Podcasts about signalwegen

Heute widmen wir uns der Vision einer Medizin der Zukunft, die von Präzision und Prävention geprägt ist. Anstelle der reinen Symptombehandlung wird der Fokus auf die Identifikation und Behandlung von Krankheitsursachen gelegt. Themen wie die Bedeutung genetischer Analysen, die Rolle von Signalwegen und Netzwerkanalysen sowie die Notwendigkeit einer präventiven Gesundheitsstrategie werden ausführlich besprochen. Wie können datenbasierte Ansätze und künstliche Intelligenz dabei helfen, personalisierte Therapien zu entwickeln? Wie könnte unser Gesundheitssystem präziser und nachhaltiger werden, in dem digitale Gesundheitscoaches und präzise Prävention entscheidende Rollen spielen? Diese Fragen beschäftigen uns im aktuellen Longevity Kompakt.   Du möchtest tiefer in das Thema einsteigen? Dann verpassen nicht mein Podcast-Interview mit dem Experten Prof. Harald Schmidt: https://link.stayoung.de/STY-158   Du interessierst dich für Gesunde Langlebigkeit (Longevity) und möchtest ein Leben lang gesund und fit bleiben, dann folge mir auch auf den sozialen Kanälen bei Instagram, TikTok, Facebook oder Youtube. https://www.instagram.com/nina.ruge.officialhttps://www.tiktok.com/@nina.ruge.official https://www.facebook.com/NinaRugeOffiziell https://www.youtube.com/channel/UCOe2d1hLARB60z2hg039l9g   Disclaimer: Ich bin keine Ärztin und meine Inhalte ersetzen keine medizinische Beratung. Bei gesundheitlichen Fragen wende dich bitte andeinen Arzt/deine Ärztin.    STY-158

Der sonderbare Zahn der Zeit. Prof. Dr. Christoph Englert ist Biochemiker und Professor für Molekulare Genetik an der Friedrich-Schiller-Universität Jena bzw. am Leibniz-Institut für Alternsforschung – Fritz-Lipmann-Institut e.V. Jena (D), Leiter der Forschungsgruppe Molekulare Genetik des Alterns. Im Jahr 2010 erhielt er den Max-Bürger-Preis der Deutschen Gesellschaft für Gerontologie und Geriatrie und 2018 den Thüringer Forschungspreis. Er ist fasziniert von genetischen Programmen und biochemischen Signalwegen, die die Lebensspanne steuern. Und davon, wie sie durch Umweltfaktoren beeinflusst werden können. Dieser Podcast begleitet die Sendung "Focus", 02.03.2024.

Bei Hund und Katze sowie beim Menschen zählen Epilepsien zu den häufigsten chronischen neurologischen Erkrankungen. Im Hinblick auf eine vollständige Prävention der Epilepsieentstehung (Epileptogenese) haben sich bis heute alle therapeutischen Strategien als klinisch unwirksam erwiesen. Ein besseres Verständnis der Mechanismen, die der Epileptogenese zugrunde liegen, stellt die Grundvoraussetzung für die Identifizierung von therapeutischen Zielstrukturen und Biomarkern dar. Differentielle Proteomanalysen könnten wesentlich dazu beitragen die komplexen epileptogenese-assoziierten molekularen Veränderungen zu erforschen. Daher wurde in der vorliegenden Dissertationsstudie eine differentielle Proteomanalyse in einem Tiermodell der Epileptogenese durchgeführt. Die Induktion der Epileptogenese erfolgte in einem elektrischen Post-Status-Epilepticus-(SE)-Modell bei weiblichen Sprague-Dawley-Ratten. Hippocampales (HC) und parahippocampales (PHC) Gehirngewebe von SE- und Kontrolltieren wurde zu drei unterschiedlichen Zeitpunkten (zwei Tage, zehn Tage und acht Wochen nach SE) entnommen und mittels markierungsfreier Liquid-Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie analysiert. Die Zeitpunkte reflektieren die Post-Insult-Phase, die Latenzphase und die chronische Phase mit spontanen wiederkehrenden Anfällen. Unter Berücksichtigung der besonderen Rolle inflammatorischer Signalwege im Kontext der Epileptogenese, erfolgte neben der unspezifischen Datenanalyse eine fokussierte Auswertung immun- und inflammations-assoziierter Prozesse. Die anschließende immunhistochemische Untersuchung der Gewebe diente sowohl der Validierung der Methodik, als auch der Validierung des differentiellen Expressionsmusters ausgewählter Proteine. Durch die Studie konnte gezeigt werden, dass zu allen untersuchten Zeitpunkten im PHC mehr Proteine reguliert waren als im HC. Des Weiteren ließen sich in beiden Gehirnregionen die umfangreichsten molekularen Veränderungen in der Latenzphase nachweisen. Durch die Pathway-Enrichment-Analyse konnte im HC während der Post-Insult-Phase eine ausgeprägte Neurodegeneration dargestellt werden. Weiterhin zeigte sich in beiden Gehirnregionen eine Regulation Integrin-assoziierter Prozesse während der Latenzphase und der chronischen Phase. Ein signifikantes Enrichment neurodegenerativer und proliferativer Signalwege ließ sich im PHC acht Wochen nach SE darstellen. Im Hinblick auf immun- und inflammations-assoziierte Prozesse konnte eine Überrepräsentation entsprechender Pathways während der Post-Insult-Phase und der Latenzphase nachgewiesen werden. Die regulierten Pathways umfassten unter anderem Toll-like-Rezeptor-(TLR)-vermittelte Signalwege, Synthese und Regulation von Prostaglandinen, leukozytäre transendotheliale Migration und die Signaltransduktion durch transformierenden Wachstumsfaktor-β (TGF beta). Die inflammatorische Antwort während der chronischen Phase zeigte im PHC eine stärkere Regulation als im HC. Im Rahmen der immunhistochemischen Validierung konnte das differentielle Expressionsmuster der Proteine Heat shock 70 kDa protein (Hspa1a), P2Y Purinoceptor 12 (P2ry12) und P2X Purinoceptor 7 (P2rx7) bestätigt werden, die eine bedeutende Rolle bei der Aktivierung von Mikroglia spielen. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie liefern neue Erkenntnisse über die komplexen molekularen Veränderungen der Epileptogenese. Darüber hinaus deuten sie auf eine unterschiedliche Veränderung der molekularen Muster von HC und PHC während dem Zeitverlauf der Epileptogenese hin. Die Daten stellen zudem neue Informationen über das differentielle Expressionsmuster zahlreicher Proteine zur Verfügung, die bei wichtigen inflammatorischen Prozessen und Signalwegen eine Rolle spielen. Von besonderer Bedeutung ist hierbei die Regulation TLR-assoziierter Proteine und Purinozeptoren, die zu den essentiellen Modulatoren der inflammatorischen Antwort gezählt werden. Zusammenfassend trägt die vorliegende Arbeit wesentlich zu unserem Verständnis über die molekularen und im Besonderen die inflammatorischen Mechanismen der Epileptogenese bei. Die Ergebnisse liefern eine umfassende Grundlage für die zukünftige Identifikation und Entwicklung von therapeutischen Zielstrukturen und Biomarkern für molekulare Bildgebungsverfahren. Die funktionellen Einflüsse einzelner Proteine sollten in zukünftigen Studien (zum Beispiel in Knock-out-Maus-Modellen) bestätigt und genauer untersucht werden.

Einleitung: Modell-basierte Vorhersagen für molekulare Netzwerke und zelluläre Interaktionen können durch zwei verschiedene Strategien der Systembiologie getroffen werden, die top-down und bottom-up Strategien. Die bottom-up Strategie beginnt bei a priori Wissen über einzelne Grundelemente und fügt diese zu größeren Einheiten wie Signalwegen oder ganzen Systemen zusammen. Top-down Strategien setzen bei Datensätzen eines Systems an und versuchen Netzwerke, Interaktionen oder Komponenten zu identifizieren, die für das Systemverhalten (z.B. Phänotyp) verantwortlich sind. Im Folgenden werden beide Strategien auf unterschiedliche Transkriptionsdaten angewendet und die Ergebnisse visualisiert. Beide Strategien können auf linearen Regressionsmodellen basieren. In dieser Arbeit werden lineare Regressionsmodelle höherer Ordnung mittels eines neuen visuellen Hilfsmittels, des Eruptionsdiagramms, verglichen. Methodik: Eruptionsdiagramme werden durch die Überlagerung zweier Vulkandiagramme erstellt. Beide Vulkandiagramme werden von derselben Datengrundlage generiert, stammen jedoch von zwei verschiedenen Modellen. Jedes Gen wird von einem Pfeil repräsentiert, welcher bei dem Punkt des Vulkandiagramms von Modell 1 startet und bei dem Punkt des Vulkandiagramms aus Modell 2 endet. Im Rahmen der Modellselektion können Eruptionsdiagramme als visuelles Hilfsmittel verwendet werden, um (ir)relevante Kovariaten, Störfaktoren und Effektmodifikation aufzudecken. Ergebnisse: Es werden zwei verschiedene Transkriptionsdatensätze analysiert: ein Maus-Infektionsdatensatz und ein humaner Asthmadatensatz. Für die Analyse des Infektionsdatensatzes werden verschiedene lineare Regressionsmodelle miteinander verglichen. Durch eine rückwärts-gewandte Modellselektionsstrategie wird gezeigt, dass durch die Infektionskovariaten erster Ordnung zusätzliche erklärende Kraft gewonnen wird. Durch das Eruptionsdiagramm werden Effekte zweiter Ordnung aufgedeckt. Ein Modellvergleich identifiziert die Kovariaten dritter Ordnung als Störfaktoren. Das Modell zweiter Ordnung, welches am besten zu den Daten passt, wird für die weiterführende Analyse verwendet. Die Ergebnisse der Interaktionskovariate werden in aggravating und alleviating Effekte unterteilt. Ein Interaktionseffekt ist alleviating (aggravating, neutral), falls der Effekt der kombinierten Kovariaten schwächer (stärker, identisch) als die Summe der individuellen Effekte dieser Kovariaten ist. Bei der bottom-up Analyse des Asthmadatensatzes werden die Daten nicht auf Einzelgenebene sondern auf Gengruppenebene analysiert. Zunächst wird das passende Regressionsmodell mit Hilfe des Eruptionsdiagramms aufgestellt. Der Einfluss der einzelnen Gene auf das globale Testergebnis der Gengruppen wird in diagnostischen Balkendiagrammen genauer untersucht. Eine Signalweganalyse der Gengruppen zeigt neue Biomarker und Signalwege für die Charakterisierung von allergischem und nicht-allergischem Asthma auf. Diskussion: Die Ergebnisse der Transkriptionsanalyse werden durch Anreicherungsanalysen auf ihre funktionelle Relevanz hin untersucht. Die Ergebnisse zeigten unterschiedliche funktionelle Eigenschaften der aggravating und alleviating Gene auf. Die Anreicherungsanalyse des Asthmadatensatzes der Gene, die von Störfaktoren beeinflusst werden und durch Effektmodifikation gekennzeichnet sind, weisen jedoch keine funktionellen Unterschiede auf.

Der humane Thyreotropin-Rezeptor (TSH-R) steuert die zentralen Funktionen der Schilddrüse und ist der wichtigste Regulator für deren Wachstum und Differenzierung. Er gehört zur Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) und kann nach einer Stimulation mit TSH die G-Proteine aller vier Familien (Gs, Gi/o, Gq/11 und G12/13) aktivieren. Dabei werden die meisten zellulären Reaktionen wie die Proliferation der Schilddrüsenepithelzellen und die Bereitstellung der Schilddrüsenhormone einer Aktivierung von Gs zugeordnet. Zu Gs-unabhängigen Signalwegen des TSH-R war dagegen erst wenig bekannt. Da der Gq/11-vermittelte Signalweg durch die Aktivierung der Phospholipase C und Proteinkinase C in maligne Prozesse von Schilddrüsenzellen involviert sein könnte, sollten in der vorliegenden Arbeit Gq/11-abhängige Effektoren des TSH-R in humanen Schilddrüsenkarzinomzellen identifiziert und näher charakterisiert werden. Als Modellsystem wurden FTC 133 wt TSH-R Zellen verwendet, eine follikuläre Schilddrüsenkarzinom-Zelllinie, die den humanen TSH-R überexprimiert. In diesen wurde die Aktivierung des Calcium/Calcineurin-abhängigen Transkriptionsfaktors NFAT nach TSH-Stimulation erstmalig beschrieben. Bei einer anschließenden Reihenuntersuchung der NFAT-abhängigen Zielgene Autotaxin, VEGF, c-Myc, Regulator von Calcineurin 1 (RCAN1) und Cyclooxygenase-2 (Cox-2) wurden c-Myc, RCAN1 und Cox-2 als TSH-regulierte Gene identifiziert. Die Induktion von c-Myc war unabhängig von NFAT, dagegen bestätigten Expressionsstudien mit Calcineurin-Inhibitoren und dem spezifischen NFAT-Inhibitor INCA-6, dass RCAN1 und Cox-2 durch eine NFAT-Aktivierung induziert wurden. Diese Aktivierung wurde durch Gq/11-Proteine vermittelt, denn nach spezifischer Herunterregulation der Gq- und G11-α-Untereinheiten mittels siRNA konnten die Zielgene nicht mehr TSH-abhängig induziert werden. Weitere Analysen zum Mechanismus der NFAT-Aktivierung zeigten, dass eine Erhöhung der intrazellulären Calciumionenkonzentration ([Ca2+]i) allein über intrazelluläre Speicher nicht ausreichend war. Um NFAT zu aktivieren, mussten zusätzlich Calciumionen aus dem Extrazellulärraum einströmen. Untersuchungen mit dem STIM1-Inhibitor SKF-96365 wiesen dabei auf einen Calciumioneneinstrom über Speicher-operierte Ionenkanäle hin. Zusätzlich zur NFAT-regulierten Genexpression wurde in dieser Arbeit die TSH-induzierte Expression des Metallothioneins MT1X in FTC 133 wt TSH-R Zellen und in primären Thyreozyten analysiert. Die mRNA Induktion dieses Cystein-reichen und zytoprotektiven Proteins war ebenfalls abhängig von einer Expression der Gq/11-Proteine. Eine Erhöhung der [Ca2+]i reichte jedoch nicht aus, um MT1X signifikant zu induzieren. Zur gesteigerten Expression war darüber hinaus auch die Aktivierung der Proteinkinase C notwendig. In der vorliegenden Dissertation konnten somit RCAN1, Cox-2 und MT1X als Gq/11-regulierte Zielgene des humanen TSH-R charakterisiert werden. Dabei wurde eine NFAT-regulierte Genexpression nach einer TSH-Stimulation erstmalig gezeigt. Die präsentierten Ergebnisse weisen damit auf eine bisher unbeachtete biologische Rolle von Gq/11-abhängigen Signalwegen des humanen TSH-R in der Schilddrüse hin.

Typ I Interferon stellt einen essentiellen Teil der angeborenen Immunantwort dar und besitzt antivirale und immunmodulatorische Eigenschaften. Diese Funktionen werden durch die Induktion sogenannter Interferon-regulierter Gene (IRGs) vermittelt, deren Expression in der Zelle nach Bindung von IFN an seinen Rezeptor reguliert wird. Im Rahmen dieser Arbeit gelang es mit Hilfe verschiedener Ansätze erstmals, eine umfassende Anzahl Typ I Interferon-regulierte Gene beim Huhn zu identifizieren. Hierzu wurden umfangreiche Datenbankrecherchen und Transkriptomanalysen von Milz und Lunge sowohl nach Applikation von rekombinanten Hühner Interferon alpha, als auch einer Infektion mit Newcastle Disease Virus, einem starken IFN Induktor, durchgeführt. Etwa 30% der hierbei gefundenen IRGs wurden auch im Säugetier als solche beschrieben (allgemeine IRGs), weitere 1.900 Gene, die im Huhn nach Injektion von rekombinanten Hühner Interferon alpha exprimiert wurden sind jedoch beim Säuger in dieser Form nicht bekannt (neu identifizierte IRGs). Die eingehende Charakterisierung der Hühner-IRGs zeigte, dass „neu identifizierte“ und „allgemeine IRGs“ an ähnlichen immunrelevanten Prozessen und Signalwegen beteiligt waren, wie der Komplement Kaskade, der TLR Signalkaskade und Zytokin-Interaktionen. Auch durch Netzwerkanalysen konnte gezeigt werden, dass die Expression von „allgemeinen“ und „neu identifizierten IRGs“ in engem Zusammenhang miteinander steht. Durch die Untersuchung von verschiedenen Zeitpunkten konnte nachgewiesen werden, dass manche der im Huhn identifizierten IRGs in Milz und Lunge nur drei Stunden nach IFN Injektion stark exprimiert wurden, und andere IRGs über einen Zeitraum von neun Stunden konstante oder auch dynamische Expressionsprofile aufwiesen. Auch fiel eine Dynamik in der Genexpression in den verschiedenen Organen auf, da viele IRGs schon drei Stunden nach IFN Injektion in der Milz, aber erst neun Stunden nach IFN Injektion in der Lunge stark exprimiert wurden. Dabei unterschieden sich zahlreiche nach IFN Injektion und NDV Infektion regulierten IRGs in Milz und Lunge, während andere IRGs in beiden Organen exprimiert wurden, was darauf schließen lässt, dass viele IRGs gewebespezifisch und andere eher global exprimiert werden. Eine Vielzahl der nach IFN Applikation identifizierten IRGs konnte auch im Infektionsmodell mit lentogenem Newcastle Disease Virus bestätigt werden. Zudem gelang es, weitere „allgemeine IRGs“ zu identifizieren, was vermutlich auf die zusätzliche Expression von Typ II und Typ III IFN nach NDV Infektion zurückzuführen ist. Zusammenfassend bleibt festzustellen, dass sich die durch IFN induzierten Gene beim Huhn zwischen den untersuchten Geweben und je nach Stimulus unterscheiden und neben den auch beim Säuger beschriebenen, eine Vielzahl an weiteren IRGs identifiziert werden konnte. Die erhaltene Übersicht von IRGs im Huhn kann nun als Grundlage genutzt werden, um potentielle antiviral wirksame IRGs auszuwählen und sie funktionell näher zu charakterisieren. Ein besseres Verständnis der IFN-Wirkungsweise beim Vogel könnte wesentlich zum Schutz von Huhn und Mensch vor gefährlichen Pandemien beitragen.

Gallensäuren stellen potente Signalmoleküle dar, die schon in geringen mikromolaren Konzentrationen, wie sie beim Menschen im Serum beobachtet werden, zentrale Leberzellfunktionen auf transkriptioneller und posttranskriptioneller Ebene beeinflussen. Die hydrophoben und potentiell toxischen Gallensäuren Lithocholsäure (LCA) und Chenodeoxycholsäure (CDCA) induzieren Apoptose und Cholestase, während hydrophile Gallensäuren hepatoprotektiv wirken können. Unter ihnen ist die antiapoptotisch und anticholestatisch wirksame Ursodeoxycholsäure (UDCA) von besonderer Bedeutung. UDCA stellt derzeit das einzige wirksame Therapeutikum bei chronischen cholestatischen Leberkrankheiten dar. Die vorliegende Arbeit untersuchte die Bedeutung intrazellulärer Signaltransduktionswege für die choleretischen, (anti-)cholestatischen und (anti-)apoptotischen Wirkungen physiologischer Gallensäuren in verschiedenen experimentellen Modellen. Hauptziel der Arbeit war die genauere Charakterisierung (i) der für den klinisch bedeutenden anticholestatischen Effekt des Taurinkonjugats der Ursodeoxycholsäure (TUDCA) verantwortlichen Signaltransduktionswege, und (ii) der zentralen Stellung von PI3-Kinasen in der intrazellulären Signalvermittlung der biologischen Effekte hydrophiler und hydrophober Gallensäuren. Im Modell der isoliert perfundierten Rattenleber untersuchten wir die anticholestatische und hepatoprotektive Wirkung der TUDCA in der intakten Leber unter Einsatz pharmakologischer Enzyminhibitoren. Als Leberfunktionsparameter dienten quantitativer Gallenfluß, Sekretion des Modellsubstrats der Konjugatexportpumpe Mrp2, GS-DNP, in die Galle und als Marker der Leberzellschädigung die hepatovenöse LDH-Freisetzung. Simultane Hemmung der cPKCa und der PKA, nicht aber Hemmung von cPKCa oder PKA allein antagonisierte bei Taurolithocholsäure (TLCA)-induzierter Cholestase die protektive Wirkung der TUDCA. Gallenfluß und GS-DNP-Sekretion waren unter gleichzeitiger Hemmung beider Signalwege signifikant reduziert, wohingegen die LDH-Freisetzung deutlich erhöht war. Die Ergebnisse zeigen, dass der posttranskriptionell vermittelte anticholestatische Effekt der TUDCA im etablierten Modell TLCA-induzierter Cholestase durch einen kooperativen cPKC- und PKA-abhängigen Signalweg vermittelt wird. Mitogenaktivierte Proteinkinasen Erk1/2- und p38-abhängige Signalwege hingegen, die als Vermittler von TUDCA-induzierter Cholerese unter nicht-cholestatischen Bedingungen beschrieben wurden, waren im untersuchten Modell ohne Bedeutung für die anticholestatische Wirkung der TUDCA. Mit Hilfe der neu etablierten Biotinylierung von Membranproteinen konnten wir in Ntcp-transfizierten humanen Hepatomzellen (HepG2-Ntcp) zeigen, dass TUDCA unter Cholestase die Insertion von MRP2 in die Hepatozytenmembran anregt. Dieser für die klinische Wirksamkeit der (T)UDCA potentiell bedeutende und im Tiermodell von uns vorbeschriebene Wirkmechanismus konnte damit erstmals in einem humanen Modell nachvollzogen werden. Ein weiterer in vitro Ansatz untersuchte die Phosphorylierung von aus HepG2-Ntcp immunopräzipitiertem MRP2 durch die als Gallensäureneffektoren diskutierten Proteinkinasen cPKCa, nPKCe und PKA. Alle drei Proteinkinasen phosphorylierten, durch den PKC/PKA-Inhibitor Staurosporin hemmbar, MRP2. Diese Phosphorylierung könnte, wie für die Gallensäurentransporter BSEP und NTCP bereits gezeigt, Einfluss auf Aktivität und Membraninsertion von MRP2 haben. Der funktionellen Bedeutung der PI3-Kinasen, welchen in den bisher entschlüsselten Signalwegen sowohl hydrophober/toxischer wie auch hydrophiler/protektiver Gallensäuren eine zentrale Rolle zugesprochen worden war („PI3-Kinasen-Paradoxon“), galten unsere in vitro Untersuchungen zur Aktivität der Isoformen der Klasse I PI3-Kinasen p110a, p110b und p110g nach Stimulation von primären Rattenhepatozyten mit TLCA, GCDCA, TCA und TUDCA in einem neu etablierten isoformspezifischen Kinaseassay. Dabei zeigte sich für jede Gallensäure ein für sie spezifisches Aktivierungsmuster unterschiedlicher PI3-Kinase-Isoformen. PI3-Kinase p110g wurde dabei spezifisch durch die cholestatisch und apoptotisch wirkenden Gallensäuren TLCA und GCDCA aktiviert. In HepG2-Ntcp-Zellen untersuchten wir daher die Bedeutung von p110g für Gallensäuren-induzierte Apoptose nach deren pharmakologischer Hemmung bzw. nach Transfektion mit siRNA gegen p110g. Die apoptotische Wirkung u.a. der Gallensäuren TLCA und GCDCA war unter beiden Methoden der p110g-Antagonisierung deutlich reduziert, wie sowohl in einem Caspase3/7-Assay als auch morphologisch evaluiert. Gallensäuren-unabhängige Apoptose, durch Etoposid bzw. TNFa ausgelöst, war p110g-unabhänig. Die Bedeutung der Aktivierung der PI3-Kinase-Isoform p110a durch TUDCA ist durch weitere experimentelle Untersuchungen zu klären. Die Erkenntnisse der vorliegenden Arbeit tragen zum Verständnis der komplexen Signalgebung im Rahmen cholestatischer Leberschädigung und der therapeutischen Wirkung der (T)UDCA bei und sind damit für die Entwicklung neuer Therapiestrategien bei cholestatischen Leberkrankheiten potentiell von Bedeutung.

Eine große Gruppe genetisch vererbter Erblindungskrankheiten steht im Zusammenhang mit Mutation in Genen, die in Photorezeptoren exprimiert sind. Diese Mutationen führen nicht nur zu einer Beeinträchtigung des mutierten Proteins selbst, sondern auch zu einer Störung von funktionell nachgeschalteten Proteinnetzwerken. In der Folge ändern sich die Zusammensetzung von Multiproteinkomplexen sowie die Proteinlokalisation, was schwerwiegende physiologische Konsequenzen nach sich zieht. Alleine im lichtwahrnehmenden Molekül Rhodopsin sind mehr als hundert unterschiedliche Mutationen beschrieben worden, die vermutlich im Zusammenhang mit Retinitis pigmentosa, einer degenerativen Erkrankung der Retina, stehen (http://www.sph.uth.tmc.edu/RetNet/). In Saccharose-Dichte Gadienten Experimenten von Dr. Magdalena Swiatek-deLange, die dieser Studie vorangegangen sind, wurde Rhodopsin als Teil eines potentiellen Rhodopsin/Ras Homolog Gene Family, Member A (RhoA)/Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (Rac1)/RhoKinase II (Rock II)/ Collapsin response mediator protein 2 (CRMP2) Signal-Multiproteinkomplexes in Außensegmenten von Stäbchen Photorezeptoren (ROS) identifiziert, welcher im Zuge dieser Studie bestätigt und eingehender untersucht wurde. Ein Zusammenhang zwischen einer Rhodopsin-vermittelten Degeneration von Photorezeptoren und der Regulation des Cytoskeletts durch die kleine GTPase Rac1, wurde von Chang und Kollegen (Chang and Ready, 2000) hergestellt. Sie haben gezeigt, dass die Expression von dominant-aktivem Rac1 in Rhodopsin-Null Mutanten von Drosophila die Rhabdomer Morphogenese erhalten kann. In Zellen fungiert Rac1 durch den Wechsel zwischen einem inaktiven, vorwiegend cytosolischen und einem aktiven, überwiegend membranassoziierten Zustand, als molekularer Schalter in der Signaltransduktion und vermittelt Signale von Membranrezeptoren an das Cytoskelett. Obwohl die Rolle von Rac1 bereits in einer großen Zahl unteerschiedlicher Zellen untersucht worden ist, ist seine Funktion in Photorezeptoren noch immer weitgehend ungeklärt. Die wenigen vorhanden Studien, in denen beispielsweise gezeigt wurde, dass Rac1 an der Fusion von Rhodpsintransportcarriern in Rana barlandieri (Deretic et al., 2004) oder auch an der lichtinduzierten Degeneration von murinen Photorezeptoren beteiligt ist (Belmonte et al., 2006), machen aber deutlich, dass Rac1 ein für die Funktion und Regulation von Photorezeptoren wichtiges Molekül ist. In dieser Studie wurde daher die Rolle von Rac1 in Photorezeptoren eingehender untersucht und ein Rac1-Interaktom in ROS, bestehend aus 22 Interaktoren, identifiziert. Von diesen 22 identifizierten Interaktoren sind fünf bereits als Interaktoren von Rac1 beschrieben worden, darunter CRMP2, einer der Hauptregulatoren von Polarität in neuronalen Zellen, sowie die cytoskelettalen Proteine Aktin ( and  und Tubulin ( and Unter den 17 neuen potentiellen Rac1 Interaktoren befindet sich das Aryl Hydrocarbon Receptor-Interacting Protein Like 1 (AIPL1), das im Zusammenhang mit Leberscher kongenitaler Amaurose (LCA) sowie mit retinalem Proteintransport steht (Sohocki et al., 2000), sowie eine Reihe von Proteinen, die Teil der Phototransduktionskaskade sind, wie die Untereinheit der 3´, 5´-cyclic-GMP Phosphodiesterase 6, Recoverin, Arrestin sowie die ,  und  Untereinheiten von Transducin. Rac1 verbindet damit die Lichtwahrnehmung durch Rhodopsin mit einer Regulation des Cytoskeletts und legt damit eine Interdependenz von Lichtwahrnehmung mit einer korrekten zellulären und funktionalen Struktur von Photorezeptoren nahe. In dieser Studie wurde nicht nur die Existenz des potentiellen Rhodopsin/RhoA/Rac1/Rock II/CRMP2 Multiproteinkomplexes in ROS bestätigt, sonder auch eine lichtabhängige Dynamik und Interaktion der einzelnen Komplexbestandteile beschrieben. In Übereinstimmung mit Daten aus verschiedenen Organismen ((Wieland et al., 1990), (Petrov et al., 1994), (Balasubramanian and Slepak, 2003)) konnte eine lichtabhängige Aktivierung von Rac1 in ROS von Schweinen nachgewiesen werden. Während lichtaktiviertes, GTP-gebundenes Rac1 überwiegend membranassoziiert vorliegt, konnte in dunkeladaptierten ROS insgesamt nur eine sehr geringe Menge an aktivem Rac1 detektiert werden. Des Weiteren wurden in dieser Studie auch deutliche Hinweise geliefert, die auf eine CRMP2 vermittelte Verbindung von Rac1 und RhoA assoziierten Signalwegen hinweisen, wohingegen die Kinase Rock II nur Teil des RhoA assoziierten Signalkomplexes zu sein scheint. Als Funktion von CRMP2 liegt daher eine Rolle als physiologischer Schalter nahe, der die Balance zwischen Rac1 und RhoA vermittelter Signaltransduktion koordiniert. Eine solche Funktion für CRMP2 wurde von Ariumura und Kollegen bereits für die Signaltransduktion in Neuronen vorgeschlagen (Arimura et al., 2000). Um die Signaltransduktion von CRMP2 in ROS eingehender untersuchen zu können, sind CRMP2 Antikörper unabdingbar, welche aber zu Beginn dieser Arbeit kommerziell nicht erhältlich waren. Daher war die Produktion und Charakterisierung von monoklonlalen CRMP2 spezifischen Antikörpern ein wichtiger Teil dieser Studie. Von den vier erhaltenen stabilen Linien monoklonaler, CRMP2 spezifischer Antikörper waren alle für den Einsatz im Western Blot sowie in der Immunohistochemie geeignet, aber nur ein Antikörper erwies sich auch als geeignet für die Immunopräzipitation von nativem CRMP2 aus primärem retinalen Gewebe. Dieser Antikörper stellt damit ein exzellentes Werkzeug für die weitere Charakterisierung der Funktion von CRMP2 in ROS dar. Drei Klassen von Proteinen regulieren die Aktivität von Rac1. Sie alle haben einen Einfluss auf den GTP/GDP-Austausch. Einer dieser Regulatoren ist der Rho GDP Dissociation Inhibitor (RhoGDI). Er kontrolliert die Interaktion von Rac1 mit weiteren regulatorischen Proteinen und Effektoren, sowie durch Interaktion mit dem Prenylrest von Rac1 das Pendeln zwischen Cytosol und Membran. Da aber der RhoGDI nicht in ROS nachgewiesen werden konnte (Balasubramanian and Slepak, 2003), legt dies den Schluss nahe, dass ein anderes Protein diese Funktion in ROS übernimmt. Das 17-kDa große Protein PDEdas lange Zeit als Untereinheit der retinalen cGMP Phosphodiesterase 6 aus Stäbchen galt, weist starke strukturelle Homologien zu RhoGDI auf. Es interagiert mit einer ganzen Reihe von prenylierten und unprenylierten Proteinen. Seine Fähigkeit, prenylierte Proteine von Zellmembranen zu lösen, erinnert stark an die Funktion, welche RhoGDI auf GTPasen der Rho Familie hat. Es wurde daher im Zuge dieser Studie untersucht, ob PDE in ROS GDI Funktion auf Rac1 ausübt. In dieser Arbeit konnte eine lichtabhängige Interaktion von Rac1 mit PDE in ROS von Schweinen nachgewiesen werden. Des Weiteren wurde gezeigt, dass aufgereinigtes PDE Rac1 von isolierten ROS Membranen lösen kann, eine Eigenschaft, die deutlich auf eine GDI-Funktion von PDE für Rac1 hinweist. Zudem wurde gezeigt, dass die Interaktion von Rac1 mit PDE mit einer lichtabhängigen Carboxylmethylierung von Rac1 in ROS korreliert, was ein Hinweis darauf sein kann, dass die die GDI Funktion von PDE durch die Methylierung von Rac1 reguliert wird. Alles in Allem zeigen diese Daten, das PDE für Rac1 in ROS die Funktion eines GDIs ausübt. In dieser Studie geben die identifizierten und mit Rac1 assoziierten Multiproteinkomplexe sowie deren lichtregulierte Dynamik einen deutlichen Hinweis darauf, dass Rac1 die Lichtwahrnehmung durch Rhodopsin mit Signalnetzwerken verbindet, die eine Rolle bei der strukturellen Integrität und Polarität von Photorezeptoren spielen. Dies deutet auf eine Abhängigkeit von Lichtwahrnehmung und funktioneller zellulärer Struktur hin. Mit der Bereitstellung von qualitativ sehr hochwertigen CRMP2 spezifischen Antikörpern liefert diese Studie zudem eine gute Basis für weiterführende Studien in diesem Forschungsfeld. Neben Rhodopsin assoziierten Komplexen stehen auch eine ganze Reihe von ciliären Komplexen in Zusammenhang mit degenerativen Erkrankungen der Retina. Im kürzlich entdeckten ciliären Protein Lebercilin (den Hollander et al., 2007) wurden Mutationen mit Leberscher kongenitaler Amaurose (LCA) in Verbindung gebracht, einer sehr schweren Form einer erblichen retinalen Dystrophie ((Kaplan et al., 1990), (Perrault et al., 1999)). Mit Hilfe von SF-TAP und LC/MS/MS Analysen konnten 24 Lebercilin Interaktoren in HEK Zellen identifiziert werden (den Hollander et al., 2007). Hier in dieser Studie wurden schließlich diese potentiellen Lebercilin Interaktoren auch in Photorezeptoren von Schweinen bestätigt (veröffentlicht in (den Hollander et al., 2007). Die identifizierten Interaktoren stellen mögliche Kandidaten für Gene für LCA und andere Ciliopathien dar und weisen Lebercilin als ein ciliär und mikrotubulär assoziiertes Protein in der Retina aus. Dies betont den Stellenwert, welche gestörte ciliäre Prozesse in der molekularen Pathogenese von LCA besitzen.

Das Membranprotein LMP1 des Epstein-Barr Virus (EBV) stellt das primäre Onkogen des Virus dar. Es ist essentiell für eine effiziente Transformation von B-Zellen durch das Virus und ist allein ausreichend, um Nagerfibroblasten zu transformieren. LMP1 aktiviert eine Vielzahl von Signalwegen über zwei carboxyterminale Aktivierungsregionen (CTAR1 und CTAR2), unter anderem die JNK-, die NF-κB, die PI3K- und die Jak/STAT-Signalkaskaden. Die Aufklärung der Signaltransduktion von LMP1 auf molekularer Ebene ist der Fokus intensiver wissenschaftlicher Forschung. Ziel der vorliegenden Doktorarbeit war es, neue Interaktionspartner von LMP1 zu identifizieren und so Lücken zwischen LMP1 und den weiter stromabwärts liegenden Signalwegen zu schließen. Dazu wurde im ersten Teil der Arbeit eine Methodik entwickelt, mit dem der Signalkomplex von LMP1 massenspektrometrisch untersucht werden konnte. Hierzu wurde zunächst ein Zellsystem etabliert, mit dem der LMP1-Multiproteinkomplex aus lymphoblastoiden Zelllinien (LCLs), also im viralen Kontext, präzipitiert werden konnte. Darüber hinaus wurde ein zusätzlicher Aufreinigungsschritt durch die Integration einer TEV-Protease-Schnittstelle zwischen den Transmembrandomänen und dem C-Terminus von LMP1 eingeführt. Mit diesem Verfahren wurde eine Reihe von neuen potenziellen Interaktionspartnern von LMP1 identifiziert. Von diesen konnten bereits zwei Proteine als LMP1 Interaktionspartner mit weiteren Methoden verifiziert werden, das Transmembranprotein CD48 und die Kinase TNIK. Der zweite Teil der Arbeit beleuchtet die Rolle der Protein-Tyrosin-Phosphatase SHP-1 in der Signaltransduktion von LMP1. Sie wurde in unserer Arbeitsgruppe als Interaktionskandidat von LMP1 identifiziert. Neben der Verifikation der Bindung gelang es in dieser Arbeit, die Interaktionsstelle von SHP-1 auf die beiden Tyrosine Y185 und Y186 von LMP1 zu kartieren. Damit wurde neben CTAR1 und CTAR2 ein weiteres, neues Bindemotiv von LMP1 entdeckt. Es konnte im Rahmen dieser Doktorarbeit gezeigt werden, dass LMP1 den NF-κB- und den Jak/STAT-Signalweg nicht nur induziert sondern durch die Interaktion von LMP1 mit SHP-1 diese Aktivierung regu-liert und begrenzt. LMP1 verfügt somit auch direkt auf der Ebene der Signaltransduktion über einen Me-chanismus, der seine eigene Aktivität moduliert.

Erufosin (Erucylphosphohomocholin, ErPC3) ist ein neuer Wirkstoff aus der Substanzklasse der Alkylphosphocholine, deren Angriffspunkt nicht die DNA, sondern die Zellmembran ist. Die Alkylphosphocholine lagern sich dort ein, beeinflussen die Lipidzusammensetzung, den Lipidmetabolismus und agieren durch Beeinflussung von intrazellulären Signalwegen unter anderem als Apoptoseinduktoren. Seit Januar 2004 wird mit Erufosin eine Phase I Studie durchgeführt (Dr. med. Lars Lindner, Medizinische Klinik und Poliklinik III, Klinikum Großhadern, LMU München, unpubliziert). Nach Abschluss der Studie wird sich für die folgenden Phase II Studien die Frage nach möglichen Kombinationsmöglichkeiten mit klassischer Chemotherapie oder auch Strahlentherapie stellen. Aufgrund der fehlenden myelosuppressiven Aktivität und der bislang guten Verträglichkeit (fehlende gastrointestinale Toxizität) eignet sich Erufosin insbesondere als Kombinationspartner für weitere toxische Therapieprinzipien wie z.B. Strahlentherapie. Für verschiedene andere, zum Teil bereits klinisch eingesetzte Alkylphosphocholine (Miltefosin®, Perifosin®) konnte in vitro gezeigt werden, dass sie die strahleninduzierte Apoptose verstärken und das klonogene Gesamtüberleben reduzieren, beides zum Teil sogar synergistisch. Eine Phase I Studie zum Einsatz von Strahlentherapie und Perifosin® wurde in den Niederlanden durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen eine gute Verträglichkeit der Kombinationsbehandlung (Vink, Schellens et al. 2006). In dieser Arbeit wurde anhand von Zellkulturexperimenten an 14 humanen Zelllinien von für Strahlentherapie in Frage kommenden Tumorentitäten die Kombinationswirkung von Erufosin und Strahlentherapie untersucht. Um die Bestimmung des klonogenen Überlebens zu simulieren wurde das WST1-Zellproliferationsassay verwendet. Die Tumorzellen wurden in einer 96-well-Platte ausgesät, mit Erufosin und Bestrahlung behandelt und die Zellzahl nach 5-8 Tagen Inkubation mit WST1-Reagenz gemessen. Dabei handelt es sich um eine Substanz, die von lebenden Zellen verstoffwechselt wird und der Metabolit photometrisch mit dem ELISA-Reader bestimmt werden kann. Zusätzlich wurde bei 6 Zelllinien die Auswirkung der Kombinationsbehandlung auf die frühe Apoptoseinduktion untersucht. Hierzu wurden die Zellen ausgesät, behandelt und nach 48h mit Propidiumiodid und Hoechst 33342 angefärbt. Die Auswertung erfolgte durch Auszählung der apoptotischen Zellen am Fluoreszenzmikroskop. Zur Quantifizierung der Kombinationseffekte wurde die isobolographische Analyse eingesetzt. Alle untersuchten Zelllinien zeigten in unterschiedlicher Empfindlichkeit ein Ansprechen auf Bestrahlung und Erufosin. Die Strahlenwirkung konnte durch Zugabe von Erufosin verstärkt werden, so dass das mehr Tumorzellen abstarben bzw. die frühe Apoptoseinduktion zunahm. In der isobolographischen Analyse ergaben sich subadditive bis additive Effekt. Besonders empfindlich für die Kombinationsbehandlung zeigten sich mit additiven Effekten A-549 (Bronchial-Ca), MCF-7 (Mamma-Ca), SK-LMS1 (Leiomyosarkom), NCI-H460 (Bronchial-Ca), DU-145 (Prostata-Ca), RD-ES (Ewing-Sarkom), KB (Zervix-Ca), FADU (Pharynx-Ca). Angesichts der Verstärkung des Strahleneffekts im Bezug auf Gesamtüberleben, der frühen Apoptoseinduktion bei Tumorzellen und dem bisher viel versprechenden Einsatz in der Klinik sollte die Kombination aus Erufosin und Strahlentherapie experimentell und klinisch weiter evaluiert werden.

Für den antiproliferativen Effekt der Kombinationstherapie aus UVA-Strahlung mit dem Furocoumarin Psoralen (PUVA) wird die Ausbildung von Doppelstrangvernetzungen (Interstrand Cross Links, ICL) verantwortlich gemacht. Unklar war, ob der PUVA-induzierte Zellzyklusarrest durch Doppelstrangvernetzungen, die die Replikationsgabeln mechanisch behindern, oder durch die Aktivierung von Zellzykluscheckpoints ausgelöst wird. Zellzykluscheckpoints garantieren die Stabilität des Genoms, indem sie die Zellzyklusprogression soweit verlangsamen oder anhalten, dass die Replikation von aufgetretenen DNA-Schäden oder Fehlverteilungen von Chromosomen verhindert werden kann. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass HaCaT-Keratinozyten durch PUVA-Exposition mit S-Phase-DNA-Gehalt arretiert werden. Zellen, die die DNA-Replikation bereits abgeschlossen hatten, waren von der PUVA-Exposition unbeeinträchtigt und durchliefen die Mitose. Zellen, die während der G1-Phase PUVA exponiert worden waren, durchquerten die G1-Phase und arretierten erst in der frühen S-Phase. PUVA induzierte eine schnelle Phosphorylierung der Chk1-Checkpointkinase an Serin 345, die mit einer Abnahme von Cdc25A einherging. Die Chk1-Phosphorylierung, die Abnahme von Cdc25A und der S-Phase-Arrest konnten durch Koffein aufgehoben werden. Dies lieferte den Beweis, dass die Aktivierung von Checkpointsignalkaskaden und nicht eine passive, mechanische Blockierung durch DNA-Doppelstrang-vernetzungen für den PUVA-induzierten Replikationsarrest verantwortlich ist. Die Überexpression von Cdc25A konnte den S-Phase-Arrest nur zum Teil aufheben, woraus sich folgern lässt, dass die Aktivierung von zusätzlichen Signalwegen an der Ausbildung des PUVA-induzierten S-Phase-Arrests beteiligt ist.

Zu Beginn dieser Arbeit wurde DJ-1 erstmals mit der PK in Zusammenhang gebracht. Die ersten Studien zeigten, dass L166P, eine Punktmutation im C-Terminus des DJ-1-Proteins, und eine Deletion von Exon 1-5 zu den Mutationen gehören, die zu den motorischen Fehlfunktionen, den Kardinalsymptomen, im Parkinsonpatienten führen. Diese Arbeit konnte dazu beitragen die Funktion von DJ-1 besser zu verstehen bzw. die Auswirkungen des Fehlens von DJ-1 aufzudecken. Es stellte sich heraus, dass die Expression von L166P im Vergleich zu [wt]DJ-1 sowohl in Eukaryoten als auch in Prokaryoten stark reduziert war. Die stark verminderte Proteinexpression kann entweder durch eine erhöhte Instabilität der RNA, durch eine Störung in der Proteinsynthese oder einen beschleunigten Abbau hervorgerufen werden. Durch semiquantitative RT-PCR- und quantitative RT-PCR-Experimente konnten Instabilitäten der RNA ausgeschlossen werden. Eine ineffektive Translation konnte durch „Pulse-Chase“-Experimente und CHX-Inhibitorstudien ebenso entkräftet werden. Allerdings scheint ein gesteigerter Abbau von [L166P]DJ-1 verantwortlich für dessen reduzierte Expression zu sein. Die Art des beschleunigten Abbaus konnte zwar nicht zweifelsfrei geklärt werden, aber es zeigte sich, dass ein Zusammenhang zwischen der Stabilität und der Struktur von DJ-1 besteht. Dabei spielt die C-terminale Domäne eine große Rolle, die nur im DJ-1-Protein als signifikante Helix-Knick-Helix Struktur vorhanden ist, nicht aber unter seinen Strukturhomologen. In einer Mutagenesestudie konnte gezeigt werden, dass im Helix-Knick-Helix Motiv nicht nur die PK-assoziierte Mutante L166P, sondern auch die Helix-brechende Mutante V169P in derselben Helix (G-Helix) und eine Deletion am Knick des Motivs (deltaN173/G174) eine Destabilisierung von DJ-1 bewirken konnte. Helix-brechende Mutationen in der H-Helix zeigten keine verminderte Proteinexpression im Vergleich zu [wt]DJ-1. Die G-Helix-brechenden Mutanten scheinen das Protein konformationell so zu verändern, dass keine Dimerisierung mehr möglich ist, was aus Co-IP Studien hervorging. Das Helix-Knick-Helix Motiv, welches einen Großteil der Dimerberührungsfläche ausmacht, scheint bei der Dimerisierung eine entscheidende Rolle einzunehmen. Weiterhin konnte ein direkter Zusammenhang der Stabilität und Integrität von DJ-1 und seiner Funktion herausgearbeitet werden. Dabei sind die G-Helix-brechenden Mutanten unter oxidativem Stress weniger zytoprotektiv und können in (anti)-apoptotischen Signalwegen eine Expression von apoptotischen Genen nicht verhindern. Diese Prozesse sind abhängig vom oxidativen Stress und von der Fähigkeit von redox-sensitivem DJ-1 als Intermediator in apoptotischen Signalwegen antioxidative Gene zu aktivieren. Diese Erkenntnis ist vor allen Dingen in reaktiven Astrozyten von Wichtigkeit, die Neurone, in Parkinsonpatienten besonders die dopaminergen Neurone, vor oxidativem Stress schützen können. In reaktiven Astrozyten ist DJ-1 in großen Mengen lokalisiert und scheint die Aktivierung von Verteidigungssystemen wie GSH zu beeinflussen. Somit ist DJ-1 ein wichtiger Marker für erhöhten oxidativen Stress, nicht nur in der PK, sondern auch bei Schlaganfallpatienten. Eine erhöhte Produktion von DJ-1 würde einen größeren Schutz vor neuronalem Sterben bewirken, so dass dies auch therapeutische Möglichkeiten eröffnen könnte.

PPAR gamma ist in mehreren Zellen des atherosklerotischen Plaques hochexprimiert und beeinflusst zahlreiche Mechanismen der Atherogenese. Ziel dieser Arbeit war es, an einem Makrophagenmodell, der MM6 sr Zelle, die Wirkung einer Stimulation des Transkriptionsfaktors PPAR gamma auf die Expression atherogener Scavengerrezeptoren und die funktionellen Auswirkungen des veränderten Rezeptorstatus auf die oxLDL- Aufnahme zu untersuchen sowie die daran beteiligten Regulationsmechanismen zu klären. Insbesondere sollte auch die Expression des Cholesterintransporters ABCA 1, der den reversen Cholesterintransport initiiert, untersucht werden. Dabei wurden verschiedene PPAR gamma- Liganden verwendet: An synthetischen Liganden wurde aus der Gruppe der NSAR Indomethacin ausgewählt und als Maßstab wurde 15-deoxy-12,14-Prostaglandin J2, der präsumtive physiologische Ligand, eingesetzt. Als pharmakologisch bedeutsamer Ligand wurde Rosiglitazon verwendet. Damit sollte dessen Wirkung auf Mechanismen der Atherogenese abgeschätzt werden. Weiteres Ziel dieser Arbeit war es, Interaktionen des PPAR gamma-Transduktionsweges mit anderen, für die Atherogenese potentiell relevanten Signalwegen zu charakterisieren. Da die Hyperinsulinämie im Rahmen des metabolischen Syndroms eine wichtige Rolle für arteriosklerotische Gefäßwandveränderungen spielt, und Thiazolidindione an peripheren Zellen als Insulinsensitizer wirken, sollte die Interaktion der PPAR gamma- und Insulin- Signalwege auf die Expression von Scavengerrezeptoren auf Makrophagen untersucht werden.

In dieser Arbeit wurde die biologische Funktion der PTP-Meg2 in der zellulären Signaltransduktion untersucht. Analysen mittels c-DNA-Filter, „Real Time PCR” und Immunblot zeigen eine ubiquitäre Expression der PTP-Meg2 auf ähnlichem, jedoch geringem Niveau in fast allen untersuchten Krebszelllinien unterschiedlicher Gewebeherkunft, wobei die Expressions-stärke nicht in direktem Zusammenhang mit krebsrelevanten Eigenschaften wie Invasivität und Metastasierung steht. Die induzierte Differenzierung von MCF 7-Zellen durch Natriumbutyrat steigert die Meg2-Expression um das 5-fache, wogegen die Differenzierung von SW948- und SK-N- SH-Zellen mit TPA bzw. Retinolsäure die Meg2-Expression reprimiert. Zellfraktionierung und Immunfluoreszenz zeigen eine primär zytosolische, aber partiell auch vesikuläre bzw. strukturierte Lokalisation der PTP-Meg2, für welche die CRALBP-Domäne der PTP-Meg2 mitverantwortlich ist. Untersuchungen der endogenen Meg2-Aktivität nach Immunpräzipitation und in vitro Phosphatasetests zeigen eine erhöhte Phosphataseaktivität nach Stimulation von Zellen mit FCS, EGF und LPA, wogegen TPA stark inhibierenden wirkt. Aktivitätsstudien mit GST-Meg2-Fusionsproteinen zeigen, dass die CRALBP-Domäne die Meg2-Phosphataseaktivität negativ reguliert. Im Protein-Lipid-Overlay interagiert PTP-Meg2 mit PI(3)P, PI(4)P, PI(5)P und Phosphatidylserin. Eine Interaktion mit PI(4)P führt zu einer erhöhten Meg2 Aktivität. Pervanadat-Stimulation von Zellen führt zu einer Tyrosinphosphorylierung sowie einer Mobilitätsänderung der PTP-Meg2, was auch mit einer katalytisch inaktiven Meg2-Mutante beobachtet wurde. PTP-Meg2 interagiert in vitro und in Koexpressionsstudien mit dem EGF-Rezeptor in Abhängigkeit von dessen Aktivierung. Eine physiologische Relevanz konnte nicht gezeigt werden. Die Depletion der PTP-Meg2 durch spezifische siRNA führt zu einer erhöhten Tyrosinphosphorylierung einiger, noch zu identifizierender Proteine. PTP-Meg2 vermindert, die inaktive PTP-Meg2CS-Mutante erhöht die durch v-ErbB und EGF-Rezeptor, nicht aber die durch HER2 und v-Ki-Ras induzierte Transformation von NIH3T3-Zellen im Focusbildungstest. Zudem bewirkt PTP-Meg2CS, mit Ausnahme der v-Ki-Ras infizierten Zellen, eine leicht erhöhte ERK1/2-Aktivität. Ferner stimuliert PTP-Meg2 die Migration von NIH3T3-Zellen im Wundheilungsexperiment. Ein Einfluss auf die basale und durch Stimuli induzierte Proliferation von Zellen in Wachstumstests wurde nicht beobachtet. Ein durch siRNA-vermittelter Meg2- „knockdown“ führte zur Induktion bzw. Repression der Expression von Genen, wie z.B. einiger Liganden, Caveolin-2, Nck und Rock, was auf eine Beteiligung der PTP-Meg2 an der Regulation von Signalwegen kleiner GTPasen bzw. von endo- sowie exocytotischen Prozessen schließen lässt.

Das Prion-Protein ist in seiner infektiösen Form für das Auftreten und die Übertragung von transmissiblen spongiformen Enzephalopathien verantwortlich. Diese Erkrankungen können bei Mensch und Tier auftreten, wobei die bekannteste tierische Form der „Rinderwahn“ bzw. BSE ist. Die häufigste Prion-Krankheit beim Menschen ist die Creutzfeldt-Jacob-Krankheit, deren neue Variante im Zusammenhang mit dem Auftreten von BSE steht. Die pathologische Form des Prion-Proteins (PrPSc) wird durch posttranslationale Umwandlung aus der apathogenen physiologischen Isoform PrPC gebildet. Dieses Protein wird vor allem in neuronalem Gewebe exprimiert und ist in allen Säugetieren hoch konserviert. Die Funktion des zellulären, apathogenen Prion-Proteins ist noch immer nicht geklärt, da Mäuse ohne dieses Protein gesund sind und keinen pathologischen Phänotyp haben. Daher müssen alternative experimentelle Ansätze unternommen werden, um zur Klärung der physiologischen Funktion beizutragen. In der vorliegenden Arbeit wurde deshalb mittels eines „Yeast-Two-Hybrid“-Screens nach Interaktoren des zellulären Prion-Proteins der Maus gesucht, welche in murinem Gehirn exprimiert werden. Es konnten in Hefe erfolgreich mehrere Proteine identifiziert werden, die bislang noch nicht als mögliche Interaktoren des zellulären Prion-Proteins beschrieben worden waren. Drei dieser Isolate wurden ausgesucht, um deren physiologische Interaktion mit PrP näher zu charakterisieren: Pint1, Synapsin Ib und Grb2. Mittels Copräzipitation konnte bestätigt werden, dass auch in Säugetierzellen eine physiologische Wechselwirkung zwischen den identifizierten Interaktoren und PrP auftritt. Das Protein Pint1 wurde bislang noch nicht beschrieben und besitzt eine hoch konservierte Aminosäureregion, die in Proteinfragmenten vom Menschen bis zum Wurm C. elegans zu finden ist. Die beiden anderen untersuchten Proteine sind beide an verschiedenen Wegen der zellulären Signaltransduktion beteiligt. Synapsin Ib ist mit synaptischen Vesikeln assoziiert, womit eine mögliche Verbindung zwischen der zellulären Funktion von PrPC und extrazellulären bzw. endokrinen Signalwegen besteht. Grb2 ist ein Adaptorprotein mit vielfältigen Aufgaben, vor allem der Kopplung von Membranrezeptoren mit intrazellulären Signalkaskaden. Durch den Nachweis einer Interaktion dieser beiden Proteine mit dem zellulären Prion-Protein konnte in der vorliegenden Arbeit erstmals ein physiologischer Zusammenhang zwischen PrPC und intrazellulären Signaltransduktionswegen gezeigt werden.