Podcasts about rattenleber

Thu, 16 Oct 2014 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/17694/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/17694/1/Hartmann_Anna_Christina.pdf Hartmann, Anna Christina

Thu, 2 Oct 2014 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/17584/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/17584/1/Gmelin_Leonore_Friederike.pdf Gmelin, Leonore Friederike

Die hyperakute Abstossung stellt die unmittelbarste Hürde für die Leber-Xenotransplantation dar. Das Ziel dieser Arbeit war es die Bedeutung verschiedener Zellpopulationen für die Bildung von freien Radikalen während der hyperakuten Abstossung der xenotransplantierten Leber zu untersuchen. Wir befassten uns mit der Frage ob es einen Zusammenhang zwischen der FR-Freisetzung und der hyperakuten Abstossung gibt und welche Zellpopulationen hauptverantwortlich für den oxidativen Schaden während der hyperakuten Abstossung sind. In einem etablierten Xenoperfusions-System wurden Rattenlebern mit Perfusaten bestehend aus gezielt-isolierten Zellgruppen reperfundiert. Hierbei evaluierten wir ein Leukozytenfiltersystem und wendeten zur Thrombozytengewinnung ein validiertes Separations/Zentrifugationsprotokoll an. Sowohl die physiologische Zusammensetzung der Perfusate, als auch die physiologische Funktion der Zellen konnten durch Coulter Counter, P-Selektin Flowzytometrie und histologische Untersuchungen gewährleistet werden. Zur Erfassung der FR-Produktion, wurden die Lipidperoxidation, NO Abbauprodukte anhand der Griess–Reaktion, Peroxynitrikonzentration und der antioxidative Status mittels Glutathionkonzentration analysiert. Durch die Verwendung dieser Messmethoden, ließen sich freie Radikale nicht direkt messen und mögliche Zwischenprodukte oder Reaktionsschritte nicht vollständig erfassen, aber die Bestimmung derer stabilen Endprodukte bot uns die Möglichkeit auch ohne Hinzufügen von Chemikalien in das Perfusionssystem ein umfassendes Bild des oxidativen Stresses zu erfassen. Die Organfunktion wurde mittels der Galleproduktion und der Freisetzung von Leberenzyme kontrolliert. Der Potaldruck war ein wichtiger Messparameter für die Makrohämodynamik. Nach Ende der Perfusion wurden Gewebeproben zur histologischen Aufarbeitung mit der HE-, Esterase- und Komplementfärbung zum Nachweis der hyperakuten Abstossungsreaktion entnommen. Folgende Ergebnisse konnten wir zusammenfassend aus unseren Daten gewinnen: In unserem Modell der perfundierten Rattenleber gab es einen signifikanten Unterschied bezüglich der Freisetzung von ROS/RNS zwischen der isogenen und xenogenen Reperfusion mit Vollblut. In den xenogen perfundierten Gruppen hatten wir trotz Zeichen einer Komplementaktivierung, d.h. einer hyperakuten Abstossung, in den Versuchsgruppen mit geringen FR-Konzentrationen eine Reduktion der Leberschäden beobachtet. Wir konnten daraus folgern, die ROS-Bildung im engen Zusammenhang mit der Leberfunktion, dem Zellschaden und der hyperakuten Abstoßungsreaktion stand. Wir konnten in unserem Modell nun erstmals zeigen, dass die Aktivierung des Komplementsystems nur bei gleichzeitiger Anwesenheit von Leukozyten zur Freisetzung von radikalen Stickstoff- und Sauerstoffspezies führt, die dann wiederum die Schädigung des Gewebes und die Dysfunktion des Transplantates verursachen. Es gab signifikante Unterschiede zwischen den untersuchten Zellpopulationen hinsichtlich der Freisetzung von FR in unserem Xenotransplantations-Modell. Unsere Daten weisen darauf hin, dass in der Frühphase der hyperakuten Abstossung weder Erythrozyten noch Thrombozyten oder Hepatozyten eine große Rolle in der Freisetzung von FR spielen. Es ließen sich in den Erythrozyten-und Thrombozytengruppen keine signifikanten Unterschiede zur isogen perfundierten Kontrollgruppe finden. Hauptsächlich für den oxidativen Schaden - also Freisetzung von ROS und RNS - verantwortlich waren in unserem Modell die Leukozyten und in einem geringeren Maße die Kupfferzellen, aber nur in Kombination mit den Leukozyten. Die Leukozytendepletion durch die Filtration wirkte am protektivsten auf die Organfunktion, wogegen die Depletion von KC, nur die ROS-Freisetzung reduzierte, aber keinen protektiven Einfluss auf den Grad der hyperakute Abstossung und Organschädigung hatte. Die Anwesenheit von KC dagegen scheinen NO abzufangen und wirken bezüglich RNS protektiv. Unsere Daten tragen zu dem Verständnis der frühen Vorgänge und insbesondere der Rolle der Freien Radikale während der hyperakuten Abstossung in der Xenotransplantation der Leber bei. Eine Inhibierung oder Modulation der ROS-Freisetzung könnte eine viel versprechende Basis für einen therapeutischen Ansatz der hyperakuten Abstossung darstellen. Inwieweit eine gezielte pharmakologische Hemmung der Leukozytenaktivität und der Einsatz von FR spezifischen Scavengern zu einer Verminderung der hyperakuten Abstoßung von Xenotransplantaten bewirken können, bleibt Inhalt künftiger Untersuchungen.

Gallensäuren stellen potente Signalmoleküle dar, die schon in geringen mikromolaren Konzentrationen, wie sie beim Menschen im Serum beobachtet werden, zentrale Leberzellfunktionen auf transkriptioneller und posttranskriptioneller Ebene beeinflussen. Die hydrophoben und potentiell toxischen Gallensäuren Lithocholsäure (LCA) und Chenodeoxycholsäure (CDCA) induzieren Apoptose und Cholestase, während hydrophile Gallensäuren hepatoprotektiv wirken können. Unter ihnen ist die antiapoptotisch und anticholestatisch wirksame Ursodeoxycholsäure (UDCA) von besonderer Bedeutung. UDCA stellt derzeit das einzige wirksame Therapeutikum bei chronischen cholestatischen Leberkrankheiten dar. Die vorliegende Arbeit untersuchte die Bedeutung intrazellulärer Signaltransduktionswege für die choleretischen, (anti-)cholestatischen und (anti-)apoptotischen Wirkungen physiologischer Gallensäuren in verschiedenen experimentellen Modellen. Hauptziel der Arbeit war die genauere Charakterisierung (i) der für den klinisch bedeutenden anticholestatischen Effekt des Taurinkonjugats der Ursodeoxycholsäure (TUDCA) verantwortlichen Signaltransduktionswege, und (ii) der zentralen Stellung von PI3-Kinasen in der intrazellulären Signalvermittlung der biologischen Effekte hydrophiler und hydrophober Gallensäuren. Im Modell der isoliert perfundierten Rattenleber untersuchten wir die anticholestatische und hepatoprotektive Wirkung der TUDCA in der intakten Leber unter Einsatz pharmakologischer Enzyminhibitoren. Als Leberfunktionsparameter dienten quantitativer Gallenfluß, Sekretion des Modellsubstrats der Konjugatexportpumpe Mrp2, GS-DNP, in die Galle und als Marker der Leberzellschädigung die hepatovenöse LDH-Freisetzung. Simultane Hemmung der cPKCa und der PKA, nicht aber Hemmung von cPKCa oder PKA allein antagonisierte bei Taurolithocholsäure (TLCA)-induzierter Cholestase die protektive Wirkung der TUDCA. Gallenfluß und GS-DNP-Sekretion waren unter gleichzeitiger Hemmung beider Signalwege signifikant reduziert, wohingegen die LDH-Freisetzung deutlich erhöht war. Die Ergebnisse zeigen, dass der posttranskriptionell vermittelte anticholestatische Effekt der TUDCA im etablierten Modell TLCA-induzierter Cholestase durch einen kooperativen cPKC- und PKA-abhängigen Signalweg vermittelt wird. Mitogenaktivierte Proteinkinasen Erk1/2- und p38-abhängige Signalwege hingegen, die als Vermittler von TUDCA-induzierter Cholerese unter nicht-cholestatischen Bedingungen beschrieben wurden, waren im untersuchten Modell ohne Bedeutung für die anticholestatische Wirkung der TUDCA. Mit Hilfe der neu etablierten Biotinylierung von Membranproteinen konnten wir in Ntcp-transfizierten humanen Hepatomzellen (HepG2-Ntcp) zeigen, dass TUDCA unter Cholestase die Insertion von MRP2 in die Hepatozytenmembran anregt. Dieser für die klinische Wirksamkeit der (T)UDCA potentiell bedeutende und im Tiermodell von uns vorbeschriebene Wirkmechanismus konnte damit erstmals in einem humanen Modell nachvollzogen werden. Ein weiterer in vitro Ansatz untersuchte die Phosphorylierung von aus HepG2-Ntcp immunopräzipitiertem MRP2 durch die als Gallensäureneffektoren diskutierten Proteinkinasen cPKCa, nPKCe und PKA. Alle drei Proteinkinasen phosphorylierten, durch den PKC/PKA-Inhibitor Staurosporin hemmbar, MRP2. Diese Phosphorylierung könnte, wie für die Gallensäurentransporter BSEP und NTCP bereits gezeigt, Einfluss auf Aktivität und Membraninsertion von MRP2 haben. Der funktionellen Bedeutung der PI3-Kinasen, welchen in den bisher entschlüsselten Signalwegen sowohl hydrophober/toxischer wie auch hydrophiler/protektiver Gallensäuren eine zentrale Rolle zugesprochen worden war („PI3-Kinasen-Paradoxon“), galten unsere in vitro Untersuchungen zur Aktivität der Isoformen der Klasse I PI3-Kinasen p110a, p110b und p110g nach Stimulation von primären Rattenhepatozyten mit TLCA, GCDCA, TCA und TUDCA in einem neu etablierten isoformspezifischen Kinaseassay. Dabei zeigte sich für jede Gallensäure ein für sie spezifisches Aktivierungsmuster unterschiedlicher PI3-Kinase-Isoformen. PI3-Kinase p110g wurde dabei spezifisch durch die cholestatisch und apoptotisch wirkenden Gallensäuren TLCA und GCDCA aktiviert. In HepG2-Ntcp-Zellen untersuchten wir daher die Bedeutung von p110g für Gallensäuren-induzierte Apoptose nach deren pharmakologischer Hemmung bzw. nach Transfektion mit siRNA gegen p110g. Die apoptotische Wirkung u.a. der Gallensäuren TLCA und GCDCA war unter beiden Methoden der p110g-Antagonisierung deutlich reduziert, wie sowohl in einem Caspase3/7-Assay als auch morphologisch evaluiert. Gallensäuren-unabhängige Apoptose, durch Etoposid bzw. TNFa ausgelöst, war p110g-unabhänig. Die Bedeutung der Aktivierung der PI3-Kinase-Isoform p110a durch TUDCA ist durch weitere experimentelle Untersuchungen zu klären. Die Erkenntnisse der vorliegenden Arbeit tragen zum Verständnis der komplexen Signalgebung im Rahmen cholestatischer Leberschädigung und der therapeutischen Wirkung der (T)UDCA bei und sind damit für die Entwicklung neuer Therapiestrategien bei cholestatischen Leberkrankheiten potentiell von Bedeutung.

Basierend auf den Ergebnissen klinischer Studien müssen bakterielle Infektionen als Trigger akuter Ösophagusvarizenblutungen bei Patienten mit Leberzirrhose angenommen werden. Hierfür werden Permeabilitätsstörungen der Darmwand als Folge der portalen Hypertonie verantwortlich gemacht, die eine Einschwemmung pathogener Darmkeime in die portale Zirkulation begünstigen. Kupffer'sche Sternzellen (KS), die residenten Makrophagen der Leber, kommen nicht nur als größte sondern auch als erste Makrophagenpopulation des menschlichen Körpers mit pathogenen Darmbakterien in Kontakt. Durch bakterielle Bestandteile wie Endotoxine oder die in der Zellwand von Bakterien und Pilzen verankerten β-Glucane, werden KS aktiviert und produzieren in der Folge verschiedene Vasokonstriktoren, die den portalen Druck massiv erhöhen. Die von aktivierten KS gebildeten Vasokonstriktoren sind deshalb als potenzielle Mediatoren einer Infekt- getriggerten Varizenblutung anzusehen. Von großem klinischen Interesse ist deshalb die Identifizierung der verantwortlichen Vasokonstriktoren als Basis für die Entwicklung pharmakologischer Strategien zur Prävention Infekt- getriggerter Varizenblutungen. Bislang konnte die Beteiligung des Cyclooxygenase- Weges und insbesondere die Bildung von Thromboxan A2 (TXA2) an der portalen Druckerhöhung durch aktivierte KS nachgewiesen werden. Allerdings konnte im Tierexperiment durch den Einsatz von Cyclooxygenase- Inhibitoren und TXA2 -Antagonisten der portale Druckanstieg nach KS Aktivierung nur um 50% reduziert werden, weshalb die Beteiligung weiterer Vasokonstriktoren angenommen werden muss. Die Identifizierung der bislang unbekannten Vasokonstriktoren als wesentliches Ziel der vorliegenden Arbeit erscheint nicht zuletzt auch deshalb von besonderem klinischen Interesse, da sich eine pharmakologische Hemmung der bislang identifizierten Cyclooxygenase- bzw. TXA2- abhängigen Wege der Vasokonstriktion bei Patienten mit Leberzirrhose wegen der Gefahr schwerwiegender Nebenwirkungen verbietet. In der vorliegenden Arbeit sollte deshalb die Rolle vasokonstriktorischer Cysteinyl-Leukotriene (Cys-LT) bei der portalen Druckerhöhung durch aktivierte KS untersucht werden. Die Experimente wurden am Modell der isoliert perfundierten Rattenleber durchgeführt. Zusammenfassend führen die Ergebnisse zu einem neuen Konzept der portalen Hypertension durch β-Glucane unter Beteiligung aktivierter KS, TXA2 und Cys-LT. Ferner zeigen diese Ergebnisse erstmals eine bislang nicht beschriebene Vernetzung von Prostaglandin- und Cys-LT- Signalwegen unter der Kontrolle von TXA2- und Cys-LT1-Rezeptoren. Für die portale Druckerhöhung nach KS-Aktivierung muss ein durch TXA2 mediierter Mechanismus der Cys-LT –Bildung mit nachfolgender CysLT1–Rezeptorstimulation angenommen werden. 5-Lipoxygenase- Inhibitoren wie MK 886, die die Synthese von Prostanoiden nicht beeinflussen, sind dabei als besonders aussichtsreiche Kandidaten zur pharmakologischen Prävention der Infekt- getriggerten portalen Hypertension zu erachten.

Seit Beginn der 1990er Jahre sind protektive Wirkungen von Tacrolimus auf Ischämie-Reperfusionsschäden der Leber bekannt. Die in bisherigen experimentellen Arbeiten beschriebene Spenderpräkonditionierung erscheint jedoch wegen potenzieller Nebenwirkungen klinisch nicht umsetzbar. Eine amerikanische Arbeitsgruppe konnte dabei in einer klinischen Pilot-Studie zeigen, dass die Spülung humaner Lebern mit Tacrolimus (20ng/ml) vor Implantation zu einer signifikanten Reduktion von Ischämie-Reperfusionsschäden nach Lebertransplantation führte. Unsere Arbeitsgruppe hat umfangreiche Untersuchungen mit Glutathion als Therapeutikum von Ischämie-Reperfusionsschäden nach warmer und kalter Ischämie durchgeführt. Gleichzeitig scheint, dass intrazelluläres Glutathion bei Anwesenheit hoher Konzentrationen von ROS über die Induktion von Radikalkettenreaktionen beziehungsweise die Thiolierung anderer Proteine selbst als Mediator von Ischämie-Reperfusionsschäden fungieren kann. In Vorarbeiten untersuchten wir die Wirkung von Tacrolimus im isoliert-perfundierten Modell der Rattenleber. Die Vorbehandlung mit Tacrolimus bewirkte bei Zufuhr von H2O2 eine Verringerung des ROS-induzierten zellulären Schadens, ausgedrückt in einer dosisabhängigen, signifikanten Verringerung des LDH-Efflux. Als Ursache hierfür wird eine verminderte intrazelluläre Akkumulation von zytotoxischem GSSG diskutiert, das nach Tacrolimus-Gabe vermehrt in Galle und Blut freigesetzt wurde, während die Aktivität der an Bildung und Abbau von GSH/GSSG beteiligten Enzyme Katalase, GSH-Peroxidase und GSSG-Reduktase unverändert war. Dieser Effekt konnte durch Gabe des p38 MAPK Inhibitors SB203580 imitiert werden. Wir übertrugen daraufhin das Konzept der Tacrolimus-Rinse in das Modell der arterialisierten, orthotopen Lebertransplantation an der Ratte. Die Spülung der Leber (20ml) mit Tacrolimus unmittelbar vor Implantation in den Empfängerorganismus führte zu einer signifikanten Reduktion des Ischämie-Reperfusionsschadens, gemessen in Transaminasen, LDH sowie Gallefluss. Das höchste Ausmass an Zytoprotektion wurde durch eine Tacrolimus-Konzentration von 10 ng/ml erreicht, wobei die protektive Wirkung der Tacrolimus-Rinse in der 10 ng-Gruppe stärker ausgeprägt war als in der 50 ng-Gruppe. Die Ursachen für diese inverse Dosis-Wirkungsbeziehung sind unklar, zumal keine statistische Signifikanz zwischen den beiden Gruppen besteht. Außerdem fehlen bislang systematische Untersuchungen zur optimalen Tacrolimus-Dosis in dieser Versuchsanordnung. Als Wirkmechanismus der Tacrolimus-Rinse postulieren wir - aufbauend auf Voruntersuchungen im isoliert perfundierten Modell und den erhobenen in-vivo-Daten - Veränderungen der zellulären Glutathionhomöostase: Hepatozyten setzten im Modell der Lebertransplantation nach Tacrolimus-Rinse vermehrt zytotoxisches GSSG in Blut und Galle frei, wodurch ROS-vermittelte Zellschäden während der Reperfusion minimiert werden. Zusammenfassend kann aufgrund der bisherigen Untersuchungen gezeigt werden, dass die Tacrolimus-Rinse eine neue und klinisch praktikable Therapieoption von Ischämie-Reperfusionsschäden der Leber darstellen könnte.

Störungen in der Mikrozirkulation werden als Ursprung für die Organdysfunktion und letztlich für die Abstoßung von xenogenen Transplantaten angesehen. Nach Evaluierung eines eigens zu diesem Zweck entwickelten Perfusionssystems gelang es, die Mikrozirkulation der Rattenleber ex vivo mittels Intravital-Fluoreszenz-Mikroskopie (IVM) zu beobachten. Um den Einfluss des Gerinnungssystems auf die Mikrozirkulationsstörungen zu untersuchen, wurden die Rattenlebern mit Ratten- (isogen) oder Humanblut (xenogen) perfundiert, die jeweils mit GPI 562, einem GP IIb/IIIa-Antagonist, oder Hirudin behandelt wurden, quantifiziert werden16. Hierdurch konnte nachgewiesen werden, dass für die Mikrozikulationsstörungen der Leber, die nach Hemmung des Gerinnungssystems fortbestehen, die Akkumulation von Leukozyten, als auch die Aggregation von Thrombozyten verantwortlich sind.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde an Hand dreier verschiedener Ansätze, die Bedeutung von HSP70 für die Stressreaktion der Bauchspeicheldrüse und den Schweregrad bei der akuten experimentellen Pankreatitis untersucht. Im Zentrum stand dabei die Frage, ob durch die verschiedenen gewählten Präkonditionierungsmodelle HSP70 induziert werden kann und welche Auswirkungen HSP70 auf die pankreatitisspezifischen Parameter, insbesondere der frühzeitigen intrazellulären Trypsinaktivierung hat. Von besonderem Interesse war zudem die hormonelle Präkonditionierung mit dem Atrial Natriuretischen Peptid zur Prävention vor einer Caerulein-induzierten Pankreatitis durch Induktion von HSP70. Weiterhin wurde die Bedeutung der Hyperthermie-Präkonditionierung an isolierten Azinuszellen eingehend studiert und schließlich durch die Generierung einer transgenen Maus versucht, die genaue Funktion von HSP70 bei der akuten experimentellen Pankreatitis aufzudecken. Am Modell frisch isolierter Azinuszellen wurde untersucht, ob und in welchem Ausmaß es durch eine Hyperthermie Präkonditionierung zu Veränderungen in der azinären Antwort auf eine CCK- Hyperstimulation kommt. Die Hyperthermie führt sowohl im Pankreas als auch in Azinuszellen zu einer verstärkten Expression von Hitzeschockproteinen, insbesondere von HSP70. Die Untersuchung des Effekts der Hyperthermie an isolierten Azinuszellen, die einer Hyperthermie Präkonditionierung unterzogen wurden, stellte sich als ein nicht prakti-kables Modell heraus, da die Zellen durch die vorangegangene Hyperthermie so in ihrer Funktionalität geschädigt waren, dass sie keine Reaktion mehr auf die Stimulation mit ver-schiedenen CCK- Konzentrationen zeigten. Die Kombination einer in vivo Hyperthermiebe-handlung von Ratten mit einem in vitro Modell der experimentellen Pankreatitis an frisch isolierten Azinuszellen, gewonnen aus den vorbehandelten Tieren, zeigte dann eine sehr deut-liche Reduktion der CCK- vermittelten intrazellulären Trypsinaktivierung. Dies spricht dafür, dass die Präkonditionierung und die darausfolgende gesteigerte HSP70 Expression eine Pro-tektion des Pankreas bewirkt und dadurch eine Reduktion der pathophysiologisch für die Ent-stehung der Pankreatitis bedeutsamen frühzeitigen intrazellulären Trypsinaktivierung hervor-ruft. Die hormonelle Präkonditionierung mit ANP hat sich als wirksamer Schutz vor Ischämie- Reperfusionsschäden in der isoliert perfundierten Rattenleber herausgestellt. Untersuchungen haben gezeigt, dass der protektiven Effekt von ANP über einen Anstieg des cGMP- Spiegels, eine Aktivierung des Hitzeschocktranskriptionsfaktors (HSF) und die dadurch hervorgerufene Expression von HSP70 zustande kommt. Pankreas- Azinuszellen weisen ANP- Rezeptoren auf und reagieren auf ANP mit einem Anstieg des cGMP- Spiegel. Deshalb wurde der Effekt der intravenösen ANP- Präkonditionierung untersucht, als mögliche Protektion des Pankreas vor einer Caerulein- induzierten Pankreatitis. Eine Gabe von ANP 20 Minuten vor der Induk-tion einer akuten Pankreatitis erwies sich aber als nicht protektiv. Dagegen konnte 24 h nach einer Präkonditionierung eine Induktion der HSP70 Expression und eine Protektion des Pank-reas vor einer experimentellen Pankreatitis beobachtet werden. Jedoch zeigte sich bei der Kontrollgruppe, die nur mit NaCl vorbehandelt wurde, der gleiche Effekt auf ANP. Dies lässt darauf schließen, dass Stress hervorgerufen durch die Anästhesie und die Katheterisierung der Jugularvene für eine Präkonditionierung und damit für eine Protektion ausreichend ist und damit ANP, im Gegensatz zum Modell des Ischämie-Reperfusionsschadens Leber, nicht für eine Präkonditionierung des Pankreas eingesetzt werden kann. Die Generierung einer transgenen Maus, zum definitiven Beweis des protektiven Potentials von HSP70, führte zwar zu einer Inkorporation des Transgens, aber zu keiner Expression von HSP70 auf Proteineben, so dass hier keine neuen Erkenntnisse gewonnen werden konnten.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden mögliche molekulare Wirkmechanismen pharmakologischer und ischämischer Präkonditionierung zur Prävention des Ischämie-Reperfusionsschadens (IRS) am Modell der Rattenleber untersucht. Im Mittelpunkt stand dabei der Einfluss dieser Therapieansätze auf das Eisenregulierende Protein IRP-1 (Iron regulatory protein-1) und das zytoprotektiv wirkende Eisenspeicherprotein Ferritin sowie auf die Aktivität von Matrix Metalloproteinasen, die vor allem an der Ablösung der sinusoidalen Endothelzellen von der sie umgebenden Matrix beteiligt sind. Außerdem wurde die Rolle von Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH), einem Schlüsselenzym der Glykolyse, beim IRS genauer betrachtet. Hormonelle Präkonditionierung mit dem Atrialen Natriuretischen Peptid (ANP) verringerte die RNA-Bindungsaktivität von IRP-1. Dieser Effekt wird wahrscheinlich über cGMP vermittelt und ist unabhängig von einer Hämoxygenase-1 Induktion. Die Regulation der RNA-Bindungsaktivität erfolgt nicht über eine Veränderung des Phosphorylierungsstatus von IRP-1, sondern wird vermutlich über ROS vermittelt, die möglicherweise von Kupfferzellen gebildet werden. ANP war außerdem in der Lage, die Ferritinexpression zu induzieren. Dies ist wahrscheinlich eine Folge der verminderten IRP-1 Bindungsaktivität und einer daraus resultierenden Erhöhung der Ferritintranslation. Die Aktivität von Matrix Metalloproteinasen wird durch Präkonditionierung mit ANP nicht beeinflusst. Bei den Untersuchungen zu GAPDH wiesen zwei der verwendeten Methoden zur mRNA-Quantifizierung auf eine Reduktion der GAPDH mRNA-Expression durch ANP hin und lassen eine neuartige Rolle von GAPDH beim IRS vermuten, z.B. eine Beteiligung an der Auslösung von Apoptose. Da die Reduktion der GAPDH mRNA-Menge sich in einer Größenordnung von ca. 40% bewegte und es bisher keine Methode der mRNA-Quantifizierung gibt, die diese relativ geringen Unterschiede zuverlässig und reproduzierbar detektieren kann, konnten wir aufgrund methodischer Grenzen keine eindeutige Aussage bezüglich einer Reduktion der GAPDH mRNA-Expression durch ANP treffen. Die GAPDH Proteinmenge blieb unverändert. Präkonditionierung mit α-Liponsäure führte ebenfalls zu einer Reduktion der IRP-1 Bindungsaktivität. Folglich liegt IRP-1 wahrscheinlich überwiegend als zytosolische Aconitase vor und könnte aufgrund der hohen Homologie zur mitochondrialen Aconitase an einer vermehrten Umsetzung von Citrat im Citratzyklus beteiligt sein. Dies ist vermutlich ein Hinweis darauf, wie α-Liponsäure den ATP-Gehalt in den Zellen erhöhen und so die Energiebereitstellung in der Leber verbessern kann. Auf die Ferritinexpression hatte die Präkonditionierung mit α-Liponsäure keinen Einfluss. Ischämische Präkonditionierung hatte eine deutliche Induktion der Ferritinexpression zur Folge, was zum Schutz vor IRS erheblich beitragen könnte. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen neue Hinweise zum molekularen Wirkmechanismus verschiedener Therapieansätze zum Schutz vor IRS geben. Diese Kenntnisse sind eine wichtige Voraussetzung für deren sinnvolle und rationale Anwendung in der Klinik.

Zur Bedeutung von Phosphatidylinositol-3-Kinasen für die Modulation hepatobiliärer Sekretion durch Gallensäuren in der perfundierten Rattenleber