CD73, CD90, CD105, CD140b, Sca-1) expandiert werden, die in vitro starke immunsuppressive Effekte im Proliferationsassay aufwies. Die Untersuchungen potenzieller Effektormoleküle zeigten, dass bei den murinen MSCs TGFβ, HGF und das Enzym IDO keine entscheidende Rolle spielten und von den bekannten Mechanismen vor allem die Produktion von PGE2 die Lymphozytenproliferation hemmte. Als wichtigstes Ergebnis kann der Nachweis, dass die murinen MSCs die Ektonukleotidasen CD39 und CD73 koexprimieren, die extrazelluläres ATP über 5’-AMP in das extrem stark immunsuppressiv wirkende Adenosin konvertieren können, angesehen werden. Zusammenfassend wurde in der vorliegenden Arbeit erstmals die Expression von CD39 auf murinen MSCs beschrieben. Die Koexpression von CD39/CD73 auf den MSCs und die daraus folgende Produktion von Adenosin stellt einen neuen Ansatz dar, um die Funktion der MSCs besser zu verstehen. Die CD39+/CD73+-MSCs sind demnach eine vielversprechende Zellpopulation für die Behandlung von Autoimmunerkrankungen und für die Entwicklung neuer lokaler oder systemischer Therapien zur Toleranzinduktion nach Transplantation.
Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 05/06
Mon, 13 Jan 2014 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/16544/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/16544/1/Nagel_Daniel.pdf Nagel, Daniel ddc:570, ddc:
Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 05/06
Die Entwicklung und die Erforschung von Sterol-Biosynthese-Inhibitoren ist ein wichtiges Thema in der pharmazeutischen Chemie. Durch die Verwendung eines Ganzzell-Assays konnte eine Reihe von Inhibitoren im Post-Lanosterol-Abschnitt der Cholesterol-Biosynthese charakterisiert werden. Darunter waren Inhibitoren der Oxidosqualencylase, der delta24-Reduktase, der delta8/7-Isomerase und der 7-Dehydrocholesterolreduktase. Diese Substanzen zeichneten sich durch zum Teil nanomolare IC50-Werte, gemessen an der Gesamt-Cholesterol-Neubildung aus, sowie durch eine hohe Selektivität. Die Verbindungen könnten als molekulares Werkzeug zur Erforschung von Cholesterol-Biosynthese induzierten Pathogenesen eingesetzt werden oder aber als Adjuvans in der Chemotherapie. Durch die Neuentwicklung eines Ganzzell-Screening-Assays für den Post-Lanosterol-Abschnitt der Ergosterol-Biosynthese war es nun auch möglich, Verbindungen auf ihre antimykotische Aktivität zu testen. Dabei konnte EMC120B12 als neuer Inhibitor der C14-Demethylase identifiziert werden. In Candida krusei bildeten sich unter dessen Zugabe bis dato unbekannte Sterole. Diese konnten als Derivate von 14-Methylergosta-8,24(28)-dien-3beta,6alpha-diol identifiziert werden. Ebenso wurde eine IC50-Wert-Bestimmung, gemessen an der Gesamt-Ergosterol-Neubildung durch Einbau von nicht-radioaktiven 13C-Acetat in Ergosterol etabliert. Des Weiteren wurden neue Methoden für die moderne Spurenanalytik entwickelt. Das Kernstück dabei war die Entwicklung einer Methode zur Bestimmung von Nicotin und Coffein in Schokolade mittels Dampfraum-Festphasenmikroextraktion (HS-SPME) gekoppelt mit einem Gaschromatographie-Tandemmassenspektrie Gerät (GC-MS/MS). Dabei konnte zum ersten Mal Nicotin in Schokolade nachgewiesen werden (230-1590 ng/kg). Die gleichzeitige Mitbestimmung des bereits bekannten Inhaltsstoffes Coffein (420-2780 mg/kg) war trotz der hohen Konzentrationsunterschiede möglich.
Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 05/06
Mit der intensiven Erforschung von Stammzellen soll zukünftig die Möglichkeit eröffnet werden durch Manipulation von Stammzellpopulationen das regenerative Potential des Organismus zu verstehen und zu nutzen. Darüber hinaus soll mittels genetisch modifizierter Stammzellpopulationen die Grundlagen dafür geschaffen werden schwere Gen- und Immundefekte zu therapieren. Humane mesenchymale Stammzellen (hMSC) versprechen hierbei großes Potential, da sie bereits für systemische Therapieansätze eingesetzt werden. Allerdings sind die theoretischen Grundlagen der Stammzelleigenschaften der hMSC wie Proliferation, Invasion bzw. Migration und die Differenzierungskapazität nur rudimentär verstanden. Aufbauend auf den Ergebnissen von Dr. Marisa Karow und Dr. Thomas Kolben, die eine Beteiligung des Wnt/β-Catenin-Signalweges an der Steuerung dieser Stammzelleigenschaften in ihren Arbeiten nachweisen konnten (Karow 2008; Kolben et al. 2012), sollten in der vorliegenden Arbeit die Rezeption des spezifischen Wnt-Signals und die dabei beteiligten Frizzled (Fzd)-Rezeptoren näher untersucht werden. Da aus den vorigen Arbeiten schon hervorging, dass alle 10 Fzd-Rezeptoren in den hMSC exprimiert werden, sollte über eine qualitative PCR die Expression potentieller Wnt-Liganden sowie der beiden Inhibitoren des Wnt-Weges sFRP1 und WIF1 geprüft werden. Dabei zeigte sich, dass 8 der 19 Wnts sowie der Inhibitor sFRP1 exprimiert werden. Das Wnt-Expressionsmuster der Krebszelllinie HT1080 unterschied sich dagegen nur in der Expression zweier Wnts, was wahrscheinlich auf den mesodermalen Ursprung dieser Krebszelllinie zurückzuführen ist. Im Gegensatz hierzu zeigte sich eine umfangreichere Wnt-Expression in der immortalisierten Zelllinie HEK293, in der 13 der 19 Wnts sowie auch die beiden Inhibitoren sFRP1 und WIF1 nachgewiesen wurden. Für eine detailliertere Aufschlüsselung der Beteiligung einzelner Fzds an der Rezeption eines Wnt-Signals sowie an der basalen Aktivität des Wnt/β-Catenin-Signalweges in hMSC wurde ein TCF/LEF-Reporter-Vektorsystem in die hMSC eingebracht. Als Reportergen kam die sekretierte Form einer Luciferase aus dem Tiefsee-Cephalopoden Gaussia princeps zum Einsatz. Vorteil dieser Luciferase ist, dass die Sekretion in den Überstand eine Evaluierung der Wnt/β-Catenin-Aktivität über die Zeit hinweg erlaubt, ohne die Zellen zerstören zu müssen. Hierbei wurden transient und stabil-transfizierte TCF/LEF-(T-cell-specific transcription factor/lymphoid enhancer-binding factor)-Reporter-hMSC generiert und die Zellkulturbedingungen für nachfolgende Experimente optimiert. Die Evaluierung unterschiedlicher Aktivatoren des Wnt/β-Catenin-Signalweges ergab die stärkste Aktivierung nach Knockdown des Tumorsuppressorgens APC, während ein Knockdown des β-Catenins, dem zentralen Mediator des Wnt-Weges, zu einer signifikanten Reduktion der Gaussia-Luciferase-Aktivität führte. Bei Knockdown-Studien mit den verschiedenen Fzds mittels RNA-Interferenz (RNAi) in den TCF/LEF-Reporter-hMSC zeigte sich, dass Fzd5 und Fzd7 an der Weiterleitung eines Wnt-Signals sowohl unter unstimulierten Bedingungen als auch nach Applikation von Wnt3a beteiligt sind. Weiter zeigte nur noch der Knockdown von Fzd1, dass dieser Rezeptor an der Weiterleitung eines Wnt3a-Signals partizipiert. Um diese Ergebnisse über einen reversen Ansatz in Form einer Überexpression der Fzds zu untersuchen, wurde ein flexibles Klonierungssystem entwickelt, das einen einfachen Austausch von Protein-tags ermöglichen sollte. Nach Bestätigung der Überexpression der Fzds auf mRNA-Ebene und Proteinebene wurde die Wirkung der Überexpression in den TCF/LEF-Reporter-hMSC ohne und mit Wnt3a-Aplikation untersucht. Hier zeigte sich, dass neben der Überexpression von Fzd5 auch Fzd3 und Fzd6 eine Erhöhung der Gaussia-Luciferase-Aktivität und damit eine gesteigerte Aktivität des Wnt/β-Catenin-Signalweges sowohl unter unstimulierten als auch unter stimulierten Bedingungen nach sich zogen. Bei vergleichender Überexpression von Wnt3 oder Wnt3a konnte gezeigt werden, dass Wnt3 – welches hMSC auch endogen exprimieren – sehr viel stärker den Wnt-Weg aktivieren kann als Wnt3a. Um die Auswirkung des kanonischen Wnt-Rezeptors Fzd5 auf die Stammzelleigen-schaften der hMSC zu prüfen, wurde die Expression des Wnt-Zielgens Cyclin D1 und die Proliferation nach Knockdown sowie transienter Überexpression von Fzd5 quantitativ erfasst. Hierbei zeigte sich nach Knockdown von Fzd5 eine signifikante Abnahme der Proliferation, die auch auf Ebene der Wnt-Zielgene mit einer Abnahme der Cyclin D1-Expression einherging. Umgekehrt konnten stabil Fzd5-transfizierte hMSC-Populationen generiert werden, die eine signifikante Steigerung der Cyclin D1-Expression aufwiesen. Zusammenfassend konnte im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass die verschiedenen Fzds in unterschiedlichem Maße an der Weiterleitung eines Wnt-Signals beteiligt sind. Besonders scheinen hier Fzd5 und Fzd7 eine wichtige Rolle in hMSC zu spielen, da sie auch an der Vermittlung eines endogenen Wnt-Signals innerhalb der Stammzellpopulation beteiligt sind. Weiter wurde im Fall von Fzd5 auch die maßgebliche Beteiligung dieses Rezeptors am Erhalt der Proliferationskapazität der hMSC-Population nachgewiesen.
Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 05/06
Das Epstein-Barr Virus (EBV) ist mit einer Reihe von lebensbedrohlichen Krankheiten assoziiert. Dazu zählen unter anderem Nasopharynxkarzinome, Hodgkin-Lymphome und lymphoproliferative Erkrankungen nach Organtransplantationen. Dennoch gibt es bisher keinen wirksamen Therapieansatz, der sich spezifisch mit der Rolle von EBV in diesen malignen Erkrankungen auseinandersetzt. Das latente Membranprotein 1 (LMP1) ist das primäre Onkogen von EBV und essenziell für die Transformation von B-Zellen durch das Virus. Für eine effiziente Transformation von Zellen ist die Aktivierung verschiedener zellulärer Signalwege durch LMP1 notwendig. LMP1 besitzt jedoch keine enzymatische Aktivität und die Induktion der Signalwege ist somit abhängig von der Rekrutierung verschiedener zellulärer Adapterproteine. Die Ausbildung der notwendigen Signalkomplexe wird über zwei C-terminale Aktivierungs-Regionen (CTAR1 und CTAR2) vermittelt. Verschiedene Mitglieder der Tumornekrosefaktor (TNF)-Rezeptor-assoziierten Faktoren (TRAF)-Protein-Familie spielen bei der Induktion der Signalwege durch diese beiden CTAR-Domänen eine zentrale Rolle. Nach grundlegenden Protein-Protein-Interaktionsstudien zwischen LMP1 und rekombinanten TRAF-Proteinen wurde hier die Interaktion zwischen TRAF2 und LMP1 als Zielstruktur für Inhibitoren vorgestellt. TRAF2 ist essenziell für die Aktivierung des NF-κB-Signalweges durch die CTAR1-Domäne und somit für das Überleben EBV-transformierter Zellen. Die Bindung von TRAF2 an LMP1 wurde biochemisch näher charakterisiert und die gewonnen Erkenntnisse verwendet, um ein System zu etablieren, mit dem Inhibitoren gegen den Komplex aus LMP1 und TRAF2 identifiziert werden können. Dieses ELISA-basierte System erfüllt die Anforderungen, die allgemein an hochdurchsatzfähige Systeme gestellt werden. In einem Pilotscreen einer Bibliothek mit Naturstoffen wurden Substanzen identifiziert, die die Bindung von TRAF2 an LMP1 in vitro inhibierten. Die potenteste Substanz inhibierte die Interaktion von TRAF2 und LMP1 mit einem IC50 von 8 µM in diesen in vitro Studien. Weiterhin zeigte diese Substanz eine spezifische biologische Wirkung auf die Vitalität von EBV-transformierten B-Zellen. Zusätzlich konnte in den Protein-Protein-Interaktionsstudien zwischen den verschiedenen TRAF-Proteinen und LMP1 erstmals eine direkte Bindung von TRAF6 an LMP1 gezeigt werden. Entgegen der bisherigen Modellvorstellung, nach der TRAF6 indirekt über Adapterproteine an LMP1 gebunden wird, konnte hier gezeigt werden, dass TRAF6 direkt an die LMP1-Sequenz P379VQLSY innerhalb der CTAR2-Domäne bindet. Diese Sequenz ist essenziell für die Aktivierung verschiedener TRAF6-abhängiger Signalwege durch die CTAR2-Domäne. Auf der Oberfläche von TRAF6 wird die Bindung an LMP1 durch dieselbe Bindetasche vermittelt, über die auch die Interaktion mit zellulären Rezeptoren stattfindet. Diese direkte Interaktion zwischen LMP1 und TRAF6 ist wichtig für die Aktivierung des NF κB-Signalweges durch die CTAR2-Domäne. TRAF6-Mutanten, die nicht mehr in der Lage waren, mit LMP1 zu interagieren, waren ebenfalls nicht mehr dazu fähig, die Induktion von NF κB-Signalen durch die CTAR2-Domäne von LMP1 in embryonalen TRAF6-/- Mausfibroblasten wiederherzustellen. Ebenfalls konnte neben der direkten Bindung von TRAF6 an LMP1 hier eine weitere neue Protein-Protein-Interaktion für TRAF6 beschrieben werden. TRAF6 bindet direkt an das TNF-Rezeptor-assoziierte Todesdomänenprotein (TRADD). Die Interaktion zwischen TRAF6 und TRADD unterscheidet sich jedoch von der Bindung anderer TRAF-Proteine an TRADD. Die in vitro Studien zeigten, dass TRAF6 in der Lage ist, sowohl mit Teilen des N-Terminus, als auch mit Teilen des C-Terminus von TRADD zu interagieren. Diese bisher nicht beschriebene Art der direkten Interaktion von TRAF6 mit TRADD eröffnet neue Einblicke in den Aufbau des LMP1-Signalkomplexes.
Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 05/06
Mon, 25 Feb 2013 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/18284/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/18284/1/Mittner_Agnes.pdf Mittner, Agnes Maria ddc:570, ddc:50
Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/06
Tue, 11 Dec 2012 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15326/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15326/1/Wolfgardt_Annette.pdf Wolfgardt, Annette ddc:540, ddc:500, Fakultät für Chemie und Pharmazie
Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/06
Mit der Cholesterolbiosynthese sind verschiedenste Krankheiten assoziiert, wie beispielsweise Hypercholesterinämie oder auch neurodegenerative Krankheiten wie Morbus Alzheimer oder die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit. Andererseits werden durch die kontinuierlich steigende Anzahl immun supprimierter Patienten Infektionen mit opportunistischen Pilzen ein schwerwiegendes Problem steigender Bedeutung. Da sich die Enzyme der Cholesterol- und der Ergosterolbiosynthese unterscheiden, ist es möglich, in diese selektiv einzugreifen. Durch Inhibition einzelner Enzyme der Cholesterolbiosynthese ergeben sich Möglichkeiten zur Senkung des Serumcholesterolspiegels und damit zur Behandlung der Hypercholesterinämie oder auch Ansätze zur Behandlung oder gezielteren Untersuchung von anderen Cholesterolbiosynthese-assoziierten Erkrankungen. Die selektive Hemmung von Enzymen der Ergosterolbiosynthese kann zur Behandlung von Erkrankungen durch schädliche Pilze oder Protozoen genutzt werden. Im Rahmen dieser Arbeit gelang es diverse Modifikationen in der Seitenkette von Steroidderivaten ausgehend von Ergosterol durchzuführen und so beispielsweise Gruppen mit potenzieller Reaktivität gegenüber Thiolen, metallchelatisierende Gruppen oder auch Ester und Amide einzuführen. Unterschiedlichste Strukturen ließen sich in arbeitskreisinternen Assays als potente selektive Inhibitoren verschiedener Enzyme der Ergosterol- oder Cholesterolbiosynthese klassifizieren.
Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/06
Die vorliegende Dissertation befasst sich mit den durch S-Lost-verursachten Symptomen in der Haut, die zunächst durch starke Blasenbildung und später durch eine verzögerte Wund-heilung charakterisiert sind. Bei S-Lost handelt es sich um einen chemischen Kampfstoff, der erstmals im ersten Weltkrieg zum Einsatz kam und bis heute in vielen internationalen Kon-flikten großen Schaden anrichtete, obwohl der Gebrauch schon 1925 durch die Genfer Konvention verboten wurde. Aktuell stellt S-Lost zudem eine Bedrohung durch terroristische Aktivitäten dar. Da für S-Lost-induzierte Verletzungen bislang keine spezifisch wirksamen Behandlungs-methoden verfügbar sind, besteht großes Interesse an der Aufklärung der dem Krankheitsbild zugrunde liegenden molekularen Pathomechanismen, um daraus Rückschlüsse auf besser ge-eignete therapeutische Maßnahmen ziehen zu können. In unseren ersten Experimenten wurden als mögliche Auslöser der Blasenbildung die Expression und Sekretion ausgewählter Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) und deren endogenen Inhibitoren, den tissue inhibitors of matrix metalloproteinases (TIMPs) in einem 3D-Haut-modell und in verschiedenen Zelltypen der Haut (Keratinozyten, Fibroblasten, mikrovaskuläre Endothelzellen, mesenchymale Stammzellen, monozytäre Zellen, PMN-Granulozyten) sowohl in Mono- als auch in Mischkultur untersucht. Unter Verwendung von molekularbiologischen und proteinbiochemischen Methoden wie qRT-PCR, Zymographie und Western Blot gelang der Nachweis, dass MMPs - insbesondere MMP-9 - nach Exposition der Zellen (v.a. Fibroblasten und monozytäre Zellen) mit S-Lost deutlich hochreguliert wurden. Zu Erhärtung der Annahme, dass MMP-9 durch Degradation der Basalmembran zwischen Epidermis und Dermis zur Blasenbildung beiträgt, konnte als Pathomechanismus nun erstmals eine parakrine Stimulation von Fibroblasten durch S-Lost-behandelte Keratinozyten identifiziert werden, als deren Folge eine vermehrte MMP-9-Sekretion resultierte. Darüber hinaus zeigte sich in weiteren Versuchen unter Verwendung des sog. Scratch-Assays und eines Transwell-basierten Invasionsassays, dass das Migrations- und Invasionsverhalten der Fibroblasten in Gegenwart des konditionierten Mediums der S-Lost-behandelten Keratinozyten positiv beeinflusst wurde. Aus klinischer Sicht sprechen diese Erkenntnisse für neue therapeutische Ansätze, die darauf beruhen sollten, die S-Lost-induzierte, auf proteolytischer Aktivität basierende Blasenbildung der Haut durch Applikation spezifischer MMP-Inhibitoren zu behandeln. In einem weiteren Projekt wurde die verzögerte Wundheilung als spätes Symptom der S-Lost-Vergiftung auf zellulärer Ebene untersucht, bei der eine eingeschränkte Re-Epithelialisierung der betroffenen Hautstellen beobachtet wird. Sowohl für den Prozess der Wundheilung als auch für die stetige Erneuerung der Haut werden epidermale Stammzellen benötigt, die für die Bildung von Keratinozyten verantwortlich sind. Diese unipotenten Progenitorzellen befinden sich in der basalen Schicht der Epidermis und sind in der Lage zu proliferieren und anschließend terminal zu differenzieren. Um eine Beeinflussung dieser Prozesse durch S-Lost zu untersuchen, wurden primäre unreife Keratinozyten (NHEK) verwendet und hinsichtlich ihres Differenzierungspotenzials untersucht. Dabei erwies sich S-Lost als potenter Induktor der Differenzierung von NHEK, was durch Bestimmung der Expression typischer Markerproteine wie Keratin-1, Involucrin und Loricrin gezeigt wurde. Die Induktion des Reifungsprozesses war sowohl von einem Rückgang der Proliferation als auch von einer verminderten Migrationsrate der Zellen begleitet. Die eingehende Analyse von mitogen-activated protein kinase (MAPK)-Signaltransduktionswegen führte zu der Erkenntnis, dass die Aktivitäten von p38 und ERK1/2 gegenteilige Rollen im Differenzierungsprozess einnehmen. Studien mit spezifischen Inhibitoren der MAPK be¬legten, dass p38 für den Reifungsvorgang in NHEK essentiell ist, während ERK1/2 diesem entgegen wirkt. So konnte durch Blockade von p38 die von S-Lost ausgelöste Differenzierung der Zellen verhindert werden. Ebenso war es durch diese Behandlung möglich, die von S-Lost stark beeinträchtige Migrationsfähigkeit der Keratinozyten wiederherzustellen, welche mit einer erhöhten MMP-1-Expression einherging. Davon abgeleitet erscheint es therapeutisch sinnvoll, selektive p38-Inhibitoren für die Behandlung von Wundheilungsstörungen nach Exposition der Haut mit S-Lost einzusetzen. Zusammenfassend erbrachten unsere Studien also den Nachweis, dass der S-Lost-induzierten Blasenbildung (als frühes Symptom) die spezifische Induktion der MMP-9 zugrunde liegt. Darüber hinaus konnte erstmals eine verfrühte Differenzierung in unreifen Keratinozyten der Haut (als mögliche Ursache für die verzögerte Wundheilung) nachgewiesen werden, wobei die MAPK p38 bei der Initiierung des Prozesses von entscheidender Bedeutung ist. Aufgrund dieser Resultate empfiehlt sich eine kombinierte Applikation von Inhibitoren der Aktivitäten von MMP-9 und p38, wobei der Einsatz jedoch zeitlich abgestimmt erfolgen sollte, um pathologische Effekte (Blasenbildung bzw. Differenzierungsinduktion in Keratinozyten) zu blockieren, ohne die positiven Auswirkungen von MMP-9 und p38 auf die Heilung (Migration von Immunzellen und Keratinozyten bzw. Reepithelialisierung) zu hemmen.
Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/06
Die Cholesterolbiosynthese ist ein wichtiger Ansatzpunkt für die Kontrolle und Manipulation von biochemischen Vorgängen in Wirbeltieren und damit für die Entwicklung therapeutischer Wirkstoffe. Mit der Cholesterolbiosynthese assoziierte Krankheiten sind beispielsweise Hypercholesterinämie, die Alzheimer Erkrankung oder die Creutzfeld-Jakob Krankheit. Im Rahmen dieser Arbeit konnten ausgehend von Grundmanns Keton und alpha-Tetralon verschiedene Amin-substituierte Spiroacetale dargestellt werden, von denen mehrere Strukturen als spezifische Inhibitoren der humanen delta8,7-Sterolisomerase identifiziert werden konnten.
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 13/19
In der vorliegenden Arbeit wurde die Wirkung der Farnesyltransferase-Inhibitoren hinsichtlich der antitumorösen Wirkung auf gastrointestinale Tumore in verschiedenen in vitro Experimenten untersucht. Als Marker für die therapeutische Wirkung wurde die Induktion der Apoptose gewählt. Durchgeführt wurden unsere Versuche mit den Zelllinien HepG2, gewonnen aus einem hepatozellulären Karzinom, sowie HT29, einem kolorektalen Adenokarzinom, unter Verwendung von BMS-214662 und SCH66336 als Vertreter der Farnesyltransferase-Inhibitoren. Diese werden derzeit in klinischen Studien getestet. BMS-214662 befindet sich in Phase II, im Rahmen von SCH66336 sind bereits Phase III Studien abgeschlossen worden. Anhand von Apoptose-Assays waren wir in der Lage einen antitumorösen Effekt durch Induktion der Apoptose aufzuzeigen. Hierbei war die Apoptose-Auslösung dosisabhängig von dem verwendeten Farnesyltransferase-Inhibitor. Im Gegensatz zu SCH66336 induzierte BMS-214662 bereits unter Verwendung von 1µM in 24h die Apoptose, wohingegen eine Konzentration von 25µM SCH66336 notwendig war, eine signifikante Apoptose hervorzurufen. Die Induktion der Apoptose war dabei unabhängig von einer Ras-Mutation. Sowohl in den HT29-Zellen mit Mutation des Ras-Proteins, als auch in den mutationsfreien HepG2-Zellen erfolgte ein Anstieg der Apoptoserate. Zusätzlich zeigten wir einen möglichen synergistischen Effekt für den Antikörper anti-APO in Verbindung mit BMS-214662. Mit Hilfe des Western Blots konnte als ein möglicher Induktionsfaktor eine gesteigerte Rekrutierung der Caspase 8 dargestellt werden. Dies bestätigte sich durch eine messbare Erhöhung der Caspase 3, welche durch Caspase 8 aktiviert wird und den apoptotischen Tod der Zelle hervorruft. Insgesamt läuft der Mechanismus Rezeptor- bzw. Liganden-unabhängig ab, da in der durchgeführten rt-PCR weder vermehrt CD95-Rezeptor bzw. dessen Ligand nachgewiesen werden konnte.
Tierärztliche Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 05/07
Infektionen mit Mykobakterien sind beim Vogel weit verbreitet. Am häufigsten werden die Subspezies M. avium ssp. avium und M. avium ssp. silvaticum nachgewiesen, die schwere chronische Erkrankungen bei einem breiten Spektrum von Vogelarten verursachen. Außerdem muss von einem zoonotischen Potential dieser Keime ausgegangen werden. Da die Mykobakteriose beim Vogel letztlich immer zur Erregerausscheidung führt und meist letal verläuft, ist es insbesondere zur Infektionsprophylaxe in Beständen wichtig, eine Infektion frühzeitig und sicher diagnostizieren zu können. Für die Diagnostik standen neben einer serologischen Untersuchung bisher die Ziehl-Neelsen-Färbung zum Nachweis säurefester Stäbchen und die lang dauernde Anzucht von Mykobakterien aus Organmaterial zur Verfügung. Neuere molekularbiologische Nachweisverfahren können Mykobakterien nur bis auf die Speziesebene differenzieren oder sie sind sehr aufwendig. Insbesondere Kot wurde bisher selten direkt als Ausgangsmaterial für einen Nachweis beim Vogel verwendet. In der vorliegenden Arbeit wurde daher eine Realtime-PCR zum Nachweis von M.a.a. und M.a.s. in Organproben und Vogelkot entwickelt. Da vor allem bei Kotproben mit dem Vorkommen von PCR-Inhibitoren zu rechnen ist, wurde zur Qualitätssicherung eine interne Kontrolle in die Extraktion und PCR integriert. Basierend auf den Ergebnissen von Sequenzanalysen von hsp65, der 16SrRNA und von Insertionselementen wurde als Zielgen für die Realtime-PCR das Insertionselement IS901 ausgewählt. Für den Nachweis von M.a.a und M.a.s. wurden anschließend Primer und eine Taqman-Sonde konstruiert, die auf dieses Insertionselement gerichtet sind. Als interne Kontrolle wurde eine Realtime-PCR nach WAKELEY et al. (2006) für Taylorella equigenitalis verwendet und die gesamte Realtime-PCR in Form einer Duplex-PCR konzipiert. Die Reaktionsbedingungen dieser Realtime-PCR wurden anschließend hinsichtlich der Konzentrationen von Magnesiumchlorid, dNTP, Primer und Sonden optimiert. Zur Ermittlung der Spezifität wurden 13 Mykobakterien-Referenzstämme mit dieser PCR untersucht. Zur Ermittlung der Nachweisgrenze und Überprüfung der Sensitivität wurden zudem Kotproben von SPF-Tauben mit Suspensionen aus unterschiedlichen Mykobakterienkonzentrationen gespickt und dann geblindet sowohl mittels Ziehl-Neelsen-Färbung als auch mit der Duplex-Realtime-PCR untersucht. Des Weiteren wurden 27 Organproben, 18 Kotproben sowie 12 asservierte Mykobakterienstämme, die aus Organproben von Vogelpatienten angezüchtet worden waren, einer Testung mittels PCR unterzogen. Bei der Etablierung der internen Kontrolle wurde die DNA-Menge der internen Kontrolle so eingestellt, dass keine Hemmung der PCR für M.a.a und M.a.s auftrat. Die Relevanz der Verwendung dieser internen Kontrolle wurde insbesondere bei der Untersuchung von 18 Kotproben von Vogelpatienten deutlich, bei der in drei Ansätzen bei der Verwendung von unverdünnter DNA aus der Extraktion eine Inhibition der PCR angezeigt wurde. Bei der Untersuchung der Referenz-Stämme wurde eine DNA-Amplifikation anhand eines spezifischen Fluoreszenzsignals nur bei den vogelpathogenen Erregern M.a.a. und M.a.s. nachgewiesen. In der geblindeten Untersuchung von mit M.a.a gespickten Kotproben wurde für die Duplex-Realtime-PCR eine Nachweisgrenze von 104 Mykobakterien pro Gramm Kot ermittelt, was rechnerisch einem Nachweis von 1,25 Mykobakterien pro PCR-Ansatz entspricht. Die mikroskopische Untersuchung nach Ziehl-Neelsen-Färbung zeigte eine höhere Nachweisgrenze mit 105 Mykobakterien pro Gramm Kot als die PCR und erlaubt zusätzlich keine Aussage darüber, ob es sich um vogelpathogene Mykobakterien handelt. Mit der Realtime-PCR wurden alle negativen Ansätze als negativ erkannt. Bei der Untersuchung von klinischem Material von Vogelpatienten (27 Organproben, 18 Kotproben) und von 12 asservierten Mykobakterienstämmen, bei denen vergleichend auch mikroskopische Untersuchungen nach Ziehl-Neelsen-Färbung durchgeführt wurden, wurde bei 32 von 34 Proben mit Nachweis von säurefesten Stäbchen auch DNA von M.a.a./M.a.s. mittels Realtime-PCR festgestellt. Dies belegt die Bedeutung dieser beiden Unterarten als Krankheitserreger für Vögel. Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit entwickelte Realtime-PCR zum Nachweis von M.a.a. und M.a.s erwies sich als sehr gut für die Diagnostik von klinischem Material und ist somit für die Untersuchung von Vogelpatienten und zur Bestandsuntersuchung geeignet. Insbesondere die in die PCR integrierte interne Kontrolle ist für die Qualitätskontrolle der Diagnostik bedeutend, da, wie hier gezeigt wurde, vor allem Kot- und Darmproben hinsichtlich eines hohen Gehalts an Inhibitoren problematisch sind.
Tierärztliche Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/07
An important factor in the development and main¬tenance of neuropathic pain is a loss of glycinergic inhibition in the spinal cord. Here glycine is the major inhibitory neuro¬transmitter, but it also has excitatory functions as an obligate co-agonist of glutamate at the NMDA re¬ceptor. Glycine concentration in the synaptic cleft is controlled by glycine transporter 1 and glycine transporter 2. Inhibition of these two glycine transporters can influence glycinergic neuro¬transmission. The goal of this study was to determine whether the intrathecal application of glycine transporter inhibitors ALX 5407 and ALX 1393, which would raise glycine levels in the synaptic cleft, can influence the nociception of rats. As gly¬cine acts on both the inhibitory glycine receptor and the excitatory NMDA receptor, we ex¬pected to see differential effects. Bennett and Xie´s chronic constriction injury model was used as a model for neuro¬pathic pain. Hyperalgesia and allodynia develop ten to twelve days after loose ligation of the left sciatic nerve and can be measured to quantify neuropathic pain. An intrathe¬cal PE10 catheter was inserted into the vertebral canal to enable application of both gly¬cine transporter in¬hibitors (three dos¬ages respectively: 10, 50 and 100 μg dis¬solved in 10 μl 100 % DMSO; n = 8) in the vicinity of the dorsal horn of the spinal cord. Following the treatment, me¬chanical paw withdrawal threshold was measured using a von Frey-filament and thermal paw withdrawal latency was measured using a modified Har¬greaves method. Both measurements were made for 240 minutes. The glycine transporter 1 inhibitor ALX 5407 had dose dependent differential effects on the noci¬cep¬tion of rats. Antinociceptive effects were obtained after application of the low and the high concentrations and pronociceptive effects were obtained after applica¬tion of the intermediate concentration. The pronociceptive actions were most prominent in the un¬injured right paw. There were no side effects. The glycine transporter 2 inhibitor ALX 1393 exerted exclusively antinociceptive ef¬fects that were significant only after appli¬cation of the high concentration. Additionally, at the high concentration, we observed severe neurological side effects in four of eight animals (pareses, paralysis, res¬piratory depres¬sion and analgesia). The pronociceptive effects of glycine transporter 1 inhibitor ALX 5407 can be ex¬plained by an in¬creased activation of NMDA receptor through un¬hampered spill over of synaptically released glycine. The antinociceptive effects of both glycine transporter inhibitors and the neurological side effects of the glycine transporter 2 inhibitor ALX 1393 are likely to be mediated by the gly¬cine receptor. This study shows, that neuropathic pain behaviour can be significantly in¬fluenced in vivo by manipulating glycine concentration through a singular intra¬the¬cal injection of spe¬cific glycine transporter inhibitors. The study of glycinergic neurotransmission with the aid of glycine transporter inhibi¬tors promises future development of potent and versatile therapeutics. These may have potential to treat neuropathic pain, act as muscle relaxants and analgesics and also function as cognitive enhancers and treatments for schizo¬phrenia.
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 10/19
Thu, 3 Dec 2009 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/10883/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/10883/1/Armann_Jakob.pdf Armann, Jakob
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 08/19
Thu, 31 Jul 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8886/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8886/1/Greiner_Dorothea_E.pdf Greiner, Dorothea ddc:600, ddc:61
Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 03/06
Thu, 5 Jun 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9490/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9490/1/Kuch_David.pdf Kuch, David ddc:540, ddc:500, Fakultät
Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 03/06
Fri, 23 May 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8605/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8605/1/Stroedke_Benjamin.pdf Strödke, Benjamin ddc:500, ddc:540, Fakultät für Chemie und Pharmazie
Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06
Tue, 18 Dec 2007 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8998/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8998/1/Eisenmann_Michael.pdf Eisenmann, Michael ddc:500, ddc:540, Fakultät für Chemie und Pharmazie
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 07/19
Die Fähigkeit der meisten aktiven Pyridinium-4-Aldoxime, wie Obidoxim und Trimedoxime, zur Reaktivierung phosphorylierter Acetylcholinesterase (AChE) ist noch nicht vollständig untersucht, da es zur unvermeidbaren Bildung von Phosphoryloximen (POX) kommt, diese sind ihrerseits extrem potente Inhibitoren der AChE. Vermutet wird das Vorliegen eines topochemischen Gleichgewichts am aktiven Zentrum, wobei das eben reaktivierte Enzym sofort durch POX wieder re-inhibiert wird. In der folgenden Arbeit wurden Dimethylphosphoryl-, Diethylphosphoryl- und Diisopropylphosphoryl-Obidoxime Verbindungen synthetisiert und isoliert. Ihre Hemmkonstanten gegenüber der AChE humaner Erythrozyten waren um den Faktor 2250, 480 und 600 höher, als die Entsprechenden von Paraoxon-methyl, Paraoxon-ethyl und Diisopropylfluorophosphat. Alle drei POX-Verbindungen wurden durch humane Paraoxonase 1 (PON1) hydrolysiert, dabei war das Alloenzym PON1 192Q um den Faktor 50 aktiver als PON1 192R. Das Verhältnis der Hydrolysegeschwindigkeiten mit Obidoxime als Produkt war 1:6:0,03 für die jeweiligen POX-Verbindungen. Die Geschwindigkeit des nicht-enzymatischen Zerfalls mit Obidoxime-Mononitril als Produkt war bei allen POX-Verbindungen ähnlich und zeigte eine hohe Temperaturabhängigkeit (Aktivierungsenergie 83 kJ/mol), während die enzymatische Hydrolyse weniger Energie benötigte (16 kJ/mol); aus diesem Grund wurde zur Bestimmung der POX-Hydrolase-Aktivität eine Reaktionstemperatur von 20 °C gewählt. Das Auftragen der POX-Hydrolase gegenüber der salz-stimulierten Paraoxonase-Aktivität zeigte besonders deutliche die Differenzierung der PON1 Q192R Alloenzyme. Eine Erklärung dafür könnte die abstoßende Wechselwirkung zwischen der Ladung des quarternären Stickstoffatoms des protonierten Argininrestes und dem bisquarternären POX liefern. Hieraus kann man schlussfolgern, dass der pharmakogenetisch relevante PON1 Q192R Polymorphismus eine weitere Ursache für die große Variabilität der Wirksamkeit Obidoxim-behandelter Patienten ist.
Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06
Aspergillus fumigatus ist ein opportunistischer Krankheitserreger, der ubiquitär in der Umwelt vorhanden ist. Die schwerwiegende Krankheit, die er verursacht, ist die invasive Aspergillose, welche nur bei immungeschwächten Patienten auftritt und bis heute nur sehr schwierig zu diagnostizieren und zu heilen ist. Die Sporen von A. fumigatus können aufgrund ihrer geringen Größe bis in die Alveolen der Lunge gelangen. Dort bilden Makrophagen die erste Verteidigungslinie, indem sie die Sporen phagozytieren. Die Phagozytose ist Bestandteil der angeborenen Immunantwort und ein initialer Schritt bei der Bekämpfung von A. fumigatus-Sporen durch Makrophagen. Das Verstehen dieses Prozesses gewinnt durch die stetige Zunahme der Patienten mit invasiver Aspergillose immer größere Bedeutung und ist Gegenstand intensivster Forschung. Im Rahmen dieser Dissertation wurden die Interaktionen von murinen und humanen Makrophagen mit A. fumigatus-Sporen untersucht. Die Fragestellung wurde aus zwei unterschiedlichen Perspektiven betrachtet. Zum einen wurde die Oberfläche der A. fumigatus-Sporen analysiert; zum anderen wurden die Interaktionen von A. fumigatus mit phagozytierenden Zellen erforscht. Um die Phagozytose von A. fumigatus-Sporen in murinen und humanen Zellen genauer charakterisieren zu können, wurde in dieser Arbeit der so genannte „Biotin-Calcofluor Staining Assay“ (BCS-Assay) entwickelt. Mit Hilfe dieser Methode war es möglich, zwischen extra- und intrazellulären Sporen zu unterscheiden, ohne auf die Anwesenheit von Antikörpern angewiesen zu sein. Mit Hilfe von diversen Inhibitoren konnte der Mechanismus der Phagozytose genauer untersucht werden. So konnte gezeigt werden, dass die Aufnahme von A. fumigatus-Sporen ein Aktin-abhängiger Prozess ist und dass Makrophagen für die Phagozytose die Aktivierung der Phosphoinositid 3 Phosphat-Kinasen und von Tyrosin-Kinasen benötigen, insbesondere diejenigen der scr Familie. Butanedion Monoxim, ein Inhibitor der Myosinmotor-Aktivität, blockierte ebenfalls effizient die Sporenaufnahme. Die weiteren Untersuchungen der Phagozytoseprozesse von A. fumigatus-Sporen erfolgten u.a. mit Hilfe von Fluoreszenz- und elektronenmikroskopischer Aufnahmen. In der Immunfluoreszenz ließen sich Tyrosin-phosphorylierte Proteine in den Aufnahmestrukturen detektieren, und elektronenmikroskopische Aufnahmen infizierter Makrophagen zeigten so gennante „Ruffle“-Strukturen. Diese Tatsache deutet darauf hin, dass A. fumigatus-Sporen durch einen „Trigger“-ähnlichen Mechanismus aufgenommen werden. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurden die Rezeptoren der Phagozytose von A. fumigatus-Sporen charakterisiert. Die Ergebnisse von Meier und ihren Kollegen zeigten bereits, dass die Erkennung von A. fumigatus durch Makrophagen mittels Toll-like Rezeptor 2 und TLR4 erfolgt. In der vorliegenden Arbeit wurde nun auch der Frage nachgegangen, welche Rolle TLR2 und TLR4 bei der Phagozytose von A. fumigatus-Sporen spielen. Hierzu wurden aus den Mausstämmen C3H/HeN (WT), C3H/HeJ (TLR4-), C3H/HeN TLR2-/- (TLR2-) und C3H/HeJ TLR2-/- (TLR2-/4-) murine Peritonealmakrophagen mittels Peritoneallavage entnommen, mit A. fumigatus-Sporen infiziert und mit Hilfe des BCS-Assays ausgewertet. Es konnte gezeigt werden, dass Toll-like Rezeptor 2 und nicht Toll-like Rezeptor 4 für eine effiziente Phagozytose benötigt wird. Dieses Ergebnis ließ sich wiederum mit Hilfe eines anti TLR2-Antikörpers bestätigen, da dieser auch die Phagozytose von A. fumigatus-Sporen, aber nicht von Kontrollbeads blockieren konnte. Des Weiteren wurde untersucht, ob der von Brown und seinen Mitarbeitern entdeckte Dectin-1 Rezeptor ein potentieller Phagozytoserezeptor von A. fumigatus-Sporen ist (Brown et al., 2001). Es konnte gezeigt werden, dass Laminarin, ein lösliches ß 1-3 Glucan, die Phagozytose von A. fumigatus-Sporen durch Makrophagen blockierte. Außerdem ließ sich mit einem anti-Dectin-1 Antikörper die Phagozytose von A. fumigatus-Sporen in Makrophagen hemmen. Zudem ließ sich Dectin-1 mit diesem Antikörper in infizierten Makrophagen in der Immunfluoreszenz detektieren. Mit einem weiteren Antikörper konnte beta-1-3 Glucan, ein wichtiger Bestandteil der pilzlichen Zellwand, auf ruhenden Sporen detektiert werden. Es zeigte sich, dass die Menge an 1-3 Glucan eine wichtige Rolle bei der Eliminierung von A. fumigatus-Sporen spielt. Vergleiche zwischen ruhenden und angeschwollenen Sporen zeigten, dass angeschwollene Sporen, welche größere Mengen an ß 1-3 Glucan auf ihrer Oberfläche besitzen, effizienter phagozytiert werden können. Auch die A. fumigatus pksP-Mutante, welche mehr 1-3 Glucan auf ihrer Oberfläche besaß, wurde effizienter phagozytiert. Betrachtet man die intrazelluläre Signaltransduktionskaskade, so deuten die Daten darauf hin, dass die Dectin-1-gesteuerte Phagozytose von A. fumigatus-Sporen abhängig von der Syk-Kinase verläuft. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass Dectin-1 und TLR2 für eine effiziente Phagozytose von A. fumigatus-Sporen benötigt werden. Die Ergebnisse legen allerdings nahe, dass außer Dectin-1 und TLR 2 noch weitere Rezeptoren bei der Phagozytose von A. fumigatus-Sporen beteiligt sind. Ein genaues Verständnis der bei der Phagozytose ablaufenden Erkennungsprozesse und der nachgeschalteten Signaltransduktionskaskaden könnte in Zukunft ausgenutzt werden, um die Effiziens der Phagozytose auch in immungeschwächten Patienten zu erhöhen und sie so zu schützen.
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 07/19
Bei etwa 30 % der Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) können aktivierende Mutationen der Rezeptortyrosinkinase FLT3 gefunden werden. Damit ist FLT3 eines der am häufigsten mutierten Gene in der AML. Die Mutationen treten in zwei Regionen des FLT3-Rezeptors auf: Längenmutationen (FLT3-LM) in der juxtamembranösen Region (24 %) und Punktmutationen der Aktivationsschleife der zweiten Tyrosinkinasedomäne (FLT3-TKD-Mutationen; 7 %). FLT3-Mutationen verleihen Ba/F3-Zellen Unabhängigkeit von Interleukin-3. In einem Knochenmarktransplantationsmodell der Maus erzeugen FLT3-LM ein myeloproliferatives Syndrom und in Zusammenwirken mit PML-RARα eine akute Promyelozytenleukämie. Darüber hinaus scheint das Auftreten von FLT3-LM bei Patienten mit einer schlechteren Prognose assoziiert zu sein. In dieser Arbeit wurden AML-Zelllinien und durch FLT3-Mutationen transformierte Ba/F3-Zellen mit dem kleinmolekularen PTK-Inhibitor SU5614 behandelt. SU5614 induziert selektiv Wachstumsarrest, Zellzyklusarrest und Apoptose in Ba/F3-Zellen und leukämischen Zelllinien, die FLT3-Mutationen tragen. Darüber hinaus hebt SU5614 die antiapoptotische und wachstumsfördernde Wirkung von FLT3-Ligand (FL) in FL-abhängigen Zellen auf. In Zelllinien, die keinen aktivierten FLT3-Rezeptor tragen, zeigte die Substanz keine zytotoxische Wirkung. Auf biochemischer Ebene hemmt SU5614 die Hyperphosphorylierung des FLT3-Rezeptors und seiner Downstream-Targets STAT3, STAT5 und MAPK, sowie die Expression der STAT5-Zielgene BCL-XL und p21. Es konnte somit demonstriert werden, dass das Indolinonderivat SU5614 ein potenter Hemmstoff von mutiertem FLT3 und Wildtyp-FLT3 ist. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass Zelllinien leukämischen Ursprungs, die endogen FLT3-Mutationen exprimieren, selektiv empfindlich gegenüber SU5614 sind. Diese selektive und potente Zytotoxizität von FLT3-Inhibitoren impliziert den klinischen Einsatz solcher Inhibitoren als zusätzliche molekulare Therapiemöglichkeit bei Patienten mit akuter myeloischer Leukämie und FLT3-Mutationen.
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 07/19
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, neue HIV-Replikationsinhibitoren in vitro auf Virusreplikationshemmung und eventuell vorhandene Toxizität zu testen. Die hier untersuchten Protease- und REV-Inhibitoren sind eine neue Generation von HIV-Replikationsinhibitoren. Sie sind teilweise durch das SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) -Verfahren hergestellte Moleküle, die vorher selektierte Aptamere von den definierten Bindungsstellen verdrängen konnten. Der Rest der neuen Inhibitoren sind anderweitig ins Visier geratene Verbindungen wie Nandrolon und Uvaol, bei denen ebenfalls sogenannte “small molecules“ eine Rolle spielen. Diese beiden Inhibitoren fungieren hier als Nicht-Substratanaloge Protease-Inhibitoren. Eine eindeutige Wirksamkeit auf die Senkung der Viruslast unter den neuen HIV-Replikationsinhibitoren zeigte Nandrolon, ein Protease-Inhibitor, bei HIV-1/O und minimal besser bei HIV-1/M. Bei den REV-Inhibitoren ließ sich fast bei allen Konzentrationen Toxizität nachweisen und somit auch keine eindeutig belegbare Wirkung auf die Senkung der RT-Aktivität. Von den bekannten Nukleosidischen und Nicht-Nukleosidischen RT-Inhibitoren wirkten AZT (Azidothymidin), DDI (Dideoxyinosin) und NVP (Nevirapin) eher im frühen Anteil des HIV-Replikationszyklus. Obwohl der Versuchsaufbau bei chronisch infizierten Zellen den fortgeschrittenen Teil des Replikationszyklus darstellte, zeigte sich bei DDC eine statistisch eindeutige Viruslastsenkung und eine Dosis-Wirkungsbeziehung. Bei den anderen bekannten RT-Inhibitoren zeigte sich wie erwartet keine Wirkung auf die Viruslast bei chronisch infizierten HUT-78 Zellen. Bei frisch infizierten Zellen, die den frühen Anteil des HIV-Replikationszyklus darstellen, zeigten alle in diesem Ansatz untersuchten RT-Inhibitoren (AZT, DDI und NVP) eine Wirkung. Den langsamsten Viruslastanstieg und somit die beste Wirksamkeit zeigte AZT im Gegensatz zu DDI und NVP. Zusammenfassend konnte die Wirksamkeit eines neuen Protease-Inhibitors (Nandrolon) sowohl bei HIV-1/M als auch bei HIV-1/O und ein unerwarteter Wirkungszeitpunkt von DDC bei chronisch infizierten Zellen gezeigt werden. Problematisch stellte sich die Toxizität der Rev-Inhibitoren bei höheren Konzentrationen dar. Allerdings könnten feinere Abstufungen der Konzentrationen einer besseren und exakteren Eingrenzung der Toxizität dienen. Weitere Untersuchungen für Nandrolon oder die entsprechenden, neuen Inhibitorenklassen konnten infolge einer Neuausrichtung des Forschungsschwerpunktes der Firma NASCACELL im Rahmen dieser Arbeit nicht weiter verfolgt werden. Auch in Zukunft ist die Erforschung neuer Substanzen und Substanzklassen wichtig, da mit Resistenzen der HI-Viren nach absehbarer Zeit und somit konsekutivem Therapieversagen gerechnet werden muss.
Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06
Zusammenfassung Die Protease Separase trägt zur Regulation mitotischer und meiotischer Vorgänge entscheidend bei. Ihre klassische Funktion ist die Induktion der Schwesterchromosomen-trennung durch Spaltung des Cohesin-Proteinkomplexes, der die Schwesterchromatiden von der S-Phase bis zur Mitose gepaart hält. Separase wird am Ende der Metaphase durch Ubiquitin-abhängigen Abbau ihres Inhibitors Securin aktiviert. Ein zweiter Separase-Inhibitionsmechanismus ist die Hemmung durch Cyclin B1/Cdk1 („Cyclin Dependent Kinase 1“). Dafür ist Separase-Phosphorylierung durch Cdk1 notwendig (Stemmann et al., 2001). In vielen Modellorganismen hat Separase Funktionen, die über die Anaphase-Induktion hinausgehen. So trägt sie in S. cerevisiae beispielsweise zur Cdk1-Inaktivierung beim Meiose I-Meiose II-Übergang bei. Diese Separase-Funktion benötigt die proteolytische Separase-Aktivität nicht, ist jedoch abhängig vom Securin-Abbau. Für andere Funktionen der Separase hingegen könnte die Separase-abhängige Spaltung noch nicht identifizierter Substrate notwendig sein. In der vorliegenden Arbeit wird deshalb die Etablierung der IVEC-Methode („In Vitro Expression Cloning“) zur Identifizierung neuer Separase-Substrate vorgestellt. Mittels IVEC wurde - basierend auf der proteolytischen Separase-Aktivität - aus einer menschlichen cDNA-Bibliothek das In-vitro-Separase-Substrat GASP isoliert. Des Weiteren wurde die Separase-Hemmung durch Cyclin B1/Cdk1 näher untersucht. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Phosphorylierung von Separase durch Cyclin B1/Cdk1 für ihre Inhibition zwar notwendig, aber nicht hinreichend ist. Nach Phosphorylierung der Separase assoziiert die Kinase stabil mit der Protease, und erst diese Komplexbildung führt letztendlich zur Inhibition der proteolytischen Separase-Aktivität. Cyclin B1/Cdk1 ist also ein nicht-katalytisch wirkender Separase-Inhibitor. Die zeitlich korrekte Separase-Aktivierung ist für die fehlerlose Chromosomentrennung essentiell. Da Zellen ohne Securin ihre Chromosomen jedoch akkurat und zum richtigen Zeitpunkt trennen, muss es alternative Separase-Inhibitionsmechanismen geben. Die Separase-Hemmung durch Cyclin B1/Cdk1-Bindung könnte dieser gesuchte Securin-unabhängige Mechanismus sein, da der Separase-Cyclin B1/Cdk1-Komplex in Zellen bereits vor der Anaphase nachgewiesen werden kann und Cyclin B1 - wie Securin - am Ende der Metaphase Ubiquitin-vermittelt abgebaut wird. Securin und Cyclin B1/Cdk1 können nicht gleichzeitig an Separase binden. Die beiden Inhibitoren sind also Komponenten parallel und nicht konvergent wirkender Regulationsmechanismen. Die Phosphorylierung von Separase an Serin 1126 ist für ihre Cyclin B1/Cdk1-abhängige Inhibition essentiell (Stemmann et al., 2001). Daneben konnte in der hier vorgestellten Arbeit eine zweite Domäne in Separase identifiziert werden, die ebenfalls sowohl für die Inhibition der proteolytischen Separase-Aktivität als auch für die Komplexbildung mit Cyclin B1/Cdk1 nötig ist. Da diese zweite Cyclin B1/Cdk1-Bindungsdeterminante Sequenzhomologie zu dem Cdc6-Protein aufweist, wurde sie CLD („Cdc6 Like Domain“) genannt. Cdc6 ist ein konserviertes Protein, das in S. cerevisiae Cdk1-Inhibitionsaktivität besitzt. Dazu bindet es abhängig von der Phosphorylierung seines Aminoterminus direkt an B-Typ-Cycline, die sich im Komplex mit ihren Cdks befinden (Mimura et al., 2004). Durch Phosphatase-behandlung und Mutationsanalyse konnte bewiesen werden, dass die Interaktion zwischen Separase und Cyclin B1/Cdk1 auch von Phosphorylierung der Protease innerhalb ihrer CLD abhängt. Dies legt nahe, dass die Separase-CLD wie der Cdc6-Aminoterminus direkte Kontakte mit der Cyclin-Untereinheit der Kinase ausbildet. Serin 1126-Phosphorylierung ist dagegen indirekt an der Kinase-Bindung beteiligt. Denn erstens wird sie nach der Etablierung des Komplexes für seinen Erhalt nicht mehr benötigt (Holland et al., 2006), und zweitens ist sie für die Wechselwirkung zwischen CLD-enthaltenden Separasefragmenten und der Kinase abkömmlich. Ein zunächst favorisiertes Bindungsmodell, bei dem die Polo-Kinase an phosphoryliertes Serin 1126 bindet, um danach die Bindung von Cyclin B1 durch Phosphorylierung der CLD zu vermitteln, konnte ausgeschlossen werden. Stattdessen bewirkt die Phosphorylierung von Serin 1126 wohl eine Konformationänderung der CLD, die dadurch in die Lage versetzt wird, starke Wechselwirkungen mit der Cyclin B1-Untereinheit der Kinase einzugehen. Überraschenderweise ist im Separase-Cyclin B1/Cdk1-Komplex auch die Kinase inaktiv. Diese unerwartete Separase-Funktion als Cdk1-Inhibitor ist in Oozyten der Maus für den Übergang von der Meiose I in die Meiose II von entscheidender Bedeutung. Denn die Inhibition der Separase-Cyclin B1/Cdk1-Komplexbildung durch Mikroinjektion entsprechender Antikörper in Maus-Oozyten verhindert den Ausstoß des ersten Polkörpers, d.h., die Eizellen können den Meiose I-Meiose II-Übergang nicht vollziehen. In diesen Oozyten sinkt die Cdk1-Aktivität am Ende der Meiose I nicht wie bei Kontroll-Oozyten ab. Diese persistente Cdk1-Aktivität ist der Grund für den verhinderten Übergang von Meiose I nach -II, da künstliche Cdk1-Inhibition in Anwesenheit des inhibitorischen Antikörpers den Polkörperausstoß wiederherstellt. In mitotischen Zellen steigt der unter endogenen Bedingungen mit Separase assoziierte Anteil von Cyclin B1/Cdk1 in der Anaphase - d.h. nach dem Abbau seines Bindungskompetitors Securin - an. Übertragen auf die Meiose bedeutet das, dass Securin-Abbau die Induktion der Anaphase mit der Separase-abhängigen Cdk1-Inaktivierung koppelt.
Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Identifikation und Lokalisation eines ATP-abhängigen Kaliumkanals (KATP) in isolierten humanen Granulosazellen und im humanen Ovar. In RT-PCR- und Western Blot-Experimenten zeigte sich, dass dieser in humanen GZ von IVF-Patientinnen ohne und mit PCOS aus den Untereinheiten Kir 6.1 und SUR 2B besteht. Die Proteine der KATP-Untereinheiten in kultivierten humanen GZ ließen sich in immunzytochemischen Färbungen mit Antikörpern, die gegen die Kir 6.1- und die SUR 2B-Untereinheit gerichtet waren, nachweisen. Immungoldfärbungen mit anschließender elektronenmikroskopischer Betrachtung zeigten, dass sich der KATP in der Plasmamembran humaner GZ befindet, nicht jedoch in Mitochondrien. Dies ergab sich auch in funktionellen Untersuchungen, in denen Diazoxid und Glibenclamid keine Wirkung auf das mitochondriale Membranpotential hatten. Der KATP, der aus den Untereinheiten Kir 6.1 und SUR 2B zusammengesetzt ist, entspricht dem Subtyp des KATP-Kanals, der typischerweise im glatten Muskel in Gefäßen vorkommt. Die elektrophysiologischen Eigenschaften des KATP wurden durch Einzelkanalmessungen untersucht und ergaben, dass der beschriebene Kanal alle charakteristischen Merkmale eines KATP aufweist, nämlich eine Leitfähigkeit von etwa 44 pS, Einwärtsgleichrichtung und eine Regulation durch Nukleotide. Neben der Charakterisierung des KATP auf Einzelkanalebene wurde auch das Ansprechen des Kanals auf KATP-Öffner und -Inhibitoren in Whole-Cell-Messungen und durch Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Der KATP spricht auf den KATP-Inhibitor Glibenclamid an, was zu einer Depolarisation der Plasmamembran führt. Somit ist der KATP der erste Kanaltyp in humanen GZ, für den eine Rolle bei der Regulation des Membranpotentials gezeigt werden konnte. Es ergaben sich Hinweise darauf, dass der KATP-Inhibitor Glibenclamid Auswirkungen auf die Expression des für die Östradiolsynthese wichtigen Enzyms Aromatase hat. Des Weiteren führte das Schließen des KATP durch Glibenclamid zu einer Senkung der hCG-induzierten Progesteronproduktion, der Hauptaufgabe der Granulosalutealzellen. Zur Klärung des zugrundeliegenden Mechanismus wurde der Einfluss des KATP auf verschiedene Syntheseschritte der Progesteronproduktion und die daran beteiligten Enzyme untersucht. Es konnte jedoch weder für das Enzym StAR noch für die Enzyme SCC und 3β-HSD eine Veränderung der Expression durch die Behandlung humaner GZ mit den KATP-Modulatoren Diazoxid und Glibenclamid nachgewiesen werden. Bei der Betrachtung von Ultradünnschnitten im Elektronenmikroskop zeigten sich in humanen GZ, die mit hCG und Glibenclamid behandelt worden waren, weniger Lipidtröpfchen als nach der Behandlung mit hCG und DMSO. Zudem traten unter hCG und Glibenclamid vermehrt Mitosen und Apoptose auf, aber es bleibt unklar, wie sich dies auf die Progesteronproduktion auswirkt. Diese Effekte von Glibenclamid auf den KATP bzw. das Membranpotential einerseits und auf die hCG-induzierte Progesteronproduktion in humanen GZ andererseits legt einen Zusammenhang zwischen der KATP-Aktivität und der Steroidhormonsynthese in humanen GZ nahe. Der Mechanismus dieses Effekts bleibt aber noch zu klären. Da der KATP in humanen GZ vorkommt und einen potentiellen Angriffspunkt für pharmakologische Wirkstoffe darstellt, sollte er als möglicher Auslöser eventuell noch nicht berücksichtigter Wirkungen im Ovar weiter untersucht werden.
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 06/19
Das Auftreten von Resistenzen ist eines der Hauptprobleme der heute angewandten antiretroviralen Therapie. Resistenzen können diagnostisch mit dem sog. genotypischen oder dem phänotypischen Verfahren festgestellt werden. Die genotypische Diagnostik beruht auf der Nukleotid-Sequenzierung der viralen Target-Gene Reverse Transkriptase (RT) oder Protease (PR), die relativ einfach zu bewerkstelligen ist. Ein phänotypischer Resistenztest und damit direkter Aktivitätstest der Enzyme RT und PR ist sehr viel präziser. Dies ist z.B. beim Vorliegen komplexer Resistenzmuster oder einem Mangel an genotypischer Information von resistenzrelevanten Mutationen bei einem neu verwendeten antiviralen Medikament von großer Bedeutung. Die zu testenden Enzyme werden entweder aus DNA, isoliert aus PBMCs aus Patientenvollblut oder Plasma-RNA rekombinant hergestellt. Vor kurzem wurde nun die Frage erhoben, ob die diagnostisch gemessenen Werte Unterschiede aufweisen, je nachdem ob DNA oder RNA als Ausgangsmaterial verwendet wurde. Die Veröffentlichungen zu diesem Thema waren diskreptant in ihren Aussagen. Zur Klärung dieser Frage wurde in der vorliegenden Arbeit das phänotypische Resistenzverhalten der HIV-Protease von 12 Patienten gegenüber 5 verschiedenen Proteaseinhibitoren untersucht. Aus jedem der Patienten wurde ein "Protease-Paar" sowohl aus HIV-DNA als auch HIV-RNA (via cDNA) rekombinant produziert. Die Patienten wiesen eine unterschiedliche Höhe der Viruslast auf, sie lag zwischen 1.900 cp/ml und 230.000 cp/ml, und hatten unterschiedlich hohe CD4-Zellzahlen. Mit dieser Untersuchung sollte also erstens die Frage beantwortet werden, ob zu einem gegebenen Zeitpunkt Abweichungen im Resistenzprofil zwischen den beiden Formen genetischer Information von HIV im Körper vorliegen können. Im positiven Fall sollte festgestellt werden, welchen Einfluss die Virusvermehrung/Virusdynamik und der Immunstatus des betroffenen Patienten, ausgedrückt durch die Laborparameter Viruslast und CD4-Zellzahl, darauf haben. Zweitens sollte dasjenige Probenmaterial gefunden werden, welches für den phänotypischen Resistenztest das optimale Resultat ergibt: entweder HIV-DNA aus PBMCs im Vollblut oder HIV-RNA aus Blutplasma. Der hier verwendete phänotypische Resistenztest (PRT) basiert auf der direkten Messung der HIV-Proteaseaktivität, die durch rekombinante Expression der gesamten Population von HIV-Protease eines Patienten hergestellt wurde. Für die vorliegende Arbeit wurde parallel sowohl HIV-DNA aus PBMCs im Vollblut als auch cDNA aus viraler RNA im Blutplasma des Patienten als Ausgangsmaterial für die nested PCR verwendet. Nach erfolgter Expression des Enzyms in E. coli und effektiver Ein-Schritt-Aufreinigung wurde die Proteaseaktivität mit einem neuen und schnellen phänotypischen Testsystem mittels eines Fluoreszenzsubstrates in Ab- und Anwesenheit der verschiedenen Inhibitoren gemessen. Durch den Vergleich mit Wildtyp-Werten konnten die entsprechenden Resistenzfaktoren berechnet werden. Ergebnis: Von den 12 untersuchten Patienten zeigten sich in 3 "DNA/RNA-Paaren" signifikante Unterschiede in mindestens einem Proteaseinhibitor, während bei 9 Patienten übereinstimmende Resistenzmuster gefunden wurden. Schlussfolgernd wird festgestellt, dass die Verwendung von entweder DNA oder RNA als Ausgangssubstanz für den benutzten Resistenztest unterschiedliche Ergebnisse im Resistenzmuster erbringen kann, dies aber nicht notwendigerweise der Fall ist. Zwischen dem Auftreten bzw. Fehlen von unterschiedlichen Resistenzmustern und den virologischen und immunologischen Parametern Viruslast und Anzahl der CD4 positiven Zellen konnte keine klare Korrelation festgestellt werden. Ein Auftreten von Differenzen zwischen den Resistenzmustern von DNA und RNA kann die Folge eines Populationswechsels der HIV-RNA sein, die im Gegensatz zur archivarischen Natur der meist integrierten DNA aus ruhenden CD4 positiven T-Gedächtniszellen oder Monozyten erst kürzlich von aktiv infizierten Zellen produziert wurde. Ein Fehlen von Unterschieden kann bedeuten, dass die Hauptfraktion der DNA entweder erst kürzlich generiert wurde oder die RNA sich nicht verändert hat. Für die diagnostische Anwendung des PRT haben diese Ergebnisse folgende Konsequenzen: um die aktuelle Resistenzsituation abzubilden, ist virale RNA aus dem Blutplasma das bevorzugte Ausgangsmaterial. Um dagegen stille Mutationen aufzudecken, die z.B. für zukünftige Therapien oder eine adäquate Postexpositionsprophylaxe von Bedeutung sind, sollte virale DNA, stammend aus PBMCs des Vollblutes, verwendet werden.
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 06/19
Ziel dieser Arbeit war die Vereinfachung und Optimierung der bekannten hochsensitiven RT-Nachweisverfahren. Hochsensitive RT-Nachweisverfahren bestehen aus der Generierung von cDNA aus einem heteropolymeren Template mit anschließender Amplifikation der entstandenen cDNA mittels PCR. Bei den ersten in der Literatur beschriebenen Verfahren zum hochsensitiven RT-Aktivitätsnachweis mit PCR-Amplifikationsschritt (PERT, Pyra 1994; AmpRT, Heneine 1995) handelt es sich um qualitative Verfahren mit Gel-Elektrophorese und Ethidiumbromid Färbung der PCR-Produkte als Read-out. Von diesen beschriebenen Verfahren wurde die Auswahl des heteropolymeren RNA-Templates und der grundsätzliche Ablauf, sowie einige Überlegungen zur Optimierung übernommen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden neue, optimierte Primersequenzen für den RT-Schritt sowie für den PCR-Amplifikationsschritt entworfen. Diese Primersequenzen ermöglichen die Untersuchung der RT-Aktivität im Verlauf des RNA-Templates sowie die Untersuchung des Einflusses von RT-Inhibitoren. Es wurden die üblichen Optimierungsschritte wie MgCl2-Titration, Titration der Primerkonzentration und Variation der Annealing-Temperatur durchgeführt. Um eine Kontamination im Sinne eines Carry-over von PCR-Produkten zu verhindern, wurde ein UNG/dUTP System integriert und in seiner Wirksamkeit überprüft. Zwei verschiedene quantitative Read-out Verfahren wurden verglichen: Die Bestimmung der Menge an entstandenem PCR-Produkt am Ende des PCR-Schrittes stellte sich als arbeitsaufwändig heraus und ermöglichte nur einen geringem linearen Messbereich. Die Real-Time-Quantifizierung zeigte dagegen einen weiten linearen Messbereich und benötigt nach dem PCR-Schritt keine zusätzlichen Arbeitsschritte. Es konnte somit die Überlegenheit des Nachweises mittels Real-Time-PCR im Vergleich zur Endpunkt-Bestimmung gezeigt werden. Zur Real-Time Quantifizierung wurde für die Fluoreszenz-Detektion statt einer Exonuklease-Sonde (TM-PERT, TaqMan-Verfahren, z.B. von Maudru 1998 beschrieben) ein Molecular Beacon verwendet. Auch hier wurden die üblichen Optimierungsverfahren (Sonden-Titration, Einsaatmenge cDNA) durchgeführt. Mit dem entwickelten Verfahren können so geringste Mengen von RT-Aktivität, entsprechend ca. 40 Viruspartikeln mit hoher Kontaminationssicherheit und hoher Spezifität nachgewiesen werden. Es konnte das Ansprechen auf nukleosidische RT-Inhibitoren gesteigert werden, mit der Möglichkeit phänotypische Resistenztests auch gegen AZT durchzuführen. Zahlreiche viel versprechende Anwendungsgebiete des RT-Aktivitäts Nachweises mit dem hier etablierten Test sind jedoch derzeit für die Routineanwendung nicht zugänglich, solange die Probleme durch unspezifische Inhibitoren, wie sie beispielsweise im Blutplasma vorkommen, nicht gelöst sind. Um dieses Nachweisverfahren für die virologische Diagnostik einzuführen, wird ein stabiles und einfaches Aufreinigungsverfahren für RT aus Blutplasma von Patienten benötigt.
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 05/19
1. Fragestellung: Die Fragestellung der vorliegenden Arbeit war zum einen die Untersuchung des tatsächlichen Einflusses verschiedener nicht steroidaler Antiphlogistika auf die Thrombozytenfunktion und zum anderen der Vergleich der hier angewandten Methoden hinsichtlich ihrer Empfindlichkeit und Praktikabilität im klinischen Alltag. Während die Thrombozytenaggregationshemmung für Acetylsalicylsäure schon lange bekannt ist, sind Daten oder Aussagen zu einer Reihe von anderen Analgetika nach wie vor unklar. Diese Fragestellung interessierte uns insbesondere vor dem Hintergrund der onkologischen und hämatologischen Patienten, bei denen häufig eine krankheits- oder medikamentenbedingte Thrombozytopenie besteht, und die andererseits häufig auf schmerzstillende oder fiebersenkende Medikamente angewiesen sind. Ausserdem sollte die Dauer einer Thrombozytenfunktionsstörung nach Einnahme von NSAIDs untersucht werden. 2. Methoden Wir untersuchten 5 nichtsteroidale Antiphlogistika an gesunden Probanden. Die Medikamente waren ASS, Ibuprofen, Paracetamol, Diclofenac und der selektive COX-2 Hemmer Rofecoxib. Zunächst wurde an Tag 0 die Thrombozytenfunktion der Probanden ohne Einfluss eines Medikamentes gemessen. An Tag 1, 2 und 3 nahmen die Probanden eines der genannten Medikamente ein. An Tag 4, 5 und 6 wurde die Thrombozytenfunktion im Verlauf gemessen. Die angewandten Methoden waren die Durchflusszytometrie, die Aggregometrie, die Thrombelastographie und der Platelet function Analyser -100. Die Durchflusszytometrie ermöglicht Aussagen über die Plättchengröße, die Plättchengranularität und Glykoproteinexpression an der Oberfläche der Thrombozyten. Die Aggregometrie erlaubt Aussagen über das Aggregationsverhalten der Thrombozyten nach Stimulation durch ADP oder Kollagen. Die Thrombelastographie ist in der Lage, die Geschwindigkeit der plasmatischen Gerinnung, der Koagelbildung und die Festigkeit des Blutgerinnsels zu messen. Der PFA-100 ist ein Analysesystem, das den Prozess der Thrombozytenadhäsion und Thrombozytenaggregation nach einer Gefäßverletzung simuliert. Sozusagen eine Messung der Blutungszeit in vitro, die das Erkennen von ererbten, erworbenen oder durch Thrombozytenaggregationshemmer induzierte Thromozytenfunktionsstörungen ermöglicht. 3. Ergebnisse In der Durchflusszytometrie zeigte sich nach der Einnahme von ASS, Ibuprofen und Diclofenac eine vermehrte Expression von P-Selektin an der Oberfläche der Thrombozyten. Die Expression des Glykoproteins GPIIb/IIIa war überraschenderweise nach Einnahme von Rofecoxib statistisch signifikant vermindert. Bei der Untersuchung der Blutungszeit in vitro mit dem PFA-100 fanden sich statistisch signifikante Verlängerungen der Blutungszeit nach Einnahme von ASS, Ibuprofen und Diclofenac. Paracetamol und Rofecoxib nahmen keinen Einfluss auf die Blutungszeit. In der Aggregometrie ließ sich nur nach Einnahme von ASS ein signifikanter Einfluss auf die Menge der benötigten, die Aggregation auslösenden, Stimulantia nachweisen. Die weiteren Medikamente hatten keinen Einfluss. In der Thrombelastographie zeigte sich eine Verlängerung der plasmatischen Gerinnung nach Einnahme von ASS, Diclofenac und Rofecoxib. 4. Zusammenfassung Im Vergleich der hier angewandten Methoden stellte sich heraus, dass im klinischen Alltag der PFA-100 und die Aggregometrie als wegweisende Methoden für die Entdeckung eventueller Gerinnungsstörungen nach Einnahme von NSAIDs als Methoden der Wahl anzusehen sind. Die Thrombelastographie ist aufgrund der Dauer bis zu einem Ergebnis zu langsam und aus den Veränderungen in der Durchflusszytometrie lassen sich nicht zwangsläufig Thrombozytenfunktionsstörungen ableiten, die zu veränderten Blutungsneigungen führen können. Außerdem ist die Durchflusszytometrie auch die aufwendigste und teuerste der hier durchgeführten Methoden. In der Zusammenschau ist also dem PFA-100, und in zweiter Linie der Aggregometrie, der Vorzug in der Untersuchung der Throm-bozytenfunktion - nach Einnahme von NSAIDs - hinsichtlich einer Aussage über die Blutungsgefahr zu geben. Von den untersuchten Medikamenten hatte der selektive COX-2 Inhibitor Rofecoxib und das nicht steroidale Antiphlogistikum Paracetamol den geringsten Einfluss auf die Thrombozytenfunktion. Eine Empfehlung zur Schmerztherapie bzw. fiebersenkenden Therapie bei blutungsgefährdeten Patienten geht also zum Einsatz von Paracetamol oder einem Medikament aus der Gruppe der COX-2 Inhibitoren.
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 05/19
Thu, 11 May 2006 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/5269/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/5269/1/Schneider_Philip.pdf Schneider, Philip
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 05/19
Oxidative Veränderungen von LDL-Partikeln und Aktivierung der Blutplättchen spielen eine wesentliche Rolle bei der Entstehung von Herz-Kreislauferkrankungen. Lysophosphatidsäure (LPA) ist eine thrombogene Substanz, die in oxidativ modifizierten LDL-Partikeln (mox- LDL) und atherosklerotischen Läsionen enthalten ist. Kurzkettige Analoga von Phosphatidsäure wurden auf ihren Effekt auf zwei initiale thrombozytäre Antworten, Gestaltwandel (shape change) und Ca2+-Mobilisation, untersucht. Dioctylglycerol Pyrophosphat [DGPP(8:0)] und Dioctyl-Phosphatidsäure [PA(8:0)], die kürzlich als selektive Antagonisten des LPA1- und LPA3-Rezeptors beschrieben wurden, inhibierten spezifisch die Thrombozytenaktivierung durch LPA. DGPP (8:0) war hierbei ein potenterer Antagonist als PA (8:0). DGPP (8:0) hemmte auch den thrombozytären shape change durch mox-LDL und Lipidextrakte aus humanen atherosklerotischen Plaques. Bemerkenswerterweise konnte in dieser Arbeit erstmals gezeigt werden, dass der lipidreiche Kern atherosklerotischer Plaques direkt den shape change induzierte. Dieser Effekt war durch Vorinkubation mit DGPP (8:0) vollständig zu hemmen. Überdies konnte durch gemeinsame Gabe des lipidreichen Kerns oder LPA mit unterschwelligen Konzentrationen ADP oder Adrenalin eine deutliche synergistische Aggregation hervorgerufen werden, welche wiederum durch DGPP (8:0) gehemmt werden konnte. Durch Analyse von Plaquematerial mittels Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie ließen sich besonders potente Thrombozyten-aktivierende LPA-Spezies (16:0-alkyl-LPA und 20:4-acyl-LPA) identifizieren. Homogenate des gesamten atheromatösen Plaques induzierten Aggregation, die nicht mit dem LPA-Gehalt der Plaques korrelierte. Maßgeblich für die Aggregation schienen v.a. Matrixbestandteile, wie Kollagen zu sein. Im Rahmen von Untersuchungen zur klinischen Bedeutung von LPA fand sich bei Patienten mit Carotisstenosen, die eine Hypercholesterinämie hatten, ein signifikant höherer Gehalt an LPA im Plaquematerial als bei Patienten mit normalen Cholesterinwerten. Außerdem reagierten Thrombozyten von Patienten mit manifester Atherosklerose sensitiver auf LPA als Blutplättchen von gesunden Probanden. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass LPA eine Schlüsselrolle bei der Thrombozytenaktivierung durch den vulnerablen Lipidkern atherosklerotischer Läsionen besitzt. LPA-Moleküle des lipidreichen Kerns induzierten eine rasche Plättchenaktivierung, wahrscheinlich über Aktivierung von LPA1- und LPA3-Rezeptoren. Spezifische Antagonisten der thrombozytären LPA-Rezeptoren könnten als wirkungsvolle Inhibitoren der arteriellen Thrombusbildung bei Patienten mit kardiovaskulären Krankheiten dienen.
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 05/19
Kristallstrukuturuntersuchungen zur dreidimensionalen Struktur der Src-Kinase Hck im Komplex mit dem Tyrosinkinasen-Inhibitor PP1 haben gezeigt, dass die Zusammensetzung der Aminosäuren an verschiedenen Positionen kritisch für die Sensitivität von Kinasen gegenüber diesem Inhibitor sein können. In dieser Arbeit sollten die für die Bindung von PP1 und Hck relevanten Aminosäuren identifiziert werden und gezeigt werden, dass Hck direkt durch PP1 inhibiert wird. Es sollte ein System entwickelt werden, dass zur Selektion niedermolekularer Kinase-Inhibitoren dient. In dieser Arbeit wurden PP1-insensitive Punktmutanten von Hck hergestellt. Die untersuchten Aminosäure-Positionen innerhalb von Hck begrenzen zum einem den Eingang zu einer hydrophoben Tasche (Position 338 und 403), zum anderen liegen sie innerhalb dieser Tasche (Positionen 314, 323, 325 und 336). Diese Positionen wurden durch Aminosäuren mit längeren oder polaren Seitenketten ersetzt. Es konnte gezeigt werden, dass die mutierten Positionen innerhalb der hydrophoben Tasche nicht wesentlich an der Bindung zu PP1 beteiligt sind. So zeigt zwar die Mutation zu Phenylalanin an den Positionen L325 und I336 Wildtyp-Aktivität, allerdings ist bei keiner der Taschen-Mutanten Inhibitor-Resistenz gegenüber PP1 nachweisbar. Die meisten der untersuchten Eingangs-Mutanten (Position 338 und 403) zeigen eine dem Wildtyp Hck vergleichbare Aktivität. Allein die Position 388 konnte als einzige Spezifitätsdeterminante von Hck für den Inhibitor PP1 identifiziert werden, da die Mutation dieser Aminosäuren zu einer erheblichen Reduktion der Sensitivität der Kinasen gegenüber PP1 führte. Die Position 403 hingegen wird nicht als Spezifitätsdeterminante von PP1 anerkannt, da die Mutanten sensitiv gegenüber PP1 sind. Zusammengefasst zeigen die Daten, dass PP1 die Src-Kinase Hck direkt über die Bindung in die hydrophobe Tasche in Nachbarschaft zur ATP-Bindungsstelle inhibiert. Das etablierte System der Mutation einer Aminosäureposition, die entscheidend die Bindung eines Inhibitors beeinflusst, kann nützlich sein, um die biologische Potenz von Inhibitoren und deren Zielstruktur-Spezifität zu untersuchen. Es kann zudem für die Spezifizierung und Optimierung von Kinase-Inhibitoren herangezogen werden.
Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06
Die vorliegende Dissertation untersucht mit Hilfe der Microarray-Technologie die Auswirkungen gängiger Zytostatika auf die globale Genexpression humaner Tumor- und Normalzellen und evaluiert deren Gemeinsamkeiten und Unterschiede. Darüber hinaus werden niedermolekulare Inhibitoren, die spezifisch gegen onkologische Targets gerichtet sind, in ähnlicher Weise analysiert und mit einer RNAi-vermittelten Herabregulierung desselben Zielmoleküls verglichen. Der Vergleich der Expressionsmuster lässt darauf schließen, inwieweit die Effekte verschiedener Substanzen übereinstimmen, und ermöglicht aufgrund dessen eine Aussage über ihre Spezifität.
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/19
Widerstandsarterien spielen eine wichtige Rolle bei der Durchblutungsregulation. Bisher konnte der wichtigste endotheliale Dilatator in diesen Gefäßen, EDHF, nicht eindeutig identifiziert werden, da pharmakologische Inhibitoren unspezifische Nebenwirkungen aufwiesen. Die spezifische Inhibition von Enzymen mittels Antisensetechnik konnte in intakten Arterien nicht durchgeführt werden, da diese nur über einen kurzen Zeitraum funktionell intakt erhalten werden konnten. Im Rahmen dieser Dissertation wurde ein neues Organkulturmodell entwickelt, in dem erstmalig die endothelabhängigen EDHF- und NO-vermittelten Dilatationen über 48 h vollständig erhalten werden konnten. Zusätzlich entwickelten die kultivierten Arterien einen mit dem frisch isolierter Arterien vergleichbaren Spontantonus und zeigten eine myogene Reaktion, die sich in Kinetik und Ausmaß der Kontraktion nicht von den Kontrollarterien unterschied. Ebenso kontrahierten die chronisch perfundierten Arterien auf Stimulation mit Noradrenalin und dilatierten nach Applikation des NO-Donors SNP in vergleichbarem Ausmaß wie frisch isolierte Arterien. Um zu untersuchen, ob möglicherweise eine CytochromP450-Epoxygenase in der Signalkaskade des EDHF eine Rolle spielt, wurde zunächst die Expression von CYP2C8 in Widerstandsarterien mittels rtPCR und in-situ-Hybridisierung nachgewiesen. Da mit dem Organkulturmodell die Arterien funktionell vollständig intakt gehalten werden konnten, wurde die Wirkung von Antisense-Oligonucleotiden, die gegen CYP2C8 gerichtet waren, untersucht. Mittels konfokaler Mikroskopie konnte gezeigt werden, dass die FITC-markierten Oligonucleotide sich nur in der Intima befanden und die Transfektion des Endothels eine hohe Effizienz aufwies. Die Transfektion hatte keinen Effekt auf die NA-induzierte Kontraktion, auf die durch NS1619 (KCa-Kanalöffner)- oder die SNP- vermittelte Relaxation, was zeigt, dass die Funktion des glatten Muskels durch die Transfektion unbeeinträchtigt blieb. Die EDHF-vermittelten Dilatationen wurden durch die Transfektion mit den Antisense-Oligonucleotiden um 76% und die korrespondierenden Calciumabfälle um 58 % reduziert, während die Kontrolltransfektionen mit Scrambled- oder Senseoligonucleotiden keinen Einfluss auf die EDHF-mediierten Dilatationen hatten. Die endothelialen Calciumanstiege nach Stimulation mit ACh blieben in den Antisense-transfizierten Arterien unverändert. Das bedeutet, dass die Signaltransduktion der ACh-Rezeptoren durch die Transfektion funktionell nicht beeinträchtigt wurde. Auf diese Weise konnte mit einem spezifischen Inhibitor gezeigt werden, dass CYP2C8 eine EDHF-Synthase ist oder dessen Metabolit einen permissiven Faktor für einen anderen EDHF darstellt und ein elementarer Bestandteil der EDHF-Signalkaskade ist. Zusätzlich wurden mit diesem Organkulturmodell die Auswirkungen des kardiovaskulären Risikofaktors Hochdruck durch isolierte Erhöhung des transmuralen Drucks auf 120 und 160 mmHg (SMA120 bzw. SMA160) während einer Kulturperiode (48 h) untersucht. In den funktionellen Testungen zeigten sich nach 48 h geringere Außendurchmesserwerte in SMA120 und SMA160 im Sinne eines Remodelings. Der erhöhte Perfusionsdruck führte darüber hinaus zu einer Verstärkung der Noradrenalin-vermittelten Kontraktion. Dies ist jedoch nicht durch eine Erhöhung der Calciumsensitivität der Myofilamente zu erklären, da diese im Vergleich zur Kontrolle unverändert war, sondern durch eine Verstärkung der NA-induzierten Calciumanstiege. Neben den Veränderungen in der glatten Muskulatur zeigte sich insbesondere auch eine Beeinträchtigung der Endothel-vermittelten Relaxationen. Die NO-mediierte Dilatation wurde durch die chronische Perfusion bei 120 mmHg um 38% reduziert und bei SMA160 vollständig aufgehoben. Ebenso wurde die EDHF-vermittelte Relaxation bei SMA120 um 20 % und bei SMA160 um 47% verringert und der korrespondierende Calciumabfall um 41 % reduziert. Diese Reduktion der endothelialen Dilatationen wurde nicht durch eine Erhöhung der Elastance der Arterienwand hervorgerufen, da die dosisabhängige SNP-mediierte Relaxation unbeeinträchtigt war. Zusätzlich scheint eine strukturelle Schädigung des Endothels durch den erhöhten Druck unwahrscheinlich, da mittels Rasterelektronenmikroskopie keine Schäden an der Intima dargestellt werden konnten. Die Expression des ACh-Rezeptors scheint auch nicht in dem Maße verringert zu sein, dass sich daraus die verringerten NO- und EDHF-mediierten Relaxationen erklären ließen, da der endotheliale Calciumanstieg in SMA120 im Vergleich zu SMA45 unverändert war. Daher wird die Beeinträchtigung durch den erhöhten Druck in einem nachgeschalteten Signaltransduktionsweg vermutet. Erhöhter transmuraler Druck hat in diesem Modell innerhalb von 2 Tagen schon zu einer erheblichen Beeinträchtigung der endothelialen Funktionen und zu einer verstärkten Reaktivität des glatten Muskels in Widerstandsarterien geführt. Zwar ist eine Erhöhung des transmuralen Drucks für 48 h nicht mit einem jahrelang bestehenden Hypertonus vergleichbar, jedoch könnte man die so erhobenen Befunde als Hinweis werten, dass eine frühzeitige konsequente antihypertensive Therapie sinnvoll ist, um die druckinduzierte Verstärkung der glattmuskulären Reaktivität und die Einschränkung der Endothelfunktion zu verringern und eine daraus resultierende weitere Erhöhung des Blutdruckes zu verhindern.
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 03/19
Gefäßzellen und Gefäßabschnitte in Arteriolen der Mikrozirkulation reagieren auf endotheliale Autakoide, Gewebsmetabolite und transmurale Druckänderungen nicht als isolierte Einheiten, sondern in koordinierter Art und Weise, was u.a. auf der Ausbreitung von Membranpotentialänderungen über Gap-Junctions entlang der glatten Muskelzellschicht und dem Endothel beruht. Dies ermöglicht die Koordination des Gefäßtonus in parallel und hintereinander liegenden Gefäßabschnitten, was zur aufsteigenden Vasodilatation und der Zunahme der Skelettmuskeldurchblutung bei Arbeit beiträgt. Diese von Nerven unabhängige intra- und intervaskuläre Kommunikation zeigt sich auch bei lokalisierter Stimulation mit bestimmten vasoaktiven Substanzen durch eine sich weit über den Ort der direkten Wirkung schlagartig ausbreitende Gefäßreaktion (conducted vasomotor response). Um die Auslöser von fortgeleiteten Gefäßreaktionen zu untersuchen, wurden Arteriolen des Cremastermuskels in anästhesierten Goldhamstern mittels einer Mikropipette mit einem Mikrobolus (
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Die Peritonealdialyse ist neben der Hämodialyse ein häufig genutztes Verfahren zur Nierenersatztherapie. Diese Methode wird jedoch oft durch intraperitoneale Fibrinablagerungen verschiedener Ursachen (gravierende homöostatische Störungen, Peritonitiden, Fremdmaterialien, ...) eingeschränkt. Wesentlich in der Pathogenese solcher Ablagerungen sind Störungen des fibrinolytischen Gleichgewichts. Mesothelzellen synthetisieren mit t-PA und PAI-1 die Faktoren, deren Gleichgewicht in der Peritonealhöhle für ein stabiles Niveau zwischen Fibrinbildung und Fibrinabbau essentiell ist. Mesothelzellen sind somit unmittelbar und entscheidend an der Entstehung von intraperitonealen Fibrinablagerungen beteiligt. Im Tierversuch zeigte die Beifügung von Hyaluronan zur Dialyseflüssigkeit positive Effekte hinsichtlich der Membranfunktion des Peritoneums. Vor diesem Hintergrund wurde in dieser Arbeit der Effekt von Hyaluronan auf die Synthese von t-PA und PAI-1 an primären humanen Mesothelzellen untersucht: - Sowohl im Northern Blot als auch im ELISA zeigte sich ein konzentrationsabhängiger Abfall der t-PA Synthese, der ab einer HA Konzentration von 50 mg/dL signifikant wurde. - Für die Produktion von PAI-1 ließ sich im ELISA eine konzentrationsabhängige Steigerung (signifikant ab 50 mg/dL) nachweisen, die jedoch auf mRNA-Ebene nicht nachvollzogen werden konnte. - Die beschriebenen Ergebnisse ließen sich durch den Einsatz von Hyaluronsäure eines anderen Herstellers reproduzieren. Somit erscheint ein Effekt durch kontaminierte HA unwahrscheinlich. Im Northern Blot wurde darüber hinaus die mRNA-Expression von LRP bestimmt – einem Rezeptor, der eine Schlüsselposition für die Internalisation und Degradation von t-PA in Mesothelzellen einnimmt. Bei gleichbleibenden mRNA-Mengen für LRP unter Stimulation mit HA kann jedoch eine Internalisierung und Degradation von t-PA als Mit-/Ursache des HA-induzierten Abfalles weitestgehend ausgeschlossen werden. Es folgten Untersuchungen zur Klärung des Mechanismus, über den die hyaluronaninduzierten Veränderungen der mesothelialen Synthese von t-PA und PAI-1 vermittelt sind: - Die Blockade des HA-Rezeptors CD44 mittels eines monoklonalen Antikörpers veränderte die für HA beschriebenen Effekte nicht. Als weitere, für HA an Mesothelzellen in diversen Arbeiten bereits beschriebene Signaltransduktionswege, wurden sowohl die ERK1/ERK2 Kaskade, als auch die SAPK2/p38 Kaskade mittels spezifischer Inhibitoren untersucht: - Lediglich der Inhibitor für den SAPK2/p38 Weg war in der Lage, den HA-induzierten Abfall von t-PA signifikant abzuschwächen. - Der HA-bedingte PAI-1 Anstieg konnte durch keinen der eingesetzten Inhibitoren beeinflusst werden. Die beschrittenen Mechanismen der HA-induzierten Veränderungen für die mesotheliale t-PA und PAI-1-Synthese bleiben somit weitgehend ungeklärt. Die zur Erzielung signifikanter Effekte erforderlichen hohen HA-Konzentrationen, die fehlende Beteiligung des CD44 Rezeptors sowie die Mitbeteiligung des SAPK2/p38 Weges weisen auf osmotische und/oder Viskositätseffekte als eine mögliche Ursache hin. Bezüglich einer klinischen Anwendung von Hyaluronan als Dialyseflüssigkeits-Adjuvans zur Verbesserung der Membraneigenschaften lassen die hier dargestellten Ergebnisse den Schluss zu, dass niedrige Konzentrationen die mesotheliale Regulierung des Fibrinolysesystems nicht beeinträchtigen, jedoch auch keinen positiven Effekt haben. Der Einsatz von höheren Konzentrationen ist jedoch vor dem Hintergrund der beschriebenen Ergebnisse abzulehnen. Insgesamt sollte nicht vergessen werden, dass Hyaluronan sowohl in Wundheilungs-, wie auch in inflammatorischen und fibrotischen Prozessen eine entscheidende Rolle spielt, und die Anwendung in einem so sensiblen Umfeld wie dem menschlichen Peritonealraum wohl überlegt sein sollte.
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 03/19
Thu, 14 Oct 2004 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/2863/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/2863/1/Welsch_Julia.pdf Welsch, Julia
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Die vorliegenden Untersuchungen stellen eine Fortsetzung langjähriger Versuche am Institut für Chirurgische Forschung dar, zellbiologische Mechanismen des zytotoxischen Hirnödems zu klären. Bislang konnten in einem in vitro Modell von Gliazellen verschiedene Mediatoren einer Gliazellschwellung im Sinne eines zytotoxischen Hirnödems charakterisiert werden. Darunter unter anderen eine Laktazidose – in Schweregraden wie sie bei Schädel-Hirn-Traumen und zerebralen Ischämien vorkommt. Ursächlich konnten sowohl der Na+/H+-Antiporter wie auch ein Chlorid- und Bikarbonat-abhängiges Transportsystem identifiziert werden die zur Akkumulation osmotisch aktiver Solute (Na+ und Cl-) in der Zelle führen und somit eine Zellschwellung bedingen. In der vorliegenden Arbeit sollten der Azidose-induzierten Schwellung zugrundeliegende Mechanismen, d.h. Membrantransporter und –kanäle weitergehend charakterisiert werden. Dabei wurde ein Schwerpunkt auf Anionentranporter und die Rolle von Kalziumionen gelegt. Die Untersuchungen erfolgten am Modell suspendierter C6 Gliomzellen als Modellzelle für Astrozyten. Durchflusszytometrisch wurde das Zellvolumen bestimmt ebenso der intrazelluläre pH unter Zuhilfenahme des pH-abhängigen Fluoreszenzfarbstoffes BCECF. Die Ergebnisse lassen sich folgendermaßen zusammenfassen: Setzt man C6 Gliomzellen einer Laktazidose von pH 6,2 aus, so kommt es zur prompten Zellschwellung die nach 60 min ihr Maximum bei 125,1 % des Ausgangsvolumens erreicht. Gleichzeitig kommt es zum Absinken des intrazellulären pH (pHi). Analoge Versuche in Chlorid- bzw. Bikarbonat-freiem Medium gingen mit einer deutlichen Hemmung der Azidose-induzierten Schwellung einher. Das Absinken von pHi war ebenfalls geringer ausgeprägt. Ähnliche Ergebnisse ließen sich mit den Inhibitoren des Cl-/HCO3--Antiporters DIDS und Niflumat erzielen. Die Zusammenschau dieser Ergebnisse lässt sie Schlussfolgerung zu, dass im Rahmen der Azidose-induzierten Schwellung der Na+-unabhängige Cl-/HCO3--Antiporter aktiv ist und zur Akkumulation von Chlorid in der Zelle führt und somit zur Zellschwellung beiträgt. Unter physiologischen Bedingungen hingegen ist der Na+-abhängige Cl-/HCO3--Antiporter aktiv und trägt zur Regulierung des ´steady state` pHi bei. In weiteren Versuchen konnte erstmals unter Verwendung der Na+-K+-Cl--Kotransportinhibitoren Bumetanid und Furosemid eine Beteiligung dieses Kotransporters an der Azidose-induzierten Schwellung nachgewiesen werden. Beide Inhibitoren führten zur deutlichen Reduktion der Zellschwellung ohne relevante Einflüsse auf den intrazellulären pH. Die Aktivierung des Transporters in Azidose führt zur Akkumulation der transportierten Ionen Natrium, Kalium und Chlorid in der Zelle, die dort als osmotisch wirksame Teilchen einen Wassereinstrom nach sich ziehen und auf diesem Wege zur Zellschwellung führen. Daneben wurde eine Abhängigkeit der Azidose-induzierten Schwellung von extrazellulären Kalziumionen gefunden. In Kalzium-freiem Medium ist ausschließlich die Zellschwellung deutlich reduziert während der Verlauf des intrazellulärem pH dem der Kontrollgruppe entsprach. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass extrazelluläre Kalziumionen für die Aktivierung eines pH-unbeeinflussenden Transporters wie z.B. den Na+-K+-Cl--Kotransport notwendig sind. Die Chelierung intrazellulärer Kalziumionen hatte keinen Effekt auf die Azidose-induzierte Schwellung und den intrazellulären pH. Damit konnten die vorliegenden Untersuchungen die Bedeutung des Cl-/HCO3--Antiporters im Rahmen der Azidose-induzierten Schwellung näher charakterisieren und die Beteiligung des Na+-K+-Cl--Kotransportes erstmals nachweisen. Ebenfalls konnte die Bedeutung extra- nicht jedoch intrazellulärer Kalziumionen für die Azidose-induzierte Schwellung gezeigt werden.
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 03/19
Die Suppression von Tumor-Nekrose-Faktor-a durch die spezifische Hemmung der Phosphodiesterase konnte bisher sowohl in vitro als auch in verschiedenen Tiermodellen für chronisch entzündliche Erkrankungen gezeigt werden (Torphy 1998; Schudt et al. 1999; Bundschuh et. al. 2001; Hatzelmann und Schudt 2001). In der vorliegenden Arbeit wurde die Wirkung des spezifischen Phosphodiesterase Typ 4-Inhibitors Roflumilast und des dualselektiven Phosphodiesterase Typ 3/4-Inhibitors Pumafentrine im Mausmodell der Dextran-Sodium-Sulfat induzierten Kolitis getestet. Hierbei handelt es sich nach unserer Kenntnis um die erste Prüfung dieser Substanzen in diesem Tiermodell und um die erste Untersuchung eines Phosphodiesterase Typ 3/4-Inhibitors in einem Kolitismodell überhaupt. Die Kolitis wurde durch orale Gabe von Dextran-Sodium-Sulfat im Trinkwasser über 11 Tage induziert. Die Entzündung des Kolons war mit geringer Variation gut reproduzierbar. Die Phosphodiesterase-Inhibitoren wurden mit Beginn der Dextran-Sodium-Sulfat-Gabe einmal täglich p. o. über den gesamten Versuchs-verlauf appliziert. 109 weibliche Balb/c Mäuse wurden in den Versuchsreihen eingesetzt. Roflumilast zeigte eine dosisabhängige Wirksamkeit. Die 5 mg/kg KG Dosis zeigte einen deutlichen therapeutischen Effekt auf den klinischen Verlauf, die Kolonlänge, die Produktion von Tumor-Nekrose-Faktor-a im Kolon sowie das Milzgewicht. Diese Verbesserung korrelierte mit einer geringeren Ausprägung der histopathologischen Veränderungen im Kolon. Bei der 1 mg/kg KG Dosis wurden nur der klinische Score, die Kolonlänge und das Milzgewicht signifikant verbessert. Pumafentrine bewirkte in der mittleren eingesetzten Dosierung (5 mg/kg KG) eine Besserung des klinischen Scores, der Kolonlänge und der Tumor-Nekrose-Faktor-a-Produktion im Kolongewebe. Es konnte keine Beeinflussung der systemischen Entzündungsreaktion anhand einer Verringerung des Milzgewichtes beobachtet werden, jedoch zeigte sich bei ex vivo stimulierten Splenozyten eine signifikant geringere Aktivierbarkeit und Zytokinsynthese. Die 20 mg/kg KG Dosis verbesserte als einzigen Endpunkt die Tumor-Nekrose-Faktor-a-Produktion im Kolon, während die 1,5 mg/kg KG Dosis in keinem der untersuchten Parameter zu einer signifikanten Wirksamkeit führte. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die Phosphodiesterase-Inhibitoren Roflumilast und Pumafentrine dosisabhängig zu einer Verbesserung der Dextran-Sodium-Sulfat-induzierten Kolitis - als einem Modell für chronisch entzündliche Darmerkrankungen - führen. Die spezifische Hemmung der Phosphodiesterase Typ 4 und die duale Hemmung der Phosphodiesterase Typ 3/4 stellen deshalb viel versprechende Ansätze in der Therapie chronisch entzündlicher Darmerkrankungen dar. Beide Substanzen befinden sich in fortgeschrittenen klinischen Studien für die chronisch obstruktive Lungenerkrankung und für Asthma bronchiale. Deshalb sollten diese Präparate in anderen Tiermodellen für chronisch entzündliche Darmerkrankungen oder klinischen Studien weiter untersucht werden.
Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06
Es wurde ein Assay-System auf Basis von Reporter-Konstrukten entwickelt, dass eine Detektion der HIV1- Tat und Rev-Funktion auf Einzelzell-Ebene ermöglichte. Dieses fluoreszenzbasierte System wurde hinsichtlich seiner Eigenschaften untersucht und charakterisiert. Es wurde gezeigt, dass es sich dazu eignet sowohl die Tat- als auch die Rev-Funktion konzentrationsabhängig darzustellen. Des Weiteren konnten bereits beschriebene Inhibitoren der Rev-Funktion durch den Assay bestätigt werden, was die Zuverlässigkeit des Testsystems belegt. Außerdem ermöglichte dieses System in durchgeführten Versuchen eine Quantifizierung der RNA-destabilisierenden Aktivität von INS-Elementen des HIV-Genoms. Durch die Herstellung einer stabilen Zelllinie mit einem entwickelten Reporter-Konstrukt und die Etablierung einer Fluoreszenzmikroskopie- und FACS-basierten Auswertung der Daten wurde die Grundlage für eine umfangreiche Suche nach Inhibitoren der HIV-1 Genexpression gelegt. Im Laufe erster „Screenings“ nach zellulären Inhibitoren der HIV-Genregulation wurden in einer cDNA-Bank aus fötalem Hirn mehrere inhibitorisch wirksame Kandidaten-cDNAs identifiziert. Damit konnte gezeigt werden, dass zelluläre Faktoren potentiell dazu in der Lage sind regulierend bzw. inhibierend in die HIV-1 Genexpression einzugreifen.
Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06
Die vorliegende Arbeit wurde in zwei Bereiche gegliedert. Der erste Themenbereich beschäftigte sich mit der Transformation von pflanzlichen Mitochondrien bzw. mit den Voraussetzungen, die erfüllt sein müssen, um Mitochondrien höherer Pflanzen zu transformieren. Im zweiten Themenbereich wurde die Regulation der Lysinbiosynthese erstmals mit Hilfe der Plastidentransformation modifiziert sowie ein universeller plastidärer Selektionsmarker entwickelt und etabliert. Mitochondrientransformation- In dieser Arbeit wurden zwei Strategien zur Transformation von Mitochondrien höherer Pflanzen entwickelt. Zum einen wurde ein mitochondrienspezifischer Ansatz gewählt, d.h. es wurden Selektionsmarker verwendet, die eine hemmende Wirkung auf die Atmungskette der Mitochondrien besitzen. Zum anderen wurden in Anlehnung an seit die seit 1990 erfolgreich durchführbare Plastidentransformation generelle Inhibitoren der Proteinbiosynthese verwendet, welche durch die Produkte der entsprechenden in die Mitochondrien eingebrachten Resistenzgene detoxifiziert werden sollten. Markergenstrategie- Geeignete Selektionsbedingungen zur Identifizierung von mitochondrialen Transformanten wurden bei Tabakblättern und Tabakprotoplasten mit den Antibiotika Blasticidin, Chloramphenicol und Hygromycin als Hemmstoffe ermittelt. Aus Transformationen mit den mitochondrialen Transformationskassetten pBMhph II, pBMhph III und pBMhph IV konnten über 200 Hygromycin-resistente Linien selektiert und charakterisiert werden. PCR- und Southern-Analysen lassen bei mindestens 7 Linien eine zielgerichtete mitochondriale Integration des Transgens vermuten. Möglicherweise sind aber nur wenige Kopien des Transgens in das Mitochondriengenom inseriert bzw. repliziert worden, was eine eindeutige Charakterisierung erschwert. Bei einer großen Anzahl resistenter Linien handelt es sich wahrscheinlich um funktionelle zielortfremde Integrationen der Transformationskassetten in die Plastiden-, Kern- oder Mitochondriengenome. Mitochondrienspezifischer Transformationsansatz- Die in dieser Arbeit entwickelten mitochondrienspezifischen Transformationsvektoren pUMmyx II, pUMglu II, pUMarg II und pUManti II enthalten ein Fragment des mitochondrialen cob-Gens. In dieses cob-Fragment wurden Punktmutationen eingeführt, die zu einer Veränderung der Sekundär- bzw. Tertiärstruktur des Apocytochroms b führen. Bei einer korrekten homologen Integration dieses modifizierten cob-Fragmentes in das Mitochondriengenom sind die Inhibitoren Antimycin A, Myxothiazol und Moa-Stilben nicht mehr in der Lage, an den Komplex III der mitochondrialen Atmungskette zu binden. Zur Bestimmung optimaler Selektionsbedingungen von mitochondrialen Transformanten mit den Hemmstoffen Antimycin A, Myxothiazol und Moa-Stilben wurden Testreihen mit Tabakblättern, Tabakprotoplasten sowie Tabak- und Arabidopsis-Suspensionskulturen durchgeführt. Bei „particle-gun“-Transformationen von Tabakblättern mit der Transformationskassette pUMarg II wurden 23 Moa-Stilben-resistente Linien selektiert. Bei 18 Linien konnte eine Integration des mutierten cob-Fragmentes eindeutig per PCR und Sequenzierung nachgewiesen werden. Ob es sich dabei um eine mitochondriale Integration handelt, konnte nicht eindeutig belegt werden. In diesem Fall wäre jedoch zu klären, auf welchem Mechanismus der offensichtliche selektive Vorteil der mit dem Transformations-vektor transformierten Pflanzen beruht, da die Integration des cob-Gen-Fragmentes nur innerhalb des mitochondrialen Zielortes funktionell sein dürfte. Plastidentransformation- Bei dem plastidären Transformationsansatz dieser Arbeit wurden zwei Ziele verfolgt. Zum einen wurde der „feedback“-Regulationsmechanismus der DHDPS innerhalb des Aspartat-Stoffwechsels durch die Integration eines insensitiven dhdps-Gens in die Plastiden von Tabak und Kartoffel beeinträchtigt. Der Gehalt der essentiellen Aminosäure Lysin wird somit gesteigert. Zum anderen wurde das insensitive dhdps-Gen als Markergen genutzt, um eine Selektion von plastidären Transformanten auf dem Lysinanalogon AEC zu ermöglichen. Erhöhung des Lysingehaltes- Es konnten 34 Spectinomycin-resistente Tabakklone selektiert werden, die mit der Transformationskassette pHoDh2b transformiert wurden. Die molekularbiologische Charakterisierung der Transformanten konnte bei 8 Linien eindeutig eine korrekte plastidäre Integration der Transgene belegen. Biochemische Analysen zeigen eine bis zu 32-fache Erhöhung an freiem Lysin im Blattgewebe von plastidären Transformanten. Es war damit erstmals mit der Plastidentransformation möglich, regulatorisch die Lysinbiosynthese zu verändern. AEC als plastidärer Selektionsmarker- AEC (S-Aminoethyl-L-Cystein) konkurriert als Lysinanalogon mit Lysin um den Einbau in Polypeptide. Wird die AEC-Konzentration im pflanzlichen Gewebe im Vergleich mit Lysin zu hoch, kommt es zum Erliegen des Stoffwechsels und damit zum Absterben der Zelle. Durch die Überproduktion von Lysin in den Transformanten verschiebt sich das Verhältnis von AEC → Lysin. Es wird somit kompetitiv mehr Lysin in die Polypeptide eingebaut. Dies lässt sich als Selektionsvorteil nutzen. Mit dem „Markergen“ dhdps-r1 und AEC als selektivem Hemmstoff wurden insgesamt 49 Tabaklinien selektiert. Bei 3 selektierten Linien konnte eindeutig die korrekte plastidäre Intergration der Transformationskassette nachgewiesen werden. Es ist damit erstmals gelungen, einen antibiotikumfreien universell einsetzbaren plastidären Selektionsmarker zu etablieren. In weiteren Transformationsexperimenten konnten mit dem gleichen „Markergen“ plastidäre Tomatentransformanten identifiziert und charakterisiert werden (Diplomarbeit L. Schaeffer). Damit ist es bereits bei 2 Spezies gelungen, AEC als selektiven Hemmstoff einzusetzen. Bei weiterer Optimierung der Selektionsbedingungen dürfte es möglich sein, auch bei weiteren Pflanzenspezies diesen universellen Selektionsmarker zu etablieren.
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/19
In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals die Expression und Bedeutung des Toll-like Rezeptors 4 (Tlr4) in normalen und adenomatösen epithelialen Hypophysenzellen untersucht. Tlr4 ist der Rezeptor für bakterielle Lipopolysaccharide und ist daher an der Induktion der angeborenen Immunantwort bei Infektions- oder Entzündungsprozessen beteiligt, die durch gram-negative Bakterien verursacht werden. Zusätzlich könnte der Tlr4 eine Rolle bei der Tumorgenese spielen, da Tumor-assoziierte Komponenten der extrazellulären Matrix oder Heat-Shock Proteine ebenfalls aktivierende Liganden des Tlr4 repräsentieren. In vorhergehenden Arbeiten wurde gezeigt, dass in der normalen Hypophyse der Tlr4 vorwiegend in follikulostellaren (FS) Zellen exprimiert wird und für immun-endokrine Interaktionen von Bedeutung ist. In der vorliegenden Doktorarbeit wurde eine sporadische Expression des Tlr4 auch in allen endokrinen Vorderlappenzellen nachgewiesen. Außerdem wurde eine heterogene Expression des Tlr 4 auch in 26 von 67 untersuchten Adenomen gezeigt. In den meisten Fällen wurde in Tlr4-positiven Adenomen eine verstreute Expression in weniger als 5% aller Adenomzellen beobachtet. Die Tlr4 Expression korrelierte nicht mit einem speziellen Adenomtyp (hormonaktiv oder –inaktiv) oder Phänotyp (Mikro- oder Makroadenom). Der adenomatöse Tlr4 war funktionell aktiv, da LPS in Tlr4-positiven, IL-6-sezernierenden Adenomen die IL-6 Sekretion dosisabhängig stark stimulierte. Das synthetische Glukokortikoid Dexamethason und der p38α MAP Kinase Inhibitor SB 203580 waren potente Inhibitoren der LPS-induzierten IL-6 Sekretion. Eine heterogen Tlr4 Expresion wurde auch in endokrinen Hypophysenzelllinien gefunden, von denen manche Tlr4-positiv waren (kortikotrope AtT20 und inaktive humane HP75 Zellen), während laktosomatotrope GH3 und gonadotrope αT3-1 Zellen keinen Tlr4 exprimierten. LPS hatte in AtT20 und GH3 Zellen keinen Einfluß auf die Hormonsekretion. Im Gegensatz dazu supprimiert LPS das Wachstum von AtT20 Zellen, nicht aber von GH3 Zellen, was darauf hinweist, daß LPS direkt das Wachstum von Tlr4-positiven Zellen inhibiert. Zusammengefasst weisen diese Egebnisse darauf hin, daß während transienter oder chronischer infektiöser bzw. inflammatorischer Prozesse, die durch gram-negative Bakterien induziert worden sind, LPS da Wachstum von Hypophysentumoren beeinflussen könnte. Ob LPS in vivo die Hypophysentumor-Entwicklung inhibiert oder stimuliert, hängt von der Co-Expression und Stimulation von IL-6 (ein Progressionsfaktor für Hypophysentumoren) durch LPS in Tlr4-positiven Adenomen ab und vom Einsetzen und dem Ausmaß des Anstiegs von anti-inflammatorisch wirksamen Glukokortikoiden. Nicht nur LPS, sondern auch das bei Krebserkrankungen eingesetzte Chemotherapeutikum Taxol, von dem man annimmt, dass es durch Tlr4 wirksam ist, inhibierte das Wachstum von AtT20 Zellen. Das läßt vermuten, dass in Tlr4-positiven Adenomen auch noch weitere Liganden des Tlr4 wie z.B. andere bakterielle oder virale Bestandteile, Pharmaka oder intratumorale Fragmente der extrazellulären Matrix die Entwicklung von Hypophysentumoren beeinflussen. Dies muss in zukünftigen Studien noch geklärt werden, ebenso wie die Frage, ob der Tlr4 allgemein eine Rolle für die Tumorgenese in anderen Tlr4-positiven epithelialen Tumoren spielt.
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/19
Sowohl für die Inhibierung der Apoptose zur Plaquestabilisierung, wie auch für eine selektive Induktion von Apoptose in Zellen der Neointima zur Restenose-prävention ist ein besseres Verständnis der Apoptoseregulation in glatten Gefäßmuskelzellen erforderlich. In dieser Arbeit wurden glatte Gefäßmuskelzellen aus Media und Neointima der Ratte im Hinblick auf ihre Empfindlichkeit auf Statinbehandlung untersucht. Diese Zellen repräsentieren ein gut charakterisiertes und breit verwendetes Modell. Die Ergebnisse basieren auf Versuchen mit Zellkulturen und können als Grundlage für Versuche mit menschlichen Zellen und/oder weitere Tierexperimente betrachtet werden. Man kann Folgendes zusammenfassen: A). Statine induzieren in vitro Apoptose sowohl in Media als auch in Neointima glatter Gefäßmuskelzellen. Diesen Effekt beobachtet man nur bei den lipophilen Statinen Lovastatin, Simvastatin und Fluvastatin. Das hydrophile Pravastatin zeigt keinen Effekt. Die Apoptoseinduktion in glatten Gefäßmuskelzellen aus der Media war gering bei serumfreien Bedingungen. B). Die Neointima Zellen sind im Vergleich zu den Media Zellen sowohl bei serumhaltigen, als auch unter serumfreien Bedingungen deutlich empfindlicher auf Apoptoseinduktion durch Statine. C). Eine mögliche Erklärung für die beobachteten Unterschiede könnte in der niedrigeren Expression des antiapoptotischen Proteins cIAP-1 in Neointima Zellen liegen. Dank der Ergebnisse dieser Versuche könnten neue effektive Strategien zur Prävention der Restenose nach Ballonangioplastie entwickelt werden, z.B. durch die lokale Anwendung lipophiler Statine mittels entsprechender Stentbeschich-tung.
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/19
In dieser Arbeit sollte untersucht werden, auf welchem Wege die beiden Zelltodrezeptoren TNFR1 und Fas Apoptose in den Zelllinien A9 und SV80 ausführen. Ausgangspunkt waren widersprüchliche Erkenntnisse über die Signalwege von TNFR1 und Fas. So war in der Literatur beschrieben, daß TNFR1 und Fas die gleichen intrazellulären Signalmoleküle benutzen um Apoptose auszulösen. Als diese Signalmoleküle wurden FADD, TRADD und FLICE identifiziert. Ergebnisse aus unserem Labor zeigten jedoch, daß in A9 Zellen der durch Fas oder TNFR1 ausgelöste Zelltod unterschiedliche Signalwege beschreiten musste, da sich der durch TNFR1 ausgelöste Zelltod bezüglich der Hemmbarkeit durch verschiedene Inhibitoren der Apoptose deutlich von dem durch Fas ausgelösten Zelltod unterschied. Es sollte untersucht werden, ob in SV80 und A9 Zelllinien FADD als gemeinsames Signalprotein beider Zelltodrezeptoren benutzt wird, oder bereits auf dieser Ebene ein Unterschied festzustellen ist. Dazu wurde FADD kloniert, und die Mutante DFADD von FADD hergestellt, die in der Lage ist, den bisher bekannten Signalweg von FADD in einer dominant negativen Weise zu hemmen. FADD und DFADD wurden in A9 und SV80 Zellen zur Expression gebracht. In SV80 Zellen führte Überexpression von FADD wie erwartet zu Zelltod, Expression von DFADD schützte nach Stimulation des TNFR1 oder Fas wie erwartet vor Zelltod. Expression von FADD in A9 Zellen führte zu Zelltod. Überraschenderweise führte jedoch auch Expression von DFADD in A9 zu Zelltod. Es war unerwartet, daß die Mutante, die den bisher bekannte Signalweg von FADD blockieren sollte, selbst Zelltod auslösen kann. Um die Art der Wirkung dieser Mutante DFADD weiter zu charakterisieren wurde versucht, den durch DFADD vermittelten Zelltod durch verschiedene Klassen von Hemmstoffe der Apoptose zu inhibieren. Zum einen Apoptoseinhibitoren, die über Hemmung der Caspasen wirken, zum anderen solche, die durch Hemmung der Atmungskette Apoptose unterbinden. Des weiteren wurde das Signalmolekül RAIDD und verschiedene dominant negative Mutanten kloniert, um zu untersuchen, ob DFADD in der Lage ist weitere Signalproteine zu aktivieren und so Zelltod auszulösen.
Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06
Die Inhibition der b-Sekretase stellt derzeit einen vielversprechenden Ansatz zur Therapie der Alzheimer Krankheit dar. Der Hauptanteil der b-Sekretase Aktivität ist auf BACE-1, eine neuartige membrangebundene Typ I Aspartylprotease, zurückzuführen. Um gezielt spezifische und wirksame Inhibitoren entwickeln zu können, ist es notwendig, die Eigenschaften und katalytischen Spezifitäten der Protease genauer zu verstehen. Da neben BACE-1 eine weitere hochgradig homologe Aspartylprotease, BACE-2, bekannt ist, ist es für die Suche nach Inhibitoren ferner von Bedeutung, charakteristische Unterschiede zwischen den beiden Enzymen zu kennen, um mögliche Kreuzreaktionen der Inhibitoren minimieren zu können. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, die beiden Enzyme bezüglich ihrer posttranslationalen Modifikationen und insbesondere ihrer katalytischen Spezifitäten vergleichend zu analysieren. Als Modell für die durchgeführten Experimente dienten HEK293 Zellen, mit exogener Expression der beiden Proteasen, sowie dem Substrat bAPP. Beide Proteine werden in ähnlicher Weise durch die kovalente Bindung komplexer Kohlehydrateinheiten modifiziert. Matures BACE-1 besitzt im Vergleich zu BACE-2 eine eine längere Halbwertszeit. In vitro werden beide Enzyme durch CK1 an homologen Serinen in der zytoplasmatischen Domäne phosphoryliert. Während für BACE-2 bisher nicht schlüssig gezeigt werden konnte, dass auch in vivo eine Phosphorylierung erfolgt, wurde für BACE-1 S498 auch als Phosphorylierungsstelle in vivo bestätigt. Mittels Biotinylierung konnte demonstriert werden, dass beide BACE-Proteasen effizient an die Zelloberfläche transportiert werden. Im Gegensatz zu BACE-1, welches rasch in endosomale Kompartimente reinternalisiert wird und phosphorylierungsabhängig zurück zum TGN transportiert wird, wird BACE-2 entweder durch Spaltung der Ektodomäne in den extrazellulären Raum sezerniert, oder aber unmittelbar nach der Reinternalsierung ins Zellinnere in lysosomalen Kompartimenten abgebaut. Dieser Unterschied begründet vermutlich die unterschiedlichen Halbwertszeiten der beiden Proteine und erhöht gleichzeitig die Gesamtverweildauer von BACE-1 in endosomalen Kompartimenten, die aufgrund ihres pH-Wertes günstige Bedingungen für die proteolytische Aktivität des Enzyms schaffen. Hinsichtlich der katalytischen Spezifität bezüglich des membrangebundenen bAPP unterscheiden sich BACE-1 und BACE-2 grundlegend. Während BACE-1 die erwarteten b-Sekretase Spaltungen an Asp1 und Glu11 der Ab-Domäne katalysiert, spaltet BACE-2 vorzugsweise zwischen Phe19 und Phe20 der Ab-Domäne, wodurch Spaltprodukte entstehen, die denen der a-Sekretase Spaltung ähneln. Durch Koexpression der beiden Enzyme konnte gezeigt werden, dass BACE-2 die BACE-1 abhängige Prozessierung des Substrates direkt oder indirekt beeinflussen kann. Die Behandlung der entsprechenden Zelllinien mit BFA oder Monensin belegt, dass BACE-1 bereits in den frühen Kompartimenten des sekretorischen Prozessierungsweges proteolytisch aktiv sein kann, während BACE-2 auch nach exogener Expression keine Aktivität in diesen Kompartimenten zeigt. Mit Hilfe massenspektrometrischer Analysen wurde bewiesen, dass BACE-1 und BACE-2 entgegen bisheriger Annahmen nicht ausschließlich die proteolytische Spaltung membrangebundener bAPP Substrate katalysieren, sondern zudem Ab-Peptide, nach ihrer Freisetzung durch g-Sekretase, C-terminal verkürzen können. In vitro Versuche zeigen, dass BACE-1 selbst in der Lage ist, Ab 1-40 an Position 34 zu spalten und dieser Schnitt nicht wie bislang angenommen durch g-Sekretase katalysiert wird. Dieser Vorgang führt in vivo zu einer Reduktion der amyloidogenen Ab 1-40/42 Peptide. Da sich der Nachweis des Ab 1-34 Peptides mittels konservativer Proteinanalytik schwierig gestaltet, erklärt sich, warum in Zelllinien mit exogener BACE-1 Expression keine merkliche Steigerung der Ab-Sezernierung bzw. teilweise sogar eine Reduktion detektierbar war. Letztendlich bietet die Beobachtung, dass auch Peptide als Substrate für die BACE fungieren können, interessante Ansatzpunkte für die Suche nach neuen physiologischen Substraten und Inhibitoren. Die Analyse des subzellulären Transportes und die Charakterisierung, sowohl pro- als auch antiamyloidogener Enzymaktivitäten der beiden Proteasen BACE-1 und BACE-2 liefert neue Grundlagen für die Entwicklung therapeutischer Inhibitoren und für die Suche neuer Substrate.
Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06
Totalynthese des antimykotisch aktiven Steroid-Alkaloids Plakinamin B; Synthese von Strukturanaloga; Testung auf antimikrobielle Aktivität in einem Agar-Diffusionstest; Ergosterol-Biosynthese-Inhibitor-Screening und Bestimmung des jeweiligen Zielenzyms; Ableitung von Struktur-Wirkungs-Beziehungen.
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/19
Bei der akuten myeloischen Leukämie (AML) stellen die unkontrollierte Proliferation und Reifungsblockade myeloider Vorläuferzellen, Expansion dieser Zellen in das periphere Blut, extramedulläre Manifestationen und verminderte Elimination der Leukämiezellen durch das Immunsystem grundlegende Pathomechanismen dar. Diese Vorgänge werden über ein komplexes Zusammenspiel von Zytokinen und Adhäsionsmolekülen reguliert. In dieser Arbeit wurde daher mittels Durchflußzytometrie die Expression von Zytokinrezeptoren, Adhäsions- und kostimulatorischen Molekülen in Knochenmarks(KM-) Proben von 103 AML-Patienten bei Diagnosestellung und acht gesunden Probanden untersucht. Zytokinrezeptoren weisen bei der normalen Hämopoese ein reifegradabhängiges und linienspezifisches Expressionsmuster auf. Es wurden daher zum einen Zytokinrezeptoren ausgewählt, die schon in der frühen Hämopoese exprimiert werden, wie der SCF-R (CD117), FL-R (CD135), IL-3-R (CD123) und zum andern Zytokinrezeptoren, die erst in späteren Differenzierungsstadien der monozytären Zelllinie (v.a. GM-CSF-R; CD116) und der granulozytären Zelllinie (v.a. G-CSF-R, CD114) exprimiert werden. Die gp130-Subunit (CD130) stellt die signaltransduzierende Untereinheit von IL-6, IL-11, LIF etc. dar und wirkt synergistisch auf allen Stufen der Hämopoese mit. Die untersuchten Adhäsionsmoleküle wurden in drei Gruppen unterteilt: a) Adhäsionsmoleküle, die den Kontakt zur KM-Matrix oder zu sich selbst beeinflussen: VLA-2 (CD49b), VLA-3 (CD49c) und die erst kürzlich auf hämopoetischen Zellen gefundenen Adhäsionsmoleküle PRR-1 und PRR-2. b) Adhäsionsmoleküle, die den Kontakt zum Endothel fördern: LFA-1 (CD11a), Mac-1 (CD11b), L-Selektin (CD62L) und UPA-R (CD87) c) kostimulatorische Moleküle, die eine Rolle bei der Interaktion der Leukämiezellen mit immunkompetenten Zellen spielen: ICAM-1 (CD54), LFA-3 (CD58), B7-1 (CD80), B7-2 (CD87) und NCAM (CD58). Eine KM-Probe wurde als positiv gewertet, wenn mehr als 20% der Blasten im Auswertefenster den entsprechenden Marker exprimierten. Ergebnisse: Der durchschnittliche Anteil Zytokinrezeptoren exprimierender Zellen war in KM-Proben von AML-Patienten deutlich höher als in KM-Proben von gesunden Probanden. Einzige Ausnahme bildete die gp130-Subunit, die nur auf durchschnittlich 4% der AML-Blasten exprimiert wurde, während durchschnittlich 23% der Zellen in gesunden KM-Proben die gp130-Subunit exprimierten. Bei den Adhäsionsmolekülen zeigte sich im Vergleich zu den gesunden KM-Proben bei der AML ein höherer Anteil von Zellen, die kostimulatorische und Endothel-Kontakt-fördernde Moleküle exprimierten, während der Anteil von Zellen, die das Stroma-Kontakt-fördernde ß1-Integrin VLA-2 exprimierten, vermindert war. VLA-3 konnte dagegen in keinem der untersuchten AML-Fälle und der gesunden KM-Proben als positiv gewertet werden. Innerhalb der AML-Subtypen konnte ein reifegrad– und linienabhängiges (monozytäres, granulozytäres) Verteilungsmuster der Zytokinrezeptoren festgestellt werden: Blasten unreifer Leukämien (M0; M1) exprimierten bevorzugt SCF-R und FL-R. Blasten von AML-Subtypen, die der granulozytären Differenzierungslinie zugeordnet werden (M2, M3), exprimierten v.a. G-CSF-R. Blasten monozytärer Leukämien (M4, M5) exprimierten v.a. GM-CSF-R und FL-R. Der IL-3-R wurde in fast allen AML-KM-Proben auf einem Großteil der Blasten exprimiert. Den größten Anteil positiver Zellen für Adhäsions- und kostimulatorische Moleküle (Integrine, B7-2, NCAM, UPA-R) wiesen die monozytären Leukämien auf. B7-1 wurde v.a. auf Blasten des FAB-Typs M3 exprimiert. L-Selektin, ICAM-1 und PRR-1/PRR-2 zeigten eine variable Expression innerhalb aller FAB-Typen. In der Gruppe der sekundären Leukämien waren signifikant mehr Fälle Mac-1-positiv als in der Gruppe der primären Leukämien (p = 0.074, Qui2-Test). Ansonsten zeigten sich zwischen primären und sekundären Leukämien keine signifikanten Unterschiede. Wichtig für die Entscheidung über Art und Intensität der Therapie bei der AML ist das Abschätzen der Prognose eines Patienten bei Diagnosestellung. Bislang werden Patienten v.a. anhand zytogenetischer Untersuchungen von Karyotypanomalien in Prognosegruppen eingeteilt. Da aber nur ca. 50-60% der AML-Patienten chromosomale Veränderungen aufweisen, besteht ein Bedarf an Karyotyp-unabhängigen Prognosekriterien. Zytogenetische Analysen wurden bei allen AML-KM-Proben durchgeführt und die Expression der Marker sowohl mit den zytogenetischen Risikogruppen als auch mit dem tatsächlichen klinischen Verlauf der Patienten korreliert. In die klinische Auswertung wurden nur Patienten (n = 55) eingeschlossen, die nach dem Therapieprotokoll der German AML-Cooperative-Group behandelt worden waren. In der zytogenetisch günstigen Prognosegruppe zeigten sich im Vergleich zur zytogenetisch ungünstigen Prognosegruppe signifikant mehr G-CSF-R-positive Zellen (p = 0.027, T-Test), signifikant weniger L-Selektin-positive Fälle (p = 0.037, Qui2-Test) und signifikant mehr Mac-1- und PRR-1-positive Fälle (p = 0.005; p = 0.009; Qui2-Test). Diese Marker zeigten aber keine signifikanten Unterschiede bezüglich Remissionrate und progressfreier Überlebenswahrscheinlichkeit der Patienten. Dies läßt sich auf die zum Teil geringe Fallzahl und die kurze Beobachtungsdauer von im Mittel 11 Monaten nach Remission erklären. Andere Marker zeigten dagegen keine Korrelation mit den zytogenetischen Risikogruppen, dagegen aber mit dem tatsächlichen klinischen Verlauf der Patienten: VLA-2-, NCAM-, UPA-R-positive Leukämien zeigten eine signifikant niedrigere Remissionsrate (p = 0.049, p = 0.03, p = 0.03, Qui2-Test). Patienten, in deren KM-Proben >85% der Blasten den FL-R oder >45,5% den SCF-R exprimierten, wiesen eine signifikant niedrigere Wahrscheinlichkeit für progressfreies Überleben auf, ebenso wie Patienten, in deren KM-Proben >60,5% der Blasten ICAM-1-, >15% B7-1-, >65% B7-2- und >8% NCAM-positiv waren. NCAM korrelierte als einziger Marker negativ sowohl mit der Remissionsrate, als auch mit der progressfreien Überlebenswahrscheinlichkeit, allerdings nicht mit der Einteilung in zytogenetische Risikogruppen. Auch für die übrigen Marker konnten Cut-off-Werte für den Anteil Marker-positiver Blasten ermittelt werden, bei denen aus dem Vergleich der entstandenen Gruppen ein deutlicher Unterschied in der Dauer der progressfreien Überlebenszeit hervorging. Diese Unterschiede waren allerdings aufgrund der geringen Fallzahl nicht signifikant, so dass sich eine eindeutige prognostische Aussagen nicht treffen ließ. Dabei wiesen Patienten mit einem höheren Anteil von G-CSF-R-, GM-CSF-R- und einem niedrigeren Anteil von IL-3-R-exprimierenden Blasten eine längere progressfreie Überlebenszeit auf. Patienten mit sehr hohem Anteil PRR-2- oder mit geringem Anteil PRR-1-positiver Blasten tendierten zu einer eher kürzeren progressfreien Überlebenszeit. Umgekehrt wies eine niedrige Expression von Endothel-Kontakt fördernden Oberflächenmolekülen, wie z.B. L-Selektin, Mac-1 und UPA-R auf eine schlechte Prognose hinsichtlich der Dauer des progressfreien Überlebens hin. Therapeutische Konsequenzen: Die in dieser Arbeit aufgezeigten Zusammenhänge zwischen der Expression bestimmter Oberflächenmarker und dem klinischen Verlauf der Patienten helfen, die Prognoseeinschätzung von Patienten - über die Zytogenetik hinaus - weiter zu spezifizieren: So stellt die NCAM-positive Leukämie eine eigene Entität mit prognostisch schlechtem Verlauf unabhängig vom Karyotyp dar. Bei UPA-R- und/oder VLA-2-positiven AML-Fällen sollten aufgrund der verminderten Remissionswahrscheinlichkeit intensivere therapeutische Induktionstherapien eingeleitet werden. Für die Remissionsdauer ist sowohl die hohe Expression kostimulatorischer Moleküle, als auch die hohe Expression von Zytokinrezeptoren, die v.a. auf Stammzellebene wirksam sind und die die Expression von diesen kostimulatorischen Molekülen fördern, prognostisch ungünstig. Diese Patienten sollten bei intensiver Konsolidierungstherapie engmaschig kontrolliert werden und die Indikation zur Knochenmarkstransplantation sollte frühzeitig gestellt weren. In der Zytokintherapie werden G-CSF und GM-CSF regelmäßig in der Klinik zur Verkürzung der Neutropeniephase nach Chemotherapie eingesetzt. Dagegen konnte mit dem Einsatz von G-CSF und GM-CSF als Priming-Medikamente bisher noch kein eindeutiger klinischer Benefit für die Patienten erzielt werden. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse einer linienspezifischen und reifegradabhängigen Expression der Zytokinrezeptoren legen nahe, dass G-CSF als Primingmedikament v.a. bei granulozytär-differenzierten AML-Subtypen und GM-CSF eher bei monozytär-differenzierten AML-Subtypen eingesetzt werden sollte. In der Supportivtherapie, bei der die Stimulation von AML-Blasten nicht mehr gewünscht ist, sollten G- und GM-CSF genau umgekehrt eingesetzt werden. Da eine hohe Expression von FL-R und SCF-R mit einer schlechten Prognose für die Dauer des progressfreien Überlebens korrelierte, kann sich eine Stimulation dieser Rezeptoren durch die Gabe von SCF und FL in der Supportivtherapie eher ungünstig auswirken, ebenso wie beim Priming, da auch gesunde Stammzellen stimuliert und damit sensibler gegen Zytostatika werden. Darüber hinaus geben diese Ergebnisse auch Hinweise auf mögliche pathobiologische Bedeutungen und damit verbundener neuer therapeutischer Strategien bei der AML: So kann die erhöhte FL-R-Expression - wie bei der Tandemduplikation des FL-R auch - zu einer erhöhten, prognostisch ungünstigen Phophorylierung von Tyrosinkinasen führen. Auch der SCF-R aktiviert intrazellulär Tyrosinkinasen. Neue Medikamente, wie z.B. Tyrosinkinase-Inhibitoren, oder Dexamethason, das die FL-R-Expression auf den AML-Blasten herunterreguliert, könnten bei diesen AML-Patienten neue benefit-bringende therapeutische Möglichkeiten darstellen. Ebenso scheint die Immunantwort bei AML-Patienten trotz, oder vielleicht sogar gerade bei Expression von kostimulatorischen Molekülen vermindert zu sein, was die Gabe von immunstimulierenden Medikamenten, wie rIL-2 oder CTLA-4-Inhibitoren im Bereich der Immuntherapie sinnvoll erscheinen lässt. So leistet diese Arbeit nicht nur einen Beitrag zur Diagnostik, Prognose und Biologie der AML, sondern entwickelt in Zusammenschau mit bereits publizierten Daten neue, therapeutische Möglichkeiten für die Behandlung der AML.
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/19
Reaktive – Sauerstoff - Spezies (ROS) spielen in der Physiologie und Pathophysiologie des vaskulären Systems eine wichtige Rolle. So kommt es z.B. bei Hypertonie, Atherosklerose, Ischämie / Reperfusion und weiteren Krankheiten und Stoffwechselstörungen, wie z.B. Hypercholesterinämie und Diabetes mellitus zu einem Ungleichgewicht zwischen Sauerstoffradikalbildung und anti - oxidativen Mechanismen. Superoxidanionen (O2 -) spielen insofern eine besondere Rolle, als sie durch direkte Interaktion endotheliales NO inaktivieren, so daß es seine vasodilatatorische, anti – proliferative und plättchenaggregationshemmende Funktion nicht mehr voll erfüllen kann. Damit ist O2 - maßgeblich an der Induktion der Endotheldysfunktion beteiligt. Bei Beginn dieser Arbeit gab es erste Hinweise, daß eine der leukozytären NAD(P)H - Oxidase ähnlichen Oxidase auch im Endothel existiert und wesentlich zur endothelialen O2 - - Bildung beiträgt. Wenig erforscht waren jedoch die Regulationsmechanismen dieser Oxidase. Ein bisher noch nicht bekannter Stimulus zur Steigerung der endothelialen O2 - - Bildung wurde 1996 beschrieben. In Endothelzellen aus bovinen Pulmonararterien führte eine Depolarisation zu einer gesteigerten O2 - - Bildung. Dies kann insofern von Bedeutung sein, als es sowohl unter physiologischen, als auch pathophysiologischen Bedingungen zu akuten oder chronischen Veränderungen des endothelialen Membranpotentials kommt. In dieser Arbeit wurde nun untersucht, ob eine NAD(P)H – Oxidase in der Tat auch in humanen Endothelzellen vorhanden ist, ob sie im Gegensatz zur leukozytären Form konstitutiv aktiv ist, und welchen Beitrag sie zur basalen endothelialen O2 - - Bildung leistet. Weitere Untersuchungen in HUVEC sollten zeigen, ob und wie sich sowohl De – als auch Hyperpolarisation der Zellmembran auf die O2 - - Bildung auswirken, welches Enzym hierbei eine Rolle spielt und welche Signaltransduktionsmechanismen beteiligt sind. Zur O2 - - Messung an vaskulären Zellen war die Verwendung der Lucigenin – Chemilumineszenz – Methode etabliert, so daß auch hier anfänglich mit dieser Methode gearbeitet wurde. Da jedoch dann Befunde veröffentlicht wurden, die zeigten, daß Lucigenin in Enzymsyste-men, die sonst kein oder nur wenig O2 - produzieren, zu einer erheblichen O2 - - Bildung führte, mußte mit weiteren Methoden der O2 - - Messung überprüft werden, ob diese Nachteile auch unter unseren Versuchsbedingungen auftraten. Verwendet wurden hierzu die MCLA – verstärkte Chemilumineszenz, die NBT – und Cytochrom C – Methode. Mit diesen verschiedenen, voneinander unabhängigen Methoden zeigte sich, daß in Anwesenheit von NADH Lucigenin selbst zu einer wesentlich gesteigerten O2 - - Bildung in Lysaten von humanen Umbilikalvenenendothelzellen (HUVEC) führt. Daher wurde zur Untersuchung der endothelialen O2 - - Bildung in dieser Arbeit schließlich nur die Cytochrom C Methode verwendet. Zur Überprüfung der Auswirkungen der verwendeten Substanzen auf das Membranpotential wurde die Membranpotentialmeßmethode mittels dem Potential – sensitiven Fluoreszenzfarbstoff Bis - oxonol aufgebaut und verwendet. Intakte HUVEC zeigten eine basale O2 - - Produktion, die durch bekannte Inhibitoren der leukozytären NAD(P)H – Oxidase, mit unterschiedlichen Wirkmechanismen signifikant gehemmt wurde (Diphenyleniodonium ca. 48%, Phenylarsenoxid ca. 34% ). Ebenso resultierte die Inaktivierung des GTP - bindenden - Proteins rac mit Clostridium difficile Toxin B in einer signifikanten Reduktion der basalen endothelialen O2 - - Produktion um ca. 30%. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß nach Aufhebung der zellulären Integrität durch das Lysieren der HUVEC die Gabe von NADH eine um ca. 2.7 fach erhöhte O2 - - Produktion im Vergleich zu NADPH bewirkte. Mit Hilfe der Immunfluoreszenz bzw. rtPCR konnten außerdem zumindest ein Teil der leukozytären NAD(P)H – Oxidase Untereinheiten, p67phox und gp91phox auch in HUVEC nachgewiesen werden. Zur gezielten Depolarisation des Membranpotentials wurden ein Puffer mit erhöhter Kaliumkonzentration (90 mM), der nicht selektive Kalium – Kanal - Blocker Tetrabutylammonium Chlorid (1 mM) und das Kation – Ionophor Gramicidin (1 µM) verwendet. Die basale endotheliale O2 - - Produktion wurde durch diese Substanzen in ähnlichem Ausmaß (~ 60% ) signifikant gesteigert (n=23, p
Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06
Die endogene Präsentation von intrazellulären Antigenen auf MHC-Klasse-II-Molekülen ist von zentraler Bedeutung für eine Reihe immunologischer Prozesse. Die diesem Präsentationsweg zugrundeliegenden molekularen Mechanismen sind noch weitgehend unverstanden. Ziel dieser Arbeit war es, einen Beitrag zum Verständnis der molekularen Abläufe zu leisten, die an diesem endogenen MHC-Klasse-II-Präsentationsweg beteiligt sind. Am Beispiel des zytoplasmatischen/nukleären Modellantigens Neomycin-Phosphotransferase (NeoR) und eines Modellantigen-spezifischen, MHC-Klasse-II-restringierten CD4+ T-Zell Klons wurde der endogene Präsentationsweg in nicht-professionellen und professionellen antigenpräsentierenden Zellen untersucht. Eine Beteiligung von Schlüsselkomponenten des MHC-Klasse-I-Präsentationsweges konnte durch die Verwendung chemischer und biologischer Inhibitoren ebenso ausgeschlossen werden, wie eine vorzeitige Beladung von neu-synthetisierten MHC-Klasse-II-Molekülen im endoplasmatischen Retikulum. Dagegen erwies sich die endogene Präsentation des Modellantigens abhängig von endosomaler/lysosomaler Prozessierung. Durch biochemische und zellbiologische Methoden konnte nachgewiesen werden, daß das Antigen als intaktes Protein in Endosomen/Lysosomen gelangt. Eine mögliche Sekretion des Antigens und anschließende Wiederaufnahme in endosomale Kompartimente konnte durch Zellkulturüberstand- Transferexperimente als Transportmechanismus ausgeschlossen werden. Durch Inhibitor-Studien und der Beschreibung der Endosomen als Eintrittsort des Antigens in das endosomale/lysosomale System konnte gezeigt werden, daß ein Signalsequenz-vermittelter Import in Lysosomen durch Hitzeschockproteine nicht als Mechanismus in Frage kommt. Dagegen wies die Expression Autophagie-assoziierter Proteine in den verwendeten Zellinien auf eine mögliche Beteiligung dieses zytoplasmatischen Abbauvorganges an der Präsentation des Antigens hin. Eine Inhibition der Autophagie führte zu einer Stabilisierung und Anreicherung des Proteins im Zytoplasma sowie zu einer verminderten Aufnahme des Antigens in das endosomale/lysosomale Kompartiment. Die verminderte Aufnahme korrelierte mit einer starken Abnahme der MHC-Klasse-II-restringierten Präsentation des Antigens. Diese Ergebnisse identifizieren Autophagie am Beispiel des Modellantigens NeoR als den verantwortlichen molekularen Mechanismus für die endogene MHC-Klasse-II-restringierte Antigenpräsentation.
Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06
1.Die A1-ATPase-Gene ahaE, ahaC, ahaF, ahaA, ahaB, ahaD und ahaG wurden in den Fusionsvektor pMal-c2 kloniert und in Escherichia coli exprimiert.Die Fusionsproteine wurden aus dem Zellextrakt isoliert und zur Immunisierung von Kaninchen eingesetzt.Die spezifischen Antiseren gegen die A1-ATPase- Untereinheiten AhaA,AhaB,AhaC,AhaE und AhaF wurden für die Studien dieser Arbeit eingesetzt. 2.Die für die hydrophile Domäne der A1-ATPase kodierenden Gene ahaE, ahaC, ahaF, ahaA, ahaB, ahaD und ahaG des methanogenen Archäons Methanosarcina mazei Gö1 wurden in den Überexpressionsvektor pGEM-4Z hinter die lac und T7-Promotoren kloniert.Dieses Konstrukt wurde pTL2 genannt.pTL2 enthält zusätzlich 162 Bp stromaufwärts von ahaE 3.Die auf pTL2 lokalisierten Gene wurden heterolog in E. coli DK8 exprimiert und die A1-ATPase funktionell synthetisiert.Die spezifische ATPase-Aktivität im zellfreien Extrakt von E. coli DK8 (pSÖ1)betrug 186 mU/mg Protein.Die Synthese der A1-ATPase-Untereinheiten AhaA,AhaB,AhaC und AhaF konnte nachgewiesen werden.AhaE und AhaG konnten nicht detektiert werden. 4.Die A1-ATPase wurde aus dem Zellextrakt von E. coli DK8 (pTL2)über Ultra- zentrifugation,Ammoniumsulfatfällung,Gelfiltration an BioPrep SE 1000/17, Ionenaustauschchromatographie an BioScale DEAE und einer zweiten Gelfiltration an Sephacryl S-300 HR bis zur apparenten Homogenität gereinigt. 5.Das gereinigte Enzym wies eine molekulare Masse von 355 kDa auf und setzte sich aus 5 verschiedenen Untereinheiten zusammen.Die einzelnen Untereinheiten AhaA (65 kDa),AhaB (55 kDa),AhaC (41 kDa),AhaD (28 kDa)und AhaF (9 kDa)wurden mittels N-terminaler Sequenzierung identifiziert und wiesen im ATPase-Komplex eine Stöchiometrie von A3B3CDF auf.AhaE und AhaG waren nicht im Komplex enthalten. 6.Der ATPase-Testpuffer wurde für die heterolog exprimierte A1-ATPase optimiert (50 mM MES-HCl,40 mM Na-Acetat,30 mM NaHSO3,8 mM MgSO4,4 mM ATP,pH 5,2).Na-Acetat und Sulfit stimulieren die A1-A7.Die gereinigte A1-ATPase aus M. mazei Gö1 hydrolysierte Mg-ATP (im Verhältnis 2:1)als bevorzugtes Substrat mit einem V von 13 ± 3 U/mg Protein und einem K von 1,3 ± 0,3 mM für ATP. 8.DES,Hexestrol und Dienestrol wurden als spezifische Inhibitoren der archäellen A1-ATPase identifiziert.Die I Werte dieser Hemmstoffe betrugen 5 µmol Hexestrol/mg Protein,3 µmol DES/mg Protein und 6 µmol Dienestrol/mg Protein. 9.Quervernetzungsexperimente konnten belegen,dass die Kopien der Untereinheit AhaA in direkter Nachbarschaft zueinander stehen.Dies trifft auch für die Kopien der Untereinheit AhaB und für die Untereinheiten AhaA und AhaB untereinander zu.Zudem konnte eine direkte Nachbarschaft der Untereinheiten AhaA und AhaD festgestellt werden. 10.Die A1-ATPase besitzt eine dreifache Achsensymmetrie.Der Kopfteil der A1-ATPase ist hexagonal geformt und setzt sich aus sechs peripheren und einer zentralen Masse zusammen. 11.Die über Röntgenkleinwinkelstreuung ermittelten Dimensionen der A1-ATPase sind:Gesamtlänge =17,8 nm,Länge Kopfteil =9,4 nm,Stiellänge =8,4 nm, Stieldurchmesser =6 nm,Kopfdurchmesser (variabel,abhängig vom Substrat)= 10,06 nm,Kopfradius (variabel,abhängig vom Substrat)=5,03 nm. TPase,wohingegen sich alkoholische Lösungsmittel die ATPase-Aktivität hemmten.
Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/19
Bcr-Abl, eine onkogene Tyrosinkinase, ist maßgeblich an der Entstehung der chronischen myeloischen Leukämie (CML) sowie einem Teil der Fälle von akuter B-lymphoblastischer Leukämie (B-ALL) beteiligt. Die essentielle Rolle der Kinase-Aktivität von Bcr-Abl für dessen leukämogenes Potential konnte in zahlreichen Arbeiten demonstriert werden. Entsprechend ist Bcr-Abl Zielstruktur des ersten klinisch geprüften Tyrosinkinase-Inhibitors, STI571. STI571 führt bei Anwendung während der chronischen Phase der CML zu einer anhaltenden hämatologischen Remission, die nicht selten begleitet wird von einem kompletten Verschwinden Ph-positiver Zellen aus dem Knochenmark (zytogenetische Remission). In dieser Arbeit konnten zusätzlich zu Bcr-Abl weitere, therapeutisch relevante Zielstrukturen für die Behandlung Bcr-Abl-positiver Leukämien identifiziert werden. Es handelt sich hierbei um die Mitglieder der Familie der Src-Kinasen, die über einen komplexen Mechanismus, letztlich aber unabhängig von der Aktivität der Abl-Kinase, aktiviert werden (siehe Abschnitt 3.1 und 3.2). Tierexperimente zeigten, dass diese Kinasen zumindest im Rahmen der Bcr-Abl-positiven B-ALL von essentieller Bedeutung sind (siehe Abschnitt 3.3). Diese Beobachtung war vor allem deswegen interessant, weil gerade die Bcr-Abl-positive B-ALL nur ein sehr schlechtes Ansprechen auf STI571 als Monotherapie zeigt und weil STI571 Src-Kinasen weder direkt noch indirekt über Bcr-Abl inhibierte. Durch Exploration des Bindungsmodus von STI571 konnte eine Bindetasche in Abl identifiziert werden, die Grundlage für die hohe Spezifität von STI571 ist (Abschnitt 3.4). Die dabei gewonnenen Daten wurden zur Etablierung eines Zellkultursystems genutzt, das die Selektion und Validierung einer neuen Substanzklasse, der dualspezifischen Src-/Abl-Inhibitoren, ermöglichte. PP1 und CGP76030 waren Prototypen derartiger Inhibitoren. Sie blockierten die Aktivität von Src-Kinasen und Abl über einen identischen Bindungsmechanismus. Experimente mit Bcr-Abl-positiven Zellinien deuteten darauf hin, dass die alleinige oder additive Inhibition von Src-Kinasen durch diese Inhibitoren eine zusätzliche Option für die Therapie Bcr-Abl-positiver Leukämien darstellt (Abschnitt 3.5). Dies gilt insbesondere für Patienten mit fortgeschrittener Leukämie oder dann, wenn sich aufgrund spezifischer Punktmutationen eine Resistenz gegenüber STI571 ausgebildet hat. Derartige Substanzen sollten daher in naher Zukunft in Tiermodellen getestet werden.
Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06
Cytomegaloviren, die, wie alle Herpesviren, persistente Infektionen in ihren Wirten etablieren, haben Mechanismen entwickelt, um einer Elimination durch das Immunsystem zu entgehen. Alle bisher untersuchten Herpesviren interferieren mit der MHC-Klasse-I-restringierten Antigenpräsentation. Murines Cytomegalovirus verfügt neben der m152-vermittelten Retention von MHC-Klasse-I-Molekülen im ERGIC/cis-Golgi über weitere Mechanismen, den Transport von MHC-Klasse-I-Molekülen an die Plasmamembran zu verhindern (Thäle et al., 1995; Ziegler et al., 1997). In der vorliegenden Arbeit konnte das MCMV Glykoprotein gp48, welches durch das in der early Phase der Infektion exprimierte Gen m06 kodiert wird, als weiteres MHC-Klasse-I-reaktives Protein identifiziert werden. Zellen, die das Gen m06 stabil exprimieren, weisen eine stark verminderte Oberflächenexpression von MHC-Klasse-I-Molekülen auf, und sind dadurch in ihrer Fähigkeit, Peptide gegenüber CD8+ cytotoxischen T-Zellen zu präsentieren, beschränkt. Das Typ I Transmembranprotein gp48 bindet im Endoplasmatischen Retikulum (ER) an neu-synthetisierte b2-Mikroglobulin-assoziierte MHC-Klasse-I-Moleküle, wobei eine Peptidbeladung der Komplexe nicht erforderlich ist. Die gp48/MHC-Klasse-I-Komplexe verlassen das ER und werden durch den Golgi-Apparat in ein Lamp-1+ Kompartment, höchst wahrscheinlich in die Lysosomen, transportiert und dort rasch abgebaut. Die Degradation ist sensitiv gegenüber verschiedenen endosomalen/lysosomalen Inhibitoren. Eine Hemmung führt zur Akkumulation von komplex glykosylierten MHC-Klasse-I- und gp48 Molekülen, die sich resistent gegenüber Endoglykosidase H verhalten. Gp48 Moleküle, welche nicht mit MHC-Klasse-I-Komplexen assoziiert sind, werden nicht in die Lysosomen transportiert, sondern durch das Proteasom abgebaut. Das virale Glykoprotein gp48 kann in eine MHC-Klasse-I-bindende Domäne und eine Transportdomäne unterteilt werden. Der gerichtete Transport der MHC-Klasse-I/gp48- Komplexe in die Lysosomen wird durch ein di-Leucin-Motiv im cytoplasmatischen Anteil von gp48 vermittelt. Eine Deletion des gesamten cytoplasmatischen Anteils bzw. eine Mutation des Membran-proximalen di-Leucin-Motivs führt zur Wiederherstellung der MHC-Klasse-I Oberflächenexpression, ohne die gp48/MHC-Klasse-I-Assoziation zu beeinflussen. Für die Bindung von gp48 an MHC-Klasse-I-Moleküle ist die luminale Domäne ausreichend, sofern diese in membranverankerter Form vorliegt. Die direkte Bindung an MHC-Klasse-I-Moleküle über die luminale Domäne von MCMV gp48 und der gerichtete Transport, vermittelt über ein di-Leucin-Motiv im cytoplasmatischen Anteil von gp48, stellt einen neuartigen viralen Immunevasionsmechanismus dar, die MHC-Klasse-Irestringierte Antigenpräsentation zu verhindern.
Die Knabe-Reaktion von 1,2-Dihydro-2-methylpapaverin (9) und die begleitende Eliminierungsreaktion wurden durch ihre gebrochene Reaktionsordnung und durch die Möglichkeit der Inhibition als Radikalkettenreaktionen erkannt, deren kettentragendes Radikal das 3,4-Dimethoxybenzylradikal ist. Die Synthese von N-Methylpavin (19) aus 1,2-Dihydro-2-methylpapaverin (9) ist an die Anwesenheit von Ameisensäure als Inhibitor der Radikalketten gebunden. Durch Zusatz von Inhibitoren können nun Immoniumionen 10 und analoge Verbindungen stabilisiert und ihre Chemie untersucht werden.
Fri, 1 Jan 1971 12:00:00 +0100 https://epub.ub.uni-muenchen.de/9461/1/9461.pdf Werle, Eugen; Ingrisch, Heinrich; Fritz, Hans; Jaumann, Eugen; Fink, Edwin ddc:610, Medizin