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Gallensäuren stellen potente Signalmoleküle dar, die schon in geringen mikromolaren Konzentrationen, wie sie beim Menschen im Serum beobachtet werden, zentrale Leberzellfunktionen auf transkriptioneller und posttranskriptioneller Ebene beeinflussen. Die hydrophoben und potentiell toxischen Gallensäuren Lithocholsäure (LCA) und Chenodeoxycholsäure (CDCA) induzieren Apoptose und Cholestase, während hydrophile Gallensäuren hepatoprotektiv wirken können. Unter ihnen ist die antiapoptotisch und anticholestatisch wirksame Ursodeoxycholsäure (UDCA) von besonderer Bedeutung. UDCA stellt derzeit das einzige wirksame Therapeutikum bei chronischen cholestatischen Leberkrankheiten dar. Die vorliegende Arbeit untersuchte die Bedeutung intrazellulärer Signaltransduktionswege für die choleretischen, (anti-)cholestatischen und (anti-)apoptotischen Wirkungen physiologischer Gallensäuren in verschiedenen experimentellen Modellen. Hauptziel der Arbeit war die genauere Charakterisierung (i) der für den klinisch bedeutenden anticholestatischen Effekt des Taurinkonjugats der Ursodeoxycholsäure (TUDCA) verantwortlichen Signaltransduktionswege, und (ii) der zentralen Stellung von PI3-Kinasen in der intrazellulären Signalvermittlung der biologischen Effekte hydrophiler und hydrophober Gallensäuren. Im Modell der isoliert perfundierten Rattenleber untersuchten wir die anticholestatische und hepatoprotektive Wirkung der TUDCA in der intakten Leber unter Einsatz pharmakologischer Enzyminhibitoren. Als Leberfunktionsparameter dienten quantitativer Gallenfluß, Sekretion des Modellsubstrats der Konjugatexportpumpe Mrp2, GS-DNP, in die Galle und als Marker der Leberzellschädigung die hepatovenöse LDH-Freisetzung. Simultane Hemmung der cPKCa und der PKA, nicht aber Hemmung von cPKCa oder PKA allein antagonisierte bei Taurolithocholsäure (TLCA)-induzierter Cholestase die protektive Wirkung der TUDCA. Gallenfluß und GS-DNP-Sekretion waren unter gleichzeitiger Hemmung beider Signalwege signifikant reduziert, wohingegen die LDH-Freisetzung deutlich erhöht war. Die Ergebnisse zeigen, dass der posttranskriptionell vermittelte anticholestatische Effekt der TUDCA im etablierten Modell TLCA-induzierter Cholestase durch einen kooperativen cPKC- und PKA-abhängigen Signalweg vermittelt wird. Mitogenaktivierte Proteinkinasen Erk1/2- und p38-abhängige Signalwege hingegen, die als Vermittler von TUDCA-induzierter Cholerese unter nicht-cholestatischen Bedingungen beschrieben wurden, waren im untersuchten Modell ohne Bedeutung für die anticholestatische Wirkung der TUDCA. Mit Hilfe der neu etablierten Biotinylierung von Membranproteinen konnten wir in Ntcp-transfizierten humanen Hepatomzellen (HepG2-Ntcp) zeigen, dass TUDCA unter Cholestase die Insertion von MRP2 in die Hepatozytenmembran anregt. Dieser für die klinische Wirksamkeit der (T)UDCA potentiell bedeutende und im Tiermodell von uns vorbeschriebene Wirkmechanismus konnte damit erstmals in einem humanen Modell nachvollzogen werden. Ein weiterer in vitro Ansatz untersuchte die Phosphorylierung von aus HepG2-Ntcp immunopräzipitiertem MRP2 durch die als Gallensäureneffektoren diskutierten Proteinkinasen cPKCa, nPKCe und PKA. Alle drei Proteinkinasen phosphorylierten, durch den PKC/PKA-Inhibitor Staurosporin hemmbar, MRP2. Diese Phosphorylierung könnte, wie für die Gallensäurentransporter BSEP und NTCP bereits gezeigt, Einfluss auf Aktivität und Membraninsertion von MRP2 haben. Der funktionellen Bedeutung der PI3-Kinasen, welchen in den bisher entschlüsselten Signalwegen sowohl hydrophober/toxischer wie auch hydrophiler/protektiver Gallensäuren eine zentrale Rolle zugesprochen worden war („PI3-Kinasen-Paradoxon“), galten unsere in vitro Untersuchungen zur Aktivität der Isoformen der Klasse I PI3-Kinasen p110a, p110b und p110g nach Stimulation von primären Rattenhepatozyten mit TLCA, GCDCA, TCA und TUDCA in einem neu etablierten isoformspezifischen Kinaseassay. Dabei zeigte sich für jede Gallensäure ein für sie spezifisches Aktivierungsmuster unterschiedlicher PI3-Kinase-Isoformen. PI3-Kinase p110g wurde dabei spezifisch durch die cholestatisch und apoptotisch wirkenden Gallensäuren TLCA und GCDCA aktiviert. In HepG2-Ntcp-Zellen untersuchten wir daher die Bedeutung von p110g für Gallensäuren-induzierte Apoptose nach deren pharmakologischer Hemmung bzw. nach Transfektion mit siRNA gegen p110g. Die apoptotische Wirkung u.a. der Gallensäuren TLCA und GCDCA war unter beiden Methoden der p110g-Antagonisierung deutlich reduziert, wie sowohl in einem Caspase3/7-Assay als auch morphologisch evaluiert. Gallensäuren-unabhängige Apoptose, durch Etoposid bzw. TNFa ausgelöst, war p110g-unabhänig. Die Bedeutung der Aktivierung der PI3-Kinase-Isoform p110a durch TUDCA ist durch weitere experimentelle Untersuchungen zu klären. Die Erkenntnisse der vorliegenden Arbeit tragen zum Verständnis der komplexen Signalgebung im Rahmen cholestatischer Leberschädigung und der therapeutischen Wirkung der (T)UDCA bei und sind damit für die Entwicklung neuer Therapiestrategien bei cholestatischen Leberkrankheiten potentiell von Bedeutung.

Hydrophobe Gallensäuren werden für die Leberzellschädigung bei cholestatischen Lebererkrankungen verantwortlich gemacht. Sie induzieren nach Aufnahme in Hepatozyten Apoptose. Ziel der vorliegenden Arbeit war, die Effekte der quantitativ wichtigsten hydrophoben Gallensäure des Menschen, Glycochenodeoxycholsäure (GCDCA), auf molekulare Signaltransduktionswege, die Apoptose induzieren oder hemmen, und die Modulation der Transkription von Genen, die für pro- und antiapoptotische Proteine kodieren, weiter aufzuklären. Die Untersuchungen wurden am Modell der humanen Hepatomzelllinie HepG2, die stabil mit dem Gallensäurentransporter Ntcp transfiziert wurde, durchgeführt.

Hydrophobe Gallensäuren führen in der cholestatischen Leber zu Zellschädigung und Apoptose. Die vorliegende Arbeit hat zum Ziel, weiteren Einblick in die Mechanismen der durch die quantitativ bedeutendste hydrophobe Gallensäure des Menschen, Chenodeoxycholsäure, induzierten Leberzellschädigung und deren Antagonisierung durch endogene und exogene Stimuli zu verschaffen und somit mögliche Ansatzpunkte neuer Therapiestrategien chronischer cholestatischer Leberkrankheiten aufzuzeigen. Die Ergebnisse zeigen, dass das Taurin- und das Glycin-Konjugat der CDCA in der intakten Leber unterschiedliche Toxizität aufweisen. Diese Beobachtung ist zumindest teilweise über eine unterschiedliche Rolle der PI3-Kinasen in der Signalgebung der beiden Gallensäuren zu erklären. Während TCDCA simultan PI3-Kinasen-abhängige Überlebenssignale zu aktivieren scheint, die ihre schädigende Wirkung antagonisieren, scheint GCDCA die Lipidkinasen an der Vermittlung seiner starken Toxizität über bislang noch unbekannte Mechanismen zu beteiligen. Die Ergebnisse des zweiten Teils der Arbeit zeigen, dass Sulfasalazin in vitro und in der intakten Leber GCDCA-induzierte Apoptose potent hemmen kann. Mögliche Wirkmechanismen dabei sind eine partielle Reduktion der Gallensäurenaufnahme und vor allem die Aktivierung intrazellulärer Überlebenssignale, die u.a. über den Transkriptionsfaktor NF-kB vermittelt werden könnten. Die neuartigen Beobachtungen der vorliegenden Arbeit könnten zum Verständnis der komplexen Signalgebung im Rahmen cholestatischer Leberschädigung und seiner Antagonisierung beitragen und sind somit von potentieller Bedeutung für die Entwicklung zukünftiger Therapiestrategien bei cholestatischen Leberkrankheiten.