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mTOR-Inhibitoren (Synonym: Rapamycin) sind Wirkstoffe, die sowohl in der Immunsuppression als auch in der antiproliferativen Therapie systemisch und lokal Verwendung finden. In Vorversuchen unserer Arbeitsgruppe mit Zellkulturen zeigte sich schnell ein großes Adsorptionspotential von Rapamycin – beziehungsweise von dessen Derivat Everolimus – an die Oberflächen von Zellkulturflaschen. Diese Adsorption hängt im Wesentlichen von zwei Faktoren ab: dem Proteingehalt des Mediums und der spezifischen Oberfläche der Zellkulturflaschen. Um dies zu zeigen, wurden verschiedene gebräuchliche Zellkulturflaschen (Nunclon, Ultra-low-attachment, Weichglas, unbehandelte Polystyren-Oberflächen und Polystyren Oberflächen beschichtet mit Collagen 1 beziehungsweise Poly-D-Lysin) sowie Duranglas-Petrischalen ausgewählt. Die Oberflächen der Zellkulturflaschen wurden eine Stunde mit Medium mit einer definierten Menge an Everolimus bedeckt, gespült und wiederum eine Stunde mit DMSO bedeckt. DMSO löst die Substanz wieder von der Oberfläche ab. Die Everolimuskonzentrationen im Medium nach einer Stunde und in der DMSO-Lösung wurden mittels LC-MS/MS bestimmt. Es zeigte sich signifikante Adsorption von Everolimus in absteigender Reihenfolge: Ultra-low-attachment > Unbehandeltes Polystyren > Collagen 1 > Nunclon > Poly-D Lysin > Weichglas > Duranglas (bei 10% FCS in Medium) und Ultra-low-attachment > Unbehandelt > Collagen 1 > Weichglas > Poly-D-Lysin > Duranglas (bei 30% FCS in Medium). Im Folgeversuch wurden vier der Zellkulturflaschen ausgewählt (Nunclon, Unbehandelt, Collagen 1, Duranglas-Petrischalen) und untersucht, ob die reine Adsorption von Everolimus an die Oberfläche ohne Everolimus im Medium negative Effekte auf das Zellwachstum hat. Dies konnte bei drei Zelllinien (293T, VSMC, HUVEC) mittels Zellzählung demonstriert werden. Bei allen drei Zelllinien wurden p-p70s6K- Western Blots durchgeführt. Die p-p70s6K ist ein downstream gelegenes Phosphorylierungsprodukt von mTOR, welches wiederum von Rapamycin/ Everolimus gehemmt wird. Teilweise zeigte sich hier eine absteigende Phosphorylierung. Bei HUVEC- Zellen wurde zusätzlich die Expression von VEGF und p-p70s6K mittels ELISA untersucht. VEGF ist ein Faktor, der Wachstumssignale spezifisch an Gefäß- Endothelzellen vermittelt. Hier konnte entgegen der Erwartungen sogar eine Zunahme der Expression mit steigender Everolimuskonzentration gemessen werden. Neuere Studien legen jedoch nahe, dass VEGF nicht ausschließlich über TOR aktiviert wird. Bei p-p70s6K zeigte sich die erwartete Abnahme der Expression. Die Versuche weisen auf eine signifikante Beeinflussung des Zellwachstums durch Everolimusadsorption an Oberflächen hin. Inwiefern sich Adsorption bei Zellversuchen mit Everolimus in Lösung auswirkt, ist noch unklar. Eine Minderung der Everolimuswirkung wäre denkbar. Um die Oberflächenadsorption bei Versuchen mit Everolimus möglichst gering zu halten, empfiehlt unsere Arbeitsgruppe anhand der Versuchsergebnisse die Kultivierung auf wenig absorbierenden Oberflächen wie Duranglas beziehungsweise die Erhöhung der FCS-Konzentration in Lösung, soweit von den Zellen toleriert.

Desmosomen sind spezialisierte Haftstrukturen, die die Stabilisierung des Zellverbundes gegenüber Zug- und Scherkräften gewährleisten. Dazu binden desmosomale Cadherine extrazellulär an Haftmoleküle benachbarter Zellen und sind intrazellulär unter anderem über Desmoplakin (DP) und Plakoglobin (PG) an Keratinfilamenten verankert. Insbesondere für das desmosomale Cadherin Desmoglein 3 (Dsg3), das sowohl innerhalb als auch außerhalb der Desmosomen vorkommt, wurde eine wichtige Bedeutung als Adhäsionsprotein in Keratinozyten nachgewiesen. Trotz ihrer Funktion, Widerstand gegen hohe mechanische Belastungen zu vermitteln, sind Desmosomen dynamische Strukturen, die einem stetigen Umbau unterliegen. Die Notwendigkeit einer genauen Regulierung des desmosomalen Auf- und Abbaus wird durch das Vorkommen zahlreicher vererbbarer und autoimmuner Erkrankungen unterstrichen. In der vorliegenden Arbeit wurden Mechanismen, die der geordneten Assemblierung der Desmosomen und der Disassemblierung nach Störung der desmosomalen Zell-Zell-Haftung unterliegen, untersucht. Im ersten Teil der vorliegenden Studien standen die Vorgänge der Desmosomenbildung in humanen Keratinozyten im Fokus. Adhärenskontakte und deren Zusammenwirken mit Actinfilamenten spielen eine wichtige Rolle in der Ausbildung der Desmosomen. Für die Actin-Bindeproteine Adducin und Cortactin wurde durch siRNA-Interferenzstudien eine essentielle Funktion für die Vermittlung der desmosomalen Zell-Zell-Haftung nachgewiesen. Die siRNA-induzierte Depletion von Adducin verursachte eine Reduktion der zytoskelettal-gebundenen Dsg3-Moleküle, was mit einer reduzierten Membranmobiltät korrelierte. Für Cortactin wurde eine direkte Interaktion mit Dsg3 mittels zweier unabhängiger molekularbiologischer Methoden nachgewiesen. Dies deutet auf eine direkte Rolle des Cortactins in der Regulierung der Desmosomen hin. Die siRNA-induzierte Depletion von E-Cadherin führte zum Verlust der membranständigen Lokalisation von Dsg3 und zu einer verminderten Verankerung der Dsg3-Moleküle innerhalb der zytoskelettalen Proteinfraktion. Es wurde ein Signalkomplex aus extradesmosomalen Dsg3, E-Cadherin und der Tyrosinkinase Src identifiziert, dessen Stabilität durch Src reguliert wurde. Hierbei wurden Dsg3 und E-Cadherin an Tyrosinresten durch Src phosphoryliert, deren Aktivität sowohl für die Inkorporation von Dsg3 in die Desmosomen als auch für die Reifung der Desmosomen zu stabilen Haftkontakten essentiell war. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden die Prozesse der desmosomalen Disassemblierung nach Inkubation mit Pemphigus vulgaris-Autoantikörpern (PV-IgG) analysiert.PV ist eine etablierte Modellerkrankung zur Untersuchung der Desmosomen-vermittelten Zelladhäsion in Keratinozyten. Die Bindung der gegen Dsg1 und Dsg3 gerichteten PV-IgGs induziert eine Reduktion der Dsg3-Proteinmengen und eine Aktivierung verschiedener Signalwege, u.a. von RhoA und PKC. Da diese Signalwege ebenfalls Adducin regulieren und PV-IgGs eine Umorganisierung des Actin-Zytoskeletts verursachen, die durch exogene Aktivierung von RhoA verhindert wird, wurde das Zusammenspiel von PV-IgGs, RhoA und Adducin untersucht. Die protektive Wirkung der RhoA-Aktivierung auf die Zell-Zell-Haftung und die Verteilung von Dsg3 nach Applikation der PV-IgGs war sowohl von der Expression als auch von der Phosphorylierung von Adducin an Serin726 abhängig. Interessanterweise verursachten PV-IgGs über den Ca2+-Einstrom und über PKC, unabhangig von RhoA, eine schnelle Phosphorylierung von Adducin an Serin726. Die durch den Ca2+-Einstrom- und PKC-vermittelte Phosphorylierung von Adducin könnte somit einen Rettungsmechanismus der Keratinozyten darstellen, der in Reaktion auf die PV-IgG-Bindung einsetzt und die desmosomale Assemblierung induziert. Ferner wurde die reduzierte Verankerung der Keratinfilamente an Desmosomen, ein weiteres Merkmal der PV-Pathogenese, mit der Aktivität von PKC korreliert. Keratinfilamente, die einer dynamischen Regulierung durch p38MAPK unterliegen, lösen sich in Reaktion auf PV-IgGs von den Desmosomen und akkumulieren perinukleär. Dieses Phänomen der Zytokeratin-Retraktion wurde durch Inkubation mit Tandempeptid (TP), das die Transinteraktion von Desmogleinen stärkt, verhindert. Zusammenfassend liefern die in dieser Arbeit gewonnenen Daten neue Erkenntnisse über die Mechanismen des desmosomalen Umsatzes. Adducin und E-Cadherin nehmen eine essentielle Rolle in der Ausbildung und Aufrechterhaltung der desmosomalen Haftstrukturen ein. Untersuchungen der pathogenen Effekte der PV-IgGs unterstreichen die hohe Relevanz eines intakten Actin- und Keratin-Stützgerüsts für die interzelluläre Haftung von Keratinozyten. Diese Befunde könnten in Zukunft auch von medizinischer Relevanz für die Therapie von Pemphigus-Patienten sein.

Die akute myeloische Leukämie (AML) ist aus genetischer Sicht eine sehr heterogene Erkrankung. Rezeptortyrosinkinasen (RTKs) wie FLT3 sind in der Leukämogenese von zentraler Bedeutung. Durch Mutationen aktivierte RTKs sind allerdings alleine nicht in der Lage eine AML zu induzieren. Die Kooperation mit anderen Mutationen ist hierfür notwendig. Zu den am häufigsten gemeinsam auftretenden Mutationen in der AML gehören NPM1- und FLT3-ITD- (internal tandem duplication) Mutationen. Klinische Daten zeigen, dass eine FLT3-ITD die gute Prognose von NPM1-mutierten (NPM1c+) Patienten in Abhängigkeit des FLT3-ITD-mRNA-Levels in negativer Weise beeinflusst. Dies lässt auf ein pathogenes Zusammenwirken beider Genmutationen in der AML schließen, welches im Rahmen dieser Arbeit untersucht wurde. Dazu wurde basierend auf der humanen AML-Zelllinie OCI-AML3 mittels stabiler, lentiviraler Transduktion das erste zelluläre Modellsystem etabliert, das die relevanten Genotypen (NPM1c+/FLT3-ITD; NPM1c+/FLT3-WT) sowie unterschiedliche Verhältnisse von FLT3-ITD zu FLT3-WT (ITD/WT) im NPM1-mutierten Hintergrund modelliert. Zunächst wurde die NPM1-Mutation sowie die Funktionalität des FLT3-WT- und FLT3-ITD-Rezeptors in den nativen und transgenen Zellen bestätigt. Mit Hilfe des Zellmodells konnte gezeigt werden, dass Zellen, die beide Mutationen tragen, in vitro wie auch in vivo einen Wachstumsvorteil besitzen. Dieser vergrößerte sich zudem mit zunehmendem ITD/WT-Verhältnis. Ab einem bestimmten ITD/WT-Verhältnis konnte dieser Wachstumsvorteil in vitro mit einem FLT3-Inhibitor über eine gewisse Dauer gehemmt werden. Diese Ergebnisse könnten auf ein Zusammenwirken der beiden Mutationen bei der Leukämogenese hinweisen und eine Ursache für die schlechteren Überlebenskurven von Patienten mit beiden Mutationen und zunehmender FLT3-ITD-Last darstellen. Der insgesamt jedoch nur schwach ausgeprägte Phänotyp des etablierten Zellmodells erfordert zum eindeutigen Nachweis der funktionellen Interaktion von NPM1- und FLT3-ITD Mutationen ein alternatives Modellsystem. In diesem Zellmodell zeigten Zellen, die den FLT3-WT-Rezeptor überexprimierten, ebenfalls einen schwachen Wachstumsvorteil gegenüber nativen Zellen mit endogener FLT3-WT-Expression. Neben aktivierenden FLT3-Mutationen wie einer ITD, führen auch hohe FLT3-WT-Expressionslevel zur konstitutiven Aktivierung der FLT3-Kinase und verschlechtern die Prognose der Patienten. Deshalb wurde in dieser Arbeit mit der Untersuchung der transkriptionellen Regulation von FLT3, als mögliche Ursache hoher FLT3-WT-Expressionslevel, begonnen. In silico wurden im proximalen FLT3-Promotor Bindestellen für die hämatopoetischen Transkriptionsfaktoren (TF) PAX5 und MYB identifiziert. Mit Hilfe des Dual-Luciferase® Reporter Assay Systems wurden PAX5 als schwacher Repressor und MYB als Aktivator des Flt3-Promotors bestätigt. Auch der Transkriptionsfaktor CEBPA verhielt sich auf gleiche Weise als Aktivator der Flt3-Promotoraktivität. Eine Punktmutation im CEBPA-Gen, die aus zwei AML-Fällen bekannt ist, führte zu einer erhöhten Flt3-Promotoraktivität. Die Identifizierung weiterer mutierter, FLT3-regulierender TF und ihre Korrelation mit der FLT3-Expression sollen zukünftig tiefere Einblicke in die transkriptionelle Regulierung von FLT3 als Ursache der FLT3-Überexpression in AML-Patienten gewähren. Für eine Reihe von in AML-Patienten gefundenen Mutationen ist deren Rolle in der Pathogenese der AML noch unbekannt. Dazu gehören Mutationen in den Rezeptortyrosinkinasen DDR1 und DDR2. In der vorliegenden Arbeit wurden DDR1- und DDR2-Mutationen stabil in Ba/F3 Zellen und transient in HEK-293T Zellen exprimiert, um ihr transformierendes Potential zu untersuchen und diese funktionell zu charakterisieren. Transgene, DDR1- und DDR2-exprimierende Ba/F3 Zellen zeigten keinen transformierenden Phänotyp. Weitere Untersuchungen zeigten eine konstitutive Phosphorylierung der extrazellulären DDR2-Mutanten (G222R, M291I) in HEK-293T Zellen und eine Adhäsion von Ba/F3 Zellen mit wildtypischem sowie mutiertem DDR1-Rezeptor in Anwesenheit des DDR-Liganden Kollagen. DDR1- und DDR2-Rezeptoren sind bisher vor allem in soliden Tumoren untersucht. Weitere funktionelle Analysen sind notwendig, um ihren Stellenwert bei der Entstehung von AML zu erfassen. Diese Arbeit zeigt, dass Rezeptortyrosinkinasen in der Leukämogenese auf unterschiedliche Weise eine wesentliche Rolle spielen können. Da Rezeptortyrosinkinasen zudem wichtige Zielmoleküle für therapeutische Ansätze darstellen, sind sie von besonderer Bedeutung.

Hintergrund: Hyaluronan (HA) ist ein wichtiger Bestandteil von vielen Geweben und Flüssigkeiten des Körpers. HA beeinflusst die Makro- und Mikroumgebung und kann direkt über Rezeptoren wie CD44 (cluster of differentiation 44) und RHAMM (receptor for HA mediated motility) mit den Zellen wechselwirken. Dadurch hat HA Einfluss auf die Aktivierung, Migration und Proliferation von Zellen sowie auf den Umbau der extrazellulären Matrix. HA kann das Verhalten der Osteoblasten, Osteozyten und Osteoklasten beeinflussen und ist somit ein wichtiger Faktor sowohl für die gesunde Knochenhomöostase als auch für die Frakturheilung. Hyaluronansynthasen (HAS) sind komplexe Membranproteine, die für die Synthese von HA verantwortlich sind. Bei Säugetieren sind drei Isoformen bekannt: HAS1, HAS2 und HAS3. Sie zeigen eine hohe Homologie in ihrer Sequenz und Struktur, unterscheiden sich aber in Stabilität, Syntheserate und Länge des HA. Der genaue Regulierungsmechanismus der HAS ist noch nicht bekannt. Bisher wurde über eine Regulation durch externe Signalmoleküle, Ubiquitinierung oder Phosphorylierung berichtet. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Modellsystem zur Untersuchung der Regulation der Aktivität der HAS aufgebaut. Mit diesem sollte die Interaktion der HAS mit dem Aktinzytoskelett als möglicher Regulationsmechanismus untersucht werden. Methoden: Zu diesem Zweck wurden drei Zelllinien hergestellt. Zum einen hTERT immortalisierte hMSCs (human mesenchymal stem cells), die sogenannten SCP1, welche jeweils eine der HAS-Isoformen, fusioniert mit einem eGFP-Tag, stabil exprimieren. Des Weiteren SCP1, die Lifeact-mRFPruby exprimieren, welches F-Aktin fluoreszenzmarkiert. Schließlich doppeltransduzierte hMSCs, welche sowohl HAS-eGFP als auch Lifeact-mRFPruby exprimieren. Als Gentransfersystem wurden Lentiviren eingesetzt. Zuerst wurden die Zellen hinsichtlich der stabilen und funktionellen Expression ihres Transgens anhand verschiedener Methoden untersucht. Mittels Immunfluoreszenzmikroskopie wurde eine Kolokalisation von Aktin und HAS dargestellt. In fluoreszenzmikroskopischen Timelapse-Aufnahmen wurden die Bewegungsmuster der HAS beobachtet. Ergebnisse: Mittels RT-PCR, Western Blot und Fluoreszenzmikroskopie wurde nachgewiesen, dass die Zelllinien SCP1-HAS1-eGFP D6, SCP1-HAS2-eGFP und SCP1-HAS3-eGFP E6 alle ihr jeweiliges HAS-eGFP-Gen stabil exprimieren. Die Funktionalität der HAS-eGFP wurde mit einem HA-spezifischen ELISA und mit einem selbst etablierten Aktivitätsassay untersucht, welcher das HA durch den biotinylierten HA-Bindekomplex (bHABC) färbt. Im ELISA zeigten alle Zelllinien eine statistisch signifikant höhere Hyaluronanproduktion als die Negativkontrolle. Die HAS3-überexprimierende Zelllinie erzielte von allen die höchste HA-Konzentration. In der Färbung mit bHABC war deutlich zu erkennen, dass diejenigen Zelllinien, in denen eine der HAS-eGFP-Isoformen überexprimiert wurde, eine stärkere Braunfärbung zeigten als Zellen der Negativkontrolle. Für den Nachweis, dass die HAS-eGFP in der Membran lokalisiert sind, wurden Immunfluoreszenzfärbungen gegen den Oberflächenmarker CD44 durchgeführt. Die fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen zeigten an Stellen, die durch die CD44-Färbung eindeutig als Membran zu erkennen sind, ebenfalls ein Signal für die HAS-eGFP. Dies bedeutet, dass die drei Isoformen der HAS-eGFP dort in der Zellmembran integriert vorlagen. Um eine Kolokalisation der HAS-eGFP mit dem Aktinzytoskelett darstellen zu können, erfolgte außerdem eine Färbung des Aktins mit Phalloidin. Bei allen Zelllinien konnte an ausgewählten Stellen eine solche Kolokalisation gesehen werden. Die hMSC-Lifeact-mRFPruby-Zellen wurden lebendig und fixiert im Fluoreszenzmikroskop betrachtet. Sie lieferten eine gute Darstellung des Zytoskeletts mit Stressfasern im Zellkörper und Aktinfilamenten im Zellcortex. Auffallend war, dass in den lebenden Zellen kurze Aktinfilamente zu sehen waren, die sich bei den fixierten Zellen nicht beobachten ließen. Um eine Interaktion zwischen den HAS-eGFP und dem Aktinzytoskelett in lebenden Zellen untersuchen zu können, wurden von den doppeltransduzierten hMSCs Timelapse-Aufnahmen angefertigt. Darin stellten sich die grün fluoreszierenden HAS-eGFP als globuläre Strukturen dar, die entlang der Aktinfilamente angeordnet waren und sich auch entlang dieser bewegten. Schlussfolgerung: Mit diesen Zellen wurde ein Modellsystem geschaffen, mit welchem eine Regulation der HAS über die Interaktion mit dem Zytoskelett untersucht werden kann. Genaueres Wissen über diesen Mechanismus kann für zukünftige Therapieansätze bei Frakturen und bei Knochenerkrankungen, wie z.B. der Osteoporose, richtungsweisend werden.

Durch Fehler entstandene tetraploide Zellen sind chromosomal instabil und können zu Zelltransformation führen. Die Beweise verdichten sich, dass die Propagation von tetraploiden Säugetierzellen durch einen p53-vermittelten Arrest eingeschränkt wird; jedoch ist weiterhin unklar, was die Ursache dieses p53-vermittelten Arrests ist. Um die Ursache des p53-vermittelten Arrests zu identifizieren, wurden individuelle Zellen mittels zeitraffender Mikroskopie in Echtzeit verfolgt. Neu entstandene tetraploide Zellen können einen Zellzyklus vollenden, aber die Mehrzahl der Zellen starb oder verharrte in einem Arrest in der folgenden G1-Phase, abhängig davon ob die vorangegangene Mitose fehlerfrei verlief oder nicht. Tochterzellen, denen eine fehlerhafte Mitose voranging, akkumulierten p53 im Zellkern, was zum Zelltod oder einem irreversiblen Zellzyklusarrest führte. Es zeigte sich durch den Anstieg von 8-OHdG, einem Indikator für oxidative DNA Schädigung, dass tetraploide Zellen durch die vermehrten fehlerhaften Mitosen höheren Konzentrationen von reaktiven oxidativen Spezien (ROS) ausgesetzt sind. Der Anstieg von 8-OHdG korrelierte mit der p53-Akkumulation im Zellkern. Da keine vermehrte Phosphorylierung des Histons H2AX (γ-H2AX), ein Marker für DNA-Strangbrüche, detektiert wurde, lässt sich schlussfolgern, dass ROS entscheidend für den p53 vermittelten Arrest verantwortlich sind. Mehrere p53-aktivierende Kinasen wurden mittels RNA Interferenz (RNAi) und chemischer Genetik untersucht, ob sie einen Einfluss auf den Zellzyklusarrest von tetraploiden Zellen haben. Von den getesteten Kinasen hatte nur ATM einen Einfluss auf die Aktivierung von p53 nach fehlerhaften tetraploiden Mitosen. Zwar wird ATM in der Regel durch DNA-Schäden aktiviert, jedoch wurde bereits zuvor gezeigt, dass ATM auch durch erhöhte ROS Konzentrationen aktiviert werden kann. Um die Zusammenhänge des Zellzyklusarrests weiter aufzuklären, wurde ein genomübergreifender esiRNA Screen etabliert, der die Zellproliferation nach induzierter Tetraploidisierung analysiert. Durch Kombination der Zellzyklusanalyse an Hand des DNA-Gehalts zusammen mit den FUCCI-Zellzyklusindikatoren, konnten tetraploide und diploide Zellen nebeneinander mikroskopisch analysiert werden, ohne zuvor tetraploide und diploide Zellen isolieren zu müssen. Dieser neue experimentelle Ansatz ermöglichte die Identifikation von Genen, die spezifisch die Proliferation von tetraploiden Zellen verstärken oder einschränken Im Primärscreen wurden 1159 Gene identifiziert, deren Inhibition die Proliferation einschränken. Weiter wurden 431 Gene identifiziert, deren Inhibition die Proliferation der tetraploiden Zellen verstärken. Von den 431 Genen, deren Inhibition die Proliferation verstärken, wurden 371 Gene einem Konfirmationsscreen unterzogen, in dem 158 der identifizierten 371 Gene bestätigt wurden. Die bioinformatische Analyse der 158 Gene zeigte eine signifikante Anhäufung von Genen, die mit DNA-Replikation, dem kanonischen Wnt-Signalweg oder mit Tumorsignalwegen assoziiert sind. Unter letzteren ist CCDC6 sehr interessant, da dessen Genprodukt durch ATM phosphoryliert wird und nachgeschaltet den Tumorsuppressor 14-3-3σ reguliert. Des weiteren wurden mittels einer Meta Analyse der Ergebnisse des Primärscreens, zusammen mit den Daten aus dem “Project Achilles”, welches genomweit den Effekt von shRNA-vermittelter Geninhibition auf die Proliferation von 108 Krebszelllinien untersuchte, 18 Gene identifiziert, deren Inhibition sowohl die Proliferation von tetraploiden Zellen einschränkt, als auch die Proliferation von Zelllinien hemmt, welche von Krebsarten stammen, die zu meist chromosomale Instabilitäten (CIN) aufweisen. Damit bilden die präsentierten Daten nicht nur eine gute Basis zur Aufklärung des Zellzyklusarrests tetraploider Zellen, sondern auch für die Identifikation neuer potentieller Zielmoleküle, welche benutzt werden können um Tumorerkrankungen mit chromosomaler Instabilität zu behandeln, welche häufig resistent gegen die bislang verfügbaren Behandlungen sind.

Um den Wirkmechanismus verschiedener Krebstherapeutika aufzuklären bzw. besser zu verstehen wurden in der vorliegenden Arbeit deren Wirkungen auf Zelllinien untersucht. Hierfür wurde die Wirkung verschiedener kommerziell erhältlicher und einiger Roche-eigener Kinaseinhibitoren auf Leukämiezelllinien untereinander und mit der Wirkung von FLT3-siRNAs verglichen. Die Auswirkungen von Behandlungen mit anti-CD20- und anti-BCR-Antikörper wurden an Lymphomzelllinien analysiert. Für die FLT3-Inhibition konnte gezeigt werden, dass die Vorhersagen zur Spezifität aus der Display-Technologie in vier von fünf Fällen tendenziell richtig waren. In einem mehrstufigen Verfahren wurden verschiedene Eigenschaften der Inhibitoren getestet: Hemmung der Phosphorylierung von rekombinanter FLT3-Kinase, Hemmung der zellulären Phosphorylierung der Wildtyp-FLT3-Kinase, Hemmung der Phosphorylierung von FLT3 mit der ITD-Mutation. So konnte für die Substanzen VX-680, CHIR-265 und RKI-1 eine FLT3-Hemmung als primärer Wirkmechanismus in einer Zelllinie mit FLT3-ITD ausgeschlossen werden. Für die kommerziell erhältlichen Inhibitoren Sorafenib, CFI-2 und CFI-3 sowie die neue Substanz RKI-3 konnte bestätigt bzw. gezeigt werden, dass sie FLT3 / FLT3-ITD in biochemischen und zellulären Testsystemen spezifisch hemmen können. Die Expressionsprofilierung erwies sich für die Klärung dieser Fragestellung nur als bedingt geeignet, da die Expressionsmuster der Behandlungen mit verschiedenen Inhibitoren untereinander trotz unterschiedlicher Wirkungsweisen funktionell stark übereinstimmten. In diesen Profilen zeichnete sich bereits nach vierstündiger Behandlung ein Zellzyklusarrest ab, und im weiteren Verlauf wurden sie von Expressionsänderungen aus dem Umfeld der Apoptose dominiert. Die Inhibitoren konnten jedoch hinsichtlich der FLT3-Hemmung relativ zu einander aufgrund der Übereinstimmung mit dem Muster der Behandlung mit FLT3-siRNAs eingeordnet werden. Aus den bei beiden Behandlungsarten übereinstimmend deregulierten Genen wurden zeitabhängige FLT3-Inhibitionssignaturen abgeleitet.Die Untersuchungen zum Wirkmechanismus von Typ I anti-CD20-Antikörpern zeigten, dass der Signalweg downstream von CD20 in den getesteten Zelllinien zumindest teilweise mit dem der BCR-Aktivierung identisch ist. Obgleich die Übereinstimmung der BCR-Aktivierungsmuster der verschiedenen Zelllinien verhältnismäßig gering war, konnte gezeigt werden, dass die Transkriptionsmuster der Behandlungen mit anti-CD20- bzw. anti-BCR-Antikörpern untereinander in großen Teilen übereinstimmten. Zwei der besonders schnell und stark induzierten Gene waren CCL3 und CCL4. Die Kinase SYK ist als Signalüberträger downstream des BCR bekannt. Die Induktion der Cytokine CCL3 und CCL4 konnte durch SYK-Hemmung mittels spezifischer Inhibitoren und das siRNA-vermittelte Stilllegen von SYK deutlich vermindert werden. Somit deuten die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, dass SYK auch im Signalweg von CD20 eine wichtige Rolle spielt. Durch die Behandlung von NHL-Zelllinien mit anti-CD20-Antikörpern wie Rituximab oder LT20 wird demzufolge eine zelluläre Antwort ausgelöst, die einer BCR-Aktivierung ähnelt.

Sat, 8 Feb 2014 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/16915/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/16915/1/Glueck_Laura.pdf Glück, Laura

Der humane Mas-related gene X1 (hMrgX1)-Rezeptor ist ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor, der selektiv in nozizeptiven Spinalganglienneuronen exprimiert wird. Eine spezifische Aktivierung des Rezeptors durch das Proenkephalin-Spaltprodukt BAM8-22 (bovine adrenal medulla 8-22) wird als schmerzhaft wahrgenommen. Damit stellt der hMrgX1-Rezeptor eine neue molekulare Zielstruktur für eine potentiell nebenwirkungsarme, analgetische Therapie dar. Trotz dieses Potentials sind die pro-algetischen Signalwege des hMrgX1-Rezeptors bislang nicht verstanden. Der MrgX1-Rezeptor entwickelte sich unter hohem positivem Selektionsdruck und kommt nur in Primaten vor. Trotzdem wurden die nicht-homologen MrgC-Rezeptoren der Nagetiere zur Analyse des hMrgX1-Rezeptors verwendet. Im Rahmen dieser Arbeit wurden daher zunächst vergleichende Ligandenprofile des hMrgX1- und der MrgC-Rezeptoren aus Maus und Ratte erstellt. Dabei wurden deutliche Unterschiede offensichtlich, da der hMrgX1-Rezeptor exklusiv von BAM8-22 aktiviert wurde, während die MrgC-Rezeptoren durch weitere Liganden, u. a. Spaltprodukte des Proopiomelanocortins, z. T. sogar effizienter aktiviert wurden. Zudem konnte gezeigt werden, dass die MrgC-vermittelte Ca2+-Mobilisation auf Grund einer β-Arrestin-abhängigen Rezeptorendozytose deutlich desensitisierte, während der hMrgX1-Rezeptor resistent gegenüber dieser Liganden-induzierten Regulation war. Daher können die MrgC-Rezeptoren der Nagetiere nicht als Modellsytem für den hMrgX1-Rezeptor verwendet werden, so dass in dieser Arbeit weiterführend Signalwege des hMrgX1-Rezeptors in Spinalganglienneuronen-ähnlichen F11-Zellen und primären Spinalganglienneuronen untersucht wurden. Dabei zeigte sich eine duale funktionelle Regulation des etablierten pro-algetischen TRPV1 (transient receptor potential cation channel vanilloid 1)-Ionenkanals. Zum einen sensitisierte der hMrgX1-Rezeptor den TRPV1 über einen etablierten, Proteinkinase C-abhängigen Signalweg. Zum anderen zeigte sich eine direkte hMrgX1-mediierte Aktivierung des TRPV1. Dieser Regulationsmechanismus wurde durch eine Phospholipase C (PLC)-β-induzierte Produktion des endogenen TRPV1-Liganden Diacylglycerol und durch die Degradation des tonisch TRPV1-inhibierenden PLC-β-Substrates Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat vermittelt. Neben der TRPV1-Modulation induzierte der hMrgX1-Rezeptor die Expression verschiedener Gene, deren zentrale Bedeutung bei der inflammatorischen und neuropathischen Schmerzchronifizierung etabliert ist. Einerseits wurde eine hMrgX1-induzierte Phosphorylierung der extracellular signal-regulated kinases 1/2 beobachtet, die in einer Aktivierung von serum response factor-abhängigen Reportergenkonstrukten und in der Induktion von c-Fos auf mRNA- und von early growth response protein 1 auf mRNA- und Proteinebene resultierte. Andererseits zeigte sich die transkriptionelle Ca2+/Calcineurin-abhängige Aktivierung des nuclear factor of activated t cells, die in der Induktion des CCR2 (chemokine receptor 2) auf mRNA- und Proteinebene resultierte. Somit konnte erstmalig ein physiologischer Induktor des CCR2 in Spinalganglienneuronen beschrieben werden. Weiterhin wurde nach der Etablierung der endogenen Proteinexpression des hMrgX1-Rezeptors in LAD2-Mastzellen eine BAM8-22-induzierte Freisetzung des CCR2-Agonisten chemokine ligand 2 ermittelt, so dass der hMrgX1-Rezeptor die parakrine Stimulation von nozizeptiven Spinalganglienneuronen durch Mastzellen fördern könnte. Diese Dissertation trägt somit zum besseren molekularen Verständnis akuter und chronischer pro-algetischer Funktionen des hMrgX1-Rezeptors bei und könnte damit die Entwicklung neuer analgetischer Wirkstoffe ermöglichen.

Sarkome stellen eine heterogene Gruppe von mesenchymalen Tumoren mit einem teilweise aggressiven klinischen Verlauf dar. Die biomedizinische Forschung untersucht molekulare Mechanismen, um durch eine gezielte Pharmaka-Modulierung die Effizienz klassischer Behandlungsmethoden zu steigern. Ein vielversprechendes therapeutisches Verfahren basiert auf der Anwendung der Hyperthermie in Kombination mit einer Standardchemotherapie. Die biologischen Auswirkungen der Hyperthermie auf intrazelluläre Prozesse, wie z.B. Signaltransduktionskaskaden, Reparaturmechanismen und Apoptosewege sind bislang nur teilweise erforscht. In der Arbeit wurde die Auswirkung eines Hitzeschocks auf den anti-apoptotischen Akt-mTOR-Signaltransduktionsweg und dessen Bedeutung für die Vitalität der mit Hitze- oder Thermo-Chemotherapie behandelten Krebszellen in vitro untersucht. Anhand der in unterschiedlichen Sarkomzelllinien durchgeführten Analysen konnte festgestellt werden, dass eine Hitzeexposition bei einer klinisch relevanten Temperatur von 41,8°C eine starke Phosphorylierung der Kinasen Akt, mTOR und p70/p85 S6K induziert. Die zeitgleich beobachtete Erhöhung der HSP70-Expression unter einem Hitzeschock deutet auf eine adäquate Antwort der Zellen auf Hitzeschock hin. Die Aktivierung des Akt-mTOR-Signalweges sowie die Induktion von HSP70 wirken anti-apoptotisch. Eine Unterdrückung von PTEN und die resultierende Hyperaktivierung von Akt führten zu einer gesteigerten Proliferation der Zellen. Durch die Hyperaktivierung von Akt konnte die Vitatlität und Koloniebildungsfähigkeit der Zellen nach einem Hitzeschock verbessert werden, was durch Perifosin wiederum unterdrückt werden konnte. Die Anwendung des Akt-Inhibitors Perifosin hat einen stark reduzierenden Effekt auf die konstitutive und Hitzeschock-bedingte Phosphorylierung der Akt-Kinase und ihrer downstream targets. So vermindert Perifosin die Vitalität und das klonogene Überleben von Sarkomzellen, die einem Hitzeschock ausgesetzt wurden. Eine Analyse hinsichtlich des Akt-mTOR-Signalweges in vitro zeigt, dass auch Doxorubicin bei 37°C die Aktivierung der Signalkaskade auslöst. Zusätzlich wird durch Doxorubicin die PARP-Expression verstärkt. Die Kombinationsbehandlung von Sarkomzellen mit Doxorubicin und Perifosin zeigt einen reduzierenden Effekt auf die Akt-Phosphorylierung, sowie die Induktion der PARP-Expression und sensitiviert die Sarkomzellen gegenüber einem Hitzeschock. Darüber hinaus konnte Perifosin die relative Resistenz den Osteosarkom MG63-Zellen und den Fibrosarkom HT1080-Zellen gegenüber Doxorubicin verringern. In Akt-KD-Experimenten konnte dabei gezeigt werden, dass der Effekt von Perifosin spezifisch der Akt-Inhibition zugeschrieben werden kann. Sowohl ein Akt-KD als auch Perifosin führt zu einer Unterdrückung der Phosphorylierung von mTOR und p70/p85 S6K, zu einer Verminderung der Hitze-bedingten HSP70-Induktion und zur Induktion der Apoptose. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass Akt eine wichtige Rolle in dem intrazellulären Schutzmechanismus und Überleben der dem Hitzeschock ausgesetzten Zellen spielt. Sie deuten auf eine wichtige Rolle des Akt-mTOR-Signalweges bezüglich der Überlebensfähigkeit der Zellen während eines Hitzeschocks hin.

Desoxyribonuklerinsäure (DNA), die Erbinformation, definiert die Struktur und Funktion jeder Zelle. In Eukaryoten ist sie um Oktamere aus den Histonen H2A, H2B, H3 und H4 gewunden. Sie bilden mit der DNA höhere Strukturen, das sog. Chromatin. Die Struktur des Chromatins beeinflusst direkt die Aktivität der gebundenen DNA. Eukaryoten besitzen daher viele molekulare Mechanismen zu ihrer Veränderung, z.B. posttranslationale Modifizierungen (PTMs) von Histonproteinen oder den Austausch von kanonischen Histonen mit Histonvarianten (z.B. H3.1, H3.2, H3.3, u.a.). Für einige Varianten sind ihnen eigene, charakteristische PTMs beschrieben, z.B. die Phosphorylierung des Serins 31 der Variante H3.3 (H3.3S31ph). Die Histone Code Hypothesis postuliert, dass PTMs von Histonen in festen Mustern vorliegen können. Die Switch Hypothesis beschreibt die Regulation von Bindemolekülen an Histone durch benachbarte PTMs. Auf ihrer Grundlage wurde die These der Doppelmodifizierung einer bekannten Trimethylierung der Aminosäure (AS) Lysin 79 mit einer mutmaßlichen Phosphorylierung der AS Threonin 80 auf Histon H3 aufgestellt (H3K79me3T80ph). Neben der Etablierung eines einfachen Systems zur Identifizierung bisher unbeschriebener Phosphorylierungen bestand ein zweites Ziel dieser Arbeit im Nachweis der Phosphorylierung von H3 Threonin 80 in vivo. Eine weitere Zielsetzung lag in der genaueren Charakterisierung der bereits beschriebenen Varianten-spezifischen PTM H3.3S31ph, deren Expression zwar eng umschrieben ist, über deren spezifische Funktionen, Kinase und mögliche Effektorproteine aber wenig bekannt ist. Um einen Überblick über Phosphorylierungen verschiedener Histonroteine zu gewinnen, wurden unterschiedliche Polyacrylamidgel-Elektrophoresen Verfahren (PAGE) etabliert. Zum Einsatz kamen A/U-, T/A/U- und 2D-T/A/U-PAGE Verfahren. Sie ermöglichten in Übereinstimmung mit der Literatur die Auftrennung bekannter PTM und stehen nun für weiterführende Studien zur Verfügung. Der massenspektrometrische Nachweis der putativen PTM H3K79me3T80ph in vivo gelang nicht. Trotz optimierter Versuchsbedingungen konnte die Phosphorylierung weder in der MALDI-ToF, noch in der Orbitrap MS/MS nachgewiesen werden. Initiale Antikörperdaten wurde aufgrund einer aufgedeckten Kreuzreaktivität in Frage gestellt. Obgleich nicht mit letzter Sicherheit gesagt werden kann, dass H3K79me3T80ph in vivo nicht existiert, wurde die These letztlich verworfen. Die molekularbiologische Untersuchung der Varianten-spezifischen PTM H3.3S31ph ergab bei verifizierter Überexpression und Chromatin-Integration punktmutierter Histone übereinstimmend Hinweise auf einen Effekt der PTM auf die Zellteilung. Es konnte gezeigt werden, dass Serin 31 bzw. ihre PTM H3.3S31ph sowohl Zellzyklus, als auch Wachstums- und Proliferationsgeschwindigkeiten von HeLa Zellen beeinflusst. Dies argumentiert für eine aktivierende Funktion von H3.3S31ph in der Mitose. Weiter konnten mithilfe eines ELISAs fünf potentielle Proteinkinasen für H3.3S31ph identifiziert werden. Vorrangig kommt dabei die nukleäre Kinase PIM1 in Betracht. Zur weiteren Untersuchung potentieller Effektorproteine wurde in vitro ein molekularbiologisches Modellsystem etabliert. Es steht nun für weiterführende Studien zur Verfügung. Erste Vorarbeiten konnten bereits zeigen, dass hier evtl. Interaktionen mit dem Linkerhiston H1 eine wichtige Rolle spielen.

In der deutschen Bevölkerung leidet, bezogen auf den BMI (Body-Mass-Index), etwa jeder zweite an Übergewicht. Innerhalb dieser Gruppe müssen dabei über 25 % als krankhaft adipös eingestuft werden. Trotz der weiten Verbreitung, ist zurzeit weder eine erfolgreiche medikamentöse Therapie der Adipositas verfügbar, noch sind die grundlegenden Mechanismen der Gewichtsregulation vollständig verstanden. Der MC4R (Melanocortin-4-Rezeptor) und sein Ligand α-MSH (melanocyte-stimulating hormone) stellen einen entscheidenden Punkt bei der Energieregulation des Körpers dar und sind damit eine vielversprechende pharmakologische Zielstruktur zur Behandlung von Adipositas. Trotz der enormen Bedeutung dieses Rezeptors ist bemerkenswert wenig über die MC4R-induzierten Signalwege bekannt. Ziel dieser Arbeit war es, α MSH-induzierte anorexigene Signal¬wege in murinen hypothalamischen Zellen (GT1 7), die den MC4R endogen exprimieren, zu identifizieren und zu charakterisieren. In dieser Arbeit konnte mit hochspezifischen Antikörpern gezeigt werden, dass nach 20 h Serumentzug die Stimulation von GT1-7 Zellen mit α MSH die cAMP-abhängige PKA (Proteinkinase A) aktiviert und somit zu einer ERK-1/2 (extracellular signal-regulated kinase-1/2) Phosphorylierung führt. Die aktivierte ERK-1/2 inhibiert anschließend die konstitutiv aktive AMPK-Kinase LKB1 (liver kinase B1), was in einer verminderten Phosphorylierung der nach¬geschalteten AMPK (AMP-activated protein kinase) an Threonin 172 resultiert. Damit ergibt sich eine lineare α-MSH-induzierte Signalkaskade, bei der die AMPK Dephosphorylierung von PKA, ERK-1/2 und LKB1 abhängig ist. Die Durchführung von Versuchen nach mehrstündigem Serumentzug ist zwar etabliert, führt aber zu Veränderungen in der Zelle, die sich unter anderem auf Proliferation und Morphologie auswirken. Da unklar ist, welche Versuchs¬bedingungen dem physiologischen Zustand eines Neurons entsprechen, wurde die α MSH-induzierte Signalkaskade zusätzlich unter serumhaltigen Bedingungen untersucht. Dabei führt die Stimulation mit α-MSH immer noch zu einer Aktivierung der ERK-1/2 und auch zu einer Dephosphorylierung der AMPK, letzteres allerdings unabhängig von PKA und ERK-1/2. Des Weiteren wird die AMPK nicht mehr exklusiv durch LKB1 reguliert, sondern die AMPK-Kinase TAK1 (TGF-β-activated kinase-1) spielt ebenfalls eine Rolle. Erste Hinweise aus einem Kinase-Aktivitäts-Array deuten daraufhin, dass diese Unterschiede in einer distinkten ERK-1/2 Aktivierung, über Rap-1 unter serumfreien oder über K-Ras unter serumhaltigen Bedingungen, begründet sein könnten. Diese Dissertation soll zu einem besseren Verständnis von anorexigenen Signal-wegen im Hypothalamus beitragen und könnte bei der Generierung neuer Anti Adipositas Medikamente hilfreich sein.

Thu, 8 Nov 2012 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15014/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15014/4/Hermanns_Frauke.pdf Hermanns, Frauke

Das Mantelzell-Lymphom ist ein aggressives B-NHL, das durch die Expression des Zell-zyklus-regulierenden Proteins Cyclin D1 charakterisiert ist. Diese Expression wird in den meisten Fällen durch eine chromosomale Translokation t(11;14)(q13;q32) ausgelöst. Klinisch weist das MCL mit einem medianen Überleben von nur drei bis vier Jahren eine der schlechtesten Langzeitprognosen aller Lymphomsubtypen auf. In fortgeschrittenen Stadien kommt es zu frühzeitigen Rezidiven nach der Behandlung mit konventionellen Chemotherapeutika. Es besteht daher ein dringender Bedarf an neuen, effektiveren, mo-lekular ausgerichteten Therapieformen, die zu einer Verbesserung der Prognose und der Lebensqualität der Patienten führen. In dieser Arbeit wurde hierfür das Proliferationsverhalten und die Viabilität von sechs humanen MCL-Zelllinien nach der Behandlung mit dem mTOR-Inhibitor RAD001 und dem Purin-Nukleosid-Phosphorylase-Inhibitor Forodesin in Gegenwart von 2'-Desoxyguanosin (dGuo) untersucht. Im Vordergrund stand zum einen die Charakterisierung der Wirkung von RAD001 und Forodesin+dGuo als Monosubstanzen. Zum anderen war es auch Ziel, die Antitumorwirkung zytotoxischer Kombinationen mit etablierten Substanzen der Chemotherapie, dem Proteasom-Inhibitor Bortezomib sowie dem PKCß-Inhibitor Enzastaurin bezüglich Wachstumshemmung, Zelltod und Apoptose zu untersuchen und diese Kombinationen auf antagonistische, additive oder synergistische Interaktionen hin zu analysieren. Die behandelten Zellen wurden hierzu einem Viabilitäts-Trypanblau-Test unterzogen, der hier als Screeningverfahren diente, um die Empfindlichkeit der Zellen auf unterschiedliche Dosen in Einzel- und Kombinationstherapien zu quantifizieren. Im Anschluss wurden die Resultate mit Hilfe der Zellzyklusanalyse durch Propidiumiodid-Färbung und Apoptose-Assays verifiziert und der Wirkmechanismus der Kombinationen differenziert. Als Ergebnis dieser Arbeit erzielte der mTOR-Inhibitor RAD001 als Monosubstanz bereits in subtoxischen Konzentrationen vor allem nach 48- und 72-stündiger Expositionsdauer eine antiproliferative Wirkung auf die MCL-Zelllinien. Außerdem zeigte RAD001 bei allen in dieser Arbeit untersuchten Zelllinien eine potente Inhibition des Zellzyklus, mit einer Zunahme der G0/G1- und einer Abnahme der S-Phase. Nach 48-stündiger Behandlung mit RAD001 in Kombination mit Fludarabin, Cytarabin, Bendamustin sowie Enzastaurin und Bortezomib zeigte sich bei einer Zelllinie ein Syner-gismus, die im Viabilitäts-Trypanblau-Test besonders empfindlich auf RAD001 war. Additive Effekte konnten bei vier von fünf untersuchten MCL-Zelllinien durch die Kombination von RAD001 und Bendamustin nachgewiesen werden. Bei zwei von fünf Zelllinien konnten diese Effekte auch mit Fludarabin erzielt werden. Vier von fünf MCL-Zelllinien zeigten nach 48-stündiger Behandlung bei der Kombination von RAD001 plus Cytarabin eine antagonistische Wirkung. Die Behandlung mit der Kombination von RAD001 plus Bortezomib oder Enzastaurin führte in einigen MCL-Zelllinien ebenso zu additiven Effekten. Die Kombinationen RAD001 plus Forodesine+dGuo und RAD001 plus Bortezomib wiesen in drei von fünf MCL-Zelllinien dagegen eine antagonistische Wirkung auf. Nach der Behandlung mit Forodesin unter Beigabe von dGuo konnte ebenfalls eine anti-proliferative Wirkung in allen untersuchten MCL-Zelllinien induziert werden. Die weiteren Untersuchungen mithilfe von Zellzyklus- und Apoptose-Analysen zeigten jedoch keine wesentlichen Veränderungen im Vergleich zu der jeweiligen unbehandelten Kontrolle. Ganz anders stellte sich die Zellzyklus-Analyse der T-ALL-Kontrollzelllinie Jurkat dar. Hier zeigte sich eine deutliche T-Zelllinien-spezifische Wirkung des PNP-Inhibitors Forodesin unter Zugabe von 2'-Desoxyguanosin. Die Kombination von Forodesin+dGuo und Bendamustin wies bei vier von fünf MCL-Zelllinien nach 72 Stunden Expositionszeit ebenso eine additive Wirkung auf. Ein synergistischer Effekt war nach 48 Stunden dagegen lediglich bei einer MCL-Zelllinie zu erkennen. Die Kombination von Forodesin und Fludarabin zeigte schließlich nach 72 Stunden Expositionszeit bei vier MCL-Zelllinien und der T-ALL-Zelllinie Jurkat eine antagonistische Wirkung, was letztendlich auf das Konkurrieren der Phosphorylierung von dGuo und Fludarabin zurückzuführen ist. Bei vier von fünf untersuchten MCL-Zelllinien wies die Kombination von Forodesin+dGuo und Bortezomib ebenfalls eine antagonistische Wirkung auf, da die beiden Kombinationspartner um DNA-Bindungsstellen konkurrieren. Eine additive Wirkung ließ sich am Ende auch bei drei von fünf MCL-Zelllinien mit der Kombination von Forodesin+dGuo plus Enzastaurin nachweisen. Zusammenfassend wäre somit ein Einsatz des mTOR-Inhibitors RAD001 und des Purin-Nukleosid-Phosphorylase-Hemmstoffs Forodesin in Gegenwart von 2’-Desoxyguanosin additiv zu anderen Chemotherapeutika im Rahmen der Mantelzell-Lymphom-Therapie durchaus vielversprechend. Allerdings sind bei der Entwicklung dieser und weiterer, in-novativer Kombinationen die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen zu beachten, um mögliche antagonistische Wirkungen zu vermeiden.

Thu, 24 May 2012 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15132/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15132/1/Hintermair_Corinna.pdf Hintermair, Corinna

Maligne Zellen wachsen in einem komplexen zellulären und extrazellulären Umfeld, welches die Initiierung und Aufrechterhaltung des malignen Phänotyps bedeutend beeinflusst. Tumore bestehen zum einen aus den Tumorzellen, zum anderen aus dem unterstützenden Stroma, das Fibroblasten, Endothelien, Perizyten, Lymphgefäße, ein mononukleäres Infiltrat und die Extrazellulärmatrix einschließt. Dieses Tumor-Mikromilieu hat einen großen modulierenden Einfluss auf das Tumorwachstum, die Invasivität und das Metastasierungspotential. Mesenchymale Stammzellen (MSC) sind pluripotente Vorläuferzellen, die an der Aufrechterhaltung und Wiederherstellung der Gewebeintegrität beteiligt sind. Geschädigtes Gewebe führt zur Mobilisation von MSC und deren Rekrutierung an den Ort der Schädigung. Tumore werden vom Organismus als nicht-heilende Wunden angesehen, so dass MSC in das tumorassoziierte Stroma rekrutiert werden. Dort tragen die Zellen zu verschiedenen Aspekten des Tumorwachstums bei, indem sie als Progenitorzellen für die Tumorgefäße und stromale fibroblastenartige Zellen dienen. Im Rahmen dieses Ausdifferenzierungsprozesses werden gewebespezifische Gensets wie das CC-Chemokin CCL5 in den mesenchymalen Stammzellen aktiviert und zur Expression gebracht. Das Pankreasadenokarzinom ist eines der aggressivsten soliden Malignome des Menschen und ist gekennzeichnet durch eine ausgeprägte Proliferation des Stromas. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, zum einen die Rolle mesenchymaler Stammzellen im Stroma des Pankreaskarzinoms zu evaluieren und zum anderen eine gewebespezifische stammzellbasierte und promoterkontrollierte Suizidgentherapie mit dem Stroma als Angriffspunkt zu etablieren. Mesenchymale Stammzellen wurden aus dem Knochenmark von C57BL/6 p53-/- Mäusen isoliert und sowohl mit den Reportergenen des rot fluoreszierendem Proteins (RFP) und des grün fluoreszierenden Proteins (eGFP) als auch mit dem Suizidgen der Herpes Simplex I Thymidinkinase (HSV-TK) unter Kontrolle des CCL5-Promoters transfiziert. Die HSV-TK führt zu einer Phosphorylierung und Aktivierung der Prodrug Ganciclovir, welches zytotoxisch auf Thymidinkinase-positive (TK+) Zellen und über den sogenannten „Bystandereffect“ auf umgebende Thymidinkinase-negative (TK-) Zellen wirkt. Diese Stammzellen wurden C57BL/6 Mäusen intravenös injiziert, die orthotope und syngene panc02- Pankreastumore trugen. Die i.v. Applikation von nativen MSC führte zu einer Verdopplung der Tumormasse und einer gesteigerten lokalen Aggressivität im Sinne einer Peritonealkarzinose im Vergleich zur Kontrollgruppe. Dabei zeigten sich erhöhte Ccl5-Expressionsniveaus im Tumorgewebe von Tieren, die MSC erhalten hatten. In-vitro konnte gezeigt werden, dass MSC bei adäquater Stimulation zur Ccl5 Expression angeregt werden und somit als Quelle des beobachteten Ccl5-Anstiegs in Frage kommen. Die stromale Aktivierung des CCL5-Promoters in den mesenchymalen Stammzellen konnte durch Verwendung von CCL5-Promoter/Reportergen Stammzellen direkt nachgewiesen werden. Dabei zeigten sich spezifisch im Tumorgewebe Fluoreszenzsignale, die sich in der Immunhistochemie morphologisch genauer darstellen ließen. Eine Reportergenexpression war spezifisch im stromalen Kompartiment der panc02- Tumore nachweisbar, andere untersuchte Organe mit Ausnahme der Milz zeigten keine Reportergenexpression. Der Einsatz der therapeutischen CCL5-Promoter/HSV-TK MSC in Kombination mit der intraperitonealen Gabe von Ganciclovir führte zu einer Tumormassenreduktion um 50%. Darüberhinaus konnte die Therapie die Metastasierungsrate in Milz, Leber und Peritoneum signifikant senken. Es wurden keine systemischen Nebenwirkungen beobachtet. Bei der Untersuchung von humanen Pankreaskarzinomen und korrespondierenden Pankreasnormalgeweben aus den gleichen Patienten zeigte sich bei der Mehrheit eine Hochregulation von CCL5-mRNA. Im immunhistochemischen Nachweis konnte die CCL5 Expression auf Proteinebene im Tumorstroma gezeigt werden, entsprechendes Normalgewebe zeigte bis auf vereinzelte Zellen keine CCL5 Produktion. Das Tumorstroma stellt aufgrund seiner vitalen Bedeutung für die Tumorprogression einen vielversprechenden Ansatzpunkt künftiger therapeutischer Interventionen dar. Mesenchymale Stammzellen eigenen sich hierbei im Rahmen einer Suizidgentherapie als zellbasierte Vehikel. Dank der gezielten Migration und des Einsatzes gewebespezifischer Promoter kann dabei eine hohe Selektivität der Genexpression im Tumorgewebe mit Minimierung der systemischen Nebenwirkungen erreicht werden. Der CCL5-Promoter wird im stromalen Kompartiment des murinen pankreatischen Adenokarzinoms aktiviert und eignet sich daher für die selektive und spezifische Expression von therapeutischen Genen wie der HSV-TK. Dieser Ansatz kann eine mögliche Therapieoption des ansonsten therapieresistenten humanenPankreaskarzinoms darstellen.

Thu, 3 Feb 2011 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/12656/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/12656/1/ruedel_sabine.pdf Rüdel, Sabine ddc:540, ddc:500, Fakultät für Chemie und Pharmazie

Akkurate Verteilung der Chromosomen während der Zellteilung ist eine fundamentale Voraussetzung für den Erhalt der genetischen Information eines Organismus. Durch Fehler innerhalb dieses Prozesses resultieren Aneuploidien, die wiederum zur Entstehung von Krebs oder Trisomien (z.B. Down-Syndrom) führen können. Es überrascht daher nicht, dass die Chromosomensegregation einen der am höchsten regulierten Vorgänge innerhalb des eukaryotischen Zellzyklus darstellt. Die Schwesterchromatide eines jeden Chromosoms werden in S-Phase synthetisiert und gleichzeitig von einem sie ringförmig umschließenden Multi-Proteinkomplex, Kohäsin genannt, miteinander verpaart. Ihre Trennung in der nachfolgenden Kernteilungsphase (Mitose) erfolgt bei Vertebraten in zwei Stufen. Während Kohäsin von den Chromosomenarmen bei Phosphorylierung in Prophase dissoziiert, wird zentromerisches Kohäsin von der später aktiv werdenden Separase proteolytisch gespalten, wodurch die Anaphase ausgelöst wird. Shugoshine (SGOs) schützen die Schwesterchromatidkohäsion im Bereich der Zentromeren, indem sie durch Rekrutierung von Protein-Phosphatase 2A (PP2A) der Phosphorylierung von Kohäsin entgegenwirken. In Säugern schützt Sgo1 mitotisches Kohäsin in der Prophase, während Sgo2 meiotisches Kohäsin vor der phosphorylierungsabhängigen Spaltung durch Separase während der ersten Reifeteilung bewahrt. Sowohl Mitose als auch Meiose werden maßgeblich durch den Spindle Assembly Checkpoint (SAC) reguliert. Dieser lässt Anaphase grundsätzlich erst dann zu, wenn alle Chromosomen über ihre Kinetochore mit Mikrotubuli des Spindelapparates in einer Weise wechselwirken, dass Zugspannung entsteht. Solange dies nicht der Fall ist, katalysiert ein kinetochorständiger Mad1-Mad2-Komplex die konformationelle Umwandlung von löslichem Mad2 hin zu einer Form, in der es über Bindung an Cdc20 die Aktivierung von Separase und den Austritt aus der Mitose blockiert. In der vorliegenden Arbeit wird durch funktionelle Charakterisierungen in Krebszelllinien gezeigt, dass Sgo2 keine essentielle mitotische Funktion ausübt. Ein bislang in der Literatur bestehender Widerspruch wird hierdurch geklärt. Die RNAi-vermittelte Depletion von Sgo2 führt zwar zu einem Verlust des Mikrotubuli-depolymerisierenden Kinesins MCAK von den Zentromeren, entsprechende HeLa-Zellen zeigen bei fehlender Zugspannung aber weiterhin einen mitotischen Arrest, der von Aurora B abhängig ist. Die Funktion dieser mitotischen Kinase innerhalb des SAC beruht demzufolge nicht auf der Erzeugung freier Kinetochore durch die Rekrutierung von MCAK sondern auf einem alternativen Signalweg. Weiterhin wird eine unerwartete, direkte Bindung von humanem Sgo2 an Mad2 beschrieben. Biochemische Experimente machen deutlich, dass Sgo2 genauso mit Mad2 interagiert, wie dies Mad1 und Cdc20 tun. Gleichzeitig wird gezeigt, dass die Wechselwirkung zwischen Sgo2 und Mad2 konserviert ist und in Organismen, denen ein zweites Shugoshin fehlt, von Sgo1 übernommen wird. Diese Daten stellen ein zentrales Dogma in Frage, das für den SAC beschrieben wurde und das für das aktive Checkpoint-Signal von einer „Quelle“ (kinetochorständiges Mad1-Mad2) und einem „Zielprotein“ (Cdc20) ausgeht. Die Mad2-Bindung ist für die Fokussierung von Sgo2 am inneren Zentromer erforderlich. In Abwesenheit von Mad2 oder bei mutierter Mad2-Bindestelle verlagert sich Sgo2 an Randbereiche des Zentromers. Aufgrund dieser Daten sowie publizierter Studien über die Funktion von Sgo2 in Meiose wird postuliert, dass der Sgo2-Mad2-Wechselwirkung eine Funktion in der Monoorientierung von Schwesterkinetochoren während der ersten Reifeteilung zukommt.

Gallensäuren stellen potente Signalmoleküle dar, die schon in geringen mikromolaren Konzentrationen, wie sie beim Menschen im Serum beobachtet werden, zentrale Leberzellfunktionen auf transkriptioneller und posttranskriptioneller Ebene beeinflussen. Die hydrophoben und potentiell toxischen Gallensäuren Lithocholsäure (LCA) und Chenodeoxycholsäure (CDCA) induzieren Apoptose und Cholestase, während hydrophile Gallensäuren hepatoprotektiv wirken können. Unter ihnen ist die antiapoptotisch und anticholestatisch wirksame Ursodeoxycholsäure (UDCA) von besonderer Bedeutung. UDCA stellt derzeit das einzige wirksame Therapeutikum bei chronischen cholestatischen Leberkrankheiten dar. Die vorliegende Arbeit untersuchte die Bedeutung intrazellulärer Signaltransduktionswege für die choleretischen, (anti-)cholestatischen und (anti-)apoptotischen Wirkungen physiologischer Gallensäuren in verschiedenen experimentellen Modellen. Hauptziel der Arbeit war die genauere Charakterisierung (i) der für den klinisch bedeutenden anticholestatischen Effekt des Taurinkonjugats der Ursodeoxycholsäure (TUDCA) verantwortlichen Signaltransduktionswege, und (ii) der zentralen Stellung von PI3-Kinasen in der intrazellulären Signalvermittlung der biologischen Effekte hydrophiler und hydrophober Gallensäuren. Im Modell der isoliert perfundierten Rattenleber untersuchten wir die anticholestatische und hepatoprotektive Wirkung der TUDCA in der intakten Leber unter Einsatz pharmakologischer Enzyminhibitoren. Als Leberfunktionsparameter dienten quantitativer Gallenfluß, Sekretion des Modellsubstrats der Konjugatexportpumpe Mrp2, GS-DNP, in die Galle und als Marker der Leberzellschädigung die hepatovenöse LDH-Freisetzung. Simultane Hemmung der cPKCa und der PKA, nicht aber Hemmung von cPKCa oder PKA allein antagonisierte bei Taurolithocholsäure (TLCA)-induzierter Cholestase die protektive Wirkung der TUDCA. Gallenfluß und GS-DNP-Sekretion waren unter gleichzeitiger Hemmung beider Signalwege signifikant reduziert, wohingegen die LDH-Freisetzung deutlich erhöht war. Die Ergebnisse zeigen, dass der posttranskriptionell vermittelte anticholestatische Effekt der TUDCA im etablierten Modell TLCA-induzierter Cholestase durch einen kooperativen cPKC- und PKA-abhängigen Signalweg vermittelt wird. Mitogenaktivierte Proteinkinasen Erk1/2- und p38-abhängige Signalwege hingegen, die als Vermittler von TUDCA-induzierter Cholerese unter nicht-cholestatischen Bedingungen beschrieben wurden, waren im untersuchten Modell ohne Bedeutung für die anticholestatische Wirkung der TUDCA. Mit Hilfe der neu etablierten Biotinylierung von Membranproteinen konnten wir in Ntcp-transfizierten humanen Hepatomzellen (HepG2-Ntcp) zeigen, dass TUDCA unter Cholestase die Insertion von MRP2 in die Hepatozytenmembran anregt. Dieser für die klinische Wirksamkeit der (T)UDCA potentiell bedeutende und im Tiermodell von uns vorbeschriebene Wirkmechanismus konnte damit erstmals in einem humanen Modell nachvollzogen werden. Ein weiterer in vitro Ansatz untersuchte die Phosphorylierung von aus HepG2-Ntcp immunopräzipitiertem MRP2 durch die als Gallensäureneffektoren diskutierten Proteinkinasen cPKCa, nPKCe und PKA. Alle drei Proteinkinasen phosphorylierten, durch den PKC/PKA-Inhibitor Staurosporin hemmbar, MRP2. Diese Phosphorylierung könnte, wie für die Gallensäurentransporter BSEP und NTCP bereits gezeigt, Einfluss auf Aktivität und Membraninsertion von MRP2 haben. Der funktionellen Bedeutung der PI3-Kinasen, welchen in den bisher entschlüsselten Signalwegen sowohl hydrophober/toxischer wie auch hydrophiler/protektiver Gallensäuren eine zentrale Rolle zugesprochen worden war („PI3-Kinasen-Paradoxon“), galten unsere in vitro Untersuchungen zur Aktivität der Isoformen der Klasse I PI3-Kinasen p110a, p110b und p110g nach Stimulation von primären Rattenhepatozyten mit TLCA, GCDCA, TCA und TUDCA in einem neu etablierten isoformspezifischen Kinaseassay. Dabei zeigte sich für jede Gallensäure ein für sie spezifisches Aktivierungsmuster unterschiedlicher PI3-Kinase-Isoformen. PI3-Kinase p110g wurde dabei spezifisch durch die cholestatisch und apoptotisch wirkenden Gallensäuren TLCA und GCDCA aktiviert. In HepG2-Ntcp-Zellen untersuchten wir daher die Bedeutung von p110g für Gallensäuren-induzierte Apoptose nach deren pharmakologischer Hemmung bzw. nach Transfektion mit siRNA gegen p110g. Die apoptotische Wirkung u.a. der Gallensäuren TLCA und GCDCA war unter beiden Methoden der p110g-Antagonisierung deutlich reduziert, wie sowohl in einem Caspase3/7-Assay als auch morphologisch evaluiert. Gallensäuren-unabhängige Apoptose, durch Etoposid bzw. TNFa ausgelöst, war p110g-unabhänig. Die Bedeutung der Aktivierung der PI3-Kinase-Isoform p110a durch TUDCA ist durch weitere experimentelle Untersuchungen zu klären. Die Erkenntnisse der vorliegenden Arbeit tragen zum Verständnis der komplexen Signalgebung im Rahmen cholestatischer Leberschädigung und der therapeutischen Wirkung der (T)UDCA bei und sind damit für die Entwicklung neuer Therapiestrategien bei cholestatischen Leberkrankheiten potentiell von Bedeutung.

Die Charakterisierung und Kultivierung von Tumorzelllinien mit Hilfe einer zweidimensionalen (2D) Zellkultur gilt als Standardmethode in der Zellbiologie. Dreidimensionale (3D) Modelle gewinnen jedoch immer mehr an Bedeutung, da sie die Tumorbiologie in Bezug auf physiologisch relevante Zusammenhänge bei der Tumorentstehung und –progression besser abbilden als eine herkömmliche 2D-Kultur. Die auf poly-HEMA beschichteten Zellkulturplatten induzierten multizellulären Tumorspheroide reflektieren die Morphologie von avaskularen Tumoren und Mikrometastasen. In der vorliegenden Arbeit werden anhand von HER2-überexprimierenden Tumorzelllinien die Unterschiede der HER2-Signalaktivierung und –weiterleitung in 2D- und 3D-Kultur umfassend beschrieben. In 3D-Kultur konnte ohne Zugabe von zusätzlichen Wachstumsfaktoren eine stärkere HER2-Phosphorylierung beobachtet werden. Bei der Brusttumorlinie SKBR-3 bildet HER2 in 2D-Kultur bevorzugt Heterodimere mit HER3, wohingegen in Spheroiden HER2-Homodimere vorliegen. Diese Homodimere lokalisieren in lipidreichen Mikrodomänen und begünstigen die Aktivierung des Ras-MAPK-Wegs, der die Proliferation der Tumorzellen reguliert. Mit Hilfe des therapeutischen Antikörpers Trastuzumab, der spezifisch für HER2 ist, kann die Proliferation der Zellen und die Phosphorylierung von HER2 im 3D-System besser inhibiert werden. Zusätzlich konnte in 3D eine Herunterregulierung des HER2/HER3 assoziierten PI3K-Akt-Signalwegs nachgewiesen werden. Bei SKBR-3 war in 3D-Kultur neben der stärkeren Phosphorylierung von MAPK auch die Aktivierung der Integrin 4/Rac1/PAK2-Signalkaskade zu beobachten. Des Weiteren wurde im Rahmen dieser Arbeit in 3D-Kultur die Zelllinie SKBR-3 HR generiert, die resistent gegen die Behandlung mit Trastuzumab ist. Die Charakterisierung dieser Linie zeigte eine verstärkte Expression von DARPP-32 und eine gesteigerte HER2/HER3-Heterodimerbildung, gefolgt von einer Hochregulierung des PI3K-Akt-Wegs. Das Gen für DARPP-32 liegt im ERBB2-Amplikon und liegt bei vielen Brusttumorproben und –zelllinien amplifiziert vor. Es konnte gezeigt werden, dass die induzierte Resistenz reversibel ist und die erneut Trastuzumab responsiven Zellen eine schwächere Expression von DARPP-32 aufwiesen, gefolgt von einer reduzierten Aktphosphorylierung. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen darauf hin, dass das beschriebene 3D-Modell einige in vivo Aspekte des HER2-Signalmusters besser reflektiert und deshalb als Basis für die weitere Aufklärung des Wirkmechanismus von Trastuzumab dienen kann. Außerdem kann dieses 3D-System zur Identifizierung von neuen Zielmolekülen herangezogen werden um Therapiestrategien zu entwickeln, welche eine Behandlung der HER2-positiven Patientenpopulation erlaubt, die bisher nur suboptimal auf die Behandlung mit Trastuzumab angesprochen haben.

Die akute Pankreatitis beginnt in den exokrinen Azinuszellen des Pankreas und wird durch verschiedene, bisher nicht vollständig geklärte, intrazelluläre Vorgänge ausgelöst. Das Hormon Cholezystokinin stimuliert Signaltransduktionskaskaden, welche über eine Reorganisation des Aktinzytoskeletts zu einer akuten Organentzündung führen. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob ein über das Enzym RhoA vermittelter intrazellulärer Signalweg zu Aktin-bindenden Proteinen im Pankreas diese Reaktion hervorruft und durch Cholezystokinin reguliert werden kann. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bringen den Nachweis der Existenz der im Folgenden beschriebenen Signaltransduktionskaskade in exokrinen Azinuszellen: RhoA führt über eine Aktivierung von ROCK II zu einer Phosphorylierung der Zieluntereinheit MYPT1 der Myosinphosphatase und somit zu einer Hemmung des Gesamtenzyms. Dadurch transloziert die sowohl in der Zytosol- als auch in der Zytoskelettfraktion vorkommende, unphosphorylierte Form MYPT1 vollständig ins Zytosol. Die Myosinphosphatase führt zu einer Dephosphorylierung der MLC von Myosin. Die fast vollständig in der Zytoskelettfraktion exprimierte phosphorylierte Form pMLC transloziert im dephosphorylierten Zustand ins Zytosol. Durch die Interaktion mit MYPT1 kann MLC zu einer Aktinmyosinkontraktion und somit zu einer Reorganisation des Aktinzytoskeletts führen. Über alternative Signalwege bewirkt RhoA eine Aktivierung von mDia, welches mittels Profilin zu einer Aktinpolymerisation führt. Über ROCK II wird eine Aktivierung der LIMK durch RhoA vermittelt. Dadurch wird Cofilin vermehrt phosphoryliert, wodurch die Depolymerisation der Aktinfilamente gehemmt wird. Durch eine dosis- und zeitabhängige Stimulation mit physiologischen und supraphysiologischen Dosierungen Cholezystokinin wird der Signalweg über RhoA gehemmt. Dadurch kann eine Kontraktion des Aktinzytoskeletts stattfinden und es zu einer Fusion von Vesikeln und zu einer Inhibierung des regulären Sekretionsmechanismus der Pankreaszellen kommen. Da die Hemmung von Aktin-modulierenden Proteinen eine bedeutende Rolle bei der Organfunktion und Entwicklung der akuten Pankreatitis spielt, trägt diese Arbeit dazu bei, sowohl die physiologischen als auch die pathophysiologischen Vorgänge innerhalb der Azinuszellen näher zu charakterisieren. Dies könnte zu einem besseren Verständnis der dieser Erkrankung zugrundeliegenden Mechanismen führen und somit einen therapeutischen Ansatz bei der akuten Pankreatitis darstellen.

Polytraumatisierte Patienten entwickeln eine systemische Entzündungsreaktion (systemic inflammatory response syndrome, SIRS), die entscheidend den klinischen Verlauf der Patienten determiniert. Zahlreiche Untersuchungen weisen dem Immunsystem dabei eine zentrale steuernde Funktion zu, wobei die initialen Triggermechanismen der traumabedingten Immunantwort bisher unbekannt ist. Obwohl den Monozyten dabei eine führende Rolle zugesprochen wird, sind die hierfür verantwortlichen intrazellulären Steuerungsmechanismen, insbesondere die Signaltransduktion, die Transkription sowie die Modulation der Translation von inflammatorisch wirksamen Proteinen bislang nur ansatzweise aufgeklärt. Ziele der vorliegenden Untersuchungen waren daher: i) zu überprüfen, ob es überhaupt spezifische, Trauma-responsive mRNA Expressionsmuster in Monozyten polytraumatisierter Patienten in der frühen posttraumatischen Phase gibt, ii) in einem zweiten Schritt zu untersuchen, ob es darüber hinaus Genexpressionsprofile gibt, die in Abhängigkeit von klinischen Parametern einer signifikant unterschiedlichen Expression unterliegen iii) und schließlich diese identifizierten Faktoren auf ihre biologisch funktionelle Rolle im Organismus zu untersuchen Mittels Affymetrix Oligonukleotid Microarray (22.000 Probe Sets, 14.500 Gene) wurde eine Genom-weite mRNA Expressionsanalyse in Monozyten polytraumatisierter Patienten in der unmittelbar posttraumatischen Phase (0h-72h) durchgeführt und in einem mehrstufigen biostatistischen Verfahren mit klinischen Einflussfaktoren korreliert. Zur Überprüfung der biologischen Funktion der identifizierter Genexpressionsprofile wurden biologisch-funktionelle Pathway Analysen mittels Ingenuity Pathway Systems durchgeführt. Um das erste Teilziel zu erreichen wurde eine unsupervised-Analyse anhand der ermittelten Microarray Daten durchgeführt. Zentrales Kriterium der unsupervised Analyse ist nun der Variationskoeffizient eines einzelnen Faktors/Gens. Somit lassen sich diejenigen genetischen Expressionsprofile identifizieren, die durch das gemeinsame klinische Ereignis „Trauma“ zu einer gemeinsamen Expressionsänderung angeregt wurden. Dabei fanden sich 318 Probe Sets (280 Gene) signifikant durch das klinische Ereignis „Trauma“ verändert. Somit lässt sich anhand der vorliegenden Studie die Fragestellung i) klar dahingehend beantworten, dass Trauma-sensitive Gene Zeichen der gleichsinnigen Aktivierung bzw. Deaktivierung zeigen können. Um die Teilfragestellung ii) zu beantworten, wurden die Patienten im Anschluss in klinisch relevante Gruppen unterteilt. Führende Zielparameter waren dabei zunächst die Quantifizierung der anatomischen Verletzungsschwere quantifiziert mittels Injury Severity Score (ISS). In den so gruppierten Datensätzen fanden sich interessanterweise 295 Probe Sets (273 Gene), hochsignifikant verschieden exprimiert in Patienten mit einem ISS > 40 im Vergleich zu weniger schwer verletzten Patienten (ISS < 40 Punkte). Eine ähnliche supervised- Analyse wurde anhand des Kriteriums „Massive Substitution von Erythrozytenkonzentraten“ (>10 EKs/24h) berechnet. Dabei fanden sich 224 Probe Sets (205 Gene) differentiell exprimiert. Besonders interessant zeigten sich die Ergebnisse der supervised-Analyse nach Einteilung der Patienten anhand der Ausprägung eines Multiorganversagens. 660 Probe Sets (642 Gene) waren bei Patienten mit Anzeichen eines solchen (MOF Score ≥4 Punkte) hochsignifikant differentiell exprimiert im Vergleich zu Patienten ohne klinische Hinweise auf ein manifestes Multiorganversagen (MOF-Score < 4 Punkte). Schließlich konnten in einer weiteren supervised-Analyse 763 Probe Sets (696 Gene) identifiziert werden, deren Expression je nach dem, ob der Patient das Trauma überlebt hatte, oder im späteren posttraumatischen Verlauf verstorben war, erneut ein hochdifferentiell unterschiedliches Expressionsprofil aufweisen. Somit lässt sich Fragestellung ii) dahingehen beantworten, dass es tatsächlich spezifische Genxpressionsmuster gibt, die durch verschiedene klinische Situationen, wie z.B. die Verletzungsschwere, Massentransfusionen, die Entwicklung eines Multiorganversagens oder das endgültige klinische Outcome induziert werden können. Zur Beantwortung der Fragestellung iii) wurden Pathway Analysen durchgeführt. Dieses Instrumentarium fasst den derzeitigen Stand der wissenschaftlichen Erkenntnisse in einer groß-dimensionierten Software zusammen und zeigt die biologisch-funktionellen Beziehungen der einzelnen Faktoren auf. Dabei fanden sich für die klinische Entität der Verletzungsschwere vor allem Gene, die bei der oxydativen Phosphorylierung von Proteinen eine Rolle spielen, als differentiell exprimiert. Patienten, die einer massiven Bluttransfusion zugeführt werden mussten, zeigen eine signifikant andere Regulation des Ubiquitin-C Pathways als Patienten mit geringerem Transfusionsbedarf. Bei polytraumatisierten Patienten, die im Beobachtungszeitraum Anzeichen eines Multiorganversagens entwickelten, zeigte die Pathway Analyse Software eine unterschiedliche Regulation des Ephrin Rezeptor Pathways. Betrachtet man schließlich das Datenset der Outcome-klassifizierenden Gene, so fällt auf, dass Patienten mit positivem klinischen Outcome eine hochsignifikant andere Expression der PPAR-Signalkaskade aufweisen im Vergleich zu Patienten, die im späteren posttraumatischen Verlauf verstorben waren. Somit lässt sich Fragestellung iii) dahingehend beantworten, dass in der Tat einzelnen, biologisch relevanten, funktionellen Gruppen spezifische, klinische Ereignisse zugeordnet werden können. Die vorliegende Arbeit zeigt somit erstmals, dass es Trauma-responsive, hochspezifische mRNA Expressionsmuster und Signalkaskaden in Monozyten polytraumatisierter Patienten in der unmittelbaren posttraumatischen Phase gibt, die nicht nur mit dem Ausmaß des Traumas, sondern auch mit dem klinischen Verlauf des Patienten hochsignifikant korrelierbar sind.

Gastrointestinale Stromatumore (GIST) sind mit einer Inzidenz von etwa 0,3 bis 2 Fällen pro 100000 insgesamt seltene Tumore. Dennoch stellen sie unter den Weichteilge-webstumoren des Verdauungstraktes mit 1-3% aller Malignome die häufigste Fraktion dar. Sie sind verwandt mit den Cajal-Zellen, die als GI-Schrittmacherzellen angesehen werden. GIST entstehen durch Mutationen im c-kit Protoonkogen, welches für eine mit CD 117 positiv anfärbbare Tyrosinkinase Typ III kodiert. Die daraus resultierende, unkontrollierte Aktivierung durch Phosphorylierung von Wachstumssignalen führt zum Tumorwachstum. Die Tumore werden anhand ihres Aggressivitätsrisikos, ermittelt aus Größe und Mitosera-te, in sehr niedrige, niedrige, intermediäre und hohe Malignitätsrisikoklassen eingeteilt. Wir betrachteten retrospektiv ein Patientengut von 45 Patienten aus den Jahren 1991 bis Ende 2003. 30 (66,7%) davon waren primäre GIST und 15 (33,3%), hauptsäch-lich Leiomyosarkome, wurden durch Klinik, Tumorpathologie und Färbeverhalten (CD 117 positiv) zu GIST re-klassifiziert. In diesem Patientengut lag ein ausgeglichenes Ver-hältnis unter den Geschlechtern vor bei einem mittleren Erkrankungsalter von 60,4 Jahren. Allgemeine, unspezifische klinische Symptome, unspezifische Laborwerte und Tumor-marker sowie die Seltenheit des Tumors erschwerten insgesamt die Diagnosestellung. Die weitaus häufigste Tumorlokalisation war bei uns der Magen (62,2%), gefolgt von multiplen Infiltrationen (17,8%) und dem Dünndarm (9%). Entsprechend waren die häufigsten Eingriffe Magenteilresektionen (48,9%) und Gastrektomien (8,9%). Daran schlossen sich in 17,8% der Fälle en-bloc Resektionen des Tumors und Dünndarmteilre-sektionen (6,7%) an. Dabei wurden 73,3% der Patienten mit kurativer Absicht und 17,8% mit palliativer Zielsetzung operiert. Eine R0-Resektion konnte bei 66,7% erzielt werden. In 11,1% der Fälle wurde jeweils ein R1- oder R2-Status erreicht. Überwiegend wurden von uns Tumore mit hohem Aggressivitätsrisiko (62,2%) gesehen. Bei einer 5-Jahresüberlebensrate von insgesamt 61,6% sahen wir als signifikantesten Prognoseparame-ter den Residualstatus mit einer 5-Jahresüberlebensrate von 85% bei R0-Status gegenüber 30,5% bei R1/R2-Status (p=0,002). Ein signifikanter Prognoseunterschied in Abhängigkeit von der Tumoraggressivität konnte von uns nicht bestätigt werden. Dennoch nehmen auch wir diesen, in anderen Studien häufig gesehenen und hoch signifikanten Unterschied an.

Zusammenfassung Die Protease Separase trägt zur Regulation mitotischer und meiotischer Vorgänge entscheidend bei. Ihre klassische Funktion ist die Induktion der Schwesterchromosomen-trennung durch Spaltung des Cohesin-Proteinkomplexes, der die Schwesterchromatiden von der S-Phase bis zur Mitose gepaart hält. Separase wird am Ende der Metaphase durch Ubiquitin-abhängigen Abbau ihres Inhibitors Securin aktiviert. Ein zweiter Separase-Inhibitionsmechanismus ist die Hemmung durch Cyclin B1/Cdk1 („Cyclin Dependent Kinase 1“). Dafür ist Separase-Phosphorylierung durch Cdk1 notwendig (Stemmann et al., 2001). In vielen Modellorganismen hat Separase Funktionen, die über die Anaphase-Induktion hinausgehen. So trägt sie in S. cerevisiae beispielsweise zur Cdk1-Inaktivierung beim Meiose I-Meiose II-Übergang bei. Diese Separase-Funktion benötigt die proteolytische Separase-Aktivität nicht, ist jedoch abhängig vom Securin-Abbau. Für andere Funktionen der Separase hingegen könnte die Separase-abhängige Spaltung noch nicht identifizierter Substrate notwendig sein. In der vorliegenden Arbeit wird deshalb die Etablierung der IVEC-Methode („In Vitro Expression Cloning“) zur Identifizierung neuer Separase-Substrate vorgestellt. Mittels IVEC wurde - basierend auf der proteolytischen Separase-Aktivität - aus einer menschlichen cDNA-Bibliothek das In-vitro-Separase-Substrat GASP isoliert. Des Weiteren wurde die Separase-Hemmung durch Cyclin B1/Cdk1 näher untersucht. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Phosphorylierung von Separase durch Cyclin B1/Cdk1 für ihre Inhibition zwar notwendig, aber nicht hinreichend ist. Nach Phosphorylierung der Separase assoziiert die Kinase stabil mit der Protease, und erst diese Komplexbildung führt letztendlich zur Inhibition der proteolytischen Separase-Aktivität. Cyclin B1/Cdk1 ist also ein nicht-katalytisch wirkender Separase-Inhibitor. Die zeitlich korrekte Separase-Aktivierung ist für die fehlerlose Chromosomentrennung essentiell. Da Zellen ohne Securin ihre Chromosomen jedoch akkurat und zum richtigen Zeitpunkt trennen, muss es alternative Separase-Inhibitionsmechanismen geben. Die Separase-Hemmung durch Cyclin B1/Cdk1-Bindung könnte dieser gesuchte Securin-unabhängige Mechanismus sein, da der Separase-Cyclin B1/Cdk1-Komplex in Zellen bereits vor der Anaphase nachgewiesen werden kann und Cyclin B1 - wie Securin - am Ende der Metaphase Ubiquitin-vermittelt abgebaut wird. Securin und Cyclin B1/Cdk1 können nicht gleichzeitig an Separase binden. Die beiden Inhibitoren sind also Komponenten parallel und nicht konvergent wirkender Regulationsmechanismen. Die Phosphorylierung von Separase an Serin 1126 ist für ihre Cyclin B1/Cdk1-abhängige Inhibition essentiell (Stemmann et al., 2001). Daneben konnte in der hier vorgestellten Arbeit eine zweite Domäne in Separase identifiziert werden, die ebenfalls sowohl für die Inhibition der proteolytischen Separase-Aktivität als auch für die Komplexbildung mit Cyclin B1/Cdk1 nötig ist. Da diese zweite Cyclin B1/Cdk1-Bindungsdeterminante Sequenzhomologie zu dem Cdc6-Protein aufweist, wurde sie CLD („Cdc6 Like Domain“) genannt. Cdc6 ist ein konserviertes Protein, das in S. cerevisiae Cdk1-Inhibitionsaktivität besitzt. Dazu bindet es abhängig von der Phosphorylierung seines Aminoterminus direkt an B-Typ-Cycline, die sich im Komplex mit ihren Cdks befinden (Mimura et al., 2004). Durch Phosphatase-behandlung und Mutationsanalyse konnte bewiesen werden, dass die Interaktion zwischen Separase und Cyclin B1/Cdk1 auch von Phosphorylierung der Protease innerhalb ihrer CLD abhängt. Dies legt nahe, dass die Separase-CLD wie der Cdc6-Aminoterminus direkte Kontakte mit der Cyclin-Untereinheit der Kinase ausbildet. Serin 1126-Phosphorylierung ist dagegen indirekt an der Kinase-Bindung beteiligt. Denn erstens wird sie nach der Etablierung des Komplexes für seinen Erhalt nicht mehr benötigt (Holland et al., 2006), und zweitens ist sie für die Wechselwirkung zwischen CLD-enthaltenden Separasefragmenten und der Kinase abkömmlich. Ein zunächst favorisiertes Bindungsmodell, bei dem die Polo-Kinase an phosphoryliertes Serin 1126 bindet, um danach die Bindung von Cyclin B1 durch Phosphorylierung der CLD zu vermitteln, konnte ausgeschlossen werden. Stattdessen bewirkt die Phosphorylierung von Serin 1126 wohl eine Konformationänderung der CLD, die dadurch in die Lage versetzt wird, starke Wechselwirkungen mit der Cyclin B1-Untereinheit der Kinase einzugehen. Überraschenderweise ist im Separase-Cyclin B1/Cdk1-Komplex auch die Kinase inaktiv. Diese unerwartete Separase-Funktion als Cdk1-Inhibitor ist in Oozyten der Maus für den Übergang von der Meiose I in die Meiose II von entscheidender Bedeutung. Denn die Inhibition der Separase-Cyclin B1/Cdk1-Komplexbildung durch Mikroinjektion entsprechender Antikörper in Maus-Oozyten verhindert den Ausstoß des ersten Polkörpers, d.h., die Eizellen können den Meiose I-Meiose II-Übergang nicht vollziehen. In diesen Oozyten sinkt die Cdk1-Aktivität am Ende der Meiose I nicht wie bei Kontroll-Oozyten ab. Diese persistente Cdk1-Aktivität ist der Grund für den verhinderten Übergang von Meiose I nach -II, da künstliche Cdk1-Inhibition in Anwesenheit des inhibitorischen Antikörpers den Polkörperausstoß wiederherstellt. In mitotischen Zellen steigt der unter endogenen Bedingungen mit Separase assoziierte Anteil von Cyclin B1/Cdk1 in der Anaphase - d.h. nach dem Abbau seines Bindungskompetitors Securin - an. Übertragen auf die Meiose bedeutet das, dass Securin-Abbau die Induktion der Anaphase mit der Separase-abhängigen Cdk1-Inaktivierung koppelt.

Für den antiproliferativen Effekt der Kombinationstherapie aus UVA-Strahlung mit dem Furocoumarin Psoralen (PUVA) wird die Ausbildung von Doppelstrangvernetzungen (Interstrand Cross Links, ICL) verantwortlich gemacht. Unklar war, ob der PUVA-induzierte Zellzyklusarrest durch Doppelstrangvernetzungen, die die Replikationsgabeln mechanisch behindern, oder durch die Aktivierung von Zellzykluscheckpoints ausgelöst wird. Zellzykluscheckpoints garantieren die Stabilität des Genoms, indem sie die Zellzyklusprogression soweit verlangsamen oder anhalten, dass die Replikation von aufgetretenen DNA-Schäden oder Fehlverteilungen von Chromosomen verhindert werden kann. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass HaCaT-Keratinozyten durch PUVA-Exposition mit S-Phase-DNA-Gehalt arretiert werden. Zellen, die die DNA-Replikation bereits abgeschlossen hatten, waren von der PUVA-Exposition unbeeinträchtigt und durchliefen die Mitose. Zellen, die während der G1-Phase PUVA exponiert worden waren, durchquerten die G1-Phase und arretierten erst in der frühen S-Phase. PUVA induzierte eine schnelle Phosphorylierung der Chk1-Checkpointkinase an Serin 345, die mit einer Abnahme von Cdc25A einherging. Die Chk1-Phosphorylierung, die Abnahme von Cdc25A und der S-Phase-Arrest konnten durch Koffein aufgehoben werden. Dies lieferte den Beweis, dass die Aktivierung von Checkpointsignalkaskaden und nicht eine passive, mechanische Blockierung durch DNA-Doppelstrang-vernetzungen für den PUVA-induzierten Replikationsarrest verantwortlich ist. Die Überexpression von Cdc25A konnte den S-Phase-Arrest nur zum Teil aufheben, woraus sich folgern lässt, dass die Aktivierung von zusätzlichen Signalwegen an der Ausbildung des PUVA-induzierten S-Phase-Arrests beteiligt ist.

Um Aneuploidie zu verhindern, muss die Trennung der Chromosomen in der Anaphase mit hoher Genauigkeit und daher streng reguliert ablaufen. Bisher galt folgendes Modell der eukaryontischen Schwesterchromatidentrennung: Der „anaphase promoting complex/cyclosome” (APC/C) wird erst aktiviert, wenn alle Chromosomen ordnungsgemäß bipolar an die Mikrotubuli des Spindelapparates angeheftet sind. In seiner Eigenschaft als Ubiquitinligase katalysiert der APC/C dann den proteasomalen Abbau des Anaphaseinhibitors Securin aus dem Komplex mit Separase. Die auf diese Weise als Protease aktivierte Separase löst daraufhin die Anaphase aus, indem sie den Proteinkomplex Kohäsin, welcher die Schwesterchromatiden zusammenhält, spaltet. Das Ausbleiben eines Phänotyps beim Verlust von Securin deutet jedoch auf die Existenz weiterer Regulationsmechanismen der Anaphase hin. Der APC/C sorgt gleichermaßen für den Abbau von Cyclin B1. Die damit verbundene Inaktivierung der Cyclin-abhängigen Kinase 1 (Cdk1) führt zum Austritt aus der Mitose. Im Gegensatz zur Bäckerhefe, in der die Cdc14-Phosphatase ebenfalls als essentieller Gegenspieler von Cdk1 fungiert, repräsentierte in höheren Eukaryonten der APC/C-abhängige Abbau von Cyclin B1 den einzig bekannten Mechanismus zur Cdk1-Inaktivierung. Bisher glaubte man, dass nach dem APC/C die zur Anaphase und zum Mitoseaustritt führenden Signalwege strikt getrennt voneinander verlaufen. Daher war die kürzlich gemachte Beobachtung unerwartet, wonach die durch nicht abbaubares Cyclin B1 konstitutiv aktivierte Cdk1-Kinase die Schwesterchromatidentrennung in Xenopus Eiextrakten blockiert und zwar durch eine Securin-unabhängige Inhibition von Separase. Obwohl die Mutation von Separase an Cdk1-Phosphorylierungsstellen die Kohäsinspaltung in Gegenwart von aktiver Cdk1 wiederherstellte, blieben die molekularen Details der Cdk1-abhängigen Separaseinhibition unklar. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass die Phosphorylierung zwar notwendig aber nicht hinreichend ist, um Separase zu inaktivieren. Zur Inhibition kommt es erst, wenn in einem zweiten Schritt der Cdk1-Komplex stabil und unabhängig von seiner Kinaseaktivität an zuvor phosphorylierte Separase bindet. Es wurde eine Region in Separase identifiziert, die wahrscheinlich in Abhängigkeit von ihrer Phosphorylierung durch die regulatorische Cyclin B1-Untereinheit von Cdk1 erkannt wird. Da sich Securin- und Cdk1-Bindung an Separase gegenseitig ausschließen, stellen sie, anders als ursprünglich angenommen, nicht konvergente sondern parallele Inhibitions-mechanismen dar. Bei der Rekonstitution des Separase-Cdk1 Komplexes wurde eine neue Funktion von Vertebraten-Separase als ein direkter, stöchiometrischer Cdk1-Inhibitor entdeckt, welche unabhängig von der proteolytischen Aktivität ist. Eine durch Mutantenanalyse verifizierte Sequenzhomologie im Cyclin B-bindenden Bereich zwischen Separase und dem Cdk1-Inhibitor Cdc6 aus S. cerevisiae bestätigt dieses Ergebnis. Mikroinjektionsexperimente an Oozyten zeigen, dass die Separase-vermittelte Inhibition von Cdk1 eine essentielle Rolle während der Meiose I spielt. Separase ist also nicht nur ein universeller Auslöser der eukaryontischen Anaphase, sondern sie wirkt auch, trotz unterschiedlicher Mechanismen in Hefe und Vertebraten, als konservierter Cdk1-Antagonist und koppelt damit die Anaphase mit dem Austritt aus der Meiose I.

Einfluss der F1FO-ATP Synthase-Oligomerisierung auf den bioener-getischen Zustand von Mitochondrien Eine wichtige Funktion der Mitochondrien besteht in der Bereitstellung von ATP, dessen Synthese durch die OXPHOS-Komplexe der Innenmembran bewerkstelligt wird. Zusätzlich besitzt die F1FO-ATP Synthase eine strukturgebende Aufgabe. Dazu bildet diese Oligomere aus, die für die Ausbildung von Cristaestrukturen essentiell sind. Insbesondere die oligomer-spezifischen Untereinheiten Su e und Su g sind dafür, nicht jedoch für die enzymatische Aktivität der F1FO-ATP Synthase, notwendig. Der Einfluss der F1FO-ATP Synthase Assemblierung auf den bioenergetischen Zustand von Mitochondrien wurde in dieser Arbeit untersucht. Teildeletionen der C-terminalen ‚coiled-coil’-Domänen von Su e weisen eine verringerte Stabilität der Oligomere auf. Diese Destabilisierung geht mit einer Reduktion des mitochondrialen Membranpotentials und der Wachstumsrate einher, ist jedoch für die Ausbildung von Cristaestrukturen hinreichend. Des Weiteren sind die enzymatischen Aktivitäten der Atmungskettenkomplexe, die Integrität der Innenmembran sowie die Verlustrate der mtDNA in diesen Mutanten nicht beeinträchtigt. Der beobachtete Phänotyp ist daher nicht auf Sekundäreffekte zurückzuführen. Diese Arbeit unterstützt ein Modell, nach dem die Assemblierung der F1FO-ATP Synthase zu Oligomeren für die räumliche Anordnung auch von anderen Proteinkomplexen in Form von Mikrodomänen für einen effizienten Substratumsatz während der oxidativen Phosphorylierung oder für deren Regulation notwendig ist. Somit hat die Stabilität der F1FO-ATP Synthase-Oligomere einen Einfluss auf die bioenergetische Leistungsfähigkeit von Mitochondrien. Charakterisierung der mitochondrialen Rhomboidprotease Pcp1 Das Dynamin-ähnliche mitochondriale Protein Mgm1 kommt in zwei Isoformen vor, die möglicherweise an der Ausbildung von Cristaestrukturen beteiligt sind. Die kurze Isoform, s-Mgm1, entsteht in Abhängigkeit von der hochkonservierten Intramembran-Rhomboidprotease Pcp1. Zur genaueren Aufklärung dieser Prozessierung wurde die Topologie und Biogenese von Pcp1 ermittelt. Pcp1 durchspannt die mitochondriale Innenmembran mit sieben Transmembrandomänen und besitzt eine Nin-Cout-Topologie. Untersuchungen zum Import von Pcp1 zeigen, dass dessen Import in die innere Membran von der TIM23-Translokase vermittelt und die mitochondriale Signalsequenz schrittweise durch die zwei Proteasen MPP und MIP entfernt wird. Außerdem wird möglicherweise die C-terminale Transmembrandomäne von Pcp1, entsprechend einem ‚Stop-Transfer’-Mechanismus, in der TIM23-Translokase arretiert und anschließend lateral in die Innenmembran inseriert. Alternativ wird Pcp1 zunächst vollständig in die Matrix importiert und anschließend über den konservativen Sortierungsweg in die Innenmembran inseriert. Die bisherigen Ergebnisse lassen eine Unterscheidung zwischen diesen beiden Möglichkeiten nicht zu. Aufgrund von Sequenzvergleichen verschiedener Rhomboidproteasen wurden wie in anderen Serinproteasen drei konservierte Aminosäurereste als mögliche katalytische Triade postuliert. Um dies zu untersuchen, wurden diese Aminosäurereste jeweils gegen Alanin ausgetauscht. Zwei dieser Punktmutationen, in Serin-256 oder Histidin-313, führen zur vollständigen Inaktivierung von Pcp1, während die Aminosäure Asparagin-202 für die Aktivität nur partiell notwendig ist. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass die mitochondriale Rhomboidprotease Pcp1 mit einer katalytischen Diade eine besondere Stellung unter den Serinproteasen einnimmt.

Das gasförmige Stickstoffmonoxid (NO) steuert die Relaxation glatter Muskulatur. Dabei aktiviert NO die lösliche Guanylatzyklase im Zytosol der glatten Muskelzelle. Die lösliche Guanylatzyklase bildet den Botenstoff cGMP, der die cGMP-abhängige Proteinkinase (cGK) aktiviert. Die cGK gehört zur Familie der Serin/ Threonin-Proteinkinasen und führt nach Phosphorylierung von unterschiedlichen Signalproteinen zur Relaxation der glatten Muskulatur. Der Beitrag des NO/ cGMP/ cGK-Signalwegs zur glattmuskulären Relaxation kann mit Hilfe von genetisch veränderten Mauslinien, denen Komponenten dieses Signalwegs fehlen, untersucht werden. In der vorliegenden Arbeit werden neben Wildtyp-Mäusen mit intaktem NO/ cGMP/ cGK-Signalweg die cGKI-/--Mäuse, denen das Protein cGKI deletiert ist, und die IRAG∆12/∆12-Mausmutanten, die nach Zerstörung des Exon 12 des IRAG-Gens zwei hypomorphe IRAG-Allele besitzen, verwendet. Im Rahmen dieser Arbeit werden die cGMP-abhängigen Mechanismen der Relaxation nach Hormon- und Kalium-induzierter Stimulation glatter Muskelzellen untersucht. Die Experimente werden einerseits am intakten und permeabilisierten Gefäß und andererseits an kultivierten, vaskulären glatten Muskelzellen durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen die Existenz unterschiedlicher Mechanismen zur cGMP-vermittelten Relaxation an der Mausaorta. Nach Hormon-induzierter Stimulation wird der Gefäßtonus durch den cGMP/ cGKI-Signalweg relaxiert. Dabei wird der Effekt hauptsächlich über IRAG durch Hemmung der Ca2+-Freisetzung aus den intrazellulären Speichern vermittelt. Die Kalium-vermittelte Kontraktion wird ebenso cGMP/ cGKI-abhängig relaxiert, jedoch unabhängig von IRAG. Überraschenderweise demonstrieren die Ergebnisse an der permeabilisierten Aorta, dass die cGMP/ cGKI-vermittelte Ca2+-Desensitisierung eine untergeordnete Rolle spielt und in Gegenwart hoher cGMP-Konzentrationen über die Protein Kinase A vermittelt wird. Die Kontraktionsexperimente mit Thapsigargin weisen darauf hin, dass vermutlich die SERCA an der Relaxation des Kalium-induzierten Tonus beteiligt ist.

Aktivierende Mutationen in Rezeptortyrosinkinasen spielen eine wichtige Rolle in der Pathogenese solider und hämatologischer Neoplasien, wie der akuten myeloischen Leukämie (AML). Im Rahmen dieser Arbeit wurden bislang nicht-charakterisierte Mutationen der Protoonkogene c-KIT und FLT3, die in der AML auftreten, in Zellkulturmodellen auf ihr transformierendes Potential hin untersucht. In-frame-Mutationen in Exon 8 des c-KIT-Gens, die aus kleinen Deletionen mit oder ohne Insertionen im extrazellulären Bereich bestehen, treten nahezu ausschließlich in Core-binding-Faktor-Leukämien auf und verschlechtern die Prognose der betroffenen Patienten. Drei repräsentative Exon-8-Mutationen wurden stabil in IL-3-abhängigen Ba/F3-Zellen exprimiert. Sie führten zur Hyperaktiverung des Rezeptors nach Ligandenstimulation, was sich in verstärkter Proliferation und Resistenz gegenüber Apoptose äußerte. In Rezeptor-Crosslinking-Experimenten zeigte eine repräsentative Exon-8-Mutante spontane und erhöhte liganden-induzierte Dimerisierung. Die biologischen Effekte konnten anhand einer erhöhten Phosphorylierung des nachgeordneten Signalmoleküls Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK) bestätigt werden. Im Gegensatz dazu hatte der FLT3-D324N-Single-Nukleotid-Polymorphismus, der in 6.4% von De-novo-AML-, 9.0% von CML- und 4.5% von ALL-Patientenproben detektiert wurde, keinerlei Auswirkungen auf die Prognose von AML-Patienten und wurde auch bei Kontrollpersonen gefunden (1.5%). Er wies keine funktionellen Unterschiede zu Wildtyp-FLT3 hinsichtlich Rezeptorphosphorylierung, Proliferation oder Apoptoseresistenz auf. Im Gegensatz zu Exon-8-Mutationen besitzen KIT-Mutationen in der Aktivierungsschleife, die – wie hier gezeigt wurde- die Prognose von Patienten mit günstigem Karyotyp verschlechtern, Resistenz gegenüber dem PTK-Inhibitor Imatinib. Zwei dem Imatinib nicht-verwandte Inhibitoren – PKC412 und SU5614 – wurden auf die Ansprechbarkeit von KIT-D816V getestet. Nur PKC412 war in der Lage, das spontane Wachstum von KIT-D816V-transduzierten Ba/F3-Zellen und die Rezeptorautophosphorylierung in HEK 293T-Zellen zu inhibieren. PKC412 führte überdies in den Ba/F3-Zellen zu einem deutlichen G0/G1-Arrest. Die beschriebenen In-vitro-Versuche können zwar einen ersten Einblick in die Rolle der untersuchten Mutationen in der AML bieten, tiefergehende Modelle sind jedoch vonnöten, um das Verständnis der Krankheitsentstehung in diesem Kontext zu erhöhen.

Podosomen sind ein prominenter Teil des Aktinzytoskelettes primärer humaner Makrophagen und wahrscheinlich essentiell für Adhäsion, Matrixverdau und gerichtete Migration. In der vorliegenden Arbeit wurde die Regulation dieser Strukturen untersucht. Es konnte zunächst gezeigt werden, dass Monozyten Podosomen nicht nur auf starren, künstlichen Oberflächen wie Glas-Deckgläschen ausbilden, sondern auch auf einem Monolayer aus Endothelzellen. Dies unterscheidet sie klar von anderen Adhäsionsstrukturen wie z.B. focal adhesions. Auch in verschiedenen Zelllinien, unter anderem in Krebszellen, ließen sich podosomale Strukturen nachweisen bzw. induzieren. Diese Befunde sind Hinweis einerseits auf die physiologische Relevanz von Podosomen und andererseits auf eine wahrscheinlich weite Verbreitung dieser Strukturen in verschiedenen Zelltypen. Podosomen sind hochdynamische Strukturen mit einer Halbwertszeit von 2-12 Minuten, das heißt, es werden permanent Podosomen abgebaut und neu gebildet. Dazu ist die Polymerisation und Depolymerisation von filamentösem (F-)Aktin notwendig. Regulationsmechanismen F-Aktin-aufbauender Wege sind gut untersucht und bekannt, weshalb in der vorliegenden Arbeit F-Aktin-abbauende Wege untersucht wurden. Ein wichtiger Regulator des Aktinzytoskelettes ist Cofilin, das die Depolymerisierung von Aktinfilamenten beschleunigt und unter anderem durch Phosphorylierung am Serin-3 inaktiviert werden kann. Folgende Ergebnisse sprechen für eine wichtige Rolle von Cofilin in der Podosomen-Regulation: Es konnte eine spezifische Lokalisation von Cofilin und phosphoryliertem Cofilin in der Aktin-reichen Podosomen-Kernstruktur nachgewiesen werden. Im Western Blot zeigte sich eine Korrelation des Grades der Cofilin-Phosphorylierung mit der Podosomenanzahl. Durch Mikroinjektion eines kurzen Peptids, welches die Cofilin-Phosphorylierung inhibiert, sowie durch Transfektion von Cofilin-siRNA konnte die Podosomen-Bildung reduziert werden. Die am besten untersuchten Cofilin-Kinasen sind die LIM-Kinasen 1 und 2. Mittels RT-PCR war in unserer Arbeitsgruppe bereits die Expression von LIMK1 in Makrophagen nachgewiesen worden. Auch Ergebnisse im Western Blot sowie in DNA-Arrays weisen auf LIMK1 als dominante Isoform in Makrophagen hin. In fixierten Präparaten konnte allerdings weder mit kommerziell erhältlichen noch mit einem selbst hergestellten, gegen die LIM-Domänen von LIMK1 gerichteten Antikörper eine spezifische Lokalisation von LIMK1 an Podosomen nachgewiesen werden. Mittels Nucleofection wurden deshalb verschiedene LIM-Kinase-Konstrukte transfiziert und überexprimiert. Dabei bestätigten sich die Ergebnisse der Antikörperfärbungen, keines der Konstrukte war in Podosomen zu finden. Alle Konstrukte mit Kinase-Aktivität führten zum raschen Krampfen und Ablösen der Zellen, wobei die Adhäsionsfläche bis zuletzt mit Podosomen bedeckt war. Im Gegensatz zu den Befunden aus der Transfektion war durch Mikroinjektion der konstitutiv aktiven Kinase-Domäne von LIMK1 eine deutliche Reduktion der Podosomen-Bildung zu erzielen. Hier können konzentrationsabhängige Effekte eine Rolle spielen. Als Gegenspieler der LIM-Kinasen wurden die Phosphatasen PP1 und PP2A beschrieben. Eine spezifische Lokalisation von PP2A an Podosomen war jedoch nicht nachzuweisen, zudem hatte eine Inhibition der beiden Phosphatasen keinen Effekt auf die Podosomenbildung oder den Podosomenabbau. Dies spricht gegen eine Beteiligung von PP1 oder PP2A an der Podosomenregulation. LIM-Kinasen selbst können durch Effektoren der Rho-GTPasen Rho, Rac und Cdc42 reguliert werden. So aktiviert der Rho-Effektor ROCK LIMK1 und LIMK2. Der ROCK-Inhibitor Y?27632 führte zu einer Störung der Podosomen-Verteilung, auch die Podosomen-Neubildung wurde stark inhibiert. Dies spricht für eine Beteiligung von ROCK an der Podosomenregulation. Auch Rac und Cdc42 können durch die gemeinsamen Effektoren der PAK-Familie eine Aktivierung von LIMK1 bewirken, dabei sind PAK1 und PAK4 die am besten untersuchten Isoformen. Die Transfektion verschiedener PAK1- und PAK4-Konstrukte führte jeweils zu einer Reduktion der Podosomen-Anzahl, unabhängig von der Kinase-Aktivität des Konstruktes. Die Kinase-inaktive PAK4-Mutante führte zu einer Reduktion des F-Aktin mit kleinen Podosomen, während die konstitutiv-aktive PAK4-Mutante große Podosomen mit vermehrtem F-Aktin bewirkte. Weitere Arbeiten zur Untersuchung vor allem von PAK4 in unserer Arbeitsgruppe konnten diese Ergebnisse bestätigen und quantifizieren sowie weitere Interaktionspartner nachweisen. Eine weitere Regulationsmöglichkeit von Cofilin ist die Bindung des second messengers PIP2, welcher unter anderem durch Isoformen der Phospholipase C (PLC) hydrolysiert werden kann. Die Mikroinjektion zweier Peptide, die laut Literatur zu einer PIP2-Inhibition bzw. einer Steigerung des PIP2-Abbaus führen, hatte keinen Einfluss auf Podosomen. Durch Transfektion der PH-Domäne von PLCd1, welche als PIP2-Sensor eingesetzt werden kann, konnte jedoch eine teilweise Lokalisation von PIP2 an Podosomen gefunden werden. Mit spezifischen Antikörpern konnte zudem eine Lokalisation von PLCb1 im Aktin-reichen Podosomenkern und von PLCb2 in der podosomalen Ringstruktur nachgewiesen werden, PLCb3 zeigte keine spezifische Lokalisation. Auch ein PLCb2-Konstrukt reicherte sich nach Transfektion in der podosomalen Ringstruktur an. Der PLC-Inhibitor U-73122 führte zu einem kompletten Verschwinden der Podosomen mit nachfolgender Ablösung der Zellen. Aufgrund dieses Befundes und der spezifischen Lokalisation ist von einer Beteiligung der PLCb1 und PLCb2 in der Podosomen-Regulation auszugehen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten somit wichtige Effektoren der podosomalen Aktinregulation identifiziert werden: Cofilin als direkter Interaktionspartner von Aktin, LIMK1 als Cofilin-Regulator sowie ROCK und PAK als upstream-Regulatoren in der Signalkaskade. Darüber hinaus scheinen PLCb1 und PLCb2, möglicherweise über PIP2, ebenfalls an der Podosomen-Regulation beteiligt zu sein. Dies legt die Grundlage für weitere Untersuchungen über die molekularen Mechanismen der podosomalen Aktinregulation.

Neuere Studien zeigen, dass Fehlregulationen alternativer Spleißprozesse erheblichen Einfluss auf die Entstehung von Krankheiten besitzen können. Exon 10 des Tau-Gens wird alternativ gespleißt und je nachdem, ob das Exon ein- oder ausgeschlossen wird, werden Isoformen mit drei (Tau -Exon 10) bzw. vier (Tau +Exon 10) Mikrotubuli-Bindungsmotiven generiert. Bei der Frontotemporalen Demenz mit Parkinsonismus gekoppelt an Chromosom 17 (FTDP-17) führen bestimmte Spleißmutationen zur Retention von Exon 10. Wie die FTDP-17 gehört auch die Alzheimer-Erkrankung zu den sog. Tauopathien, einer Gruppe von Krankheiten, die durch übermäßige Ablagerungen des Tau-Proteins im Gehirn charakterisiert sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurde an humanem post mortem Gewebe untersucht, ob der Alzheimer-Erkrankung ein Fehler im Regulationsmechanismus des alternativen Spleißens zugrunde liegt. Mittels RT-PCR und Western Blot wurde das Spleißmuster von Tau Exon 10, dem humanen Transformer2-beta (Htra2-ß) und der CDC-ähnlichen Kinase2 (Clk2) untersucht. Ebenso wie Tau Exon 10 werden auch Htra2-ß und Clk2 alternativ gespleißt, wodurch Isoformen mit unterschiedlichen Funktionen entstehen können. Auf mRNA-Ebene konnte gezeigt werden, dass es im präfrontalen und temporalen Kortex der Alzheimer-Gehirne im Vergleich zu Kontrollhirnen zu einer signifikant stärkeren Expression der Isoform tau +Exon10 kommt. Ein möglicher Mechanismus könnte die Regulation des in Zellkulturexperimenten beobachteten Einflusses von hTRA2-ß auf das alternative Spleißen von Tau Exon 10 sein. Die im Temporalkortex der Alzheimer-Patienten verstärkt exprimierte Isoform htra2-ß1 unterstützt diese Befunde. Ebenfalls aus Zellkulturexperimenten ist bekannt, dass CLK2 sowohl das alternative Spleißen von Htra2-ß wie auch wahrscheinlich indirekt das von Tau Exon 10 beeinflusst. Untersuchungen zur RNA-Expression von clk2 ergaben, dass die phosphorylierungsaktive Isoform clk2 +Exon 4 in allen untersuchten Regionen bei Alzheimer-Patienten im Vergleich zu Kontrollen signifikant vermindert exprimiert wird. Dies deutet auf ein Zusammenspiel zwischen Clk2, Htra2-ß und dem alternativen Spleißen von Tau Exon 10 hin, sodass man sowohl von Htra2-ß wie auch Clk2 einen Einfluss auf die Regulation des alternativen Spleißens von Tau Exon 10 annehmen könnte. Basierend auf Forschungsergebnissen zum Einfluss von Phosphatase-Inhibitoren auf alternatives Spleißen in der spinalen Muskelatrophie (SMA), ist es denkbar, mittels spezifischer Phosphatase-Inhibitoren Einfluss auf die Fehlregulation des alternativen Spleißens von Tau Exon 10 zu nehmen. So könnten beispielsweise Phosphatase-Inhibitoren gegen htra2-ß1 eine verstärkte Phosphorylierung dieses Proteins bewirken und somit den Ausschluss von Tau Exon 10 verstärken. Dieser Mechanismus könnte für die Etablierung eines neuen Therapieansatzes herangezogen werden.

Tau ist ein Mikrotubuli- assoziiertes Protein, dessen Expression im Nervensystem des Menschen der Regulation durch alternatives Spleißen unterliegt. Das Exon 10 dieses Gens, welches für einen Teil der Mikrotutuli- bindenden Domäne kodiert, ist ein für Erwachsene spezifisches Kassettenexon. Mutationen, die den Einschluss von Exon 10 verstärken, resultieren in der Produktion von Tau- Protein, das vier Mikrotubuli- bindende Aminosäuresequenzwiederholungen enthält. Diese Mutationen scheinen in ursächlichem Zusammenhang mit der Frontotemporalen Demenz mit Parkinsonismus gekoppelt an Chromosom 17 (FTDP- 17) zu stehen. In dieser Arbeit konnte mittels Transfektionsexperimenten gezeigt werden, dass die Verwendung von Exon 10 durch ein komplexes Zusammenspiel der CDC- ähnlichen Kinase Clk2, einer SR- Proteinkinase, und des SR- ähnlichen Proteins humaner Transformer 2- b (Htra2- b) reguliert wird. Kotransfektionsexperimente legen den Schluss nahe, dass diese Regulation über mehrere ineinandergreifende Prozesse abläuft. Die Kinase Clk2 scheint dabei sowohl direkt durch Posphorylierung bzw. Hyperphosophorylierung von Htra2- b als auch indirekt durch Einfluss auf die alternative Expression der Htra2- b Isoformen in den Regulationsmechanismus einzugreifen. Phosphorylierung von SR- Proteinen führt zu deren Freisetzung aus den nukleären Speicherkomponenten, den speckles, und damit zur Aktivierung der Spleißreaktion, während sowohl eine Hyper- als auch eine Hypophosphorylierung in der Regel einen hemmenden Einfluss auf Spleißen ausüben. Kontrollierte Phosphorylierung scheint demnach zu einer regulierbaren Veränderung von prä- mRNA- Prozessierungswegen zu führen. Eine Interpretation dieser Resultate könnte als Grundlage für die Entwicklung neuer therapeutischer Konzepte verwendet werden.

Die vorliegende Arbeit beschreibt die durchgeführten Experimente zur Charakterisierung der molekularen Assoziation der Rezeptor-Tyrosinkinase c-Kit mit dem Onkoprotein Bcr-Abl. Es wird in der zeitlichen Abfolge der chronisch myeloischen Leukämie (CML) besonders für die chronische Phase eine Beteiligung des Stammzellfaktors (SCF), dem natürlichen Liganden von c-Kit, an der Proliferation des malignen Zellklons vermutet. Ob hierbei eine Stimulierung durch SCF wesentlich ist, oder ob der Rezeptor von intrazellulärer Seite durch Bcr-Abl stimuliert wird ist eine wichtige Frage für das Verständnis der Progression der CML. Um diese Frage zu beantworten, wurden Expressionssysteme in Säugetierzellen und Insektenzellen optimiert, um eine hohe Produktion von c-Kit zu gewährleisten. Es wurde eine Koexpression von c-Kit und Bcr-Abl hergestellt um gute Bedingungen in den nachfolgenden Immunpräzipitationen (IP) zu schaffen. In diesen Studien konnte eine Kopräzipitation von c-Kit und Bcr-Abl erstmals nachgewiesen werden. Die Bindungspartner waren jeweils im Western-Blot der IP nachweisbar, sowohl nach Präzipitation von Bcr-Abl, als auch von c-Kit. Im Western-Blots konnte der Status der Tyrosinphosphorylierung von c-Kit detektiert werden. Eindeutige Hinweise auf die Aktivierung von c-Kit durch Bcr-Abl konnten durch diese Experimente zum ersten Mal nachgewiesen werden. Punktmutationen an funktionell relevanten Positionen in Bcr-Abl änderten nichts an der gezeigten Interaktion, bis auf eine Kinase-inaktive Mutante, die keine Phosphorylierung von c-Kit mehr bewirkte. Um eine Bindungsstelle in c-Kit zu charakterisieren, wurden dann Trunkationsmutanten von c-Kit hergestellt. Dabei wurde der extrazelluläre Rezeptoranteil entfernt und immer kürzere Mutanten, durch Entfernung einzelner struktureller Domänen von N-terminal, hergestellt. Diese wurden in IPs mit Bcr-Abl eingesetzt. Es konnte für sämtliche Mutanten eine Kopräzipitation gezeigt werden, so dass eine Assoziationsstelle von c-Kit nicht klar ermittelt werden konnte.

Den überwiegend in den Mitochondrien lokalisierten Membranproteinen der Bcl-2-Familie wird eine besonders kritische Bedeutung beim Schutz der Zelle gegen den apoptotischen Zelltod beigemessen. Der genaue Wirkungsmechanismus dieser Proteine ist bis dato unbekannt. Sie sind aber in der Lage, in der mitochondrialen Membran Kanäle zu bilden und dadurch den funktionellen Veränderungen in den Mitochondrien im Verlauf der Apoptose sowie ihrer Schwellung entgegenzuwirken. Eine Störung des mitochondrialen Elektronentransports und die Öffnung der sogenannten „permeability transition“-Pore sind als frühe Ereignisse im Verlauf des apoptotischen Zelltodes bekannt. Der Entkoppler mitochondrialer Atmung und Phosphorylierung, FCCP, verursacht durch eine Erhöhung der Permeabilität der inneren mitochondrialen Membran für Protonen ähnliche Störungen der mitochondrialen Funktion. Ziel dieser Arbeit war es, den Effekt des mitochondrialen Entkopplers FCCP alleine oder in Kombination mit bekannten Apoptoseinduktoren, wie dem Proteinkinase C-Inhibitor Che und dem Serin/Threonin-Proteinkinasehemmer Sts zu untersuchen. Desweiteren sollten biochemische Mechanismen aufgeklärt werden, die der Modulation der Apoptose durch FCCP in Leukämiezellinien des lymphatischen (CCRF-CEM) und myeloischen (HL-60) Ursprungs zugrunde liegen. Der Effekt mitochondrialer Entkoppler auf die durch Che und Sts induzierte Apoptose sollte ausserdem mit der Wirkung bekannter Modulatoren des programmierten Zelltodes wie Caspasehemmer zVAD und Ca2+Mg2+-Endonuklease-Inhibitor ATA in gleichem Modellsystem verglichen werden, um weitere Hinweise über die Stärke und Dauer der apoptosemodulierenden Wirkung von FCCP zu erhalten. Die durchgeführten in vitro Zellkulturuntersuchungen zeigten, dass eine Inkubation der CCRF-CEM- und HL-60-Zellen mit FCCP dosisabhängig den verzögerten Zelltod in beiden Leukämiezellinien induzierte. Im FCS-haltigen Zellkulturmedium wurde in beiden Zellinien eine Apoptose nach 18-stündiger Behandlung mit 4 µM FCCP in 25% der Population beobachtet. 50% der HL-60-Zellen und 85% der CCRF-CEM-Zellen waren apoptotisch oder tot, wenn 20 µM FCCP über einen Zeitraum von 18 Stunden eingesetzt wurden. Ein FCS-Entzug resultierte in der Sensibilisierung der CCRF-CEM- und HL-60-Zellinien gegenüber FCCP: mehr als die Hälfte der Population in beiden Leukämiezellinien waren bereits 12 Studen nach Behandlungsbeginn mit FCCP apoptotisch bzw. tot. Die im Westernblot demonstrierte Caspase-3-abhängige proteolytische Spaltung von PARP, sowie die Reduktion des intrazellulären CPP-32-Spiegels (Procaspase-3) zeigte sich bereits 6 Stunden nach Behandlungsbeginn mit FCCP, statt, verglichen mit 24 Stunden unter normalen Inkubationsbedingungen. Im Verlauf der durch FCCP induzierten Apoptose konnten wir mittels konventioneller DNA-Agarose-Gelelektrophorese keine oligonukleosomale DNA-Fragmentierung (180-200 bp) nachweisen, mit Hilfe der pulsed field-Gelelektrophorese wurden lediglich große DNA-Fragmente (15-40 kbp) aufgezeigt. Nach zweistündiger Inkubation mit 10 µM Che bzw. achtstündiger Behandlung mit 300 nM Sts starben 90% CCRF-CEM-Zellen, während 60% der HL-60-Zellen nach zweistündiger Einwirkung von Che apoptotisch bzw. tot waren. Überraschenderweise war die proteolytische Spaltung von PARP nach Behandlung beider Zellinien mit einer niedrigeren Konzentration von Che (10 µM) ausgeprägter als mit der höheren Konzentration des Proteinkinase C-Hemmers (20 µM), obwohl die Anzahl der toten Zellen direkt proportional zur eingesetzten Che-Konzentration war. Die Zugabe von FCCP bzw. von Caspasen-Inhibitor zVAD verzögerten den durch Che und Sts induzierten apoptotischen Zelltod: 20-40% mehr Zellen überlebten innerhalb der ersten sechs Stunden der Inkubation, wenn 4-20 µM FCCP zum Inkubationsmedium zugegeben wurden, während nur 15-20% mehr Zellen bei Zugabe von 50 µM zVAD am Leben blieben. Der protektive Effekt von zVAD und ATA war jedoch nur vorübergehend: sechs Stunden nach Behandlungsbeginn mit Che oder Sts gab es keinen statistisch signifikanten Unterschied im Überleben der Zellen. Die Vorbehandlung mit ATA verhinderte komplett eine Apoptose in beiden Zellinien, so daß diese mindestens einige Tage nach Behandlungsbeginn mit Serin/Threonin-Proteinkinase-Hemmern intakt blieben. Alle eingesetzten Modulatoren hemmten das Auftreten der durch Che bzw. Sts ausgelösten biochemischen Zeichen der Apoptose, wie oligonukleosomale DNA-Degradation, Abfall der PARP-Aktivität und Aktivierung der Caspase-3. Eine 3-stündige Inkubation der CCRF-CEM- und HL-60-Zellen mit 10 µM Che führte in beiden Zellinien zu einem deutlichen Abfall der intrazellulären NAD+-, NADH-, NADPH- und ATP-Konzentrationen. Insbesondere in der CCRF-CEM-Zellinie stand die Senkung des intrazellulären Gehaltes an Pyridinnukleotiden im Vordergrund, in den myeloischen HL-60-Zellen war die ATP-Depletion ausgeprägter. Während FCCP oder zVAD den Abfall der Energie- und Redoxäquivalente lediglich partiell verhinderten, war ATA in der Lage, die Depletion von NAD+, NADH, NADPH und ATP komplett zu inhibieren. Da FCCP und zVAD lediglich die mit der Apoptose assoziierten biochemischen Phänomene, wie die Aktivierung der Caspase-3 oder der Ca2+-Mg2+-Endonuklease und nicht die Depletion der Energie- und Redoxäquivalente in Leukämiezellen aufhoben, waren die durch die Einwirkung von Che aufgetretenen Störungen des Energiestoffwechsels ein möglicher Grund, weshalb die protektive Wirkung von FCCP und zVAD nur vorübergehend war.

Die Inhibition der b-Sekretase stellt derzeit einen vielversprechenden Ansatz zur Therapie der Alzheimer Krankheit dar. Der Hauptanteil der b-Sekretase Aktivität ist auf BACE-1, eine neuartige membrangebundene Typ I Aspartylprotease, zurückzuführen. Um gezielt spezifische und wirksame Inhibitoren entwickeln zu können, ist es notwendig, die Eigenschaften und katalytischen Spezifitäten der Protease genauer zu verstehen. Da neben BACE-1 eine weitere hochgradig homologe Aspartylprotease, BACE-2, bekannt ist, ist es für die Suche nach Inhibitoren ferner von Bedeutung, charakteristische Unterschiede zwischen den beiden Enzymen zu kennen, um mögliche Kreuzreaktionen der Inhibitoren minimieren zu können. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, die beiden Enzyme bezüglich ihrer posttranslationalen Modifikationen und insbesondere ihrer katalytischen Spezifitäten vergleichend zu analysieren. Als Modell für die durchgeführten Experimente dienten HEK293 Zellen, mit exogener Expression der beiden Proteasen, sowie dem Substrat bAPP. Beide Proteine werden in ähnlicher Weise durch die kovalente Bindung komplexer Kohlehydrateinheiten modifiziert. Matures BACE-1 besitzt im Vergleich zu BACE-2 eine eine längere Halbwertszeit. In vitro werden beide Enzyme durch CK1 an homologen Serinen in der zytoplasmatischen Domäne phosphoryliert. Während für BACE-2 bisher nicht schlüssig gezeigt werden konnte, dass auch in vivo eine Phosphorylierung erfolgt, wurde für BACE-1 S498 auch als Phosphorylierungsstelle in vivo bestätigt. Mittels Biotinylierung konnte demonstriert werden, dass beide BACE-Proteasen effizient an die Zelloberfläche transportiert werden. Im Gegensatz zu BACE-1, welches rasch in endosomale Kompartimente reinternalisiert wird und phosphorylierungsabhängig zurück zum TGN transportiert wird, wird BACE-2 entweder durch Spaltung der Ektodomäne in den extrazellulären Raum sezerniert, oder aber unmittelbar nach der Reinternalsierung ins Zellinnere in lysosomalen Kompartimenten abgebaut. Dieser Unterschied begründet vermutlich die unterschiedlichen Halbwertszeiten der beiden Proteine und erhöht gleichzeitig die Gesamtverweildauer von BACE-1 in endosomalen Kompartimenten, die aufgrund ihres pH-Wertes günstige Bedingungen für die proteolytische Aktivität des Enzyms schaffen. Hinsichtlich der katalytischen Spezifität bezüglich des membrangebundenen bAPP unterscheiden sich BACE-1 und BACE-2 grundlegend. Während BACE-1 die erwarteten b-Sekretase Spaltungen an Asp1 und Glu11 der Ab-Domäne katalysiert, spaltet BACE-2 vorzugsweise zwischen Phe19 und Phe20 der Ab-Domäne, wodurch Spaltprodukte entstehen, die denen der a-Sekretase Spaltung ähneln. Durch Koexpression der beiden Enzyme konnte gezeigt werden, dass BACE-2 die BACE-1 abhängige Prozessierung des Substrates direkt oder indirekt beeinflussen kann. Die Behandlung der entsprechenden Zelllinien mit BFA oder Monensin belegt, dass BACE-1 bereits in den frühen Kompartimenten des sekretorischen Prozessierungsweges proteolytisch aktiv sein kann, während BACE-2 auch nach exogener Expression keine Aktivität in diesen Kompartimenten zeigt. Mit Hilfe massenspektrometrischer Analysen wurde bewiesen, dass BACE-1 und BACE-2 entgegen bisheriger Annahmen nicht ausschließlich die proteolytische Spaltung membrangebundener bAPP Substrate katalysieren, sondern zudem Ab-Peptide, nach ihrer Freisetzung durch g-Sekretase, C-terminal verkürzen können. In vitro Versuche zeigen, dass BACE-1 selbst in der Lage ist, Ab 1-40 an Position 34 zu spalten und dieser Schnitt nicht wie bislang angenommen durch g-Sekretase katalysiert wird. Dieser Vorgang führt in vivo zu einer Reduktion der amyloidogenen Ab 1-40/42 Peptide. Da sich der Nachweis des Ab 1-34 Peptides mittels konservativer Proteinanalytik schwierig gestaltet, erklärt sich, warum in Zelllinien mit exogener BACE-1 Expression keine merkliche Steigerung der Ab-Sezernierung bzw. teilweise sogar eine Reduktion detektierbar war. Letztendlich bietet die Beobachtung, dass auch Peptide als Substrate für die BACE fungieren können, interessante Ansatzpunkte für die Suche nach neuen physiologischen Substraten und Inhibitoren. Die Analyse des subzellulären Transportes und die Charakterisierung, sowohl pro- als auch antiamyloidogener Enzymaktivitäten der beiden Proteasen BACE-1 und BACE-2 liefert neue Grundlagen für die Entwicklung therapeutischer Inhibitoren und für die Suche neuer Substrate.

Der eukaryontische Zellzyklus wird durch die Aktivität verschiedener Cyclinabhängiger Kinasen (CDKs) reguliert. Die zelluläre Menge des CDK-Inhibitorproteins p27Kip1 spielt eine entscheidende Rolle beim Übergang der Zelle von der G1- zur SPhase. Die Menge von p27Kip1 steigt während der G0- oder der G1-Phase an und nimmt zu Beginn der S-Phase rasch wieder ab. Die Bindung von p27Kip1 an die CDKKomplexe der G1-Phase inaktiviert diese und verhindert dadurch die Initiation der SPhase. Eine verminderte Menge von p27Kip1 am G1/S-Phaseübergang findet man dagegen häufig in verschiedenen Tumorgeweben. Die geringere zelluläre Menge des Inhibitors ist dabei mit einer hohen Patientensterblichkeit und einem aggressiven Verlauf der Erkrankung verbunden. Die zelluläre Aktivität und Menge von p27Kip1 wird entscheidend durch Proteine reguliert, die mit p27Kip1 interagieren. In dieser Arbeit wurden deshalb mit Hilfe von rekombinantem p27Kip1 Interaktionspartner des Inhibitors in HeLa-Zellextrakt identifiziert. Es konnte gezeigt werden, daß p27Kip1 an die CDK-Proteine und an Grb2 bindet. Grb2 ist ein Adapterprotein der Signaltransduktion. Die Interaktion zwischen p27Kip1 und Grb2 könnte damit, nach Stimulation der Zelle durch verschiedene Mitogene, die Signalweitergabe mit der Zellzyklusmaschinerie verbinden. Die zu dieser Interaktion notwendige Domäne in p27Kip1 konnte in weiteren Analysen auf eine acht Aminosäuren lange Prolin-reiche Region eingegrenzt werden. Auf der anderen Seite interagiert Grb2 vornehmlich über seine C-terminale SH3-Domäne mit p27Kip1. Die beiden mit p27Kip1 nah verwandten Inhibitorproteine p21Cip1 und p57Kip2 interagieren dagegen nicht mit Grb2. In einer erweiterten Analyse wurden 41 verschiedene rekombinante SH3-Domänen auf eine Interaktion mit p27Kip1 hin getestet. Es konnte gezeigt werden, daß p27Kip1 nur mit der C-terminalen SH3-Domäne von Grf40/Mona und der SH3-Domäne der Tyrosinkinase Lyn wechselwirkt. Die Interaktion der Tyrosinkinase Lyn in vivo führte zur Hypothese, daß p27Kip1 durch Lyn phosphoryliert werden könnte. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde deshalb die Tyrosinphosphorylierung von p27Kip1 untersucht. In Phosphoaminosäureanalysen mit metabolisch markierten Zellen konnte gezeigt werden, daß p27K i p 1 in vivo an Tyrosinresten phosphoryliert wird. Diese Zusammenfassung 13 Phosphorylierung konnte durch rekombinant hergestellte Tyrosinkinasen und verschiedene Tyrosin/Phenylalanin-Austausche in p27Kip1 auf Tyrosin 88 und 89 eingegrenzt werden. Nach Kristallstrukturdaten des trimeren Komplexes aus p27Kip1, CDK2 und Cyclin A kommt der Tyrosinrest 88 von p27Kip1 in der ATP-Bindetasche der Kinase zu liegen und blockiert diese. Es wurde deshalb untersucht, inwieweit eine Phosphorylierung von p27Kip1 an Tyrosin 88 oder 89 Einfluß auf die Aktivität des Inhibitors hat. Die Tyrosinphosphorylierung von p27Kip1 verhindert nicht die Bindung an den CDK-Komplex. Allerdings konnte mit in vitro-phosphoryliertem p27Kip1 gezeigt werden, daß eine Tyrosinphosphorylierung zu einer etwa 40%-igen Reduktion der Aktivität des Inhibitors führt. Diese Ergebnis konnte in vivo bestätigt werden. Interessanterweise verstärkt die Tyrosinphosphorylierung des Inhibitors die Phosphorylierung von p27Kip1 an Threonin 187 durch den gebundenen CDK-Komplex. Die Phosphorylierung von p27Kip1 an Threonin 187 ist in der Zelle ein initiales Signal zum Abbau von p27Kip1 durch das 26S-Proteasom. Das so markierte p27Kip1 wird von einem E3-Ligase-Komplex erkannt und ubiquitiniert. Es wurde deshalb untersucht, welchen Einfluß die Tyrosinphosphorylierung auf den Abbau von p27Kip1 besitzt. In Halbwertszeitbestimmungen mit einer SH3-bindedefizienten Form von p27Kip1 und einer Tyrosin/Phenylalanin-Austauschform von p27Kip1 konnte zeigten werden, daß beide Formen, im Vergleich zu unverändertem p27Kip1, eine höhere Stabilität aufweisen. Die Interaktion von p27Kip1 mit der Tyrosinkinase Lyn und die Inaktivierung des Inhibitors durch die Phosphorylierung von Tyrosinresten zeigt eine Möglichkeit auf wie p27Kip1, in Abhängigkeit von mitogenen Stimuli, reguliert werden kann. Die in dieser Arbeit gefundene Interaktion von Grb2, Grf40 und Lyn mit p27Kip1 verbindet damit die Signaltransduktion mit der Zellzykluskontrolle.

Zusammenfassung 1997 wurden zusätzlich zu dem bekannten Uncoupling Protein (UCP1) im braunen Fettgewebe (BAT) die humanen Uncoupling Proteine 2 und 3 (hUCP2, hUCP3) entdeckt, die in verschiedenen Geweben des Menschen vorkommen. In den Mitochondrien von Nagetieren und Winterschläfern fungiert das Uncoupling Protein 1 als Protonentransporter der inneren Mitochondrienmembran und entkoppelt die Atmung von der Phosphorylierung für die Thermogenese. Dieser Protonentransport wird durch freie Fettsäuren in Gegenwart von Ubichinon aktiviert und druch Purinnucleotide inhibiert. Im Hinblick auf die vorliegenden Erkenntnisse für das UCP1 aus Nagetieren, insbesondere Hamster-UCP1 (haUCP1), wurden die Funktionen von hUCP2 und 3 im Vergleich mit dem humanen Uncoupling Protein (hUCP1) untersucht. Alle drei hUCPs wurden in Saccharomyces cerevisiae exprimiert. An isolierten Hefemitochondrien wurde die Entkopplung und Hemmung durch Purinnucleotide anhand des Membranpotentials bestimmt. Die Nucleotidinhibierung stellt das spezifische Merkmal für die UCP-Aktivität dar. Durch Immunopräzipitation konnten alle drei exprimierten hUCPs eindeutig nachgewiesen werden, jedoch konnte nur hUCP1 in hohen Konzentrationen in die Mitochondrienmembran eingebaut werden. Entsprechend fielen die Entkopplungen der Hefemitochondrien mit eingebautem UCP aus. Die hUCP1-haltigen Mitochondrien wurden mit Fettsäure fast vollständig entkoppelt und diese Entkopplung wurde durch Zugabe von Purinnucleotiden in gleichem Maße wieder gehemmt. Diese Aktivität von hUCP1 war pH-abhängig und entsprach dem Verhalten von nativem haUCP1. Da allerdings das meiste Protein von hUCP2 und 3 nicht in die Hefemitochondrienmembran eingebaut wurde, können mit dem Hefeexpressionssystem die hUCP2- und -3-Funktionen nicht näher untersucht werden. Deshalb wurden die hUCPs in Escherichia coli mit einem IPTG-induzierbaren pET24a-Vektorsystem exprimiert, wo sie sich in hohen Mengen in Form von Einschlusskörperchen (Inclusion Bodies, IB) ablagerten. Zur Bestimmung des Protonen- und Anionentransportes sowie deren Nucleotidinhibierung wurden die hUCPs zuerst renaturiert. Als Kriterium für die Faltung der hUCPs in eine aktive Konfiguration wurde die Nucleotidbindung mit fluoreszierendem Dansyl-GTP und -GDP gemessen. Alle drei humanen Uncoupling Proteine wiesen eine Bindung mit Purinnucleotiden auf. Nach Einbau der renaturierten hUCPs in Liposomen zeigten alle drei Proteine Protonen- und Chloridtransport, der durch Purinnucleotide inhibiert werden konnte. Für den Protonentransport der hUCPs ist der Zusatz von Ubichinon und freien Fettsäuren als Cofaktoren notwendig. Bei der Hemmung des Protonenflusses ergab sich für hUCP1 und 2 eine stärkere Inhibierung durch GTP als GDP, während es sich bei hUCP3 umgekehrt verhielt. Dieses veränderte Verhalten von humanen UCP3 kann vor allem auf die Funktion im Skelettmuskel zurückgeführt werden. Da insgesamt die Transportgeschwindigkeiten durch UCP sich ähnlich wie die von nativem haUCP1 verhalten, stellt das E. coli-Expressionssystem eine erfolgreiche Alternative zum Hefeexpressionssystem zur Ermittlung der Transportfunktionen der hUCPs dar. Zur Bestimmung der Beziehung zwischen Primärstruktur und Funktion von hUCP2 und insbesondere von hUCP3 wurden einzelne geladene Aminosäuren durch Mutagenese substituiert. Durch diese Mutagenese konnten für den Protonen- und Anionentransport sowie die Nucleotidbindung die Beteiligung bestimmter geladener Aminosäurereste (hUCP3: D28, R95, R188, R282, E173; hUCP2: R96) nachgewiesen werden. Diese Differenzierung der Aminosäure-Funktionen weist erstmalig auf Gemeinsamkeiten bei den Transport-Mechanismen der UCP-Isomeren hin. Die Resulate unterstützen auch die Vermutung, dass Protonen- und Anionentransport voneiander unabhängig sind, was einem Protonentransport-Mechanismus durch einen Fettsäureanionencyclus widerspricht. Außerdem lassen der Protonentransport und die Nucleotidinhibierung sowie -bindung sich verschiedenen Bereichen in den hUCPs zuordnen.

Im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit steht die Funktion der Untereinheit e (Sue) der mitochondrialen F1FO-ATP Synthase von Saccharomyces cerevisi-ae. Anhand der Resultate der durchgeführten Experimente wurden folgende Schlussfolgerungen gezogen: (1) Sue ist der Lage, ein Sue-Homodimeres zu bilden. Das Protein spielt eine zentrale Rolle bei der Assemblierung der F1FO-ATP Synthase zu einem stabilen Dimer. Sue-Disruptanten bilden entsprechend kein stabiles ATP Synthase-Dimeres aus. Die C-terminalen 36 Aminosäurereste von Sue, die gegenüber Untereinheiten e aus Säugerzellen zusätzlich vorhanden sind, sind für die Dimerisierung von Sue und der F1FO-ATP Synthase ohne Bedeutung. (2) Zwischen den Untereinheiten e und k, die beide im FO-Sektor der ATP Synthase lokalisiert sind, besteht eine enge räumliche Beziehung. Für die In-teraktion von Sue mit Suk ist der Bereich von Sue, der anderen Untereinheiten e aus Säugerzellen ähnelt, ausreichend. (3) Im Hefegenom wurde ein der Sequenz von Suk nahe verwandtes Le-seraster gefunden. Die Sequenzähnlichkeit auf Aminosäureebene beträgt 45%. Ein entsprechendes hypothetisches Protein wurde als Suk hom bezeichnet. Eine Deletion dieser Sequenz allein oder gemeinsam mit dem Gen für Suk blieb ohne Auswirkungen auf die oxidative Phosphorylierung, die Assemblie-rung der F1FO-ATP Synthase und die Expression von Untereinheiten des FO-Sektors der F1FO-ATP Synthase. (4) Die Dimerisierung der F1FO-ATP Synthase und somit auch die Funkti-on von Sue als Dimerisierungsfaktor erwies sich als essentiell für die Funkti-on weiterer Komponenten der Atmungskette: der Cytochrom c-Oxidase und des Cytochrom bc1-Komplexes. Die Assemblierung der ATP Synthase wirkt sich auf die Aktivitäten der beiden Komponenten des Cytochrom bc1-COX-Suprakomplexes aus. Sie beeinflusst auch deren Assemblierung in den Supra-komplex beziehungsweise seine Stabilität. Die Anwesenheit der Region von Sue, die anderen Untereinheiten e aus Säugetierzellen ähnelt, reicht für die Bildung des Cytochrom bc1-COX-Suprakomplexes aus. Das Dimer der ATPase Synthase ist demzufolge in den Suprakomplex einge-bunden. Allerdings hat der Assemblierungszustand des Cytochrom bc1-COX-Suprakomplexes keinerlei Auswirkungen auf die Assemblierung der ATP Synthase. Dies deutet auf einen hierarchisch ablaufenden Prozeß der Bildung eines Suprakomplexes aus Cytochrom bc1-Komplex, Cytochrom c-Oxidase und F1FO-ATP Synthase hin. Die ATP Synthase nutzt zur Bildung von ATP den elektrochemischen Gra-dienten über die innere Mitochondrienmembran, an dessen Aufbau der Cy-tochrom bc1-Komplex und die Cytochrom c-Oxidase beteiligt sind. Eine Ein-bindung dieser Enzyme in einen Suprakomplex würde eine koordinierte Re-gulation der oxidativen Phosphorylierung ermöglichen. (5) Zwischen der Untereinheit Sue der F1FO-ATP Synthase und der Unter-einheit Cox2 der Cytochrom c-Oxidase konnte eine enge räumliche Bezie-hung nachgewiesen werden. Diese ist von der Funktionalität der F1FO-ATP Synthase abhängig. Anhand der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit konnte somit folgende Erklä-rung für die Funktion der Untereinheit e der mitochondrialen F1FO-ATP Synthase gefunden werden: Sue dient als Dimerisierungsfaktor der F1FO-ATP Synthase. Die Dimerisie-rung von Sue und damit die Dimerisierung der ATP Synthase ist essentiell für die Stabilisierung des Cytochrom bc1-COX-Suprakomplexes und die Funkti-on seiner Komponenten.

Ziel der Arbeit war es, die molekularen Mechanismen zu erforschen, durch die das Pasteurella multocida Toxin zu einer Aktivierung von Endothelzellen mit anschließender Störung der Barrierefunktion des Endothels führt. Dafür wurden humane Endothelzellen (HUVEC) verwendet, die für Permeabilitätsmessungen auf Porenmembranen bis zur Entstehung eines dichten Monolayers kultiviert wurden. Als Maß für die endotheliale Permeabilität wurde die Durchlässigkeit des endothelialen Monolayers für Meerrettichperoxidase verwendet. Zur Sichtbarmachung des endothelialen Zytoskeletts wurden die Zellen mit Rhodamin Phalloidin gefärbt und im Fluoreszenzmikroskop analysiert. Mit Hilfe spezifischer Hemmstoffe, die teilweise in die Zellen mikroinjiziert wurden, sowie der biochemischen Messung von Enzymaktivitäten bzw. Phosphorylierung, erhielten wir folgenden Ergebnisse: 1. Das Pasteurella multocida Toxin führt zu einer Erhöhung der Permeabilität des endothelialen Monolayers über einen Rho-GTPase-abhängigen Signalweg. 2. Die Stimulierung der Endothelzellen mit dem Pasteurella multocida Toxin führt zur massiven Bildung von Aktinstreßfasern, die von Rho, seinem Zielprotein der Rho-Kinase als auch von der MLC-Phosphatase abhängig sind. Diese morphologischen Veränderungen stellen vermutlich die Basis für die Erhöhung der endothelialen Permeabilität dar. 3. Pasteurella mulocida Toxin führt über Rho und mit großer Wahrscheinlichkeit auch über die Rho-Kinase zu einer Inaktivierung der MLCPhosphatase mit anschließender Erhöhung der MLC-Phosphorylierung. Als Ergebnis unserer Arbeiten ergibt sich ein Signalweg, in dessen Zentrum die GTPase Rho steht und dessen Details noch einmal in der Abbildung 7-1 zusammengefaßt werden.

Zyklisches 3’:5’-Adenosinmonophosphat (cAMP) ist sowohl als extrazellulärer Lockstoff als auch als intrazelluläres Signalmolekül von entscheidender Bedeutung in der Entwicklung von Dictyostelium discoideum. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass dieser sekundäre Botenstoff auch eine zentrale Rolle in der hyperosmotischen Stressantwort von D. discoideum spielt. Wildtypzellen reagieren auf hyperosmotischen Stress mit einem transienten Anstieg der intrazellulären cAMP-Konzentration, der von dem Hybridhistidinkinase-Homolog DokA abhängig ist. DokA ist essentiell für das Überleben von D. discoideum-Zellen unter hyperosmotischen Bedingungen. Die Osmosensitivität von dokA--Zellen beruht auf dem gestörten cAMPMetabolismus und kann durch die transiente Zugabe eines membrangängigen cAMP-Analogs weitgehend aufgehoben werden. Der Einfluss von DokA auf den intrazellulären cAMP-Spiegel zeigt sich auch in ungeschockten Zellen: Während die basale cAMP-Konzentration in dokA-- Zellen reduziert ist, weisen Zellen, die die Regulator-Domäne von DokA überexprimieren, einen erhöhten cAMP-Spiegel auf. Basierend auf diesen Daten wurde ein Modell der Regulation des intrazellulären cAMP-Spiegels durch DokA entwickelt. Die Regulator-Domäne von DokA wirkt hierbei als Phosphatase des Histidin-Phosphotransferproteins RdeA, welches durch Phosphorylierung die Phosphodiesterase RegA aktiviert. Durch die Phosphatase-Aktivität von DokA wird somit der über den RdeA/RegAPhosphorelay gesteuerte intrazelluläre cAMP-Abbau inhibiert. Die in vitro-Dephosphorylierung von RdeA durch die Regulator-Domäne von DokA konnte ebenso nachgewiesen werden wie die verringerte Phosphodiesterase-Aktivität bei homologer Überexpression des DokA-Regulators. Die Effekte dieser Überexpression auf cAMP-Haushalt und Entwicklung sind DokA-spezifisch und von dem konservierten Aspartylrest D1567 der Regulator-Domäne abhängig. Bei Untersuchungen zu den Effektoren der hyperosmotischen Stressantwort in D. discoideum wurden Veränderungen in Aufbau und Zusammensetzung von Membran und Cytoskelett beobachtet. Dabei konnten sieben Proteine identifiziert werden, die eine deutliche Translokation bei hyperosmotischem Stress erfahren. Eine Übersicht stellt die osmoregulatorischen Signalwege in D. discoideum dar und vergleicht die Rolle von 2-Komponenten-Systemen in der Osmoregulation bei Eukaryoten.

Pflanzen sind aufgrund ihrer sessilen Lebensweise an die Bedingungen ihres Standortes gebunden. Zur Aufrechterhaltung ihrer photosynthetischen Effizienz, insbesondere unter transienten Veränderungen des Lichtregimes, haben höhere Pflanzen eine Reihe molekularer Anpassungsmechanismen entwickelt, die sowohl kurz- als auch längerfristige Adaptationen des Photosyntheseapparates ermöglichen. Für die einzigartige Dynamik der photosynthetischen Membran höherer Pflanzen spielen die reversible Phosphorylierung von Thylakoidmembranproteinen und komplexe Protein-Protein-Interaktionen unter Beteiligung multifunktioneller, regulatorischer Proteine herausragende Rollen. Hauptziel der vorliegenden Arbeit war es, durch die Identifikation und die funktionelle Charakterisierung minorer Komponenten des plastidären Kompartiments, vor allem der Thylakoidmembran, weitere Erkenntnisse zur Aufklärung der Signaltransduktionsmechanismen beizutragen, die die Lichtenergie mit physiologischen Reaktionen verknüpfen. Die Ergebnisse können wie folgt zusammengefaßt werden: 1. Die Existenz multipler, membranintegraler Proteinkinasen in den Thylakoidmembranen aus Spinatchloroplasten wurde durch den Nachweis von sechs minoren, kinaseaktiven Polypeptiden in Cytochrom b/f-Komplex-angereicherten, subthylakoidalen Fraktionen bekräftigt. Die Instabilität der in Abwesenheit des Kinasesubstrats HistonIII-S renaturierten Aktivitäten im basischen Milieu spricht für eine Autophosphorylierung der potentiellen Proteinkinasen an Serin- oder Threoninresten. 2. Die 64 kDa-Komponente AMS6 wurde mit dem monospezifischen Antikörper gegen den NTerminus seiner Aminosäuresequenz als membranintegrale Komponente gestapelter Regionen der Thylakoidmembran identifiziert. AMS6 ist weder mit der phosphorylierbaren Polyphenoloxidase noch der redoxkontrollierten LHCII-Kinase identisch, was mit Hilfe hochauflösender Gelsysteme bzw. durch Perfusionschromatographie subthylakoidaler Thylakoidmembranfraktionen gezeigt wurde. Die funktionelle Rolle von AMS6, dessen Assoziation mit dem trimeren LHCII-Komplex, nicht aber mit PSII-LHCII-Superkomplexen nachgewiesen werden konnte, ist unklar. Eine mögliche regulatorische Rolle der 64 kDa- Komponente in der Modulation des Absorptionsquerschnittes am PSII wird diskutiert. 3. Die potentielle Sensorkinase AMS9 (58 kDa) wurde mit dem heterologen Antikörper gegen das mutmaßliche cyanobakterielle Homologe slr0311 als periphere Komponente der Thylakoidmembran identifiziert. Die Interaktion mit der Stromaseite der photosynthetischen Membran erfolgte über schwache hydrophobe und elektrostatische Wechselwirkungen. Die Akkumulation von AMS9 in den ungestapelten Regionen der Thylakoidmembran war konsistent mit seiner Assoziation mit dem PSI. Die mögliche Funktion von AMS9 als Sensorkinase eines thylakoidalen Zwei-Komponenten-Signaltransduktionssystems unter Beteiligung des komplexen Polypeptids TTP30 wurde am Beispiel des rekombinanten cyanobakteriellen Homologen untersucht. Die Zerstörung des slr0311-Gens im Genom von Synechocystis sp. PCC6803 eignete sich unter den Versuchsbedingungen jedoch nicht zur Aufklärung der physiologischen Rolle von AMS9 in Spinatchloroplasten. 4. Das komplexe Polypeptid TTP30, für das in den Genomen von Spinacia oleracea L. und Arabidopsis thaliana L. mehr als ein Gen existiert, wurde durch den in organello-Import des in vitro-translatierten Vorläufers als plastidäre Komponente identifiziert. Das importierte Protein konnte über einen kurzen hydrophoben Abschnitt am C-Terminus mit der Thylakoidmembran interagieren. Die Deletion des potentiellen Membranankers führte zur Akkumulation des C-terminal verkürzten Proteins im Stroma. Die proteolytischen Erkennungssequenzen seiner größeren hydrophilen Domäne waren der Protease-Aktivität im Stroma durch die räumliche Anordung des charakteristischen, zentralen Tetratricopeptid- "repeat"-Moduls vermutlich nur bedingt zugänglich. 5. Der polyklonale Antikörper gegen den rekombinanten TTP30-Vorläufer identifizierte ein 34 kDa-Polypeptid im Stroma von Spinatchloroplasten, ein Ergebnis, das der thylakoidalen Lokalisation des in vitro importierten Proteins widersprach. Als möglicher Faktor, welcher die Spezifität des Antikörpers neben der komplexen Struktur des Vorläuferproteins beeinflussen könnte, wurde die Bindung von Calciumionen an das mutmaßliche "helix-loophelix"- Motiv in der N-terminalen Domäne von TTP30 untersucht. 6. Die DNS-Bindeaktivität des mutmaßlichen "helix-loop-helix"-Motivs von TTP30 wurde durch die "South-Western"-Analyse nachgewiesen. Der rekombinante TTP30-Vorläufer konnte Plastiden-DNS aus Spinatchloroplasten in vitro spezifisch binden. Seine säurestabile in vitro-Phosphorylierung sprach für die Regulation der potentiellen DNS-Bindeaktivität durch die posttranslationale Modifikation eines Serin- oder Threoninrestes. Eine mögliche Modulation seiner Aktivität im Sinne eines klassischen Zwei-Komponenten-Systems bestätigte sich nicht. Der Asparaginsäurerest D95 in der N-terminalen, "response regulator"- ähnlichen Domäne des rekombinanten Vorläufers übernahm in vitro keine Phosphorylgruppe von der prokaryotischen Sensorkinase EnvZ. 7. Mit dem kernkodierten Immunophilin TLP40 ist eine weitere plastidäre Komponente mit komplexer, molekularer Struktur untersucht worden. Das Protein war in seiner temporär membrangebundenen Form mit dem Cytochrom b/f-Komplex in den ungestapelten Regionen der Thylakoidmembran assoziiert. Seine lateral heterogene Verteilung und die Diskriminierung der Komplexe in den Granastapeln wurden im Zusammenhang mit der regulatorischen Interaktion von TLP40 und einer thylakoidalen Serin-/Threoninphosphatase vom Typ 2A untersucht. 8. Die reversible Interaktion von TLP40 im Thylakoidlumen mit der Innenseite der photosynthetischen Membran aus Spinatchloroplasten wurde in einem Zwei-Phasen- Polymersystem unter Verwendung von "inside-out"-Membranvesikeln nachgewiesen. Zur Identifikation essentieller Interaktionsbereiche wurden verschiedene rekombinante Deletions- und Punktmutanten von TLP40 hergestellt, die entweder keinen funktionellen Leucin-"zipper" besaßen und/oder denen die mutmaßlichen Phosphatasebindestellen im Nterminalen Abschnitt fehlten. 9. Das Gleichgewicht zwischen "freiem" TLP40 und seiner membranassoziierten Form konnte in vitro durch submillimolare Cyclosporin A-Konzentrationen zugunsten des "freien" Anteils verschoben werden. Die reversible Interaktion von TLP40 mit der Innenseite der Thylakoidmembran beeinflußte die Dephosphorylierungsrate thylakoidaler Phosphoproteine und war ein weiterer Hinweis auf eine regulatorische Interaktion des komplexen Immunophilins im Thylakoidlumen mit einer membranintegralen Proteinphosphatase vom Typ 2A. 10. Das Modell der transmembranen Signaltransduktion, die über die katalytische Aktivität der membranintegralen Proteinphosphatase auf der Stromaseite die Stabilität, die Degradation und den Umsatz der Polypeptiduntereinheiten des PSII-Holokomplexes koordinieren soll, wurde anhand zweier molekularbiologischer Ansätze untersucht. Weder die Expression der Antisens- bzw. Sens-RNS für TLP40 in A. thaliana L. noch die Inaktivierung des Gens für das potentielle cyanobakterielle Homologe sll0408 konnten jedoch unter den gewählten Versuchsbedingungen einen detaillierteren Einblick in die physiologische Bedeutung des komplexen Immunophilins TLP40 im Thylakoidlumen von Spinatchloroplasten geben.