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Artikel lesen: https://hnf.link/jTtk Ein Forscherteam aus chinesischen, russischen und amerikanischen Wissenschaftlern hat die kristallografische Struktur des Cannabinoid-Rezeptors 2 entdeckt. Die neuen Erkenntnisse könnten zur Entwicklung von Arzneimitteln gegen entzündliche oder neurodegenerative Krankheiten beitragen.

Der humane Thyreotropin-Rezeptor (TSH-R) steuert die zentralen Funktionen der Schilddrüse und ist der wichtigste Regulator für deren Wachstum und Differenzierung. Er gehört zur Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) und kann nach einer Stimulation mit TSH die G-Proteine aller vier Familien (Gs, Gi/o, Gq/11 und G12/13) aktivieren. Dabei werden die meisten zellulären Reaktionen wie die Proliferation der Schilddrüsenepithelzellen und die Bereitstellung der Schilddrüsenhormone einer Aktivierung von Gs zugeordnet. Zu Gs-unabhängigen Signalwegen des TSH-R war dagegen erst wenig bekannt. Da der Gq/11-vermittelte Signalweg durch die Aktivierung der Phospholipase C und Proteinkinase C in maligne Prozesse von Schilddrüsenzellen involviert sein könnte, sollten in der vorliegenden Arbeit Gq/11-abhängige Effektoren des TSH-R in humanen Schilddrüsenkarzinomzellen identifiziert und näher charakterisiert werden. Als Modellsystem wurden FTC 133 wt TSH-R Zellen verwendet, eine follikuläre Schilddrüsenkarzinom-Zelllinie, die den humanen TSH-R überexprimiert. In diesen wurde die Aktivierung des Calcium/Calcineurin-abhängigen Transkriptionsfaktors NFAT nach TSH-Stimulation erstmalig beschrieben. Bei einer anschließenden Reihenuntersuchung der NFAT-abhängigen Zielgene Autotaxin, VEGF, c-Myc, Regulator von Calcineurin 1 (RCAN1) und Cyclooxygenase-2 (Cox-2) wurden c-Myc, RCAN1 und Cox-2 als TSH-regulierte Gene identifiziert. Die Induktion von c-Myc war unabhängig von NFAT, dagegen bestätigten Expressionsstudien mit Calcineurin-Inhibitoren und dem spezifischen NFAT-Inhibitor INCA-6, dass RCAN1 und Cox-2 durch eine NFAT-Aktivierung induziert wurden. Diese Aktivierung wurde durch Gq/11-Proteine vermittelt, denn nach spezifischer Herunterregulation der Gq- und G11-α-Untereinheiten mittels siRNA konnten die Zielgene nicht mehr TSH-abhängig induziert werden. Weitere Analysen zum Mechanismus der NFAT-Aktivierung zeigten, dass eine Erhöhung der intrazellulären Calciumionenkonzentration ([Ca2+]i) allein über intrazelluläre Speicher nicht ausreichend war. Um NFAT zu aktivieren, mussten zusätzlich Calciumionen aus dem Extrazellulärraum einströmen. Untersuchungen mit dem STIM1-Inhibitor SKF-96365 wiesen dabei auf einen Calciumioneneinstrom über Speicher-operierte Ionenkanäle hin. Zusätzlich zur NFAT-regulierten Genexpression wurde in dieser Arbeit die TSH-induzierte Expression des Metallothioneins MT1X in FTC 133 wt TSH-R Zellen und in primären Thyreozyten analysiert. Die mRNA Induktion dieses Cystein-reichen und zytoprotektiven Proteins war ebenfalls abhängig von einer Expression der Gq/11-Proteine. Eine Erhöhung der [Ca2+]i reichte jedoch nicht aus, um MT1X signifikant zu induzieren. Zur gesteigerten Expression war darüber hinaus auch die Aktivierung der Proteinkinase C notwendig. In der vorliegenden Dissertation konnten somit RCAN1, Cox-2 und MT1X als Gq/11-regulierte Zielgene des humanen TSH-R charakterisiert werden. Dabei wurde eine NFAT-regulierte Genexpression nach einer TSH-Stimulation erstmalig gezeigt. Die präsentierten Ergebnisse weisen damit auf eine bisher unbeachtete biologische Rolle von Gq/11-abhängigen Signalwegen des humanen TSH-R in der Schilddrüse hin.

Thu, 10 Apr 2014 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/16934/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/16934/1/Herlemann_Annika.pdf Herlemann, Annika

Sat, 8 Feb 2014 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/16915/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/16915/1/Glueck_Laura.pdf Glück, Laura

Der humane Mas-related gene X1 (hMrgX1)-Rezeptor ist ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor, der selektiv in nozizeptiven Spinalganglienneuronen exprimiert wird. Eine spezifische Aktivierung des Rezeptors durch das Proenkephalin-Spaltprodukt BAM8-22 (bovine adrenal medulla 8-22) wird als schmerzhaft wahrgenommen. Damit stellt der hMrgX1-Rezeptor eine neue molekulare Zielstruktur für eine potentiell nebenwirkungsarme, analgetische Therapie dar. Trotz dieses Potentials sind die pro-algetischen Signalwege des hMrgX1-Rezeptors bislang nicht verstanden. Der MrgX1-Rezeptor entwickelte sich unter hohem positivem Selektionsdruck und kommt nur in Primaten vor. Trotzdem wurden die nicht-homologen MrgC-Rezeptoren der Nagetiere zur Analyse des hMrgX1-Rezeptors verwendet. Im Rahmen dieser Arbeit wurden daher zunächst vergleichende Ligandenprofile des hMrgX1- und der MrgC-Rezeptoren aus Maus und Ratte erstellt. Dabei wurden deutliche Unterschiede offensichtlich, da der hMrgX1-Rezeptor exklusiv von BAM8-22 aktiviert wurde, während die MrgC-Rezeptoren durch weitere Liganden, u. a. Spaltprodukte des Proopiomelanocortins, z. T. sogar effizienter aktiviert wurden. Zudem konnte gezeigt werden, dass die MrgC-vermittelte Ca2+-Mobilisation auf Grund einer β-Arrestin-abhängigen Rezeptorendozytose deutlich desensitisierte, während der hMrgX1-Rezeptor resistent gegenüber dieser Liganden-induzierten Regulation war. Daher können die MrgC-Rezeptoren der Nagetiere nicht als Modellsytem für den hMrgX1-Rezeptor verwendet werden, so dass in dieser Arbeit weiterführend Signalwege des hMrgX1-Rezeptors in Spinalganglienneuronen-ähnlichen F11-Zellen und primären Spinalganglienneuronen untersucht wurden. Dabei zeigte sich eine duale funktionelle Regulation des etablierten pro-algetischen TRPV1 (transient receptor potential cation channel vanilloid 1)-Ionenkanals. Zum einen sensitisierte der hMrgX1-Rezeptor den TRPV1 über einen etablierten, Proteinkinase C-abhängigen Signalweg. Zum anderen zeigte sich eine direkte hMrgX1-mediierte Aktivierung des TRPV1. Dieser Regulationsmechanismus wurde durch eine Phospholipase C (PLC)-β-induzierte Produktion des endogenen TRPV1-Liganden Diacylglycerol und durch die Degradation des tonisch TRPV1-inhibierenden PLC-β-Substrates Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat vermittelt. Neben der TRPV1-Modulation induzierte der hMrgX1-Rezeptor die Expression verschiedener Gene, deren zentrale Bedeutung bei der inflammatorischen und neuropathischen Schmerzchronifizierung etabliert ist. Einerseits wurde eine hMrgX1-induzierte Phosphorylierung der extracellular signal-regulated kinases 1/2 beobachtet, die in einer Aktivierung von serum response factor-abhängigen Reportergenkonstrukten und in der Induktion von c-Fos auf mRNA- und von early growth response protein 1 auf mRNA- und Proteinebene resultierte. Andererseits zeigte sich die transkriptionelle Ca2+/Calcineurin-abhängige Aktivierung des nuclear factor of activated t cells, die in der Induktion des CCR2 (chemokine receptor 2) auf mRNA- und Proteinebene resultierte. Somit konnte erstmalig ein physiologischer Induktor des CCR2 in Spinalganglienneuronen beschrieben werden. Weiterhin wurde nach der Etablierung der endogenen Proteinexpression des hMrgX1-Rezeptors in LAD2-Mastzellen eine BAM8-22-induzierte Freisetzung des CCR2-Agonisten chemokine ligand 2 ermittelt, so dass der hMrgX1-Rezeptor die parakrine Stimulation von nozizeptiven Spinalganglienneuronen durch Mastzellen fördern könnte. Diese Dissertation trägt somit zum besseren molekularen Verständnis akuter und chronischer pro-algetischer Funktionen des hMrgX1-Rezeptors bei und könnte damit die Entwicklung neuer analgetischer Wirkstoffe ermöglichen.

Mit der intensiven Erforschung von Stammzellen soll zukünftig die Möglichkeit eröffnet werden durch Manipulation von Stammzellpopulationen das regenerative Potential des Organismus zu verstehen und zu nutzen. Darüber hinaus soll mittels genetisch modifizierter Stammzellpopulationen die Grundlagen dafür geschaffen werden schwere Gen- und Immundefekte zu therapieren. Humane mesenchymale Stammzellen (hMSC) versprechen hierbei großes Potential, da sie bereits für systemische Therapieansätze eingesetzt werden. Allerdings sind die theoretischen Grundlagen der Stammzelleigenschaften der hMSC wie Proliferation, Invasion bzw. Migration und die Differenzierungskapazität nur rudimentär verstanden. Aufbauend auf den Ergebnissen von Dr. Marisa Karow und Dr. Thomas Kolben, die eine Beteiligung des Wnt/β-Catenin-Signalweges an der Steuerung dieser Stammzelleigenschaften in ihren Arbeiten nachweisen konnten (Karow 2008; Kolben et al. 2012), sollten in der vorliegenden Arbeit die Rezeption des spezifischen Wnt-Signals und die dabei beteiligten Frizzled (Fzd)-Rezeptoren näher untersucht werden. Da aus den vorigen Arbeiten schon hervorging, dass alle 10 Fzd-Rezeptoren in den hMSC exprimiert werden, sollte über eine qualitative PCR die Expression potentieller Wnt-Liganden sowie der beiden Inhibitoren des Wnt-Weges sFRP1 und WIF1 geprüft werden. Dabei zeigte sich, dass 8 der 19 Wnts sowie der Inhibitor sFRP1 exprimiert werden. Das Wnt-Expressionsmuster der Krebszelllinie HT1080 unterschied sich dagegen nur in der Expression zweier Wnts, was wahrscheinlich auf den mesodermalen Ursprung dieser Krebszelllinie zurückzuführen ist. Im Gegensatz hierzu zeigte sich eine umfangreichere Wnt-Expression in der immortalisierten Zelllinie HEK293, in der 13 der 19 Wnts sowie auch die beiden Inhibitoren sFRP1 und WIF1 nachgewiesen wurden. Für eine detailliertere Aufschlüsselung der Beteiligung einzelner Fzds an der Rezeption eines Wnt-Signals sowie an der basalen Aktivität des Wnt/β-Catenin-Signalweges in hMSC wurde ein TCF/LEF-Reporter-Vektorsystem in die hMSC eingebracht. Als Reportergen kam die sekretierte Form einer Luciferase aus dem Tiefsee-Cephalopoden Gaussia princeps zum Einsatz. Vorteil dieser Luciferase ist, dass die Sekretion in den Überstand eine Evaluierung der Wnt/β-Catenin-Aktivität über die Zeit hinweg erlaubt, ohne die Zellen zerstören zu müssen. Hierbei wurden transient und stabil-transfizierte TCF/LEF-(T-cell-specific transcription factor/lymphoid enhancer-binding factor)-Reporter-hMSC generiert und die Zellkulturbedingungen für nachfolgende Experimente optimiert. Die Evaluierung unterschiedlicher Aktivatoren des Wnt/β-Catenin-Signalweges ergab die stärkste Aktivierung nach Knockdown des Tumorsuppressorgens APC, während ein Knockdown des β-Catenins, dem zentralen Mediator des Wnt-Weges, zu einer signifikanten Reduktion der Gaussia-Luciferase-Aktivität führte. Bei Knockdown-Studien mit den verschiedenen Fzds mittels RNA-Interferenz (RNAi) in den TCF/LEF-Reporter-hMSC zeigte sich, dass Fzd5 und Fzd7 an der Weiterleitung eines Wnt-Signals sowohl unter unstimulierten Bedingungen als auch nach Applikation von Wnt3a beteiligt sind. Weiter zeigte nur noch der Knockdown von Fzd1, dass dieser Rezeptor an der Weiterleitung eines Wnt3a-Signals partizipiert. Um diese Ergebnisse über einen reversen Ansatz in Form einer Überexpression der Fzds zu untersuchen, wurde ein flexibles Klonierungssystem entwickelt, das einen einfachen Austausch von Protein-tags ermöglichen sollte. Nach Bestätigung der Überexpression der Fzds auf mRNA-Ebene und Proteinebene wurde die Wirkung der Überexpression in den TCF/LEF-Reporter-hMSC ohne und mit Wnt3a-Aplikation untersucht. Hier zeigte sich, dass neben der Überexpression von Fzd5 auch Fzd3 und Fzd6 eine Erhöhung der Gaussia-Luciferase-Aktivität und damit eine gesteigerte Aktivität des Wnt/β-Catenin-Signalweges sowohl unter unstimulierten als auch unter stimulierten Bedingungen nach sich zogen. Bei vergleichender Überexpression von Wnt3 oder Wnt3a konnte gezeigt werden, dass Wnt3 – welches hMSC auch endogen exprimieren – sehr viel stärker den Wnt-Weg aktivieren kann als Wnt3a. Um die Auswirkung des kanonischen Wnt-Rezeptors Fzd5 auf die Stammzelleigen-schaften der hMSC zu prüfen, wurde die Expression des Wnt-Zielgens Cyclin D1 und die Proliferation nach Knockdown sowie transienter Überexpression von Fzd5 quantitativ erfasst. Hierbei zeigte sich nach Knockdown von Fzd5 eine signifikante Abnahme der Proliferation, die auch auf Ebene der Wnt-Zielgene mit einer Abnahme der Cyclin D1-Expression einherging. Umgekehrt konnten stabil Fzd5-transfizierte hMSC-Populationen generiert werden, die eine signifikante Steigerung der Cyclin D1-Expression aufwiesen. Zusammenfassend konnte im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass die verschiedenen Fzds in unterschiedlichem Maße an der Weiterleitung eines Wnt-Signals beteiligt sind. Besonders scheinen hier Fzd5 und Fzd7 eine wichtige Rolle in hMSC zu spielen, da sie auch an der Vermittlung eines endogenen Wnt-Signals innerhalb der Stammzellpopulation beteiligt sind. Weiter wurde im Fall von Fzd5 auch die maßgebliche Beteiligung dieses Rezeptors am Erhalt der Proliferationskapazität der hMSC-Population nachgewiesen.

Die Schizophrenie, eine psychiatrische Erkrankung mit stärksten Auswirkungen auf Wahrnehmung, Gedanken und Emotionen der Patienten, tritt weltweit bei etwa einem Prozent aller Menschen auf. Ihre genaue Ursache ist bisher weitgehend ungeklärt. Neben Umweltfaktoren spielt die genetische Komponente eine herausragende Rolle, wobei nicht ein Gen alleine beteiligt ist, sondern ein Zusammenspiel verschiedener Gene als Auslöser vermutet wird.Die Erforschung solcher Suszeptibilitätsgene kann zu besserem Verständnis der Ätiopathogenese der Erkrankung führen und schließlich zu neuen Ansätzen in Diagnose und Therapie. Zahlreiche funktionelle Kandidatengene der Schizophrenie, allen voran der Dopaminrezeptor D2, unterliegen der Regulierung durch Retinoidrezeptoren, welche dadurch selbst zum Gegenstand der Forschung werden. In vorliegender Arbeit wird das Gen des Retinoidrezeptor RXR gamma (RXRG-Gen) untersucht, das sich auf Chromosom 1q22-23 befindet. In einer Fall-Kontroll-Assoziationsstudie mit 287 Schizophrenie¬patienten und 421 gesunden Kontrollpersonen als Probanden werden zwei Einzelbasenaustausch-Polymorphismen – einer ist innerhalb der potentiellen Promotorregion lokalisiert, der andere befindet sich auf Exon 8 –auf einen Zusammenhang mit Schizophrenie untersucht.Bei den Allel- und Genotypfrequenzen der Polymorphismen rs1467664 und rs2134095 zeigte sich keine signifikante Assoziation mit Schizophrenie, bei rs1467664 konnte der homozygote Genotyp des selteneren Allels Guanin im Vergleich zu den zusammengefaßten beiden anderen Genotypen einen Trend in Richtung Assoziation aufweisen. Um eine Beteiligung des RXR gamma bei der Entstehung der Schizophrenie endgültig klären zu können, müßten noch andere Polymorphismen des Gens flächendeckend untersucht und ein stärkeres Augenmerk auf das Wechselspiel mit anderen Genen gelegt werden, da eine isolierte Betrachtung eines Gens innerhalb der Ätiologie einer so komplexen Erkrankung wie die der Schizophrenie zu wenig Aussagekraft hat.

Thu, 25 Apr 2013 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15700/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15700/1/Welte_Benjamin.pdf Welte, Benjamin ddc:610, dd

Etwa 25-50% der Frauen im reproduktionsfähigen Alter erleiden in ihrem Leben einen spontanen Abort und 2-3% der Frauen rezidivierende Aborte [1]. Ein Großteil der Aborte bleiben weiterhin ungeklärt [4]. Folglich besteht ein essentieller Forschungsbedarf in der Ursachenerkundung und Prävention von Aborten. Die Rezeptoren Retinoid-X-Rezeptor α (RXRα) und Leptin Rezeptor (ObR) spielen eine Rolle in der plazentaren und fetalen Entwicklung. In vorherigen Studien konnte die Arbeitsgruppe von Toth und Jeschke et al. (2008 und 2009) zeigen, dass die Expression von RXRα und ObR jeweils in villösen- (VT) und extravillösen Trophoblasten (EVT) erhöht ist. In einer weiteren Studie konnte eine vermehrte Anzahl an apoptotischen EVT in Aborten festgestellt werden [191]. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Analyse der (patho-) physiologischen Rolle der Rezeptoren RXRα und ObR in Aborten mit speziellem Fokus auf apoptotische Prozesse. Dazu dienten Stimulationsversuche, in denen humane villöse Trophoblasten und Trophoblast-Modellzellen mit Retinsäuren und einem Prostaglandin-Derivat inkubiert wurden und deren Einfluss auf die RXRα und ObR Expression in den Zelllinien untersucht wurde. Des Weiteren wurde die Expression der Rezeptoren zusammen mit einem Marker für Apoptose in Abortplazenten detektiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Substanzen zu einer Abnahme der RXRα Expression in Trophoblast- und Trophoblastmodellzellen führen. Da Abortplazenten eine erhöhte RXRα Expression aufweisen und mit einer vermehrten Anzahl an apoptotischen EVT assoziiert werden, dient die Liganden-abhängige Reduktion der RXRα Expression durch die Substanzen vermutlich als Schutz vor einem apoptotischen Zustand bzw. vor einem Abort. RXRα stellt einen potentiellen Zielrezeptor in der Prävention von Aborten dar. Die ObR Expression in Trophoblastmodellzellen wurde durch die Retinsäure erhöht. Die Zunahme der ObR Expression kann als eine potentielle Reaktion auf ein vermindertes Leptin Angebot im Abort gedeutet werden. Weiterhin konnte eine Co-Expression des Apoptosemarkers mit RXRα bzw. ObR in EVT von Abortplazenten beobachtet werden. Als Ergebnis sind die vorliegenden Erkenntnisse nicht nur für das Verständnis über die Regulation der Rezeptoren im Abortprozess, sondern auch für den physiologischen Schwangerschaftsverlauf von zentraler Bedeutung.

In der deutschen Bevölkerung leidet, bezogen auf den BMI (Body-Mass-Index), etwa jeder zweite an Übergewicht. Innerhalb dieser Gruppe müssen dabei über 25 % als krankhaft adipös eingestuft werden. Trotz der weiten Verbreitung, ist zurzeit weder eine erfolgreiche medikamentöse Therapie der Adipositas verfügbar, noch sind die grundlegenden Mechanismen der Gewichtsregulation vollständig verstanden. Der MC4R (Melanocortin-4-Rezeptor) und sein Ligand α-MSH (melanocyte-stimulating hormone) stellen einen entscheidenden Punkt bei der Energieregulation des Körpers dar und sind damit eine vielversprechende pharmakologische Zielstruktur zur Behandlung von Adipositas. Trotz der enormen Bedeutung dieses Rezeptors ist bemerkenswert wenig über die MC4R-induzierten Signalwege bekannt. Ziel dieser Arbeit war es, α MSH-induzierte anorexigene Signal¬wege in murinen hypothalamischen Zellen (GT1 7), die den MC4R endogen exprimieren, zu identifizieren und zu charakterisieren. In dieser Arbeit konnte mit hochspezifischen Antikörpern gezeigt werden, dass nach 20 h Serumentzug die Stimulation von GT1-7 Zellen mit α MSH die cAMP-abhängige PKA (Proteinkinase A) aktiviert und somit zu einer ERK-1/2 (extracellular signal-regulated kinase-1/2) Phosphorylierung führt. Die aktivierte ERK-1/2 inhibiert anschließend die konstitutiv aktive AMPK-Kinase LKB1 (liver kinase B1), was in einer verminderten Phosphorylierung der nach¬geschalteten AMPK (AMP-activated protein kinase) an Threonin 172 resultiert. Damit ergibt sich eine lineare α-MSH-induzierte Signalkaskade, bei der die AMPK Dephosphorylierung von PKA, ERK-1/2 und LKB1 abhängig ist. Die Durchführung von Versuchen nach mehrstündigem Serumentzug ist zwar etabliert, führt aber zu Veränderungen in der Zelle, die sich unter anderem auf Proliferation und Morphologie auswirken. Da unklar ist, welche Versuchs¬bedingungen dem physiologischen Zustand eines Neurons entsprechen, wurde die α MSH-induzierte Signalkaskade zusätzlich unter serumhaltigen Bedingungen untersucht. Dabei führt die Stimulation mit α-MSH immer noch zu einer Aktivierung der ERK-1/2 und auch zu einer Dephosphorylierung der AMPK, letzteres allerdings unabhängig von PKA und ERK-1/2. Des Weiteren wird die AMPK nicht mehr exklusiv durch LKB1 reguliert, sondern die AMPK-Kinase TAK1 (TGF-β-activated kinase-1) spielt ebenfalls eine Rolle. Erste Hinweise aus einem Kinase-Aktivitäts-Array deuten daraufhin, dass diese Unterschiede in einer distinkten ERK-1/2 Aktivierung, über Rap-1 unter serumfreien oder über K-Ras unter serumhaltigen Bedingungen, begründet sein könnten. Diese Dissertation soll zu einem besseren Verständnis von anorexigenen Signal-wegen im Hypothalamus beitragen und könnte bei der Generierung neuer Anti Adipositas Medikamente hilfreich sein.

Thu, 28 Feb 2013 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15444/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15444/1/Hatiboglu_Nilay.pdf Hatiboglu, Nilay ddc:610, ddc:600, Medizinische Fakultät

Thu, 29 Nov 2012 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15100/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15100/1/Hamm_Wolfgang.pdf Hamm, Wolfgang ddc:610, ddc:600, Med

TRPC-Kanäle 1-7 wurden bisher als unselektive Kationenkanäle in heterologen Expressionssystemen beschrieben. Ihre physiologische und pathophysiologische Rolle in verschiedenen Organen und Geweben des menschlichen Körpers ist aber noch weitgehend unklar. Ziel dieser Arbeit war es, die Funktion zweier Mitglieder der TRPC-Familie, TRPC1 und TRPC6, in verschiedenen Zellsystemen mit Hilfe von Untersuchungen an den entsprechenden gendefizienten Mausmodellen näher zu analysieren. Nach der Klonierung der codierenden Sequenz des murinen TRPC1-Proteins aus Mausgeweben, wurden murine embryonale Fibroblasten (MEFs) aus TRPC1-defizienten und Wildtyp-Mäusen isoliert. Ein Vergleich zeigte, dass das Fehlen des TRPC1-Kanals die Viabilität dieser Zellen signifikant steigerte und die Wundheilungsrate signifikant herabsetzte. Durch die Identifikation sogenannter überaktivierter TRPC6-Kanal-Mutanten in Patienten mit fokaler segmentaler Glomerulosklerose (FSGS) war dann insbesondere die Funktion dieses Kanals in den Podozyten der Niere von besonderem Interesse. Wenig später wurden auch funktionslose Mutanten der Phospholipase C-e (PLCe) in Patienten mit dem gleichen oder einem ähnlichen Krankheitsbild beschrieben, das zu einer Erhöhung des Serumproteingehalts im Urin (Proteinurie) führt. Zur Beantwortung der Frage, ob beide Proteine interagieren und Komponenten eines gemeinsamen Signalweges sind, wurden primäre Podozyten aus Mäusen isoliert. In der Tat wurde in primären Podozyten und in HEK293-Zellen eine Interaktion beider Proteine identifiziert und ein möglicher Signalweg von der Aktivierung des Angiotensin 1-Rezeptors zum PLCe-induzierten Calciumioneneinstrom durch TRPC6-Kanäle aufgezeigt. Darüber hinaus wurden TRPC6-, PLCe- und TRPC6/PLCe-defiziente Podozyten mit Wildtyp-Podozyten in funktionellen Testsystemen verglichen. Zunächst konnte eine vermehrte Expression von TRPC4- und TRPC5-Kanälen in PLCe-defizienten und TRPC6/PLCe-defizienten Podozyten identifiziert werden. Außerdem zeigte sich in ersten Untersuchungen, dass das Fehlen des TRPC6-Kanals zu einer erhöhten Zellviabilität und zu einer verminderten Apoptoserate der Podozyten führte. In sog. Calcium-Imaging-Experimenten wurde ein stark reduzierter Calciumioneneinstrom in TRPC6- und PLCe-defizienten Podozyten nach AT1-Rezeptoraktivierung durch Angiotensin II beobachtet. Da Podozyten durch ihre Barrierefunktion wesentlich zur Stabilität des glomerulären Filters beitragen, wurde auch die Veränderung des Zytoskeletts durch Aktinpolymerisation näher untersucht. Es zeigte sich, dass Podozyten nach Applikation von Angiotensin II durch eine stärkere Polymerisation von globulärem Aktin vermehrt sog. Aktin-Stressfibern ausbilden und abflachen. TRPC6-defiziente Podozyten hingegen zeigen bereits im Ruhezustand deutlich mehr Aktin-Stressfibern, die nach Gabe von Angiotensin II nicht mehr signifikant in ihrer Anzahl zunehmen. Die Daten der vorliegenden Arbeit sind im Einklang mit der Hypothese, dass ein zu starker Calciumioneneinstrom in Podozyten durch überaktivierende TRPC6-Mutationen zu einer geringeren Podozytenstabilität und zu einer erhöhten Apoptoserate führen kann. Die mangelnde Stabilität des glomerulären Filters in den FSGS-Patienten führt dann zu einer Proteinurie und schließlich zum Nierenversagen. Durch Expression der TRPC6-Mutationen in TRPC6-defizienten Podozyten könnte sich in Zukunft die Rolle des Kanals als wichtige pharmakologische Zielsubstanz für eine Pharmakotherapie der FSGS bestätigen.

Thu, 28 Jun 2012 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/14667/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/14667/1/Poettinger_Thomas.pdf Pöttinger, Thomas

Eine Glomerulonephritis kann durch eine virale Infektion verschlechtert werden, sie kann aber auch erst durch diese entstehen. Die Erkennung der viralen Bestandteile erfolgt über Pathogenerkennungsrezeptoren, wie beispielweise Toll-like Rezeptoren und RIG-like Rezeptoren. Die Hypothese der vorliegenden experimentellen Arbeit war, dass die nierenspezifischen Podozyten Pathogenerkennungsrezeptoren besitzen, die pathogen-assoziierte molekulare Muster erkennen und daraus Zytokine und antivirale Typ-I Interferone produzieren. Hierbei könnten Podozyten zu der Entstehung bzw. Veschlechterung einer virusassoziierten Glomerulonephritis beitragen. Murine Podozyten exprimieren, mit Ausnahme des Toll-like Rezeptors 8, alle bis dato bekannten Toll-like Rezeptoren (TLR-1 bis -11) in verschiedener Ausprägung. Sie exprimieren außerdem die zytosolische Rezeptoren RIG-1, MDA-5, DAI sowie deren Adaptermolekül IPS-1. Die Aktivierung dieser Rezeptoren verursacht die Produktion von Zytokinen und Typ-I Interferonen. Um die intrazelluläre Aufnahme der Nukleinsäuren zu gewährleisten, wurden diese mit kationischen Lipiden komplexiert. Dieser Vorgang wurde durch Cytochalasin D, Chlorpromazin und Methyl-β-Cyclodextrin unterbrochen. Daraufhin ergeben sich die Phagozytose, die Clathrin-abhängige Endozytose und die Caveolae-vermittelte Endozytose als mögliche Transportmechanismen. Das Adaptorprotein MyD88 zeigte bei Podozyten keine Bedeutung für die Nukleinsäureaufnahme in die Zelle zu besitzen. Die Stimulation von Podozyten mit Typ-I Interferonen veranlasste die Produktion von großen Mengen an Interleukin-6 und führte zu einer starken Expression von Pathogenerkennungsrezeptoren sowie proinflammatorischen Zytokinen auf Transkriptionsebene. Eine autokrin-parakrine Aktivierung der Podozyten durch ausgeschüttete Typ-I Interferone konnten wir ausschließen. Weder die Durchlässigkeit für Albumin noch die Viabilität der Zellen wurde durch die Aktivierung von Pathogenerkennungsrezeptoren beeinflusst. Eine Funktionseinschränkung der Podozyten nach Stimulation der TLRs oder RLRs im Sinne eines direkten Einflusses auf die Permeabilität oder die Fußfortsatzzahl fand sich nicht, jedoch zeigten Podozyten eine vermehrte Zytokinproduktion, was zur glomerulären Entzündung bei viraler Glomerulonephritis beitragen könnte.

Fri, 11 Nov 2011 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/14426/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/14426/1/Eissler_Ruth.pdf Eißler, Ruth Ingrid ddc

Sat, 30 Jul 2011 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/13472/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/13472/1/Ruhl_Rena_Sarah.pdf Ruhl, Rena Sarah ddc:590, ddc:50

In the present study, the equine histamine 4 receptor (eH4R) was cloned, sequenced and pharmacologically characterized. The findings were compared to those, obtained with the human H4R (hH4R). Due to its expression in cells of the immune system, the eH4R provides a promising target for the development of novel therapeutic strategies in allergic diseases, such as Recurrent Airway Obstruction (RAO) and allergic dermatitis in the horse. To clone the eH4R, mRNA was isolated from horse white blood cells and cDNA was synthesized by reverse transcription. Specific primers were used to amplify the eH4R sequence, which was then cloned into pJET1.2/blunt vectors. The open reading frame is 1185 bp long and codes for a 394 amino acid protein which shows 72,9 % homology to the human receptor. The cDNA sequence was published in the NCBI GenBank under the accession number HM015200. To pharmacologically and functionally characterize the eH4R and hH4R, their cDNAs were subcloned into the expression vector pcDNA3.1 and either transfected transiently into COS-7 cells or stably into HEK293 cells. Binding-characteristics were examined by homologous und heterologous competition experiments using the antagonist 3H-pyrilamine or the agonist 3H-histamine as radioligand. High affinity binding of histamine could only be detected in hH4R, but not in eH4R transfected COS-7 cells. Nevertheless, histamine was able to inhibit cAMP-production in stably transfected HEK293 cells via the eH4R and the hH4R. The eH4R expressed in HEK293 cells is coupled to the stimulation of ERK1/2, while the hH4R shows already high constitutive activity. The antagonists JNJ7777120, Thioperamide, Pyrilamine and Diphenhydramine display considerable species-specific differences concerning the affinities between eH4R and hH4R and also vary in their intrinsic activities. Thioperamide, known for its inverse agonism at the hH4R showed agonist behaviour in ERK1/2 regulation. In contrast, the non-selective antagonist Diphenhydramin showed inverse agonist behaviour, which was more pronounced at the hH4R than the eH4R. These findings suggest that there are considerable pharmacological and functional differences between the cloned eH4R and hH4R.

Unter in vivo Bedingungen kann es in Zellen, die shear stress ausgesetzt sind (wie z.B. Endothel und Epithelzellen) ständig zu Rupturen der Plasmamembran kommen. Das sogenannte Membrane Resealing stellt die Fähigkeit von Zellen dar, auf eine solche Schädigung zu reagieren und die Membranintegrität durch schnelle Fusionsprozesse intrazellulärer Vesikel an Verletzungsstellen wiederherzustellen. Vielfach belegt ist hierbei die Beteiligung lysosomaler Vesikel sowie Enlargeosomen. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals eine Beteiligung ER-generierter Vesikel an diesen Reparaturprozessen der Zellmembran nachgewiesen werden. In verschiedenen experimentellen Ansätzen wurde eine Translokation von ER-Membranen an die geschädigten Areale der Zellmembran gezeigt. Eine Fusion der ER-Membranen mit der Zellmembran wurde durch den Nachweis luminaler Domänen transmembranöser ER-Proteine (CNX) sowie luminaler (löslicher) ER-Proteine (ERp57) an den Verletzungsstellen von Axonen des Rückenmarkes in vivo bestätigt. Durch die Blockade der am ERES freigesetzten COPII-Vesikel (Sar1) wurde der frühe sekretorische Transportweg vom ER zum Cis-Golgi-Netzwerk unterbunden. Damit einhergehend kam es zu einem verminderten Resealing der geschädigten Areale in der Zellmembran. Die Ergebnisse zeigen, dass die schnelle Freisetzung von ER-Vesikeln nach mechanischer Verletzung bzw. Schädigung der Plasmamembran durch bakterielle Toxine entscheidend an der Reparatur und Regenerierung geschädigter Zellen beteiligt ist. Nach mechanischer Schädigung kommt es auch zur Freisetzung von exozytotischen Vesikeln, sogenannten Mikropartikeln (MP), in den extrazellulären Raum. Bisher ist weitgehend unbekannt, wie die Homöostase der externalisierten MP koordiniert wird. In der vorliegenden Arbeit wurde unter in vitro- und in vivo-Bedingungen gezeigt, dass die extrazelluläre Konzentration der MP über die Clearance mittels verschiedener Endozytose-/Phagozytoseprozesse reguliert wird. An der Internalisierung dieser Vesikel ist der Class B Scavenger-Rezeptor CD36 beteiligt. Eine Blockade dieses Rezeptors in vitro zeigte eine deutliche Reduktion der Aufnahme von MP in phagozytosefähige Zellen. In vivo konnte eine CD36-abhängige Reduktion der MP-Aufnahme in verschiedenen Organen (vor allem Niere, Milz) in CD36-defizienten Tieren im Vergleich zu Kontrolltieren nachgewiesen werden. Des Weiteren wurden unter in vitro-Bedingungen Unterschiede bei der Internalisierung normaler und karzinomatöser MP nachgewiesen. Im Gegensatz zur zellulären Aufnahme von MP aus nicht-transformierten Zellen, wurden MP aus karzinomatösen Zellen nicht über Endozytose/Phagozytose internalisiert. Hingegen kam es hierbei zu einer Fusion von karzinomatösen MP mit der Membran der Akzeptorzelle, einem Mechanismus, der an der Transformation normaler Zellen in karzinomatöse Zellen beteiligt sein könnte. Insgesamt gesehen wurde hierdurch gezeigt, dass MP über Endozytose/Phagozytose in Zellen internalisiert werden, und dass dies organspezifisch über den Scavenger Rezeptor CD36 vermittelt wird.

Ektodomänenspaltung und Intramembranproteolyse des Amyloiden Vorläufer Proteins (APP) durch Alpha-, Beta- und gamma-Sekretase sind in die Pathogenese der Alzheimer Erkrankung (AD) involviert. Eine vermehrte proteolytische Prozessierung und Sekretion eines anderen Membranproteins, des Typ II Interleukin-1 Rezeptors (IL-1R2) wurde mit der Pathogenese der Alzheimer Erkrankung in Verbindung gebracht. IL-1R2 ist ein Abfangrezeptor, welcher vermutlich in der Lage ist, die schädlichen Effekte von Interleukin-1 im Gehirn zu begrenzen. Bis jetzt ist die proteolytische Prozessierung von IL-1R2 nur wenig verstanden. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass IL-1R2 ähnlich wie auch APP prozessiert wird. In humanen embryonalen Nierenzellen (HEK293) exprimiertes IL-1R2 unterläuft zuerst eine Spaltung der Ektodomäne durch eine Metalloprotease, was zur Freisetzung der Ektodomäne und einem in der Membran verbleibenden C-terminalen Fragment führt. Dieses Fragment wird durch Intramembranproteolyse des Gamma-Sekretase-Komplexes in eine intrazelluläre Domäne (ICD) gespalten. Die Intramembranproteolyse von IL-1R2 konnte durch einen hochspezifischen Gammasekretase-Inhibitor gehemmt werden und fehlte in Gamma-Sekretase-defizienten embryonalen Mausfibroblasten. Überraschenderweise erhöhen die Beta-Sekretase BACE1 und ihr Homolog BACE2 die Sekretion von IL-1R2, welche zu ähnlich großen C-terminalen Fragmenten wie auch bei der Alpha-Spaltung von IL-1R2 führen. Dies könnte bedeuten, dass beide Proteasen als alternative Alpha-Sekretasen agieren könnten. Darüber hinaus werden zahlreiche andere Membranproteine, die in dieser Arbeit untersucht wurden, nicht durch BACE1 und BACE2 geschnitten, was zeigt, dass beide Proteasen nicht am generellen Membranproteinumsatz beteiligt sind. Diese Arbeit zeigt, dass Il-1R2 und APP eine ähnliche proteolytische Prozessierung durchlaufen. Dies könnte somit eine Erklärung für die erhöhte Sekretion von IL-1R2 im Rahmen der Alzheimer Erkrankung sein.

Thu, 5 Mar 2009 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9908/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9908/1/Hofbauer_Katrin.pdf Hofbauer, Katrin ddc:610, ddc:600, Medizinische

Epilepsien zählen zu den häufigsten chronischen neurologischen Erkrankungen des Menschen, aber auch der Hunde und Katzen. Sie sind mit erheblichen Einschränkungen der Lebensqualität und Lebenserwartung verbunden und führen zu einer fortschreitenden Schädigung des gesamten Nervensystems. Gegenwärtig ist die wichtigste Therapieform der Epilepsie nach wie vor die Pharmakotherapie. Ungeachtet einer Vielzahl neuer Antiepileptika kann jedoch bei über 30% der Patienten mit Epilepsien durch eine medikamentelle Therapie keine ausreichende Kontrolle der Anfälle herbeigeführt werden, was neue Therapie- und Behandlungsstrategien unbedingt erforderlich macht. Eine, der im Zusammenhang mit einer Pharmakoresistenz am häufigsten erwähnten Thesen, ist die Multidrug-Transporter-Hypothese. Hier wird davon ausgegangen, dass es, durch an der Blut-Hirn-Schranke überexprimierte Efflux-Transporter, nicht zu einer ausreichend hohen Konzentration eines Antiepileptikums im neuronalen Gewebe kommt. Dem Multidrug-Transporter P-Glycoprotein (Pgp) wird dabei eine besondere Bedeutung beigemessen. Basierend auf der Multidrug-Transporter-Hypothese war es ein Ziel dieses Dissertationsvorhabenes die Regulation der anfallsinduzierten Pgp-Überexpression genauer zu charakterisieren, um daraus resultierend mögliche neue Angriffspunkte für eine Modulation der Pgp-Überexpression zu identifizieren. In einem ersten Teil der Dissertation wurde deshalb die Spezifität der molekularen Veränderungen des verwendeten Tiermodells untersucht. Hierfür wurde die Wirkung von spontanen Anfällen und eines SE auf die Pgp-Expression im Kaninen Gehirn untersucht. Die Untersuchungen zeigten, dass wie im Tiermodell auch nach einem spontan ablaufenden SE eine deutliche Induktion des Mutlidrug-Transporters Pgp an der Blut-Hirn-Schranke nachweisbar ist. Da bisherige Forschungsarbeiten unserer Arbeitsgruppe auf eine besondere Bedeutung des Glutamat/NMDA-Rezeptor/COX 2-Weges für die anfallsinduzierte Pgp-Überexpression in Endothelzellen der Blut-Hirn-Schranke hinweisen, wurden in diesem Dissertationsprojekt eingehende Untersuchungen durchgeführt, die darauf abzielten diesen Signalweg weiter aufzuklären. Durch vorausgegangene in vitro Untersuchungen wurde davon ausgegangen, dass die weitere Pgp-Induktion über den EP-1-Rezeptor von PGE2 abläuft. Diese Annahme konnte durch die Verwendung des EP-1-Rezeptor Hemmers SC- 51089 in vivo im Rahmen dieses Dissertationsprojektes bestätigt werden. Ein neuroprotektiver Effekt dieser Substanz konnte jedoch bei der verwendeten Konzentration von SC 51089 in diesem SE-Modell im Hilus nicht nachgewiesen werden. Weiterhin wurden Untersuchungen zu möglichen Downstream-Elementen des EP-1-Rezeptors angeschlossen, den Transkriptionsfaktoren YB-1 und ZONAB. Erstmalig konnte eine Expression dieser Transkriptionsfaktoren im adulten Gehirn unterschiedlicher Spezies nachgewiesen werden, die jedoch vermutlich nicht mit der anfallsinduzierten Pgp-Überexpression im Zusammenhang steht. Die bisherigen Ergebnisse demonstrieren jedoch, dass durch eine genaue Kenntnis, der an der Regulation der Pgp-Überexpression beteiligten Faktoren, eine Modulation bzw. Inhibtion der anfallsinduzierten Induktion von Pgp möglich ist und dadurch eine hoffnungsvolle Möglichkeit zur Behandlung und zur Prävention einer Multidrug-Transporter basierten Pharmakoresistenz geschaffen werden kann.

Thu, 23 Oct 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9254/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9254/1/Mestel_Dominik-Sebastian.pdf Mestel, Dominik Sebastian

Mon, 8 Sep 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9275/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9275/1/Sewald_Xaver.pdf Sewald, Xaver

Fri, 18 Jul 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9013/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9013/1/Hennes_Nadine_Regina.pdf Hennes, Nadine Regina

In der vorliegenden Arbeit wurden funktionelle Besonderheiten des klonierten equinen Histamin H1 Rezeptors (eH1) aufgeklärt. Insbesondere wurde die agonistvermittelte Regulation von Oberflächenrezeptoren sowie die intrazelluläre Signaltransduktion im Vergleich zum humanen Histamin H1 Rezeptor (hH1) dargestellt. Die Studie erfolgte an stabil die nativen eH1 bzw. hH1 oder die entsprechenden EGFP-Fusionsproteine exprimierenden HEK 293-Zellen. Die verwendeten Zellklone (HEK-hH1 und HEK-eH1) wiesen eine vergleichbare Rezeptorendichte auf. Im Vergleich zum hH1 induziert Histamin am eH1 nur eine geringe Internalisierung des Rezeptors, ein Effekt der sowohl mittels Radioligandenbindung an intakten Zellen als auch im konfokalen Mikroskop (LSM) nachgewiesen wurde. Die Internalisierung des eH1 erfolgt clathrinabhängig unter Beteiligung der GRK 2 und β-Arrestin 1. Dagegen scheint die Internalisierung des hH1 clathrinunabhängig mittels Lipidvesikel abzulaufen. Die klinische Wirksamkeit von Antihistaminika korreliert stark mit ihrer negativ intrinsischen Aktivität. Dabei zeigt der eH1 im Vergleich zum hH1 eine deutlich geringere spontane oder konstitutive Aktivität. Diese spiegelt sich in einer niedrigeren basalen GTPy35S Bindung (Rezeptor/G-Protein Kopplung) wieder, die in Anwesenheit von Diphenhydramin zunimmt. Das Antihistaminikum weist demnach am eH1 eine partielle agonistische Aktivität auf. Aufgrund seiner niedrigen konstitutiven Aktivität wird über den equinen Histamin H1 Rezeptor in HEK 293-Zellen keine basale ERK 1/2 Aktivierung induziert, so dass in diesem System keine dem Diphenhydramin am hH1 entsprechende inverse Aktivität bestimmt werden kann. Im Gegensatz zu hH1 führt die Aktivierung des eH1 mit Histamin zu einer sehr starken Stimulation der intrazellulären cAMP-Akkumulation. Diese ist im Vergleich zum hH1 nicht PTX- und PLC-abhängig, während beide Rezeptoren über PKA- und PKC-abhängige Mechanismen an die Adenylatcyclase (AC) gekoppelt sind. Zusammenfassend weisen die Ergebnisse auf vielfältige funktionelle und regulatorische Besonderheiten des equinen Histamin H1 Rezeptors hin, die bei der klinischen Anwendung und Entwicklung neuer Antihistaminika beim Pferd berücksichtigt werden müssen.

Die koronare Herzkrankheit (KHK) stellt momentan die häufigste Krankheits- und Todesursache in Europa dar. Häufig kommt es als Folge einer KHK zum akuten Myokardinfarkt mit den gefürchteten Folgen, wie kardiogenem Schock und plötzlichem Herztod. Während sich die etablierten konservativen Therapiestrategien bislang auf eine Verminderung des pathologischen Remodellings beschränken, gewinnt die Forschung an alternativen Therapiemöglichkeiten zur längerfristigen Regeneration des geschädigten Myokards zunehmend an Bedeutung. Ein neuer bisher noch nicht zur Therapie des Herzinfarkts eingesetzter Kandidat könnte das Parathormon (PTH) sein. Dessen Fragment PTH (1-34) befindet sich bereits seit Jahren im klinischen Einsatz zur Bekämpfung schwerer Osteoporosen. Im Tiermodell verbesserte PTH durch Steigerung des myokardialen Blutflusses die Herzfunktion und verhinderte dadurch die Ausbildung eines kardiogenen Schocks. Kürzlich konnte darüber hinaus im Mausmodell gezeigt werden, dass PTH die Stammzellnische im Knochenmark reguliert. So führte die PTH-Gabe zu einem Anstieg verschiedener Stammzellpopulationen im Knochenmark und verminderte bei bestrahlten Mäusen nach Knochenmarktransplantation signifikant deren Mortalität. Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss von PTH (1-34) auf die Mobilisation von Knochenmarkstammzellen ins periphere Blut sowie mögliche Effekte auf Pumpfunktion und Remodelling nach akutem Myokardinfarkt im Mausmodell zu untersuchen. Die Behandlung mit PTH (1-34) führte zu einer Mobilisation verschiedener Stammzellpopulationen aus dem Knochenmark ins periphere Blut. Dabei kam es nach PTH-Gabe im Gegensatz zu Granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) nicht zum Abfall von CD45+/CD34+ Stammzellen im Knochenmark. Nach chirurgisch induziertem Myokardinfarkt führte die Gabe von PTH zu einer signifikanten Abnahme der Mortalität im Vergleich zu den Kontrolltieren. Dies war bei den PTH-Tieren assoziiert mit einer signifikanten Verbesserung der globalen Herzfunktion. So waren das Herzzeitvolumen und die Auswurffraktion nach PTH-Gabe deutlich gesteigert. Wir konnten anhand einer erniedrigten arteriellen Nachlast in den hämodynamischen Untersuchungen zeigen, dass PTH am arteriellen Gefäßbett zu einer Vasodilatation führt. Über diesen bekannten Einfluss von PTH auf den arteriellen Gefäßwiderstand kommt es zu einem gesteigerten myokardialen Blutfluss. Dadurch verbessert PTH in der Akutphase nach akutem Myokardinfarkt die Herzfunktion und schützt vor einem akuten Herzversagen. Auf histologischer Ebene fanden sich nach PTH-Behandlung kleinere Infarktgrössen und eine verminderte Abnahme der linksventrikulären Vorderwand im Vergleich zu den Kontrolltieren. Diese Veränderungen im Remodelling nach PTH-Behandlung waren durch eine Zunahme von CD31+ Kapillaren in der Grenzzone um den Infarkt (Borderzone) erklärbar. Die Gefäßneubildungen waren assoziiert mit einer gesteigerten Expression von Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) sowie des Insulin like Growth Factor-1 (IGF-1)-Rezeptors in der Borderzone. PTH bewirkt somit entweder direkt oder indirekt über die Mobilisation von Knochenmarkstammzellen eine vermehrte Sekretion von vaskulären Wachstumstumsfaktoren wie VEGF und IGF-1. So kommt es nach akutem Myokardinfarkt im Mausmodell zu einem abgeschwächten „Remodelling“ mit konsekutiver Verbesserung der myokardialen Pumpfunktion. Neben weiterer Untersuchungen bezüglich der Mechanismen, über die PTH zu den gezeigten Veränderungen im kardialen Remodelling führt, müßte in einem nächsten Schritt geklärt werden, ob PTH (1-34) beim Menschen in der zur Osteoporosebehandlung üblichen Tagesdosis von 20-40 µg oder in konsekutiv höheren Dosierungen zur Freisetzung verschiedener Populationen von Knochenmarkstammzellen ins periphere Blut führt (Phase I Studie).

Histamin nimmt in der Pathogenese der Hypersensibiliätsreaktion vom Typ I eine zentrale Rolle ein. Zur Behandlung allergischer Krankheiten werden Antihistaminika eingesetzt, sie zeigen jedoch beim Pferd oftmals nur eine eingeschränkte Wirksamkeit. In der vorliegenden Arbeit wurde der equine Histamin H1 Rezeptor (eH1) mittels PCR-Klonierung isoliert. Hierfür wurde mRNA aus Pferdeblut gewonnen, durch Reverse Transkription in cDNA umgeschrieben und eine homologe Teilsequenz des Rezeptors mittels degenerierter Primer vervielfältigt. Die kodierende Sequenz des Rezeptors wurde durch anschließende 3’- und 5’-RACE-PCR vervollständigt und sequenziert. Der Rezeptor wurde einer molekularen und biochemischen Charakterisierung unterzogen. Die pharmakologische Charakterisierung wurde nach stabiler Expression der eH1-cDNA in HEK293-Zellen durchgeführt. In Radioligandenbindungsstudien wurde die Affinität von 3H-Pyrilamin, Histamin sowie der klinisch eingesetzten Antihistaminika Diphenhydramin und Chlorpheniramin am eH1 und humanen Histamin H1 Rezeptor (hH1) vergleichend ermittelt. Die Selektivität des eH1 wurde in Radioligandenbindungsstudien mit dem Histamin H2 Rezeptor-Antagonisten Cimetidin und dem Histamin H3-Rezeptor-Antagonisten Thioperamid demonstriert. Obwohl für Histamin keine Unterschiede in der Affinität zwischen beiden Rezeptoren nachweisbar waren, zeigten die Antihistaminika Chlorpheniramin und Diphenhydramin eine 2,2- bzw. 3,8-fach niedrigere Affinität zum eH1 im Vergleich zum hH1. Die funktionelle Aktivität des eH1 wurde in der intrazellulären cAMP-Produktion bestimmt. Dabei resultierte die Stimulation des eH1 in einem signifikant stärkeren Anstieg (15-fach) der intrazellulären cAMP-Konzentration im Vergleich zum hH1. Die Membranlokalisation und funktionelle Regulation des Rezeptors wurde am konfokalen Mikroskop untersucht. Durch Vorinkubation der Zellen mit den inversen Agonisten Diphenhydramin und Chlorpheniramin konnte dabei die Histamin-vermittelte Internalisierung des eH1 nach Stimulation mit Histamin unterbunden werden. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass ein voll funktionsfähiger eH1 kloniert wurde. Die im Vergleich zum hH1 gefundene niedrigere Affinität von Antihistaminika könnte zu ihrer eingeschränkten klinischen Wirksamkeit beim Pferd beitragen

Die vorgelegte Arbeit beschäftigt sich mit der Her-2/neu Genamplifikation und der Her-2/neu Rezeptorüberexpression in verschiedenen Tumoren des Ovars. Untersucht wurden diese Veränderungen mit der Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung und der Immunhistochemie. Die Ergebnisse bei den Ovarialkarzinomen exklusive Borderline-Tumoren lagen mit 6,8% (10/146) Amplifikation in der FISH und 6,7% (11/163) Überexpression in der Immunhistochemie im Vergleich zu Literaturdaten im unteren Bereich. Es fand sich kein Zusammenhang mit einem klinischen oder pathologischen Parameter (Tumorstadium, Tumorgrad, Tumortyp, Überleben). Die Literaturdaten zu diesen Fragestellungen sind kontrovers. Aufgrund der Tatsache, dass auch ein einzelner ovarieller Borderline-Tumor eine Genamplifikation aufwies, ist offensichtlich, dass diese Veränderung kein Phänomen darstellt, das vor allem für aggressive Tumoren oder fortgeschrittener Tumorstadien charakteristisch ist. Her-2/neu scheint somit für das Ovarialkarzinom sowohl prognostisch wie therapeutisch eine untergeordnete Rolle zu spielen. Die malignen Müller`schen Mischtumoren zeigten in Bezug auf die untersuchten Veränderungen ein überaus heterogenes Bild. Dabei ergab sich keine Korrelation zwischen Genotyp und Phänotyp. Die geringe Frequenz echter Genamplifikationen macht eine prognostische Relevanz dieser Veränderung auch in dieser Tumorgruppe unwahrscheinlich. Granulosazelltumoren zeigten keinerlei Auffälligkeiten des Her-2/neu Gens und Rezeptors, somit scheidet diese Veränderung zur früheren Abschätzung des Wachstumsverhaltens aus. Die Ergebnisse von Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung und Immunhistochemie zeigten zueinander eine hohe Übereinstimmung (p

In der akuten myeloischen Leukämie (AML) sind zwei Cluster aktivierender Mutationen im ´FMS-like tyrosine kinase-3´ (FLT3)-Gen bekannt: FLT3-´internal tandem duplications´ (FLT3-ITD) in der juxtamembranösen (JM)-Domäne in 20 - 25 % der Patienten und FLT3-Punktmutationen in der Tyrosinkinasedomäne (FLT3-TKD) in 7 – 10 % der Patienten. In dieser Studie haben wir eine neue Klasse aktivierender Punktmutationen (PM) charakterisiert, die in einem 16-Aminosäuren-Abschnitt der JM-Domäne von FLT3 (FLT3-JM-PM) lokalisiert sind. Die Expression von vier FLT3-JM-PM in IL-3-abhängigen Ba/F3-Zellen führte zu wachstumsfaktor-unabhängigem Wachstum, Hyperproliferation in Gegenwart von FL und Resistenz gegenüber apoptotischem Zelltod. FLT3-JM-PM-Rezeptoren waren autophosphoryliert und zeigten verglichen mit FLT3-WT-Rezeptoren eine höhere konstitutive Dimerisierungsrate. Als einen molekularen Mechanismus konnten wir die Aktivierung von STAT5 und eine erhöhte Expression von Bcl-x(L) in allen FLT3-JM-PM-exprimierenden Zellen im Vergleich zu FLT3-WT-Zellen zeigen. Der FLT3-Inhibitor PKC412 inhibierte das wachstumsfaktor-unabhängige Wachstum der FLT3-JM-PM-Zellen. Verglichen mit FLT3-ITD- und FLT3-TKD-Zellen, zeigten die FLT3-JM-PM-Zellen ein schwächeres Transformationspotential, verbunden mit geringerer Autophosphorylierung des Rezeptors und dessen nachgeordneten Ziel-Protein STAT5. Die Kartierung der FLT3-JM-PM auf die Kristallstruktur des FLT3-Proteins zeigte, dass diese Punktmutationen wahrscheinlich die Stabilität der autoinhibitorischen JM-Domäne reduzieren. Dies liefert eine strukturelle Erklärung für das transformierende Potential dieser neuen Klasse aktivierender Mutationen von FLT3. Die defekte Negativ-Regulation aktivierter Rezeptortyrosinkinasen (RTKs) ist ein bekannter Mechanismus der Onkogenese. Die RTK FLT3 wird in frühen myeloischen und lymphoiden Progenitorzellen exprimiert und ist an der Pathogenese der AML beteiligt. Das ´Casitas B-lineage lymphoma´ (CBL)-Protein ist in der Evolution stark konserviert und übernimmt wichtige Funktionen in der Negativ-Regulation der Signalübertragung verschiedener Zelloberflächenrezeptoren. Zwei CBL-Deletionsmutanten, die in vitro Fibroblasten transformieren, wurden aus murinen Retroviren isoliert, die Vorläufer-B-Zelllymphome induzieren. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass CBL nach FL-Stimulierung von FLT3-WT-exprimierenden Ba/F3-Zellen phosphoryliert wird und damit in die FLT3-nachgeordnete Signaltransduktion involviert ist. Die Koexpression der CBL-Deletionsmutanten CBL-70Z oder v-CBL mit FLT3 führt zur Transformation von Ba/F3-Zellen. Das transformierende Potential wird durch den FLT3-Rezeptor vermittelt, da die selektiven FLT3-PTK-Inhibitoren SU5614 und PKC412 die Proliferation der FLT3-WT/CBL-mutanten-Zellen vollständig aufheben. Die Aktivierung des PI3K/mTOR/AKT-Signalweges, jedoch nicht der SRC-Kinasen und MAPK, trägt wesentlich zum hyperproliferierenden Phänotyp der FLT3-WT/CBL-mutanten Zellen nach Ligandenstimulierung bei. Die Koexpression von CBL-70Z oder v-CBL mit FLT3 führt zur konstitutiven Aktivierung der FLT3-Rezeptoren sowie STAT5 und AKT. Nach FL-Stimulierung konnten wir eine Hyperaktivierung von STAT5 und AKT in FLT3-WT/CBL-70Z und FLT3-WT/v-CBL-Zellen beobachten. An der Interaktion von CBL und FLT3 sind die TKB-Domäne des CBL-Proteins und die JM-Tyrosine Y589 und Y599 des FLT3-Rezeptors beteiligt. Die Internalisierung der FLT3-Rezeptoren wird durch die Koexpression von CBL-70Z nicht verändert. Allerdings ist CBL an der Ubiquitinierung und Degradierung von Rezeptoren beteiligt und wir konnten zeigen, dass CBL-WT die Dephosphorylierung und Degradierung des FLT3-Rezeptors fördert. Es wurde vorgeschlagen, dass die CBL-Deletionsmutanten in dominant-negativer Weise agieren und die negativ-regulatorische Funktion von CBL-WT blockieren. Wir haben eine CBL-Deletionsmutante in den AML Zelllinie MOLM-13 und MOLM-14 identifiziert. Dieser CBL-Mutante fehlt Exon 8, das für Teile der Linker- und RING-Finger-Domäne kodiert, und erinnert an CBL-70Z. Die Entdeckung einer möglicherweise transformierenden CBL-Mutante in AML-Zellen unterstützt die Hypothese, dass CBL zum malignen Phänotyp der AML beiträgt. Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass die strukturelle oder funktionelle Inaktivierung negativ-regulatorischer Mechanismen das transformierende Potential von FLT3 aktivieren kann: 1. Der Verlust der Autoinhibition durch Punktmutationen, die die geordnete Konformation der autoinhibitorischen JM-Domäne stören. 2. Die funktionelle Inaktivierung eines negativ-regulatorischen Proteins durch ´loss-of-function´-Mutationen. Diese Daten unterstreichen die zentrale Rolle von FLT3 in der Leukämogenese und als ein Zielprotein für therapeutische Ansätze.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle des kürzlich identifizierten Polymorphismus im Gen der Rezeptortyrosinkinase FGFR4 (fibroblast growth factor receptor 4) im besonderen Hinblick auf seine Zusammenhänge mit der humanen Tumorpathogenese näher untersucht. Es handelt sich dabei um eine Keimbahnmutation, die zu einem Austausch der hydrophoben Aminosäure Glycin gegen die hydrophile, stark geladene Aminosäure Arginin an Position 388 (Arg388) und somit zu einer veränderten Proteinstruktur in der Transmembrandomäne des Rezeptors führt. Zuvor publizierte Studien, die Tumore verschiedener Organsysteme mit Fokus auf den FGFR4 Polymorphismus untersuchten, postulieren einen Zusammenhang zwischen der Rezeptormutation und seinem Einfluss auf die Tumorprogression und das Metastasierungspotential. Um diesen Einfluss der Mutation in unserem Tumorkollektiv zu untersuchen, führten wir bei Tumorproben von 301 Patienten, die an einem Plattenepithelkarzinom aus dem Bereich des Oropharynx litten, eine Genotypisierung mittels RFLP-PCR sowie immunhistochemische Untersuchungen durch, um die Expressionsstärke des FGFR4 feststellen zu können. Dabei zeigte sich, dass der FGFR4 in 34% der Fälle in heterozygoter oder homozygoter mutierter Form im Kollektiv vorliegt. Das entspricht einer Allelfrequenz für das Arg388 von 0.2. Die Verteilung der Rezeptorexpression im Kollektiv war weitgehend gleichmäβig verteilt. Um die Auswirkungen der durch die Untersuchungen gewonnenen Parameter auf die Tumorpathogenese festzustellen, wurden sie mit einem umfassenden Datensatz, der aus den Patientenakten gewonnen wurde, korreliert. Statistische Untersuchungen wiesen keine signifikanten Zusammenhänge zwischen dem FGFR4 Genotyp und der Tumorprogression oder einem gesteigertem Metastasierungspotential nach. Auch die in anderen Organsystemen zuvor festgestellte verringerte rezidivfreie Überlebenszeit bei Vorliegen des Arg388 Allels konnte in dem Kollektiv dieser Studie nicht reproduziert werden. Bezüglich der Rezeptorexpression ergaben unsere Untersuchungen Hinweise auf einen Überlebensvorteil bei starker FGFR4 Expression. Signifikante Zusammenhänge zwischen Rezeptorexpression und Tumorgröβe oder Tumorprogression konnten jedoch nicht nachgewiesen werden und decken sich mit den Ergebnissen von Streit et al. Somit können wir die bereits mehrfach postulierte Perspektive nicht stärken, den FGFR4 als Prädiktor oder prognostischen Parameter bei Krebserkrankungen zu deklarieren.

Systematische immunhistochemische Untersuchung der Verteilung des trkC-Rezeptors für Neurotrophin-3 im ZNS der adulten Ratte nach der Peroxidase-Anti-Peroxidase-Methode. Licht- und elektronenmikroskopische Auswertung der zellulären und intrazellulären Lokalisation des trkC-Rezeptors. Dokumentation der Ergebnisse fotographisch und in Skizzen analog eines Schnittatlas von Paxinos und Watson. Bestätigung der bekannten Funktionen und Hinweise auf weitere mögliche Wirkungen von Neurotrophin-3 über den systematischen morphologischen Nachweis des zugehörigen hochaffinen trkC-Rezeptors. Diskussion von zukünftigen therapeutischen Einsatzmöglichkeiten, die sich aus der Morphologie ergeben.

Reagible Sauerstoffradikale sind wichtige Bestandteile mikrobizider als auch zytotoxischer Funktionen polymorphkerniger neutrophiler Leukozyten (PMNL). Da dieser ambivalenten Stellung im Verlauf einer Sepsis große Bedeutung zukommt, untersuchten wir die Produktion von H2O2 in Abhängigkeit unterschiedlicher partikulärer und löslicher Stimuli bei Patienten mit zunehmender Schwere einer Sepsis. Es wurden Patienten mit unkomplizierter Sepsis (n=15), schwerer Sepsis (n=12) und Patienten mit septischem Schock (n=33) in eine prospektive Studie eingeschlossen. Die Kontrollgruppe bestand aus gesunden Probanden (n=50) mit vergleichbarer Altersstruktur und Geschlechtsverteilung. Zur Erfassung von Adhärenz, Phagozytose und der mit der Phagozytose assoziierten Sauerstoffradikalproduktion wurden nicht-opsonierte und opsonierte Zymosanpartikel verwendet. Die an β-Glukanen und Lektinstrukturen reiche Oberfläche von Zymosanpartikeln löst vermittelt durch die Lektinbindungsstelle der α-Kette (CD11b) des Komplementrezeptors Typ 3 und der in jüngerer Zeit charakterisierten „C type-lectin-like domain“ (CTLD) des Dektin-1-Rezeptors deren Phagozytose und die Phagozytose-assoziierte H2O2-Produktion des Granulozyten aus. Beide Rezeptoren werden als „non Toll-like“ Rezeptoren klassifiziert, welche zur Gruppe der „pathogene-recognition“ Rezeptoren (PRR) gerechnet werden. Zur Erfassung der durch lösliche Stimuli ausgelösten Zellaktivierung wurden PMNL mit dem chemotaktischen Tripeptid fMLP allein und nach Priming mit TNF-α inkubiert. Die ermittelte H2O2-Produktion war nach Stimulation mit nativem Zymosan reduziert, nach Stimulation mit opsoniertem Zymosan unverändert und nach Stimulation mit fMLP allein, fMLP in Kombination mit TNF-α, sowie in der Kontrollgruppe gesteigert. Alle Veränderungen hatten ihre deutlichste Ausprägung in der Gruppe der Patienten mit septischem Schock. Insbesondere die Phagozytose von Zymosan und die daran assoziierte H2O2-Produktion waren signifikant verringert, während die spontane und die durch lösliche Stimuli ausgelöste H2O2-Produktion stark erhöht waren. Diese Ergebnisse lassen auf die Entwicklung einer mit der Schwere einer Sepsis zunehmenden Granulozytendysfunktion schließen. Diese ist durch die Abnahme mikrobizider Teilfunktionen bei gleichzeitiger Steigerung der die Mikrozirkulation und potenziell das Gewebe schädigenden zytotoxischen Partialfunktionen charakterisiert. Da die Adhärenz von PMNL an nativem Zymosan unverändert blieb, während simultan die Phagozytose und die Phagozytose-assoziierte H2O2-Produktion reduziert waren, kann auf einen Defekt in der Signaltransduktion der Lektinbindungsstelle und/oder dem Dektin-1 β-Glukanrezeptor geschlossen werden.

In der vorliegenden Arbeit sollten monoklonale Antikörper gegen die extrazelluläre Domäne des humanen Notch 1 Rezeptors als Werkzeug für weitergehende Untersuchungen hergestellt werden. Dazu konnte erfolgreich ein Reinigungsprotokoll zur Aufreinigung eines rekombinanten Proteins aus dem extrazellulären Teil von Notch 1 etabliert werden. Das Austesten der Antikörper ergab, dass diese aufgrund von geringer Sensitivität im Western Blot nicht zu verwenden waren. Auch im FACS konnten sie nicht eingesetzt werden, da keine Bindung an natives Notch erfolgte. Daher wurde auf die Verwendung von mittlerweile verfügbaren Antikörpern gegen die intrazelluläre Notch Domäne zurückgegriffen. Damit konnte gezeigt werden, dass Notch 1 Rezeptor auf allen untersuchten Proben von primären Zellen exprimiert wird, sowie auf allen untersuchten Zell-Linien. Unter Verwendung von Notch 3 Antikörpern wurde die parallele Expression von Notch 1 und Notch 3 auf Zell-Linien analysiert und festgestellt, dass auf T-Zell-Linien Notch 1 und Notch 3 gleichzeitig exprimiert werden. Biochemische Untersuchungen zeigten, dass Notch 3 wie Notch 1 einer S1 Prozessierung im Golgi-Netzwerk zu unterliegen scheint. Mit den intrazellulär bindenden Notch 1 Antikörpern konnte eine immunhistochemische intrazelluläre Notch 1 Färbemethode etabliert werden, die eine Untersuchung von (Tumor-) Gewebe erlaubte. Das unterschiedliche Expressionsmuster von Notch lässt auf unterschiedliche Mechanismen bei der Regulation von Zellwachstum und Differenzierung schließen. So konnte in Tumoren der Haut keine Notch 1 Expression gesehen werden, jedoch im Str. basale. In Zellen des Kolonadenoms dagegen war eine Notch 1 Expression zu erkennen. Zusätzlich zu der bereits in der Literatur ausführlich beschriebenen Rolle von Notch als Onkogen tritt, abhängig vom untersuchten System, Notch auch in der Rolle eines Tumorsuppressorgens auf. Allerdings kann durch eine immunhistochemische Untersuchung der Notch 1 Expression allein keine Aussage getroffen werden, ob eine Änderung der Notch Expression Ursache für einen Transformationsprozess ist, oder als Folge eines solchen Prozesses auftritt. Dennoch liefert die parallele Untersuchung von gesundem und Tumor-Gewebe einen ersten Hinweis auf eine wie auch immer geartetete Beteiligung des Notch Signalweges. Prinzipiell ist bei der Interpretation auch zu beachten, dass hier die Notch 1 Färbung keine Aussage über den Aktivierungszustand von Notch liefern kann, da nicht gesichert ist, ob und in welcher Quantität Notch im Zellkern mit dieser Methode nachweisbar ist.

Thu, 26 Oct 2006 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/5985/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/5985/1/Jungbeck_Michaela.pdf Jungbeck, Michaela ddc:540, ddc:500, Fakultät für Chemie

Atherosklerose wird heute als entzündliche Gefäßerkrankung verstanden, an deren Beginn ein Funktionsverlust des Endothels steht. Genablationsversuche zeigen, dass der Protease-aktivierte Rezeptor 2 (PAR-2) eine Rolle bei der Vermittlung inflammatorischer Reaktionen des Endothels spielt. PAR-2 gehört zur Familie der heptahelikalen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren und wird durch proteolytische Spaltung seines N-Terminus aktiviert. Zusätzlich zu bekannten PAR-2-Liganden wie Trypsin und Gerinnungsfaktoren Xa und Tissue Factor/VIIa wurde mittels positional scanning synthetic combinatorial library die Typ II transmembrane Serinprotease Matriptase/MT-SP1 als PAR-2-aktivierende Protease identifiziert. MT-SP1/Matriptase wird bislang ausschließlich eine Rolle bei Tumorinvasion und Metastasierung zugeschrieben. In der vorliegenden Arbeit wurde eine entzündungsfördernde Wirkung der katalytischen Domäne von MT-SP1/Matriptase in primären Gefäßendothelzellen und der daran beteiligte Rezeptormechanismus untersucht. MT-SP1/Matriptase induzierte die de novo-Synthese der proinflammatorischen Mediatoren Interleukin-8 (IL-8), IL-6 und Monocyte Chemoattractant Protein (MCP)-1 abhängig von der katalytischen Aktivität und über die Aktivierung von PAR-2. Die MT-SP1/Matriptase-induzierten Signalwege beinhalteten die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-kB in Abhängigkeit von der Aktivität der MAPK p38 und p42/44. Die IL-8-Induktion durch MT-SP1/Matriptase erforderte dabei lediglich die Aktivität von p38. Zusätzlich wurde ein zweiter, PKCalpha-abhängiger Signalweg zur MT-SP1/Matriptase-induzierten IL-8-Expression nachgewiesen, der unabhängig von p38, p42/44 und NF-kB war. Die endotheliale Dysfunktion in der Atherosklerose kennzeichnet sich nicht nur durch Inflammation, sondern auch durch prothrombotische Veränderungen. MT-SP1/Matriptase induzierte zusätzlich zu inflammatorischen Zytokinen die Neusynthese des Gerinnungsfaktors Tissue Factor und könnte dadurch proatherogen wirken. Tissue Factor selbst induzierte wiederum IL-8 unabhängig von seinem Liganden FVIIa, aber abhängig von den Serinresten 253 und 258 in der zytoplasmatischen Domäne des Rezeptors. Expressionsstudien zeigten die erhöhte Expression von MT-SP1/Matriptase in der endothelialen Innenwand atherosklerotischer Gefäße im Vergleich zu gesundem Gefäß. Auch am Endothel adhärierte Blutzellen wiesen MT-SP1/Matriptase-Expression auf. Die Basalexpression von MT-SP1/Matriptase war nicht in Endothelzellen, aber in Monozyten nachweisbar, die im atherosklerotischen Prozess mit dem Endothel interagieren können. MT-SP1/Matriptase könnte daher eine Rolle bei der PAR-2-vermittelten Entzündungsreaktion in der atherosklerotischen Gefäßwand spielen.

Aktivierende Mutationen in Rezeptortyrosinkinasen spielen eine wichtige Rolle in der Pathogenese solider und hämatologischer Neoplasien, wie der akuten myeloischen Leukämie (AML). Im Rahmen dieser Arbeit wurden bislang nicht-charakterisierte Mutationen der Protoonkogene c-KIT und FLT3, die in der AML auftreten, in Zellkulturmodellen auf ihr transformierendes Potential hin untersucht. In-frame-Mutationen in Exon 8 des c-KIT-Gens, die aus kleinen Deletionen mit oder ohne Insertionen im extrazellulären Bereich bestehen, treten nahezu ausschließlich in Core-binding-Faktor-Leukämien auf und verschlechtern die Prognose der betroffenen Patienten. Drei repräsentative Exon-8-Mutationen wurden stabil in IL-3-abhängigen Ba/F3-Zellen exprimiert. Sie führten zur Hyperaktiverung des Rezeptors nach Ligandenstimulation, was sich in verstärkter Proliferation und Resistenz gegenüber Apoptose äußerte. In Rezeptor-Crosslinking-Experimenten zeigte eine repräsentative Exon-8-Mutante spontane und erhöhte liganden-induzierte Dimerisierung. Die biologischen Effekte konnten anhand einer erhöhten Phosphorylierung des nachgeordneten Signalmoleküls Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK) bestätigt werden. Im Gegensatz dazu hatte der FLT3-D324N-Single-Nukleotid-Polymorphismus, der in 6.4% von De-novo-AML-, 9.0% von CML- und 4.5% von ALL-Patientenproben detektiert wurde, keinerlei Auswirkungen auf die Prognose von AML-Patienten und wurde auch bei Kontrollpersonen gefunden (1.5%). Er wies keine funktionellen Unterschiede zu Wildtyp-FLT3 hinsichtlich Rezeptorphosphorylierung, Proliferation oder Apoptoseresistenz auf. Im Gegensatz zu Exon-8-Mutationen besitzen KIT-Mutationen in der Aktivierungsschleife, die – wie hier gezeigt wurde- die Prognose von Patienten mit günstigem Karyotyp verschlechtern, Resistenz gegenüber dem PTK-Inhibitor Imatinib. Zwei dem Imatinib nicht-verwandte Inhibitoren – PKC412 und SU5614 – wurden auf die Ansprechbarkeit von KIT-D816V getestet. Nur PKC412 war in der Lage, das spontane Wachstum von KIT-D816V-transduzierten Ba/F3-Zellen und die Rezeptorautophosphorylierung in HEK 293T-Zellen zu inhibieren. PKC412 führte überdies in den Ba/F3-Zellen zu einem deutlichen G0/G1-Arrest. Die beschriebenen In-vitro-Versuche können zwar einen ersten Einblick in die Rolle der untersuchten Mutationen in der AML bieten, tiefergehende Modelle sind jedoch vonnöten, um das Verständnis der Krankheitsentstehung in diesem Kontext zu erhöhen.

Das Adapterprotein TRADD spielt eine zentrale Rolle in der Signaltransduktion des zellulären TNF-Rezeptors 1 (TNF-R1) und des Latenten Membranproteins 1 (LMP1) vom Epstein-Barr-Virus. Im Gegensatz zur Situation am TNF-R1 bindet TRADD an LMP1 nicht über seine Todesdomäne, sondern über seinen N-terminalen Bereich. Betrachtet man die Zusammensetzung der TNF-R1 und LMP1 Signalkomplexe und der von diesen beiden Membranproteinen aktivierten Signalwege, sind ganz offensichtlich viele Gemeinsamkeiten zu erkennen. Dennoch ist die biologische Funktion dieser beiden Membranproteine zum Teil sehr unterschiedlich. Während der TNF-R1 maßgeblich an der Regulation inflammatorischer Prozesse beteiligt ist und in bestimmten Situationen die Zelle in den programmierten Zelltod (Apoptose) treiben kann, ist LMP1 essentiell an der Immortalisierung von B-Lymphozyten durch das Epstein-Barr-Virus beteiligt. LMP1 ist ein virales Onkogen, das die Expression mitogener Faktoren induziert und gleichzeitig Apoptose und Seneszenz inhibiert. Die Aufklärung der Signaltransduktion dieser beiden Membranproteine auf molekularer Ebene steht seit vielen Jahren im Zentrum intensiver Forschung. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Rolle von TRADD in der Signaltransduktion von TNF-R1 und LMP1 zu klären. Da das einzig wirklich zuverlässige System zur Untersuchung der TRADD Proteinfunktionen ein TRADD „knockout“ Zellsystem ist, wurde im Rahmen dieser Doktorarbeit erstmals ein TRADD-defizientes Zellsystem mittels homologer Rekombination in humanen B-Lymphozyten (DG75) hergestellt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Signaltransduktion von TNF-R1 und LMP1 in DG75 wildtyp und DG75 TRADD-defizienten Zellen untersucht. Dabei konnte erstmals gezeigt werden, dass TRADD für die Aktivierung des klassischen NF-κB Signalwegs sowohl durch die TNF-R1 Signaldomäne als auch durch LMP1 notwendig ist. Zusätzlich konnte durch die Entwicklung einer neuen, auf FACS-basierenden Methode zur Zelltodanalyse nach transienter Transfektion apoptotischer Gene, in DG75 TRADD-defizienten Zellen nachgewiesen werden, dass TRADD an der Induktion von Apoptose durch TNF-R1 essentiell beteiligt ist. Diese beiden Ergebnisse stützen das derzeitige Modell der TNF-R1 bzw. LMP1 Signaltransduktion. Dagegen konnte im Rahmen dieser Doktorarbeit festgestellt werden, dass TRADD weder für die Aktivierung des JNK1 Signalwegs durch die TNF-R1 Signaldomäne noch durch LMP1 benötigt wird. Im Fall von TNF-R1 stellt dieses Ergebnis das bis heute gültige Modell der TNF-R1 Signaltransduktion in Frage und zeigt, dass TRADD nicht das zentrale Adapterprotein zur Induktion aller wichtigen TNF-R1 Signalwege sein kann. Diese Ergebnisse konnten durch Experimente mit TRADD-siRNA in HeLa Zellen bestätigt werden. Abschließend konnte in dieser Arbeit erstmals gezeigt werden, dass TRAF2 unabhängig von TRADD mit dem TNF-R1 interagieren kann und von der TNF-R1 Signaldomäne in Abwesenheit von TRADD in „lipid rafts“ rekrutiert wird. Da TRAF2 für die TNF-R1-vermittelte JNK1 Aktivierung essentiell ist, könnte dies eine Erklärung für die TRADD-unabhängige Induktion des JNK1 Signalwegs durch TNF-R1 sein. Welches Molekül die Bindung von TRAF2 an TNF-R1 vermittelt, ist noch unklar und wird in Zukunft experimentell adressiert werden. Hierfür stellen die DG75 TRADD-defizienten Zellen ein wertvolles experimentelles System dar.

Fri, 11 Feb 2005 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/4089/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/4089/1/Kortendieck_Birte.pdf Kortendieck, Birte ddc:590, ddc:500, Tierär

In der vorliegenden Arbeit wurden Effekte von IL-10 auf monocytäre Lipidrezeptoren und -Transporter untersucht, die zusätzlich zu den anti-inflammatorischen Wirkungen von IL-10 für dessen anti-atherosklerotische Wirkung von Bedeutung sein könnten. Es konnte gezeigt werden, dass IL-10 die Expression des quantitativ wichtigsten Scavenger Rezeptors, CD36, in Monocyten/Makrophagen sowohl auf RNA- als auch auf Proteinebene hemmt. Diese Hemmung ging einher mit einer verringerten zellulären Aufnahme von oxidiertem LDL. Durch PPARgamma-FACS und -Western Blot in Cytosol-Kern-Fraktionen sowie Koinkubationen mit IL-10 und den PPARgamma-Agonisten 15d-PGJ2 (15-deoxy-Δ12,14-Prostaglandin J2) und Indomethacin konnte gezeigt werden, dass die IL-10 Hemmung von CD36 über die Hemmung des Transkriptionsfaktors PPARgamma vermittelt wird. Im Gegensatz dazu stimulierte IL-10 den Cholesterinexporter ABCA1 und dessen wichtigsten Transkriptionsfaktor LXRalpha auf RNA- und Proteinebene. Die Induktion von ABCA1 hatte funktionell einen verstärkten zellulären Cholesterinefflux zur Folge, welcher die Monocyten und Makrophagen vor Lipidakkumulationen schützte und das vermehrte Einschleusen von Cholesterin in den reversen Cholesterintransport ermöglicht. IL-10 stimulierte ABCA1 dabei trotz der Hemmung des Transkriptionsfaktor PPARgamma. Die IL-10 Stimulation von ABCA1 war durch Piceatannol, einem Inhibitor der proximalen, STAT3-vermittelten Signalübertragung des IL-10 Rezeptors, hemmbar. Mittels LXRalpha "knock down" Zellen konnte weiter gezeigt werden, dass für die IL-10-stimulierte ABCA1 Expression ein intakter LXRalpha-Signaltransduktionsweg nötig ist. Koinkubationen mit Fenofibrat, 9-cis RA (9-cis retinoic acid) und 22-OHC (22-Hydroxycholesterol) ergaben, dass IL-10 auch die Induktion von ABCA1 durch die beiden Transkriptionsfaktoren, PPARalpha und LXRalpha, verstärkte. Durch Hemmung der Proteinkinase A (PKA) und Messung der zellulären cAMP-Spiegel konnte des Weiteren ein distaler cross-talk des IL-10-Signalweges mit dem cAMP/PKA-Weg für die ABCA1 Stimulation nachgewiesen werden. Dagegen hatte IL-10 keinen anhaltenden Einfluss auf die Transkription von SR-BI. Der Scavenger Rezeptor BI (SR-BI) kann je nach Konzentrationsgradient sowohl die zelluläre Cholesterinaufnahme wie die Cholesterinabgabe vermitteln. Des Weiteren reduzierte IL-10 die LPS-induzierte ICAM-1 Expression, was auf die Attenuierung der NFkappaB- und PPARgamma-vermittelten ICAM-1 Expression zurückgeführt werden konnte. Insgesamt befördert IL-10 somit den ABCA1-initiierten peripheren Cholesterinabtransport aus Monocyten/Makrophagen durch HDL. Die gezeigten Effekte von IL-10 erklären tierexperimentelle Befunde eines deutlich reduzierten Lipidgehalts in atherosklerotischen Plaques unter IL-10 Behandlung. Sie erklären auch die niedrigen HDL-Spiegel bei IL-10 knock out (IL-10-/-) Mäusen, die durch exogene IL-10 Substitution korrigiert werden können. Demnach sollte IL-10 nicht nur durch seine anti-inflammatorischen Mechanismen, sondern auch durch seine Effekte auf das Cholesterinhandling von Monocyten/Makrophagen in der Gefäßwand die Entstehung und Progression atherosklerotischer Plaques reduzieren.

Glucocorticoidresistenz ist ein Phänomen, das bei vielen Krankheiten eine wichtige Bedeutung hat. Insbesondere wird vermutet, dass ihr eine kausale Rolle bei depressiven Erkrankungen zukommt. In den meisten Fällen kommt die Resistenz durch eine Fehlfunktion des Glucocorticoidrezeptors zustande. Deswegen ist es von grossem Interesse, den Signalweg dieses Rezeptors im Detail zu verstehen. In der Vergangenheit wurde viel zum Verständnis beigetragen, unter anderem indem eine Reihe von GR-Regulatoren identifiziert und deren Wirkungsmechanismus aufgeklärt wurde. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, neue Faktoren zu finden, die in die GR-Signaltransduktion verwickelt sind. Dazu wurde ein funktioneller Screen durchgeführt, der darauf beruhte, GC-resistente Zellen herzustellen, diese mit responsiven Zellen zu vergleichen und damit Kandidaten zu identifizieren, die möglicherweise die GR-Funktion regulieren. Für die Herstellung hormonresistenter Zellen wurde eine humane Zelllinie hergestellt, die in Anwesenheit von Hormon nicht überleben kann; diese wurde zufallsverteilt mutiert und in GC-haltigem Medium selektiert. Drei hormonresistente Klone konnten die Selektion überleben, einer davon wurde im Detail charakterisiert, dessen Proteinexpressionsmuster mittels 2D-Gelektrophorese mit derjenigen der Ausgangszelllinie verglichen und die unterschiedlich exprimierten Faktoren mittels Tandem-Massenspektrometrie analysiert. Dies führte zur Identifikation von vier Kandidaten: Thioredoxin, hsp27, Reticulocalbin und Cofilin 1, deren Wirkung auf den GR in verschiedenen Zelllinien getestet wurde. Während die ersten drei keinen Einfluss auf den GR hatten, konnte Cofilin als neuer GR-Inhibitor etabliert werden. Cofilin ist gut untersucht als Depolymerisierungsfaktor des Actin-Cytoskeletts, eine Rolle im Signalweg des GRs oder eines anderen Transkriptionsfaktors war bis jetzt jedoch nicht bekannt. Es zeigte sich, dass seine inhibitorische Wirkung auf den GR von seiner Funktion in der Actin-Regulation abhängig war, und ausserdem, dass Cofilin eine Veränderung der intrazellulären Rezeptorverteilung vor Hormongabe bewirkte. In nachfolgenden Experimenten wurde gefunden, dass sowohl die chemische Zerstörung des Actin-Cytoskeletts wie auch die direkte Erhöhung des Anteils an freiem Actin zur GR-Inhibierung und veränderten Rezeptorverteilung führt. Des Weiteren wurde entdeckt, dass erhöhte Mengen an freiem Actin den bekannten GR-Inhibitor c-Jun induzieren, wodurch folgendes Modell aufgestellt wurde: Cofilin erhöht durch seine Actin-Depolymerisierungsfunktion freies Actin, damit wird über einen noch unbekannten Mechanismus c-Jun induziert, welches wiederum den GR inhibiert. Damit wurde über einen zellulären genetischen Screen Cofilin 1 als ein neuer GR-Regulator identifiziert und nachfolgend der inhibierende Wirkungsmechanismus von Cofilin aufgeklärt.

Um die Therapiemöglichkeiten bei depressiven Störungen zu verbessern, ist die Kenntnis der molekularen Grundlagen dieser Erkrankungen notwendig. Die erhöhten basalen Cortisolwerte im Serum von depressiven Patienten und die gestörte negative Rückkopplung der HPA-Achse sind Hinweise darauf, daß die Funktionsweise der Rezeptoren für Corticoide wie Cortisol eingeschränkt ist. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit den Cochaperonen für die Corticoid-Signaltransduktion, insbesondere den Immunophiline FKBP51 und FKBP52, sowie p23. Für die Immunophiline wurde entdeckt, daß für ihren Beitrag zu einer effizienten Aktivierung Corticoid-abhängiger Promotoren drei Eigenschaften von Bedeutung sind: 1. Interaktion mit Hsp90, um überhaupt den Zugang zum Heterokomplex zu erhalten, 2. Wechselwirkung mit Dynein, um den nukleären Transport der Rezeptoren zu begünstigen und 3. die Peptidyl-Prolyl-Isomerase-Aktivität. Diese Postulate gründen sich auf die folgenden experimentellen Befunde: Das Immunophilin FKBP51 reduziert als Bestandteil des Heterokomplexes mit Hsp90 und den Corticoidrezeptoren sowohl die Bindungsaffinität (Denny et al., 2000) als auch die nukleäre Translokation des Glucocorticoidrezeptors (GRs) und des Mineralocorticoidrezeptors (MRs). Im Gegensatz zu seinem Homologen FKBP52 zeigt FKBP51 nur eine geringe Interaktion mit dem Motorprotein Dynein, welches für den retrograden Transport verantwortlich ist. Durch Einführung einer Punktmutation, die die Peptidyl-Prolyl-Isomerase-Aktivität inaktiviert, konnte gezeigt werden, daß FKBP51 diese Aktivität nicht für seine inhibierende Wirkung benötigt. Im Gegensatz dazu liefert die PPIase-Aktivität von FKBP52 einen aktiven Beitrag für die Funktionalität der Corticoidrezeptoren, weil die analoge Mutation in FKBP52 zur einer Hemmung der Transaktivierung und nukleären Translokation des GRs und des MRs führt. Da diese Mutante immer noch mit Dynein interagiert, ist allein die Wechselwirkung mit diesem Motorprotein offensichtlich nicht ausreichend für die volle GR-Aktivität. Des weiteren konnte gezeigt werden, daß Polymorphismen im FKBP51-Gen nicht nur mit dem Erfolg einer Antidepressivabehandlung korrelieren, sondern auch mit den Proteinmengen von FKPB51 in Lymphozyten. Schließlich wurde die Bedeutung von p23 analysiert, einem kleinen Cochaperon von Hsp90, dem aber auch eigene Chaperonaktivität zugeschrieben wurde. Durch gezielte Mutationen im p23-Protein war es möglich, seine Chaperonaktivität getrennt von seiner Cochaperon-Funktion zu untersuchen. Dabei stellte sich heraus, daß p23 für die Hemmung der GR-abhängigen Transkription nur als Hsp90-Cochaperon fungiert, weil zwar seine Interaktion mit Hsp90 für diesen Effekt notwendig war, nicht aber seine Chaperonaktivität. Um die beschriebene nukleäre Rolle von p23, die zum Zerfall von GR-Transkriptionskomplexen führt, zu untersuchen, wurde ein konstitutiv nukleärer GR verwendet. Auch hier benötigt p23 für die Hemmung des Rezeptors seine Hsp90-Interaktion, nicht aber seine Chaperonaktivität. Diese Arbeit leistet einen Beitrag zum Verständnis der Rolle von Chaperonen in der Steroid-Signaltransduktion. Darüber hinaus wurden starke Hinweise für eine mögliche Rolle von FKBP51 bei der Depression entdeckt.

Krebs stellt heute in den Industrieländern die zweithäufigste Todesursache dar. In der Therapie von Krebserkrankungen spielt die Chemotherapie neben der operativen Entfernung und der Bestrahlung als systemische Behandlungsform eine wichtige Rolle. Forscher unternehmen große Bemühungen, neue und verbesserte Therapieformen gegen Krebs zu entwickeln. Diese Aktivität hat dazu geführt, dass heute zahlreiche Medikationen erhältlich sind, die gegen Krebs einsetzbar sind. In Folge dieser Entwicklungen ist die Therapiewahl schwieriger geworden. Obwohl pathologisch diagnostizierte Charakteristika eine gewisse Selektion erlauben, gehen diese Klassifizierungen nicht weit genug, um auf die individuellen Bedürfnisse des Krebspatienten einzugehen. Prätherapeutische in vitro Chemosensitivitätstests bieten die Möglichkeit, Behandlungserfolge durch eine Individualisierung der Chemotherapie für Krebspatienten zu vergrößern. Für diese Untersuchungen werden dem Patienten Tumorzellen entnommen, und ex vivo mit in Frage kommenden Therapeutika in Kontakt gebracht. Dabei lässt sich herausgefunden, welche Therapeutika eine Wirkung auf die individuellen Tumorzellen zeigen. Bis heute sind solche Testverfahren unter Onkologen umstritten und eine Integration dieser Verfahren in den medizinischen Alltag ist noch nicht realisiert. Unterschiedliche methodische Herangehensweisen existieren in der Chemosensitivitätstestung. In dieser Arbeit wurde der bestehende ChemoSelect®-Test grundlegend untersucht und optimiert. Die Optimierung diente dazu, Durchführbarkeit und Vorhersagekraft des Verfahrens zu vergrößern und eine breite Anwendbarkeit des Tests zu ermöglichen. Es konnte gezeigt werden, dass Chemosensitivitäten in bestimmten Grenzen unabhängig von der Zellzahl reproduzierbar im Test nachzuweisen sind. Mit Hilfe eines optimierten Mediums konnte der Einsatzbereich des Tests mittels einer Reduktion der erforderlichen Zellzahl vergrößert werden. Ferner konnte gezeigt werden, dass die im ChemoSelect®-Test gemessene Ansäuerungsrate mit der Proliferation der Zellen korreliert. Untersuchungen ergaben eine gute Vergleichbarkeit des Tests mit verschiedenen Proliferationstests. Für Vertreter der wichtigsten Chemotherapeutikaklassen ließen sich in vitro spezifische Wirkungen nachweisen. Basierend auf den Erkenntnissen der vorliegenden Arbeit wurde ein grundlegendes Konzept für eine klinische Validierungsstudie aufgesetzt, mit welchem innerhalb von zwei Jahren überprüft werden kann, wie hoch der prädiktive Wert des Tests ist. Ferner wurde die Möglichkeit untersucht, im Test Sensitivitäten gegenüber neuartigen, spezifisch gegen Tumorzellen gerichteten Therapeutika nachzuweisen. Als Beispiel für eine solches Therapeutikum wurde der monoklonale Antikörper Herceptin verwendet, der gegen den Her2/neu Rezeptor gerichtet ist. Im Testsystem ließ sich eine Wirkung des monoklonalen Antikörpers sowohl als Monotherapeutikum als auch in Kombination mit Chemotherapie nachweisen. Dieser Effekt war spezifisch bei Zellen zu beobachten, die sich durch eine Überexpression des Her2/neu Rezeptors auszeichneten.

Der 5-HT3-Rezeptor gewinnt zunehmend pharmakologische Bedeutung, z.B. hinsichtlich der Wirkmechanismen von Antidepressiva. Diese wirken u.a. als 5-HT3-Rezeptor-Antagonisten oder hemmen die präsynaptische Serotonin-Wiederaufnahme. Darüber hinaus werden 5-HT3-Antagonisten in der Therapie des Zytostatika-induzierten Erbrechens eingesetzt. 5-HT3-Rezeptoren haben auch eine Bedeutung im Schmerzgeschehen. Die Beurteilung der Interaktion eines Pharmakons mit einem Rezeptor-gekoppelten Ionenkanal erfordert die Kenntnis über die Rezeptorkinetik. Deshalb untersuchten wir die Aktivierung- und Deaktivierungskinetik des heteromeren 5-HT3-Rezeptors. Der in HEK 293-Zellen exprimierte 5-HT3AB-Rezeptor diente als Modell für den nativen Rezeptor. Anhand der Rezeptor-vermittelten Antworten ermittelten wir die Aktivierungs- und Deaktivierungskinetik des 5-HT3AB-Rezeptors. Zu deren Beschreibung erstellten wir ein Reaktionsschema. Dieses verdeutlicht insbesondere die Unterschiede zwischen dem homomeren 5-HT3A-Rezeptor und dem heteromeren 5-HT3AB-Rezeptor. Beim 5-HT3AB-Rezeptor erfolgt die Desensitisierung als „klassische“ Desensitisierung, beim homomeren 5-HT3A-Rezeptor durch einen Offen-Kanal-Block. Darüber hinaus sind 5-HT3A-Rezeptoren und 5-HT3AB-Rezeptoren unterschiedlich sensitiv für den Agonisten 5-HT und zeigen eine unterschiedliche Resensitisierungszeit. Der 5-HT3-Rezeptor-spezifische Agonist mCPBG bewirkt hingegen bei 5-HT3A- und 5-HT3AB-Rezeptoren einen Offen-Kanal-Block. Dies bedeutet, dass der Desensitisierungs-Mechanismus nicht nur von der Quartärstruktur des Rezeptors, sondern auch vom Agonisten bestimmt wird. Funktionelle Unterschiede zwischen heterolog exprimierten und nativen 5-HT3-Rezeptoren konnten lange nicht erklärt werden und man machte unbekannte zelluläre Faktoren dafür verantwortlich (van Hooft et al., 1997). Erst die Entdeckung der 5-HT3B-Rezeptoruntereinheit (Davies et al., 1999) legte nahe, dass der native 5-HT3-Rezeptor ein Heteromer aus 5-HT3A- und 5-HT3B-Untereinheiten ist. Man nimmt auch an, dass sowohl homomere als auch heteromere 5-HT3-Rezeptoren in sensorischen Neuronen exprimiert werden (Morales et al., 2001). Dadurch gewinnen die in der vorliegenden Arbeit beschriebenen unterschiedlichen Eigenschaften homomerer und heteromerer Rezeptoren zusätzlich an Bedeutung. Zudem könnten unsere Ergebnisse dazu beitragen, Interaktionen zwischen Pharmaka und dem 5-HT3-Rezeptor besser zu verstehen.

Thu, 13 May 2004 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/2192/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/2192/1/Beyerle_Michaela.pdf Beyerle, Michaela ddc:

Thu, 1 Apr 2004 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/2253/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/2253/1/Engeholm_Maik.pdf Engeholm,

In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals die Expression und Bedeutung des Toll-like Rezeptors 4 (Tlr4) in normalen und adenomatösen epithelialen Hypophysenzellen untersucht. Tlr4 ist der Rezeptor für bakterielle Lipopolysaccharide und ist daher an der Induktion der angeborenen Immunantwort bei Infektions- oder Entzündungsprozessen beteiligt, die durch gram-negative Bakterien verursacht werden. Zusätzlich könnte der Tlr4 eine Rolle bei der Tumorgenese spielen, da Tumor-assoziierte Komponenten der extrazellulären Matrix oder Heat-Shock Proteine ebenfalls aktivierende Liganden des Tlr4 repräsentieren. In vorhergehenden Arbeiten wurde gezeigt, dass in der normalen Hypophyse der Tlr4 vorwiegend in follikulostellaren (FS) Zellen exprimiert wird und für immun-endokrine Interaktionen von Bedeutung ist. In der vorliegenden Doktorarbeit wurde eine sporadische Expression des Tlr4 auch in allen endokrinen Vorderlappenzellen nachgewiesen. Außerdem wurde eine heterogene Expression des Tlr 4 auch in 26 von 67 untersuchten Adenomen gezeigt. In den meisten Fällen wurde in Tlr4-positiven Adenomen eine verstreute Expression in weniger als 5% aller Adenomzellen beobachtet. Die Tlr4 Expression korrelierte nicht mit einem speziellen Adenomtyp (hormonaktiv oder –inaktiv) oder Phänotyp (Mikro- oder Makroadenom). Der adenomatöse Tlr4 war funktionell aktiv, da LPS in Tlr4-positiven, IL-6-sezernierenden Adenomen die IL-6 Sekretion dosisabhängig stark stimulierte. Das synthetische Glukokortikoid Dexamethason und der p38α MAP Kinase Inhibitor SB 203580 waren potente Inhibitoren der LPS-induzierten IL-6 Sekretion. Eine heterogen Tlr4 Expresion wurde auch in endokrinen Hypophysenzelllinien gefunden, von denen manche Tlr4-positiv waren (kortikotrope AtT20 und inaktive humane HP75 Zellen), während laktosomatotrope GH3 und gonadotrope αT3-1 Zellen keinen Tlr4 exprimierten. LPS hatte in AtT20 und GH3 Zellen keinen Einfluß auf die Hormonsekretion. Im Gegensatz dazu supprimiert LPS das Wachstum von AtT20 Zellen, nicht aber von GH3 Zellen, was darauf hinweist, daß LPS direkt das Wachstum von Tlr4-positiven Zellen inhibiert. Zusammengefasst weisen diese Egebnisse darauf hin, daß während transienter oder chronischer infektiöser bzw. inflammatorischer Prozesse, die durch gram-negative Bakterien induziert worden sind, LPS da Wachstum von Hypophysentumoren beeinflussen könnte. Ob LPS in vivo die Hypophysentumor-Entwicklung inhibiert oder stimuliert, hängt von der Co-Expression und Stimulation von IL-6 (ein Progressionsfaktor für Hypophysentumoren) durch LPS in Tlr4-positiven Adenomen ab und vom Einsetzen und dem Ausmaß des Anstiegs von anti-inflammatorisch wirksamen Glukokortikoiden. Nicht nur LPS, sondern auch das bei Krebserkrankungen eingesetzte Chemotherapeutikum Taxol, von dem man annimmt, dass es durch Tlr4 wirksam ist, inhibierte das Wachstum von AtT20 Zellen. Das läßt vermuten, dass in Tlr4-positiven Adenomen auch noch weitere Liganden des Tlr4 wie z.B. andere bakterielle oder virale Bestandteile, Pharmaka oder intratumorale Fragmente der extrazellulären Matrix die Entwicklung von Hypophysentumoren beeinflussen. Dies muss in zukünftigen Studien noch geklärt werden, ebenso wie die Frage, ob der Tlr4 allgemein eine Rolle für die Tumorgenese in anderen Tlr4-positiven epithelialen Tumoren spielt.

Das humanpathogene Bakterium H. pylori persistiert im Gastroduodenaltrakt für Jahre oder sogar Jahrzehnte und löst durch die Kolonisation der Magenmukosa eine chronische Entzündungsreaktion aus. In den meisten Fällen bleibt diese symptomlos, es können jedoch auch schwerwiegende Erkrankungen wie ein Magen- oder Zwölffingerdarm-Geschwür oder Magenkrebs daraus hervorgehen. Obwohl die Infektion eine starke zelluläre und humorale Immunantwort hervorruft, kann H. pylori durch das Immunsystem nicht eliminiert werden. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von H. pylori auf die Proliferation und Aktivierung von CD4+ T-Zellen untersucht. Dabei zeigte sich, dass H. pylori zwei Faktoren besitzt, um die Expansion der T-Zellen zu hemmen. Der eine, nicht näher charakterisierte Faktor scheint mit der Oberfläche der Bakterien assoziiert zu sein und inhibiert die Proliferation der T-Zellen bei direktem Kontakt der Bakterien mit den Zellen. Der zweite Faktor wurde als vakuolisierendes Zytotoxin VacA identifiziert, das, wie bisher bekannt war, in Epithelzellen die Bildung saurer Vakuolen auslöst. T-Zellen produzieren, wenn sie aktiviert werden, den Wachstumsfaktor IL- 2, beginnen sich zu vermehren und setzen eine Immunreaktion gegen das Pathogen in Gang. Das VacA-Toxin hemmt jedoch die Bildung von IL-2 und bewirkt eine Hemmung des Zellzyklus bei T-Zellen, indem es die Expression der Cycline D3 und E reprimiert. Diese sind essentiell für die Aktivierung des Retinoblastom-Proteins, das den Übergang des Zellzyklus von der G1- in die S-Phase vermittelt. Durch die Hemmung der IL-2-Produktion und die Erniedrigung der Oberflächenlokalisation von CD25, der -Kette des IL-2-Rezeptors, unterbricht VacA die Signaltransduktion, die normalerweise über den IL-2-Rezeptor zur Expression der Cycline führt. Die Hemmung der IL-2-Produktion durch VacA erfolgt auf transkriptioneller Ebene, indem die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFAT (Nuclear Factor of Activated T cells) verhindert wird. Die anderen für die Transkription des IL-2-Gens essentiellen Transkriptionsfaktoren AP-1 und NF-B werden durch VacA nicht beeinflusst. Die Stimulation der T-Zellen aktiviert zwei Haupt-Signalwege: einer führt über den MAPKinase / ERK-Kinase Weg zur Aktivierung von AP-1 und NF-B, der andere löst eine Erhöhung der Calcium-Konzentration im Zytoplasma aus, was die Ca2+-abhängige Phosphatase Calcineurin aktiviert. Calcineurin dephosphoryliert daraufhin den Transkriptionsfaktor NFAT und NFAT wird in den Zellkern transportiert, wo es zusammen mit AP-1 und NF-B die Transkription des IL-2-Gens initiiert. Es konnte gezeigt werden, dass VacA die Translokation von NFAT in den Kern durch Hemmung der Phosphatase-Aktivität von Calcineurin verhindert. Dies hat zur Folge, dass NFAT-abhängige Gene, wie das IL-2- Gen oder das für CD25 codierende Gen, nicht abgelesen werden können. Dass Calcineurin ein geeignetes Zielmolekül ist, um eine Immunantwort zu unterdrücken, zeigen auch die medizinisch bedeutsamen Substanzen FK506 (Tacrolimus) und Cyclosporin A. Beide V Zusammenfassung 91 Substanzen verursachen durch Hemmung von Calcineurin eine starke Immunsuppression. In DNA-Microarray-Analysen wurde untersucht, ob VacA einen ähnlich drastischen Effekt auf die Funktion der T-Zellen hat wie FK506. Dabei zeigte der Vergleich der Genexpression von VacA- und FK506-behandelten T-Zellen, dass VacA eine Untergruppe der Gene, die auch von FK506 reprimiert werden, herunterreguliert, wie z.B. die Gene für die Zytokine Macrophage Inflammatory Protein (MIP)-1, MIP-1, Single C Motif-1 (SCM-1) und SCM- 1. VacA scheint also die Genaktivität von T-Zellen ähnlich wie FK506 zu modulieren, was auf einen ähnlichen Mechanismus, nämlich die Calcineurin-Hemmung schließen lässt. Da das VacA-Toxin ein sekretiertes Protein ist, das auch in den tieferen Schichten des Magengewebes nachgewiesen werden kann, erreicht H. pylori nicht nur die vereinzelt im Magenepithel vorkommenden T-Zellen, sondern auch die T-Zellen, die bei der Infektion in die Lamina propria, eine tiefere Schicht der Magenmukosa, einwandern. Durch die Unterdrückung der T-Zell-Aktivierung und die Repression von Zytokin-Genen, die wichtig sind für die Modulation der Immunantwort, induziert H. pylori so vermutlich eine lokale Immunsuppression, die seine Eliminierung durch das Immunsystem verhindert und eine chronische Infektion des Magens ermöglicht. In einem zweiten Projekt wurde die Spaltung von CagA in ein 100 kD- und ein Tyrosinphosphoryliertes 40 kD- Fragment nach dessen Translokation in diverse Zelltypen untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Prozessierung nicht nur in Makrophagen, sondern auch in dendritischen Zellen und in T-Zellen auftritt. Die Spaltung scheint von der Tyrosin-Phosphorylierung des CagA-Proteins und von Calcium abhängig zu sein. Dabei wurde die Ca2+-abhängige Protease Calpain in einem in vitro-Ansatz als ein CagAprozessierendes Enzym identifiziert. Auch in Makrophagen kann die Spaltung von CagA in P100 und P40P-Tyr durch den Calpain-Inhibitor Calpeptin verhindert werden. Die Tatsache, dass transloziertes CagA in allen getesteten eukaryontischen Zelltypen außer der Magenepithelzellinie AGS prozessiert wird, deutet darauf hin, dass diese Prozessierung eine biologische Bedeutung hat.

Thu, 15 Jan 2004 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/1728/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/1728/1/Jostarndt_Kristina.pdf Jostarndt, Kristina

Mon, 27 Oct 2003 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/1554/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/1554/1/Raeder_Hanna.pdf Räder, Hanna

Most of the genetically inherited Alzheimer's disease cases are caused by mutations in the presenilin genes, PS1 and PS2. PS mutations result in the enhanced production of the highly amyloidogenic 42/43 amino acid variant of amyloid ß-peptide (Aß). Arbitrary mutations were introduced at position 286 of PS1, where a naturally occurring PS1 mutation has been described (L286V). Introduction of charged amino acids (L286E or L286R) resulted in an increase of Aß42/43 production, which reached almost twice the level of the naturally occurring PS1 mutation. Although pathological Aß production was increased, endoproteolysis of Notch and nuclear transport of its cytoplasmic domain was significantly inhibited. These results demonstrate differential effects of PS proteins in the endoproteolysis of the ß-amyloid precursor protein and Notch.

Entwicklungsbiologen haben vor über 25 Jahren festgestellt, daß Progesteron (PROG) die Fortsetzung der Reifeteilung an Xenopus Oozyten durch nicht-genomische Mechanismen an der Plasmamembran initiiert. Obwohl mehrere Publikationen dabei keine oder nur späte Veränderungen der intrazellulären Calciumkonzentration [Ca2+]i beschreiben, konnten Wasserman et al. an einigen Oozyten [Ca2+]i-Erhöhungen innerhalb der ersten Minute nach PROG-Zugabe beobachten. Diese Versuche sollten mit der Methode des Calcium Imaging reproduziert werden, wobei der Verlauf von [Ca2+]i durch Fluoreszenzmessung und dem Ca2+-Indikatorfarbstoff Fura-2 gemessen wurde. Dabei konnten innerhalb der ersten Minuten nach PROG-Zugabe keine Veränderungen von [Ca2+]i gefunden werden. Lysophosphatidylsäure (LPA) hingegen löste sehr zuverlässig Calcium-Signale aus. Durch Thrombin, Angiotensin II und Acetylcholin ausgelöste Effekte ließen sich, wenn auch seltener, ebenfalls zeigen. Xenopus Oozyten sind molekularbiologisch als eukaryontisches Expressionssystem nutzbar. Zur Etablierung des Expressions- und Testsystems wurde RNA in die Oozyten injiziert, die für den GnRH-Rezeptor kodiert. Nach erfolgreicher Expression steigt [Ca2+]i 1-3 Minuten nach der Rezeptorbindung über eine Aktivierung von Phospholipase Cb und das InsP3 System an. Auch bei Injektion von weniger als 0,5ng RNA pro Oozyte in das Zytosol konnte nach zwei Tagen, bei weniger als 0,15ng nach vier Tagen, ein schnelles Ca2+-Signal auf GnRH-Zugabe gesehen werden. Ebenso zeigten diese Effekte auch Oozyten, bei denen ein eukaryontischer GnRH-Rezeptor-Expressionsvektor in den Kern mikroinjiziert wurde, nicht aber unbehandelte Oozyten oder andere Negativkontrollen. An glatten Gefäßmuskelzellen (RSMC) kann in vitro eine schnelle Erhöhung von [Ca2+]i auf Aldosteron (ALDO) und an Spermatozoen auf PROG gezeigt werden. Zur Anwendung des Expressionssystems auf schnelle nicht-genomische Steroideffekte wurde einerseits aus diesen Zellen isolierte RNA in den Oozyten exprimiert, als auch RNA, welche für ein membranständiges Progesteron-bindendes Protein (mPR) kodiert. Durch Expression von RSMC-RNA konnte an Oozyten allerdings keine Calciumreaktion auf ALDO beobachtet werden; ebensowenig auf PROG durch Expression von RNA aus Mäusehoden oder mPR-RNA. Die hier vorgestellte Methode ist daher weniger geeignet zur Screening-Untersuchung bei der Expressionsklonierung zur Isolierung putativer Rezeptoren aus Genbanken oder Gesamt-RNA. Insgesamt handelt es sich jedoch um ein sehr gutes System, die Expression eines Rezeptors funktionell nachzuweisen; weitere Untersuchungen zur Rezeptoraktivierung, Signaltransduktion und topographischen Signalausbreitung lassen sich anschließen.

Thu, 9 Jan 2003 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/845/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/845/1/Urban_Stephanie.pdf Urban, Stephanie ddc:610, dd

Das von (Licitra and Liu, 1996) entwickelte Hefe-3-Hybrid-System ermöglicht die in vivo Identifikation von Ligand-Rezeptor-Interaktionen. Es ist eine Weiterentwicklung des klassischen Hefe-2-Hybrid-Systems und beinhaltet den Einsatz eines synthetischen Hybridmoleküls. Der feste Bestandteil dieses Hybridmoleküls ist das Hormon Dexamethason, das über die Hormon-bindende Domäne des Glukokorticoidrezeptors in der Hefezelle verankert wird und kovalent mit einem Molekül verbunden ist, für das der Interaktionspartner gesucht wird. Ziel dieser Arbeit war es, das Hefe-3-Hybrid-System im Labor zu etablieren und das System zur Identifikation neuer Interaktionspartner für das Immunsuppressivum FK506 einzusetzen. Um das Hefe-3-Hybrid-System sensitiver zu gestalten, wurde zunächst der ABC-Transporter PDR5 deletiert, der an dem Export von Steroidhormonen beteiligt ist. Dabei wurde gezeigt, daß der Pdr5-Transporter auch chemisch modifizierte Steroidhormone wie beispielsweise Dexamethason-Linker transportiert. Darüberhinaus wurden zwei Aminosäurepositionen innerhalb der Hormon-bindenden Domäne des Glukokorticoidrezeptors identifiziert, die entscheidend zur die Aktivierbarkeit des Rezeptors beitragen. Im Rahmen des durchgeführten 3-Hybrid-Screens wurde zusätzlich zu dem bekannten FK506- Bindeprotein, FKBP12, eine unbekannte, C-terminal verkürzte Spleißvariante von Antizym- Inhibitor als neuer Interaktor für FK506 identifiziert. Die Interaktion war FK506-spezifisch, da keine Interaktion mit anderen an Dexamethason gekoppelten Liganden nachzuweisen war. Die im 3-Hybrid-Screen isolierte Spleißvariante wurde zusätzlich über RT-PCR amplifiziert, wobei noch eine weitere Spleißform von Antizym-Inhibitor identifiziert werden konnte. Es wurde gezeigt, daß beide Formen ubiquitär exprimiert werden und Homologe in der Maus existieren. Antizym-Inhibitor ist an der Regulation der Polyaminbiosynthese beteiligt. Polyamine spielen für das Zellwachstum, die Zelldifferenzierung und die Proteinbiosynthese eine essentielle Rolle. Die Aktivität von Antizym-Inhibitor wird anhand seiner Fähigkeit bestimmt, Ornithin- Decarboxylase (ODC, EC 4.1.1.17) aus dem inhibitorischen Komplex mit Antizym freizusetzen. Die freigesetzte ODC-Aktivität gibt somit Auskunft über die Antizym-Inhibitor- Aktivität. Bei den Antizymen handelt es sich um eine Proteinfamilie, die aus vier Mitgliedern besteht, deren Interaktion mit Antizym-Inhibitor bislang nur für Antizym 1 beschrieben ist. Für die Charakterisierung der Antizym-Inhibitor-Spleißvarianten, wurde ein nichtradioaktiver Aktivitätsassay entwickelt, der auf der funktionellen Expression von humaner ODC, Antizym und Antizym-Inhibitor in der Hefe Saccharomyces cerevisiae beruht. Dabei wurde gezeigt, daß humane ODC die Deletion der Hefe-ODC (∆spe1) komplementiert und so das Hefezellwachstum auf Polyamin-freiem Medium ermöglicht. Dieser Assay erwies sich auch als geeignet für ein Hochdurchsatzverfahren (HTS) zur Identifikation von ODCInhibitoren. Die Koexpression von Antizym führte zu einer Wachstumshemmung, die auf einem Polyaminmangel beruht und durch Zugabe von Putrescin, oder durch die zusätzliche Koexpression von Antizym-Inhibitor wieder aufgehoben werden konnte. Darüber hinaus wurde ein 3-Hybrid-Assay für den Proteinkomplex aus ODC, Antizym und Antizym-Inhibitor entwickelt. Hiermit wurde untersucht, inwieweit Antizym-Inhibitor die Heterodimerisierung zwischen ODC und Antizym unterbindet. Aufgrund dieser Ergebnisse konnte erstmals gezeigt werden, daß Antizym-Inhibitor in der Lage ist, an alle Proteine der Antizym-Familie zu binden und ODC aus dem Komplex mit Antizym 1, 2, 3 und 4 verdrängt. Bislang war dies nur für Antizym 1 beschrieben. Desweiteren wurde für das noch nicht charakterisierte Mitglied der Antizym-Familie, Antizym 4, gezeigt, daß auch dieses an ODC bindet und die Aktivität der ODC hemmt. Die C-terminal verkürzte Spleißvariante konnte zwar an die Antizyme 1, 2 und 3 binden, war jedoch nicht der Lage, ODC aus dem Komplex freizusetzen. Um die Antizym-Bindungsdomäne von Antizym-Inhibitor weiter zu charakterisieren, wurden Fragmente hergestellt mit deren Hilfe die Antizym-Bindungsdomäne auf einen Bereich von Leucin45 bis Serin300 eingegrenzt werden konnte. Die Antizym-Bindungsdomäne überlappt dabei mit der FK506-Bindungsdomäne, die vollständige Form von Antizym-Inhibitor bindet interessanterweise nicht an FK506. Zusammengefaßt zeigt dies, daß der C-Terminus von Antizym-Inhibitor von großer Bedeutung für die Konformation des Proteins ist und einen wichtigen Beitrag zur Stabilisierung der Antizym / Antizym-Inhibitor-Interaktion leistet. Die Relevanz der in der Hefe gewonnenen Daten wurde abschließend mit HEK 293-Zellextrakten überprüft. Die Komplexbildung der transient exprimierten Proteine ODC, Antizym und Antizym-Inhibitor konnte durch Immunpräzipitation nachgewiesen werden. Damit wurde gezeigt, daß die Hefe-Daten auf höhere Organismen übertragen werden können.

Wed, 13 Jun 2001 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/183/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/183/1/Lutterbuese_Ralf.pdf Lutterbüse, Ralf ddc:570, ddc:500, Fakultät für Biologie

Der Neurotrophinrezeptor p75 wurde als erstes Mitglied der Tumornekrosefaktor-Rezeptor-Superfamilie kloniert. Da die trophischen Eigenschaften der Neurotrophine durch eine zweite Klasse von Rezeptoren, die Trk-Rezeptor-Tyrosinkinasen, vermittelt werden, wurde p75 lange als deren „Corezeptor“ angesehen. Inzwischen gibt es viele Beweise für eine eigen-ständige Signaltransduktion durch p75, die beispielsweise zur Aktivierung von NF-κ B oder zu programmiertem Zelltod führen kann. Zu Beginn dieser Arbeit war weitgehend unbekannt, wie der Neurotrophinrezeptor p75 apoptotische Signale im Inneren der Zelle weiterleitet. Unter Verwendung des Hefe-„Two-Hybrid“- Systems war im Vorfeld das Zinkfingerprotein NRIF1 („Neurotrophin Receptor Interacting Factor“) als potentieller p75-Interaktionspartner identifiziert worden. Die wichtige Rolle dieses Proteins als Vermittler von apoptotischen Signalen konnte später durch gezielte Deletion des nrif1-Gens in der Maus bestätigt werden: In nrif1-Nullmutanten wurde eine Reduktion des embryonalen Zelltodes von Nervenzellen der Netzhaut nachgewiesen, deren Ausmaß dem einer p75- oder ngf („Nerve Growth Factor“)-Deletion entsprach (Casademunt et al., 1999). In der vorliegenden Arbeit wurde ein zweites nrif-Gen (nrif2) kloniert, das zu über 90% mit nrif1 identisch ist. Beide Proteine besitzen typische Strukturmerkmale negativ regulatorisch wirkender Transkriptionsfaktoren. Der carboxyterminale Abschnitt enthält fünf Zinkfinger des Cys2-His2-Typs, die eine Bindung an DNA vermitteln könnten, während der aminoterminale Bereich zwei KRAB-Domänen enthält, die Transkriptionsrepressor-Module darstellen. Das nrif2-Gen wird im 5’-untranslatierten Bereich differentiell gespleißt. Durch Experimente mit rekombinanten Proteinen aus E. coli und Fibroblasten-Zellinien wurde die vermutete Interaktion von NRIF und p75 biochemisch nachgewiesen. Die Ver-wendung unterschiedlicher Deletionskonstrukte zeigte, daß für die Wechselwirkung nur die Juxtamembran-Domäne des Rezeptors und ein carboxyterminaler Abschnitt von NRIF (stromaufwärts der Zinkfinger) nötig sind. NRIF-Proteine können unter Bildung von Homo- und Heterodimeren mit sich selbst interagieren. Die Colokalisierung von NRIF1 und NRIF2 bzw. NRIF und p75 nach transienter Transfektion von Fibroblasten-Zellinien bestätigte die biochemisch nachgewiesenen Interaktionen auch in vivo. Die Expression von NRIF in Zellinien neuronalen Ursprungs offenbarte eine mögliche Funktion als Auslöser von Apoptose, welche unabhängig von p75 allein durch Über-expression dieser Zinkfingerproteine verursacht wurde. Außerdem war in NRIF-überexprimierenden Zellen der Einbau von BrdU, einem Thymidin-Analogon, das Zellen in der S-Phase des Zellzyklus markiert, stark eingeschränkt. Diese Funktionen von NRIF sindbesonders interessant, da in den letzten zwei Jahren weitere Adaptermoleküle des Neuro-trophinrezeptors p75 identifiziert wurden, die einen Einfluß auf Apoptose und/oder den Ablauf des Zellzyklus besitzen. p75 spielt insbesondere während des programmierten Zelltodes in der Entwicklung des Nervensystems eine wichtige Rolle und wird im Embryonalstadium am stärksten exprimiert. Die Analyse der mRNA-Expression von nrif bestätigte, daß auch nrif1 und nrif2 während der Embryonalentwicklung deutlich höher exprimiert sind als in adulten Mäusen. Nrif-mRNA wurde jedoch im Gegensatz zu p75-mRNA ubiquitär in allen untersuchten embryonalen Geweben nachgewiesen. In weiterführenden Experimenten wurden transgene Mäusen untersucht, in denen das nrif1-Gen durch homologe Rekombination entfernt worden war. Diese Mäuse sind in einem kongenen Sv129- oder einem gemischten Sv129/BL6-Hintergrund lebensfähig und fertil, sterben jedoch im BL6-Hintergrund ungefähr am zwölften Embryonaltag. Die Hypothese, daß die nrif2-mRNA-Menge in überlebenden Tieren erhöht sein könnte, wurde zuerst in neugebo-renen Sv129-Mäusen durch semiquantitative RT-PCR-Analysen bestätigt. Eine vergleichen-de Untersuchung 10,5 Tage alter Embryonen aus verschiedenen Stämmen deutete auf die Möglichkeit einer funktionellen Kompensation hin: Während in Nullmutanten des Sv129- Stammes die nrif2-mRNA-Konzentration ungefähr doppelt so hoch war wie in Wildtyp-Tieren, konnten BL6-Nullmutanten die nrif2-Menge nicht differentiell regulieren. Das Fehlen von NRIF1 und die gleichzeitige Unfähigkeit einer ausgleichenden Hochregulation von NRIF2 könnten ein wichtiger Grund für die embryonale Letalität der nrif1 (-/-)-Embryonen im BL6- Stamm sein. Eine genau ausgewogene Menge der Zinkfingerproteine NRIF1 und NRIF2 scheint demnach essentiell zu sein, damit wichtige Prozesse wie Zellzyklus und Apoptose ungestört ablaufen können.

Das Leukocyten-spezifische Integrin LFA-1 spielt eine wichtige Rolle bei der Immunantwort, durch die Vermittlung dynamischer Zell-Zell- bzw. Zell-Matrix-Interaktionen. Die kontrollierte Adhäsion bzw. Deadhäsion von Leukocyten bedarf einer spezifischen Regulation des LFA-1-Integrins und die Aufklärung der molekularen Grundlagen dieser Vorgänge ist von großem Interesse. Cytohesin-1 war unmittelbar vor Beginn dieser Arbeit als cytoplasmatischer Regulationsfaktor der durch LFA-1 vermittelten Zelladhäsion identifiziert worden und seine spezifische Interaktion mit der cytoplasmatischen Domäne von CD18 konnte in vitro dokumentiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit gelang es zunächst, die Assoziation von Cytohesin-1 und LFA-1 auch endogen, im intakten Zellverband, mittels Kolokalisationsstudien in der lymphoblastoiden B-Zellinie LCL-721, zu demonstrieren. Ferner konnte mit Hilfe von Mutationsanalysen die, für die Interaktion kritische Region in der cytoplasmatischen Domäne von CD18 lokalisiert werden. Sie befindet sich im aminoterminalen Bereich und umfaßt die Aminosäuren WKA(723 - 725). Die Mutation dieser Aminosäurereste nach TRG resultierte in einem vollständigen Interaktionsverlust mit Cytohesin-1. Die Inhibition der Cytohesin-1/CD18-Bindung konnte dabei sowohl durch Protein-Protein-Interaktionsanalysen in Hefe als auch durch biochemische Bindungsstudien in vitro dokumentiert werden, wobei jeweils Fusionsproteine der cytoplasmatischen Domäne von CD18 charakterisiert wurden. Funktionale Analysen der WKA(723-725)-Region von CD18 ergaben, daß die Mutation von WKA(723-725) nach TRG im intakten LFA-1-Molekül eine signifikante Reduktion der Integrin- Aktivität zur Folge hatte. Sowohl T-Zellklone als auch nicht hämatopoetische Zellen, wie HeLa, wiesen nach Expression von LFA-1(TRG), mit Hilfe rekombinanter Vaccinia- Viren, eine stark reduzierte Adhäsionsfähigkeit an immobilisiertes ICAM-1 auf. Ferner ergaben funktionale Studien mit HeLa-Zellen, die LFA-1 stabil exprimierten, daß Cytohesin-1 nur dann eine gesteigerte Adhäsion dieser Zellen an ICAM-1 induzierte, wenn sie Wildtyp-LFA-1 exprimierten. HeLa-Zellen, die LFA-1(TRG) exprimierten, ließen sich durch Cytohesin-1 zu keiner verstärkten Adhäsion aktivieren. Diese Ergebnisse demonstrierten die Bedeutsamkeit der Cytohesin-1/CD18-Interaktion für eine effiziente, durch LFA-1 vermittelte Zelladhäsion. Unklar war jedoch der Mechanismus, durch den Cytohesin-1 die Integrin/Liganden-Bindung regulierte. Studien mit dem Reporterantikörper 24 ließen darauf schließen, daß Cytohesin-1 durch die Bindung an CD18 eine Konformationsänderung in der extrazellulären Domäne des LFA-1-Integrins induzieren konnte, die möglicherweise die Affinität des Rezeptors modulierte. Diese Modulation der LFA-1-Konformation schien jedoch nicht hinreichend für eine stabile Bindung an ICAM-1 zu sein, wie eingehendere Analysen von Dr. W. Kolanus zeigten. Vielmehr erforderte eine effiziente Zelladhäsion zusätzlich die Guaninnukleotid-Austauschfunktion (GEF-Funktion) von Cytohesin-1, da die GEF-defekte Punktmutante, Cytohesin-1(E157K), nicht mehr in der Lage war, die Adhäsion von Jurkat E6-Zellen an ICAM-1 stabil zu induzieren. Biochemische Interaktionsstudien konnten dabei zeigen, daß die Mutante weiterhin fähig war, die cytoplasmatische Domäne von CD18 zu binden. Diese und weitere Ergebnisse von Dr. W. Nagel, die einen Zusammenhang zwischen der GEF-Funktion von Cytohesin-1 und dem „Spreading“ von adhärenten Jurkat E6-Zellen aufzeigten, legen die Vermutung nahe, daß Cytohesin-1 durch einen dualen Mechanismus in die LFA-1-Regulation involviert ist. Sowohl die direkte Interaktion von Cytohesin-1 und dem Integrin als auch seine GEF-Funktion stellen essentielle Faktoren für eine stabile Zelladhäsion, die durch LFA-1 vermittelt wird, dar. Welche funktionalen Mechanismen dabei durch den Guaninnukleotid-Austausch und der damit verbundenen Aktivierung einer GTPase induziert werden, ist noch unklar. Primär wäre eine Modulation des Aktin-Cytoskelettes und eine damit verbundene erhöhte laterale Mobilität der Integrine denkbar, die eine verstärkte Rezeptormultimerisierung und dadurch eine Aviditätsänderung des Integrins ermöglicht. Weitere Studien dieser Arbeit analysierten die Regulation von Cytohesin-1 selbst. Es konnte gezeigt werden, daß PI3-Kinase in die Kontrolle der Cytohesin-1-Funktion involviert war. Die Überexpression einer konstitutiv aktiven Form dieser Kinase (P110*) führte zu einer gesteigerten Adhäsion von Jurkat E6-Zellen an ICAM-1. Eine Inkubation dieser Zellen mit dem PI3-Kinase-spezifischen Inhibitor Wortmannin resultierte dagegen in einer signifikanten Reduktion der Zelladhäsion. Weitere funktionale Analysen, die die Zelladhäsion von Jurkat E6-Zellen nach Koexpression von P110* und der PH-Domäne von Cytohesin-1 untersuchten, sowie eingehendere Studien von Dr. W. Nagel, ermöglichten die Entwicklung eines Modells zur Regulation von Cytohesin- 1. Demzufolge führt die Aktivierung der PI3-Kinase zu einer verstärkten Rekrutierung von Cytohesin-1 an die Plasmamembran. Als Rekrutierungsmodul fungiert dabei die PHDomäne, die durch Bindung von PtdIns(3,4,5)P3, einem Produkt der PI3-Kinase, die Assoziation mit der Membran gewährleistet. Die Rekrutierung von Cytohesin-1 an die Plasmamembran führt zur Aktivierung von LFA-1 und der damit verbundenen stabilen Zelladhäsion an ICAM-1.