Podcasts about zur untersuchung

Computertomographie und Magnetresonanztomographie sind in der Humanmedizin häufig eingesetzte Verfahren. Sie liefern neben Ultraschall und Röntgen zusätzliche Informationen, die eine exakte Diagnosestellung ermöglichen. Auch in der Tiermedizin gewinnen diese Verfahren zunehmend an Bedeutung. Die Computertomographie ist besonders gut für die feinauflösende Darstellung von Hochkontraststrukturen wie Knochen. Zur Untersuchung von Weichteilen ist bei der Computertomographie die intravenöse Gabe, eines jodhaltigen Kontrastmittels erforderlich. Einmal mit und einmal ohne Röntgenstrahlen Bei der Magnetresonanztomographie wird nicht mit Röntgenstrahlen gearbeitet, sondern mit einem starken Magnetfeld. Dadurch können Bereiche im Körper dargestellt werden, die sonst durch einen Knochen abgeschirmt sind. Abgeklärt werden vor allem zentrale Störungen, Prozesse im Gehirn, Entzündungen, Blutungen oder Verletzungen im Rückenmark, wie Bandscheibenvorfälle, Embolien und Infarkte.

Schweighöfer, Kerstinwww.deutschlandfunkkultur.de, Studio 9Direkter Link zur Audiodatei

In der 8. Folge begrüßen wir Simone Rafael, Chefredakteurin der Website Belltower.News – Netz für digitale Zivilgesellschaft der Amadeu Antonio Stiftung. Seit 2019 leitet sie außerdem den Digitalbereich der Amadeu Antonio Stiftung, alle Projekte, die sich mit Demokratiegefährdung online und gesellschaftlichen Gegenstrategien befassen.Mit Gilda Sahebi spricht Simone Rafael über die Rahmenbedingungen, die Hassrede, Desinformation und Online-Radikalisierung möglich machen. Was läuft schief, dass der Ton so unerträglich ist und es zu massiven Bedrohungen kommt? Geschäftsmodelle und Algorithmen der Plattformen spielen ebenso eine Rolle wie Gesetzgebung sowie fehlende Ressourcen und Kompetenzen bei Polizei und Justiz. Wir bewegen uns in einem Spannungsfeld zwischen Meinungsfreiheit und Beschränkung der Meinungsfreiheit.Zur Untersuchung von Manipulationen während des Wahlkampfes hat Avaaz kürzlich eine Analyse zur Rolle von Desinformationen im Wahlkampf veröffentlicht. HateAid, eine Organisation, die Betroffene digitaler Gewalt unterstützt, hat eine aktuelle Analyse zur Bundestagswahl veröffentlicht, aus der hervorgeht, dass auf Facebook nach wie vor ein unzureichender Schutz vor strafbaren Inhalten besteht. Im Vergleich zu 2020 stiegen die Beratungsanfragen bei HateAid um 289% an.Der Podcast wird ermöglicht durch Zoom, betterplace und die Schöpflin Stiftung. Inhaltliche Kooperationspartner*innen sind die Neuen Deutschen Medienmacher*innen und das Veto Magazin. Am Ende hört ihr einen Kommentar von Markus Beckedahl, Gründer von netzpolitik.org und Mitgründer der re:publica-Konferenzen. In seinem Kommentar skizziert Markus Beckedahl Themen und Forderungen der digitalen Zivilgesellschaft für die kommende Bundesregierung, um das Netz gemeinwohlorientierter zu gestalten. Moderation: Gilda SahebiKonzept und Idee: Nadine Brömme (DAS NETTZ) und Lea RichterProjektkoordination und Redaktion: Lena Deser (betterplace lab)Produktion: Markus Dreesen (Podcast Monkey)#DISKURSzurWAHL #BTW21 #btw2021 #wahlkampf #Bundestagswahl2021 #HateSpeech #noHate #FakeNews #Rechtsextremismus #Rechtspopulismus #Antisemitismus #Rassismus #Verschwörungsmythen #Verschwörung Hosted on Acast. See acast.com/privacy for more information.

Heute möchte ich euch mal etwas zum Thema Spermiogramme erzählen! Richtig, heute widmen wir uns mal den Männern - bzw. der Untersuchung der männlichen Fruchtbarkeit. In diesem Podcast erkläre ich dir, wie ein Spermiogramm abläuft, was genau untersucht wird und wie man die möglichen Diagnosen und Normwerte nach WHO interpretiert. Außerdem sprechen wir darüber, was ein schlechtes Spermiogramm für den Kinderwunsch bedeutet und welche Möglichkeiten es gibt! ---- Link zum Youtube Video: https://www.youtube.com/watch?v=2JVFfreFaPc Link zum Blog Post: https://babybauchblog.de/spermiogramm ---- Social media/Blog: Link zum Blog: www.babybauchblog.de Youtube: Babybauch Channel Instagram: @babybauchblog Facebook: @babybauchblog Facebook Gruppe: Babybauch Gruppe ---- Haftungsausschluss: Dieser Podcast dient nur der Information und ersetzt in keinem Falle die persönliche Rücksprache mit einem Arzt oder einer anderen geeigneten Fachkraft. Ich erstelle alle meine Podcasts mit größtmöglicher Sorgfalt und auf Basis wissenschaftlicher Fakten - dennoch können auch mir Fehler passieren. Ich erhebe daher keinen Anspruch auf Aktualität, Richtigkeit oder Vollständigkeit. Auch wenn ich selbst approbierte Medizinerin bin, stellen meine Podcasts keine Onlineberatung dar und dürfen nicht als ärztliche Auskunft gesehen werden. Ich stelle keine Onlinediagnosen, auch nicht in Antworten und Kommentaren. Aber ich wünsche euch persönlich ganz viel Glück und Erfolg mit eurem Kinderwunsch und eurer Schwangerschaft - genug jetzt mit dem Juristenkram! ;) ---- Credits Outro Music: The Right Direction by Shane Ivers - https://www.silvermansound.com

Ein kanadischer Wissenschaftler ist in Nairobi während eines Vortrags plötzlich gestorben. Er arbeitete am Nationalen Mikrobiologie-Labor (NML) in Winnipeg, Kanada – dem einzigen P4-Labor in Kanada. Dieses unterhielt bis letztes Jahr enge Verbindungen mit Chinas einzigem P4-Labor in Wuhan. Mehr dazu: https://bit.ly/2uwwefO (c) 2020 Epoch Times

Um so komplexe System wie das gesamte Universum zu untersuchen, müssen Astrophysiker Meister im Auffinden einfacher Lösungen aus großen Datensätzen sein. Was können Sie mit dieser Expertise noch bewirken? In diesem interdisziplinären Vortrag erklärt TED Fellow Federica Bianco wie sie astrophysische Analysemethoden nutzt, um städtische und soziale Probleme zur lösen -- und stellare Mysterien.

In der vorliegenden Arbeit sollte die Fragestellung untersucht werden, inwieweit bei der Durchführung einer intradiscalen elektrothermischen Therapie (IDET) neurale Strukturen thermisch geschädigt werden könnten. Für die Generierung der Fragestellung wurde die Tatsache herangezogen, dass während einer IDET-Behandlung gezielt Temperaturen appliziert werden, welche für sich genommen potentiell zu Gewebeschäden führen können (Maximum: 90°C). Zur Untersuchung der Hypothese einer thermischen Schädigung wurde ein realitätsnaher, experimenteller Versuchsaufbau gewählt, bei dem ein gängiges Operationsgerät der Firma Smith&Nephew zur Anwendung kam. Bei den durchgeführten Experimenten wurden standardisierte IDET-Therapien an humanen postmortalen Lendenwirbelkörpersegmenten durchgeführt. An den Orten wichtiger benachbarter neuraler Strukturen (im Bereich des Rückenmarks, der Neuroforamina an der Bandscheibe sowie an der medialen Ventralseite der Bandscheibe) wurde die jeweilige Temperaturentwicklung bestimmt. Um dabei eine Annäherung an die in vivo Bedingungen der IDET-Therapie zu erzielen, wurde ein physiologischer Blut- und Liquorfluss in temperaturkonstanter, isotoner Kochsalzlösung (37,0 +/- 1,0°C) simuliert. Zusätzlich wurde die Oberflächentemperaturentwicklung eines weiteren Wirbelkörpersegmentes während IDET mithilfe einer Wärmebildkamera erfasst. Als wichtigstes Untersuchungsergebnis kann festgehalten werden, dass sowohl an der Hinterkante der vermessenen Wirbelkörpersegmente, als auch von diesem 2 mm in den Spinalkanal hineinreichend, Temperaturentwicklungen mit einem kurzfristigen Maximalwert Tmax von 45,2°C aufgezeichnet wurden. Im Anschluss kam es zu einem raschen Temperaturabfall. Die über die Zeit aufgetragene Temperaturentwicklung der zehn Messungen korrelierte übereinstimmend mit der Aufzeichnung der Hitzeentwicklung mittels der Wärmebildkamera an einer einzelnen Bandscheibe. Hierbei wurde das Maximum der Hitzeentwicklung 14-16 Minuten nach Behandlungsbeginn erreicht. In der Zusammenschau der beiden Untersuchungsverfahren lässt sich daher die Schlussfolgerung ziehen, dass die im benachbarten Gewebe freiwerdenden Temperaturen bei der IDET-Therapie mit zunehmender Entfernung zur Bandscheibe abnehmen. Wenngleich der gemessene Spitzenwert von 45,2°C als potentiell gewebeschädigend einzustufen ist, wurde während der durchgeführten IDET-Eingriffe eine mit 2 Minuten so kurze Gesamteinwirkdauer erfasst, dass angenommen werden kann, dass diese keinen oder nur geringen thermischen Schaden verursachen würde. Damit sollte für die standardisierte, sachgerechte Durchführung einer IDET-Behandlung das Risiko einer thermischen Denervation im Bereich des Rückenmarkes und weiterer benachbarter nervaler Strukturen als gering gewertet werden.

Prionerkrankungen gehören zu den neurodegenerativen Erkrankungen und können sowohl genetisch übertragen als auch erworben werden. Sie verlaufen bisher ausschließlich letal. Verursacht werden sie durch das PrPsc, die pathologische Isoform des physiologisch vorkommenden PrPc. Ein – teilweise noch kontroverser – Einfluss von Kupfer auf die Pathologie wurde mehrfach dargestellt. Bisherige Arbeiten haben diesen Einfluss jedoch insbesondere anhand der Bindung an die Oktarepeatregion untersucht; zunehmend wächst allerdings das Interesse an den Kupferbindungsstellen außerhalb dieser Region: unter anderem insbesondere am Histidin 95 (His95). Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmalig der Einfluss der Kupferbindung an der murinen Aminosäure Histidin 95 des Prionproteins (PrP) in vivo nach Infektion untersucht. Da die Erreger von Scrapie und CJD eine ähnlich Primär-, Sekundär- und Tertiärstruktur besitzen [51, 168], sind wahrscheinlich die Ergebnisse aus Tiermodellen - zumindest teilweise - auf das menschliche Prionprotein übertragbar. Zur Untersuchung wurden transgene Mäuse verwendet, die ein mutiertes PrP mit einem Aminosäure-Austausch von Histidin zu Glycin an der Position 95 des Prionproteins explizieren. Zur Abgrenzung des Einflusses der Mutation nach Infektion wurde vorab eine Charakterisierung der nicht infizierten Mäuse durchgeführt: Die Mäuse nach Mutation (H95G-Mäuse) sowie das mutierte Prionprotein (H95G- PrP) wurden vor Infektion ausführlich untersucht und mit Wildtypkontrollen verglichen. Immunhistochemisch, histologisch und klinisch zeigte sich vor Infektion kein Unterschied zwischen H95G-Mäusen und Wildtypmäusen. Anschließend erfolgten diese Untersuchungen bei RML-infizierten H95G- und Wildtypmäusen. In dieser Arbeit konnte zum ersten Mal anhand von homozygoten HG95+/+-Mäusen mit Prnp-/- Hintergrund und Prnp+/+-129/Sv- C57/Bl6-Kontrollmäusen ein signifikanter Einfluss der Kupferbindungsstelle am Histidin 95 auf die Pathologie und das Überleben nach Prioninfektion gezeigt werden. Die Ergebnisse wurden bei den Mäusen nach Infektion zweiter Passage geprüft. Hierdurch konnte eine stabile, signifikant verkürzte Inkubationszeit bei den H95G- Mäusen im Vergleich zum Wildtyp nachgewiesen werden. Nach Infektion konnte weiterhin gezeigt werden, dass die H95G-Mäuse in fast allen beurteilten Hirnregionen reproduzierbar signifikant mehr plaqueartige PrPsc-Ablagerungen sowie reproduzierbar signifikant geringere spongiforme Veränderungen aufwiesen. Im Bereich des Kleinhirns zeigten sich signifikant deutlicher ausgeprägte, in den untersuchten Cortexbereichen signifikant geringer ausgeprägte synaptische PrPsc- Ablagerungen nach RML-Infektion, die teilweise reproduzierbar waren. Wahrscheinlich werden diese Ergebnisse beeinflusst durch den hier gezeigten veränderten Abbau des H95G- PrPsc, das im Gegensatz zum Wildtyp-PrPsc hauptsächlich über den a-Abbaumechanismus abgebaut wird, sowie den möglichen höheren Konzentrationen von H95G-PrPc.

Sat, 12 Jul 2014 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/17567/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/17567/1/Munoz_Schmieder_Viviana.pdf Munoz Schmieder, Viviana

Proteine werden durch Gene kodiert und sind die Vermittler biologischer Strukturen und Prozesse. Veränderungen der Gene haben einen Einfluss auf die Struktur und Funktion der Proteine. Zur Erfüllung ihrer Aufgaben bilden Proteine über Protein-Protein-Interaktionen (PPI) Komplexe oder Funktionseinheiten. Diese zu kennen, ist wesentlich für das Verständnis der Funktion einzelner Proteine im Gesamtkontext und um den Einfluss von genetischer Variation auf die Proteinfunktion im Rahmen angeborener Erkrankungen besser einordnen zu können. Bislang werden PPI einerseits v.a. mit Hochdurchsatz-Verfahren untersucht, bei welchen die Proteine nicht in ihrer biologischen Umgebung exprimiert oder in denaturierter Form verwendet werden; dadurch ist häufig mit Artefakten zu rechnen. Andererseits erfordern die Verfahren zur in vivo-Untersuchung biologisch relevanter Interaktionen einen hohen Aufwand. Wir beschreiben in dieser Arbeit den Aufbau und die Etablierung eines Verfahrens zur in vivo Hochdurchsatz-Untersuchung von PPI. Dieses beruht auf der Technologie des Biolumineszenz Resonanzenergietransfers (BRET), welche durch Optimierung des Prozesses zu improved BRET (iBRET) hinsichtlich Effizienz, Durchsatz und Validität verbessert wurde. Dabei wurde die Konstrukt-Klonierung durch Einsatz eines auf Rekombination basierenden Klonierungssystems beschleunigt und Effizienz sowie Durchsatz der Transfektion von eukaryonten Zellen mit Hilfe eines Elektroporationsverfahrens im 96-Well Format optimiert. Bei der Detektion wurde ein Substrat verwendet, welches nur von lebenden Zellen verarbeitet werden kann. Die Signalmessungen erfolgten automatisiert an einem Multiwell Plattenlesegerät. Die Auswertung wurde durch eine bioinformatische Methode zur Berechnung von Schwellenwerten für positive Interaktionen verbessert. Mit dieser Technologie konnte die Homodimerisierung von PEX26 erstmals beschrieben und charakterisiert werden. PEX26 ist ein Membranprotein des Peroxisoms, das am Import von Matrixporteinen in das Peroxisom beteiligt ist. Bei genetischen PEX26-Defekten kommt es zum Auftreten von sog. peroxisomal ghosts – dies sind Membrankompartimente ohne Matrixinhalt. Klinisch kommt es v.a. zu Erkrankungen aus dem Zellweger-Spektrum, die sich mit einem unterschiedlichen Schweregrad manifestieren. Anhand von Trunkierungs-Konstrukten identifizierten wir mittels iBRET die zwei Interaktionsdomänen für die Homodimerisierung am C-Terminus des Proteins in der Umgebung der Transmembrandomäne bzw. in der peroxisomalen Matrix. Diese liegen abseits der für den Matrixprotein-Import essentiellen Bindedomäne für PEX6, der sich im zum Zytosol gerichteten N-terminalen Abschnitt von PEX26 befindet. Neben dem Volllängeprotein PEX26 wurde auch die Splice-Variante PEX26Δex5 beschrieben, welcher das Exon 5 und damit die Transmembrandomäne fehlt. Diese Variante ist im Endoplasmatischen Retikulum (ER) und im Zytoplasma lokalisiert. Wir zeigten, dass auch sie Homodimere bildet und zudem das Volllängeprotein PEX26 bindet. Sie ist in der Lage, das Fehlen von funktionellem PEX26 in PEX26-Defektzelllinien zu etwa 50% zu komplementieren, obwohl das Protein nicht am Peroxisom lokalisiert ist. Dies lässt die Schlussfolgerung zu, dass sich PEX26 für den Matrixprotein-Import nicht zwingend am Peroxisom befinden muss. Die physiologische Funktion der Splice-Variante ist noch nicht aufgeklärt. Mittlerweile ist bekannt, dass auch PEX26 anteilig im ER lokalisiert ist und es mehren sich die Hinweise, dass es aufgrund der Herkunft der Peroxisomen aus dem ER bei deren Biogenese und Homöostase eine Rolle spielt. Wir führten eine Literaturrecherche nach Interaktionspartnern von PEX26 und seinem homologen Protein Pex15p aus der Hefe durch, fanden hier jedoch keinen Hinweis auf weitere Funktionsbereiche von PEX26. Klar ist jedoch, dass sich die unterschiedliche Manifestation der Defekte bei den Patienten nicht allein aus seiner Rolle beim Import von Matrixporteinen ableiten lässt. Basierend auf der vorliegenden Arbeit könnten Erkenntnisse aus der derzeit in unserer Arbeitsgruppe umgesetzten Untersuchung des peroxisomalen Interaktoms zu einem besseren Verständnis der Funktion von PEX26 und der Fehlfunktion bei PEX26-Defekt beitragen.

Thu, 3 Apr 2014 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/17673/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/17673/1/Stroeh_Katja.pdf Ströh, Katja

Purpose The aim of this study was to establish a method to examine acute ischemic pain in humans using the example of adenosine. Materials and Methods 11 patients with unilateral peripheral arterial disease (PAD) performed a treadmill exercise until intolerable exercise-induced ischemic pain. Blood gas analysis (BGA) and blood samples were taken before treadmill examination (baseline), directly after treadmill examination and after recovery. The ankle-brachial index (ABI) and systemic blood pressure was measured at the same time. The ABI was measured via conventional Doppler method. High-performance liquid chromatography (HPLC) was used to determine the purine adenosine and its metabolite inosine. S100B-serum levels were detected via Elecsys® S100B Immunoassay (Roche Diagnostics, Penzberg Deutschland). Results Treadmill exercise lead to intolerable exercise-induced ischemic pain in the PAD affected leg. ABI decreased to pathological values. BGA and blood samples showed typical ischemic changes. A systemic increase in adenosine levels was measured, whereas no local increase in the PAD affected leg could be found. A correlation between S100B and peripheral nerve damage could not be found. Conclusion The established method is an effective model to examine acute ischemic pain in humans.

Otoakustische Emissionen (OAE) werden von den Äußeren Haarzellen im Corti-Organ im Rahmen der aktiven Verstärkerfunktion der Cochlea generiert. Die Messung von OAE ermöglicht somit die Beurteilung der cochleären Funktion mittels einer einfach durchzuführenden, zuverlässigen und nicht-invasiven Technik. Durch die Lage der Cochlea im Felsenbein sind die nicht-invasiven diagnostischen Möglichkeiten ansonsten deutlich eingeschränkt. Dementsprechend unklar ist bis heute die Pathophysiologie zahlreicher Innenohrschwerhörigkeiten. Könnten einzelne charakteristische Veränderungen der OAE jeweils verschiedenen pathophysiologischen Vorgängen in der Cochlea zugeordnet werden, brächte dies umfangreiche Möglichkeiten in Erforschung und Diagnostik von Innenohrschwerhörigkeiten. Eine cochleäre Ischämie mit folgender Hypoxie wird bei vielen Hörstörungen diskutiert. Ziel dieser Arbeit war die Etablierung eines Tiermodells, an dem die Veränderung der Pegel von Distorsionsprodukten Otoakustischer Emissionen (DPOAE) durch verschiedene Einflussfaktoren frequenz-spezifisch und im Zeitverlauf untersucht werden können. Insbesondere sollten die Veränderungen durch Hypoxie detailliert charakterisiert werden. Mit dem etablierten Tiermodell konnten störungsfreie DPOAE-Messungen unter stabilen Rahmenbedingungen erreicht werden. Durch kontinuierliches Monitoring mittels invasiver Blutdruckmessung und pulsoxymetrischer Bestimmung der Sauerstoffsättigung konnten kontrollierte Bedingungen zur Reduktion etwaiger Verzerrungseffekte geschaffen werden. Die Genauigkeit der Pulsoxymetrie wurde mittels Blutgasanalyse validiert. Erstmalig beschrieben werden konnte eine ausgeprägte Destabilisierung der DPOAE-Pegel unter Hypoxie. Eine bereits von mehreren Autoren berichtete Pegelabnahme konnte zudem erstmals mit dem Grad der Hypoxie korreliert werden, welcher mittels kontinuierlichem Monitoring der Sauerstoffsättigung im Blut erhoben wurde. Ein ebenfalls vorbeschriebener erneuter Abfall der DPOAE-Pegel nach Reoxygenierung wurde reproduziert. Dieser dürfte am ehesten durch osmotische Prozesse mit Ausbildung eines endolymphatischen Hydrops bedingt sein. Darüber hinaus wurde im Zusammenhang mit der Hypoxie ein vorübergehender Pegelanstieg auf Werte über den prähypoxischen Mittelwert beobachtet. Dieser wird, 44 analog zu ähnlichen Beobachtungen nach Exposition mit Tönen tiefer Frequenz, durch Verschiebung des „operating points“ der Äußeren Haarzellen erklärt. Bei suboptimaler Ausgangsposition befinden diese sich durch die Verschiebung vorübergehend in optimaler Position, was sich in einem Pegelanstieg bemerkbar macht. Die beobachtete markante Pegelinstabilität ist zwar unseres Wissens bislang für keinen der möglichen Einflussfaktoren beschrieben worden, zur Klärung ob diese tatsächlich Hypoxie-spezifisch ist bedarf es jedoch weiterer Studien. Da deutliche Unterschiede zwischen den einzelnen Frequenzen auffielen, sollten weitere Studien stets ein breites Frequenzspektrum berücksichtigen. Besonders auffallend war ein zu den Veränderungen bei 4, 8 und 16 kHz differentes Muster bei 2 kHz und insbesondere bei 12 kHz. Zusammen mit der einfach erhebbaren Pegelinstabilität könnte eine Analyse der einzelnen Frequenzen einem etwaigen Messmodell zur Erfassung einer cochleären Hypoxie zusätzliche Sicherheit bieten. Ließe sich dadurch tatsächlich eine cochleäre Hypoxie nachweisen, könnte das von großer Bedeutung für das Verständnis von Innenohrschwerhörigkeiten sein und als Bestandteil der audiologischen Diagnostik eventuell bei Therapieentscheidungen helfen.

Chronische Extremitätenischämien stellen eine sowohl subjektiv belastende als auch volkswirtschaftlich bedeutende Krankheitsentität dar. Dabei können etliche Patienten mit den zur Verfügung stehenden konventionellen Verfahren nicht befriedigend therapiert werden. Neuere Konzepte zur Zelltherapie der chronischen Therapie führten in der klinischen Erprobung dabei zu eher ausbaufähigen Resultaten. Unsere Gruppe konnte in Vorarbeiten zeigen, dass die exogene Applikation embryonaler Endothelprogenitorzellen (eEPCs) im Tiermodell zu einem deutlichen Effet auf die chronische Ischämie führt. Um diesen Effekt weiter zu steigern, wurde ein künstliches Fusionsmolekül aus dem Chemokin SDF-1 als Kopf, der Mucindomäne des Fractalkine als Rückgrat und einem GPI-Teil zur Verankerung im Endothel (SDF-Fractalkine-GPI oder S1FG) kloniert. Wir konnten ebenfalls in Vorarbeiten zeigen, dass dieses S1FG eEPCs in vitro und in vivo rekrutiert, und dass eine Vortransfektion des Endothels des Ischämiegebietes vor Applikation der eEPCs zu einer Steigerung des funktionellen Effekts führt. Wir stellten die Hypothese auf, dass ein Ersatz der exogenen Applikation der eEPCs durch eine Mobilisierung endogener vaskulärer Progenitorzellen ebenfalls zu einem guten funktionellen Effekt führt. Weiterhin sollte der genaue Rekrutierungsmechanismus des S1FG untersucht werden. Zur Untersuchung des funktionellen Effekts wurde wie in den Vorarbeiten ein Kaninchenmodell der chronischen Hinterlaufischämie gewählt, bei dem an Tag 0 die rechte Femoralarterie entfernt wurde. Nach Entwicklung eines chronischen Zustandes wurde am Tag 7 eine Angiographie beider Femoralisstromgebiete durchgeführt und entweder S1FG oder eGFP liposomal per Retroinfusion transfiziert. An den Tagen 9, 10 und 11 wurde jeweils 1 mg des kurzwirksamen CXCR4-Antagonisten AMD3100 oder 1 ml NaCl intraperitoneal injiziert. An Tag 35 wurde eine erneute Angiographie durchgeführt, das Tier getötet und die Hinterlaufmuskulatur entnommen. Die Angiogenese wurde über die mittels PECAM-1-Färbung bestimmte Kapillardichte gemessen, die Arteriogenese über die Mengenzunahme der in der Angiografie sichtbaren Kollateralen. Zur Messung der Perfusion wurden die Flussgeschwindigkeit in der Angiographie sowie fluoreszierende Mikrosphären verwendet. Um das Rekrutierungsprofil des S1FG in vitro zu eruieren, wurden statische Adhäsionsversuche mit PMNs auf transfizierten HMECs sowie Adhäsionsversuche in Flusskammern von THP-1-Zellen auf transfizierten HUVECs verwendet. Es zeigte sich, dass signifikant weniger PMNs auf S1FG-transfiziertem Endothel adhärieren, als auf Fractalkine-transfizierten HMECs, während die eEPC-Adhäsion signifikant besser war. Bei den Versuchen unter Schubspannung ergab sich durch S1FG-Transfektion keine signifikante Änderung der Anzahl rollender Zellen, während die Anzahl fest haftender Zellen signifikant höher war. Durch Zugabe eines L-Selektin-Antikörpers zu den THP-1-Zellen vor Superfusion konnte die Anzahl fest haftender Zellen wieder auf Kontrollniveau reduziert werden, während die Anzahl rollender Zellen leicht reduziert wurde. Zugabe von AMD3100 führte dort nicht zu einer signifikanten Änderung der Anzahl adhärierender Zellen, jedoch wurde durch AMD3100 die Stärke der Interaktion, gemessen als Anzahl nach Applikation hoher Flüsse noch adhärierender Zellen, wieder auf Kontrollniveau reduziert. Ein über andere Adhäsionsmoleüle vermitteltes Zellrollen ist also vermutlich eine Voraussetzung für eine adäquate S1FG-Funktion. Dabei würde es über SDF-1-CXCR4-Interaktion zu einer Erhöhung der Festigkeit der Bindung kommen. In Bezug auf den funktionellen Effekt im Tiermodell führte Verwendung von S1FG und AMD3100 zu einer signifikanten Steigerung von Kapillardichte, Kollateralenwachstum und Perfusion gegenüber der Kontrolle. Die Werte lagen dabei im selben Bereich wie durch Verwendung von S1FG und eEPCs erzielte Ergebnisse. Transfektion von S1FG ohne weitere Behandlung führte nicht zu einer signifikanten Änderung eines Parameters zur Kontrolle, während die Verwendung von AMD3100 zu moderaten Steigerungen bei Kapillardichte, und Kollateralenwachstum führte. Die Werte waren jedoch immer noch signifikant geringer als die nach Kombination von S1FG und AMD3100 erreichten Werte. Verwendung einer proteaseresistenten, funktionell jedoch aktiven Mutante für das SDF-1 im S1FG-Molekül führte nicht zu signifikanten Änderungen bei funktionellen Parametern, bis auf eine zwar signifikante, quantitativ jedoch geringe Verringerung des Kollateralwachstums. Zusammenfassend kann man sagen, dass die lokale Applikation eines künstlichen Adhäsionsmoleküls gemeinsam mit einer Mobilisierung knochenmarksständiger endothelialer oder vaskulärer Progenitorzellen zu einem deutlichen funktionellen Effekt führt, der den der Zellmobilisierung ohne Adhäsionssteigerung übertrifft. Dennoch birgt der Ansatz einige Risiken, wie die versehentliche Förderung von Tumorangiogenese oder die Beschleunigung des Wachstums atherosklerotischer Plaques. Zusätzlich bleibt unklar, welche Zellen genau durch das Adhäsionsmolekül rekrutiert werden, und ob es sich überhaupt um eine homogene Zellpopulation handelt. Weiterhin bleibt zu überprüfen, in welcher Weise die Wirksamkeit der Therapie durch chronische Defekte der Progenitorzellmobilisierung und -funktion, wie sie beispielsweise bei Diabetes oder Nikotinabusus auftreten, beeinträchtigt wird, und ob gegebenenfalls Optimierungsmöglichkeiten in Bezug auf das Mobilisierungsregime, den Aufbau des Adhäsionsmoleküls oder die Applikationsart bestehen. Nichtsdestotrotz stellt diese Methode einen vielversprechenden neuen Ansatz zur Verbesserung der bisher eher zwiespältigen Ergebnisse der Zelltherapie dar.

Ziel: 1)Etablierung einer immortalisierten hMSC-Zelllinie durch lentivirale hTERT-Transduktion. 2)Untersuchung der biologischen Effekt einer lentiviralen Transduktion von hTERT auf hMSCs. 3)Aufklärung des Transformationspotenyials von hTERT-transduzierten hMSCs. Material und Methoden: hMSCs wurden mit Lentiviren, die hTERT enthieten, transduziert. Konale hMSCs-hTERT wurden durch Isolation einzelner Zellen gewonnen. Die Expression von hTERT wurde mittels RT-PCR bestätigt. Die Zellproliferation wurde durch morphologische Beobachtung und Berechnung der “population doubling level”(PDL) und “population doubling time”(PDT) überwacht. Die Verhinderung der Seneszenz durch hTERT-Transduktion wurde durch Seneszenz-assoziierte β-gal-Färbung bestätigt. Dabei dienten nicht-transduziert hMSCs als Kontrollen. Der Stammzellcharakter von hMSC-hTERT wurde durch adipogene, chondrogene und osteogene Differenzierung überprüft. Zur Untersuchung der potenziellen tumorösen Transformation von lentiviral transduzierten hMSCs wurden Karyotypisierung und FISH-Analyse durchgeführt. Des Weiteren wurde der zeitliche Verlauf der Tumorsuppressor-Gene-Expression von RB1,TP53 und p21 untersucht, ein in vitro Softagar-Assay und in vivo Nacktmäusen Klonale und heterogene hMSCs-hTERT implantiert. Ergebnisse: hTERT wurde erfolgreich in hMSCs transduziert und “single-cell-picking”-Klone(SCP) konnten etabliert werden. In der RT-PCR wurde die hTERT-Expression bestätigt. Nicht-transduzierte hMSCs zeigten keine hTERT-Expression. Sowohl klonale, als auch heterogene hTERT-transduzierte hMSCs konnten über mehr als 500 Tage Kultiviert werden, während nicht-transduzierte hMSCs nach weniger als 250 Tagen seneszent wurden. Drei Phasen des Wachstums mit unterschiedlichen PDL und PDT konnten in hMSCs-hTERT beobachtet werden. Die Zellmorphologie der hMSCs-hTERT veränderte sich von einem gemischten Phänotyp in der “initialen Phase”(PDT 2,3 bis 5,5, PDL 20,7 bis 27,1) zu einem vermehrten Auftreten von flachen Zellen in der “Plateau-Phase” (PDT 9,2 bis 22,1, PDL 30,6 bis 48,2). Dies war ganz im zeitlichen Einklang mit dem Alterungsprozess von nicht transduzierten hMSCs. In der letzten und andauernden Phase zeigte sich eine hohe Anzahl von schnell wachsenden, kleinen und spindelförmigen Zellen (PDT von 2,1 bis 6,1, PDL 53,7 bis 105,6), welche aus einem Selbstselecktionierungsprozess in einer kontinuierlichen in-vitro Kultur hervorgegangen waren. Die erhaltene Differenzieungs-Kapazität der hTERT-transduzierten hMSCs wurde sowohl für klonale als auch heterogene hMSCs-hTERT durch eine positive Adipogenese-spezifische Oil-red-O-Färbung, Chondrogenese-spezifische Toluidinblau-Färbung und Osteogenese-spezifische von-Kossa-Färbung bestätigt. Zur Untersuchung einer potentiellen malignen Transformation der hMSCs-hTERT wurde eine Karyotyp-Analyse durchgeführt, die keine Auffälligkeiten zeigte. Darüber hinaus konnte eine unveränderte RB1, TP53 und p21 Tumorsuppressor-Gen-Expression nachgewiesen werden. Als Hinweis auf eine erhaltene Kontaktinhibition zeigten sich im Softagar-Assay keine Kolonien. Nach subkutaner Implantation der Zellen im Nacktmaus-Modell zeigte sich histologisch in vivo keine Tumorformation. Fazit: Zusammenfassend konnte mit dieser Arbeit erstmals gezeigt werden, dass eine lentivirale Transduktion von hMSCs mit hTERT eine effiziente und relative sichere Methode zur Erzeugung immortalisierter hMSCs ist. Obwohl es notwedig ist die Differenzierungskapazität und onkogene Potenzial für einen noch längeren Zeitraum zu untersuchen, konnte nach mehr als 500 tage in Zellkultur nachgewiesen werden, dass klonal expandierte lentivital hTERT-transduzierte hMSCs eine viel versprechende Zelllinie für die Forschung, aber möglicherweise auch für therapeutische Anwendungen zum Beispiel im Bereich “Tissue engineering” sein könnte.

Die überwiegende Mehrzahl der chloroplastidären Proteine ist im Nukleus kodiert und muss folglich posttranslational in das Organell importiert werden. Der Transport dieser Vorstufenproteine in die Chloroplasten wird von zwei multimeren Proteinkomplexen bewerkstelligt, den Toc- (Translocon at the outer envelope of chloroplasts) und Tic- (Translocon at the inner envelope of chloroplasts) Komplexen. In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Aspekte des Proteinimports analysiert: (i) die Evolution des Proteintransports, (ii) die Importwege von Proteinen der inneren Hüllmembran und (iii) die Struktur und Funktion des Kanalproteins Tic110. Zur Untersuchung der Evolution des Proteinimports wurde die Translokation verschiedener Vorstufenproteine in Chloroplasten höherer Pflanzen mit der in Chloroplasten des Mooses Physcomitrella patens verglichen. Dabei wurden Kinetik, Energiebedarf und Prozessierung analysiert. Dies ermöglicht Aussagen über die Entwicklung des Proteintransports, da bekannt ist, dass die Zusammensetzung der Toc- und Tic-Komplexe in der nicht-vaskulären Pflanze P. patens Unterschiede zu den Importapparaten höherer Pflanzen aufweist. Es konnte verdeutlicht werden, dass die untersuchten Vorstufenproteine dennoch das gleiche Importverhalten in den analysierten Modelsystemen zeigen, was darauf hinweist, dass die Importwege trotz der Unterschiede in den Translokationskomplexen konserviert sind. Im weiteren Verlauf dieser Arbeit wurde der Import von Proteinen der inneren Hüllmembran analysiert, für welche zwei unterschiedliche Wege beschrieben wurden: im „conservative-sorting“-Weg werden die Proteine über die Toc- und Tic-Komplexe in das Stroma transportiert, wo das Erkennungssignal von der stromalen Prozessierungspeptidase vom maturen Protein getrennt wird, bevor anschließend die Insertion der Proteine in die Membran erfolgt. Beim „stop-transfer“-Weg dagegen stagnieren die Proteine auf Höhe des Translokationskanals der inneren Hüllmembran und werden von dort lateral in die Membran inseriert. Eine systematische Charakterisierung der Importwege hydrophober Proteine der inneren Membran in Chloroplasten von Pisum sativum bezüglich Energiebedarf, Nutzung von Rezeptorkomponenten, sowie Bildung löslicher Intermediate konnte zeigen, dass die Insertion der untersuchten Vorstufenproteine in die innere Hüllmembran mittels des „stop-transfer“-Weges erfolgt. Des Weiteren wurde die Struktur und Funktion des Kanalproteins der inneren Chloroplastenmembran - Tic110 - näher untersucht, wobei vor allem die Verankerung von Tic110 in die Membran von Interesse war. Tic110 besitzt zwei N-terminale, hydrophobe Transmembranhelices, welche für die Verankerung in die Membran verantwort-lich sind, sowie vier C-terminale, amphipatische Transmembrandomänen. In dieser Arbeit konnte mittels Sequenzanalyse ein konservierter Bereich am Ende der ersten amphipatischen Helix identifiziert werden, welcher ebenfalls maßgeblich an der Membranverankerung beteiligt ist. Eine Mutation dieser Domäne führt zu einer Konformationsänderung des Proteins, woraufhin es nicht mehr in der Lage ist, stabil in Membranen zu inserieren. Die Topologie von Tic110 macht deutlich, dass große Teile des Proteins sowohl in den Intermembranraum, als auch in das Stroma hineinragen, wohingegen die amphipatischen Transmembrandomänen den Translokationskanal bilden. In dieser Arbeit konnte ein künstliches Importsystem mittels in Liposomen rekonstituiertem Tic110 etabliert werden, wodurch nicht nur gezeigt werden konnte, dass Tic110 in der Lage ist, Vorstufenproteine zu binden, sondern auch, dass eine Translokation der Proteine erfolgen kann. Die Daten weisen auf eine bedeutende Rolle von Tic110 als Proteinimportkanal der inneren Hüllmembran hin.

Im Rahmen dieser Dissertation wurde ein Studiendesign etabliert, um den Einfluss von Topiramat auf die Zielparameter Körpergewicht sowie Futter- und Wasseraufnahme und den Insulin- und Fettstoffwechsel unter kohlenhydratreicher Ernährung zu evaluieren. Es wurden insgesamt 4 Versuchsreihen im Paarfütterungsdesign durchgeführt. Homozygote Zuckerratten und db/db Mäuse erhielten über 1 bis 4 Wochen eine Hochdosis-Topiramattherapie (100 mg/kg/d) über eine orogastrale Sonde. Die db/db Maus erwies sich als nicht robust genug für das zu etablierende Studiendesign. Bei den Zuckerratten zeigte Topiramat den bekannten akuten anorektischen Effekt. Im Verlauf wurde bei den behandelten Tieren eine Verlangsamung der Wachstumsgeschwindigkeit gegenüber den Placebotieren trotz höherer oder gleicher Futteraufnahme deutlich. Dies lässt auf Wirkmechanismen des Topiramats schliessen, die das Energiegleichgewicht der Tiere auf metabolischer Ebene beeinflussen. Als ein wichtiger metabolische Effekt konnte die bereits vorbeschriebene antidiabetische Wirkung beobachtet werden. Daneben konnte erstmals eine Verminderung der de novo Lipogeneserate im weißen Fettgewebe nachgewiesen werden. Dieser Befund lässt der Carboanhydrasehemmung durch Topiramat eine zentrale Bedeutung für die gewichtsreduzierende Wirkung zukommen und gibt Anlass zur Erforschung weiterer Hemmstoffe, die nach Möglichkeit eine höhere Spezifität für das weiße Fettgewebe aufweisen sollten.

Thu, 22 Apr 2010 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/11452/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/11452/1/Havla_Joachim.pdf Havla, Joachim

Die Exposition mit Umweltstäuben, ultrafeinen Partikeln und Gasen wird als Ursache akuter kardiovaskulärer Morbidität und Mortalität angesehen. Epidemiologische und toxikologische Studien der letzten Jahre weisen auf die Bedeutung von ultrafeinen Partikeln als Auslöser für die lokalen pulmonalen und systemischen Entzündungsreaktionen hin, die durch Veränderungen in der kardiovaskulären Funktion gekennzeichnet sind. Dazu gehören endotheliale Dysfunktion und prothrombotische Prozesse, die letztlich zum akuten Herztod führen können. Die Mechanismen, die dazu führen, sind derzeit nur unzureichend geklärt. Es konnte in zahlreichen Studien gezeigt werden, dass ultrafeine Partikel von der Lunge in die systemische Blutzirkulation translozieren können. Als Ursache kardiovaskulärer Negativ-Effekte werden entweder die Freisetzung von löslichen Mediatoren aus der Lunge und direkte Effekte von translozierten, ultrafeinen Partikeln in die systemische Blutzirkulation diskutiert. Unsere Tierexpositionsstudie wurde durchgeführt, um die Hypothesen zu prüfen, dass „translozierte“ ultrafeine Kohlenstoffpartikel (UfCP) eine signifikante extrapulmonale Entzündung induzieren können. Zu diesem Zweck wurden die systemischen Effekte von zwei verschiedenen Expositionsmodellen verglichen. Die Versuchsmäuse wurden mittels der Inhalation von UfCP (48 nm; 440 µg/m3) bzw. gefilterter Luft für 4 oder 24 Stunden oder durch die intraarterielle Infusion mit der berechneten äquivalenten Dosis von innerhalb einer 24-Stunden- Inhalation translozierten UfCP (5 × 10E7 UfCP) exponiert. Die Versuchsmäuse wurden hinsichtlich systemischer Effekte in der Blutzirkulation mittels automatisierter hämatologischer Untersuchung von Zellzahlen und Plasma-Zytokin-Konzentrationen untersucht. Darüber hinaus wurden Aktivierungsmarker auf peripheren Monozyten und Granulozyten mit FACS analysiert. Zur Untersuchung der lokalen, entzündlichen, mikrovaskulären Effekte in den Geweben von der Lunge, vom Herz, von der Aorta und von der Leber wurde eine quantitative Genexpressionsanalyse und eine multianalytische Proteinexpressionsanalyse durchgeführt. Die Inhalation von UfCP war durch eine leichte pulmonale Entzündungsreaktion mit endothelialer Aktivierung und einer leicht erhöhten Fibrin(ogen)deposition auf Endothelzellen von kapillaren Blutgefäßen der Lunge gekennzeichnet, wohingegen die intraarterielle Infusion von UfCP keine signifikanten Reaktionen in der Lunge aufwies. Auf systemischer Ebene verursachten beide Expositionsmodelle nach der Partikelexposition einen Anstieg von neutrophilen Granulozyten- und Monozytenzellzahlen und zugleich eine Abnahme der pro-entzündlichen Plasma-Zytokin-Konzentrationen, jedoch mit einem stärkeren Effekt nach der Inhalation von UfCP. Hinsichtlich dieser Endpunkte lassen diese Ergebnisse auf einen adjuvanten Effekt von „translozierten“ Partikeln schließen. Jedoch zeigte sich nur nach der Inhalation von UfCP eine signifikante Abnahme von Aktivierungsmarkern auf der Oberfläche der zirkulierenden Leukozyten-Populationen, was auf eine Retention/Transmigration von aktivierten Zellen über die Adhäsion des aktivierten Endothels in der Lunge hinweist. Das Zytogramm der Thrombozyten ergab ebenso nur nach der Inhalation von UfCP einen Anstieg der Zellzahlen und ihres Aktivierungszustandes und dessen der Riesenthrombozyten. Diese Tatsache lässt auf die notwendige pulmonale Entzündungsreaktion schließen, die für die Rekrutierung und Aktivierung der Thrombozyten ausschlaggebend war. In beiden Expositionsmodellen mit UfCP zeigte innerhalb der extrapulmonalen Organe die Aorta die stärkste entzündliche und prothrombotische Reaktion auf, wobei im Vergleich zur intraarteriellen Exposition ein stärkeres pro-entzündliches Reaktionsbild nach der Inhalation von UfCP zu erkennen war. Die Inhalation von UfCP induzierte in der Leber eine frühe, vorübergehende pro-entzündliche Reaktion mit einer endothelialen Aktivierung und einer geringfügigen Reaktion im Herzen, die mit steigender Expositionsdauer zunahm, während die intraarterielle Infusion von UfCP in diesen Organen keine offensichtlichen Effekte verursachte. Die Ergebnisse dieser Studie weisen darauf hin, dass die systemisch verfügbaren UfCP teilweise förderliche Effekte auf spezifische biologische Endpunkte haben mögen. Jedoch zeigen die Ergebnisse eindeutig, dass die Entzündungsreaktion in der Lunge entscheidender für die meisten extrapulmonal beobachteten Effekte ist. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit kann die wichtigste Aussage getroffen werden, dass die Lungenentzündung und nicht die Translokation ultrafeiner Partikel entscheidend für die extrapulmonalen Effekte ist.

Fri, 6 Feb 2009 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9789/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9789/1/Renner_Riitta.pdf Renner, Riitta

HIV-1 ist ein neurotrophes Virus und kann im Gehirn über Jahre verbleiben. Während bekannt ist, dass Astrozyten ein zelluläres Reservoir für das Virus im Gehirn bilden, ist die Infektion anderer neuraler Zellen des ZNS noch ziemlich unklar. Neurale Progenitorzellen sind mulitpotente, sich selbsterneuernden Zellen des fetalen und des adulten Gehirns, die in der Lage sind, sich in Neuronen, Oligodendrozyten und Astrozyten zu differenzieren. Es konnte bereits gezeigt werden, dass diese Zellen durch das HI-Virus infiziert werden können. Ziel der vorliegenden Arbeit war nun, zu untersuchen, ob diese Zellpopulation ein weiteres mögliches Reservoir für das Virus darstellen könnte. Als Zellkulturmodell wurde die neurale Progenitorzelllinie HNSC.100 verwendet. Sie konnte zum einen als proliferierende Progenitorpopulation kultiviert werden und zum anderen auch, nach gezielter Differenzierung mittels des Zytokins CNTF, als Modellsystem für Astrozyten. Die beiden HNSC.100-Populationen zeigten verlässliche funktionale und phenotypische Unterschiede. Zur Untersuchung des Differenzierungsstatuses konnte eine transgene Zellpopulation etabliert werden, welche eine differenzierungsabhängige Expression des EGFP-Proteins zeigt. Die Progenitorzelllinie HNSC.100 wurden mittels zellfreiem HIV-1 infiziert und die HIV-Infektion über einen Zeitraum von vier Monaten untersucht. Die Bestimmung der Proviruskopienzahl zeigte, dass die Zellpopulation während der gesamten Beobachtungsperiode infiziert blieb. Die infizierte Progenitorpopulation setzte über 60 Tage lang moderate Mengen an HIV frei, danach sank die Virusproduktion der Zellen ab. Die Progenitorzellen bildeten jedoch weiterhin virale RNA-Transkripte. Durch Induktion der Astrogenese oder Behandlung der Zellen mit dem proinflammatorischen Zytokin TNF- konnte die Virusproduktion der infizierten Progenitorzellen vorübergehend wieder aktiviert werden. Die Langzeit-Infektion der neuralen Progenitorpopulation hatte Auswirkungen auf einige zelluläre Eigenschaften der Zellen: die GFAP-Produktion der Zellen nahm im Verlauf der Infektion zu, die Zellen zeigten eine veränderte Zellmorphologie und die Differenzierung in reife Neuronen war beeinträchtigt. Diese Ergebnisse zeigen, dass HIV in neuralen Progenitorzellpopulationen persistieren kann und dabei zelluläre Eigenschaften der Population verändert.

Die Akupunktur wird zunehmend in der Patientenversorgung eingesetzt. Auch wenn einige klinische Effekte in großangelegten Studien nachgewiesen werden konnten, ist der Wirkmechanismus der Akupunktur weitgehend ungeklärt. Grundlagenforschungen und klinische Studien schreiben der Akupunktur eine lokale und zentrale Wirkung zu. Insbesondere zu den lokalen, das heißt peripheren, Effekten liegen nur sporadische Studienergebnisse vor. Zur Untersuchung der peripheren sensorischen Effekte ist mittlerweile die Quantitativ Sensorische Testung (QST) ein Standardverfahren mit welchem verschiedene Empfindungs- und Schmerzschwellen bestimmt werden können. Ziel der vorliegenden Studie war es, die Soforteffekte verschiedener Stimulationstechniken der Akupunktur auf Veränderung sensorischer Parameter mittels QST zu untersuchen. Dazu wurde eine prospektive, randomisierte, kontrollierte und einfachverblindete Studie mit 24 gesunden Probanden im Cross-over-Design mit sechs Behandlungssträngen und drei verschiedenen Interventionen (manuelle Akupunktur, niedrigfrequente Elektroakupunktur, hochfrequente Elektroakupunktur) einseitig an vier Akupunkturpunkten am Unterschenkel (Milz 6, Milz 9, Magen 36, Gallenblase 39) durchgeführt. Zielparameter waren die Veränderungen der senorischer Parameter. Hierzu wurde mittels QST Wärme- und Kälteschwelle, paradoxe Hitzeempfindung, Hitze- und Kälteschmerz, taktile Detektionsschwelle, Allodynie, Druckschmerzschwelle und Vibrationsempfinden gemessen. Messstelle war jeweils eine 30 mm x 30 mm große Fläche an beiden lateralen Unterschenkeln. Das individuelle Nadelgefühl (DeQi) und die Intensität des Einstichs der Akupunkturnadel wurden mittels eines Fragebogens und Visueller Analog Skala untersucht. Die Analyse der Ergebnisse zeigte keine Veränderung bei folgenden Parametern: Wärme- und Kälteschwelle, paradoxe Hitzeempfindung, Hitze- und Kälteschmerz, taktile Detektionsschwelle, Allodynie, Vibrationsempfinden. Unter hochfrequenter Elektroakupunktur (HF) kam es zu einer signifikanten Erhöhung der Druckschmerzschwelle sowohl an der ipsilateralen als auch an der kontralateralen Messtelle. Es konnte mit Ausnahme der Druckschmerzschwelle kein Unterschied zwischen den drei verschiedenen Stimulationstechniken festgestellt werden. Trotz des repetitiven Schmerzreizes durch Akupunktur kam es zu keiner Allodynie oder gesteigertem Wind-up. Die methodentypische Nadelsensation DeQi und der Einstich der Akupunkturnadel wurden individuell sehr unterschiedlich erlebt und scheinen keinen Einfluß auf die Veränderung der sensorischen Parameter zu haben. Eine eindeutige Zuordnung der beteiligten Strukturen kann nicht getroffen werden. Es wird geschlußfolgert, dass die Akupunktur mit HF bei gesunden Probanden zu einer Veränderung der Druckschmerzschwelle führt, so dass auf Grund der bereits vorliegenden Forschungsergebnisse eine Aktivierung der deszendierenden Schmerzhemmung vermutet werden kann. Weitere Nervenfaserfunktionen konnten bei dem untersuchten Probandenkollektiv nicht demonstriert werden. Auf Grund der in der vorliegenden Studie auffällig hohen Standardabweichungen sollten zukünftige Studien mit QST mit einer größeren Fallzahl durchgeführt werden.

Tue, 20 May 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9392/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9392/1/Krok_Patrizia.pdf Krok, Patrizia

Wed, 20 Feb 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8638/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8638/1/Gueth_Jan-Frederik.pdf Güth, Jan-Frederik

Thu, 29 Nov 2007 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/7851/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/7851/1/Klose_Alexander.pdf.pdf

Tropische Zyklonen, die aus den Tropen in höhere Breiten kommen, wechselwirken dort oft mit einem außertropischen Tiefdruckgebiet. Das daraus entstandene System kann sich infolge der Wechselwirkung nochmals verstärken und hohe Windgeschwindigkeiten und starke Niederschläge in den mittleren Breiten hervorrufen, die normalerweise von solchen Wetterextremen nur selten bedroht sind. Gerade solche Ereignisse gehen oft mit erheblichen Vorhersagefehlern einher und das, obwohl hier eine verlässliche Vorhersage aufgrund der heftigen Wettererscheinungen sehr wichtig wäre. Ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden Dynamik könnte helfen diese Vorhersagen zu verbessern. Hier wurden idealisierte, numerische Experimente durchgeführt, erstens um herauszufinden, ob ein hurrikan-ähnlicher Wirbel die barokline Entwicklung entscheidend beeinflussen oder sogar auslösen kann. Dazu wurde der Tropische Wirbelsturm zu verschiedenen Zeitpunkten eingesetzt, zum einem zu einem Zeitpunkt bei dem die barokline Welle gerade initialisiert wird, zum anderen zu einem reiferen Entwicklungsstadium der baroklinen Welle. Zweitens wurden die Anfangspositionen des Hurrikans variiert, um zu untersuchen, wie die Lage des tropischen Systems relativ zur Welle deren zukünftige Entwicklung verändert. Alle Experimente wurden mit dem zyklonalen und antizyklonalen Entwicklungsmuster einer baroklinen Welle durchgeführt. Kommt der Tropische Wirbelsturm in eine fast ungestörte, barokline Umgebung, hatte er in diesen numerischen Experimenten einen erheblichen Anteil an der Entwicklung der Welle. Bei einem späteren Zeitpunkt war dies nicht der Fall. Außerdem stellte sich heraus, dass kleine Änderungen der Lage von Hurrikan relativ zur baroklinen Welle die Entwicklung entscheidend beeinflussen können. Eine hinreichend genaue Kenntnis der Position des Hurrikans und der baroklinen Welle ist nötig, um eine korrekte Vorhersage machen zu können. Eine wichtige Rolle, ob nach der Wechselwirkung eine Verstärkung stattfindet, scheinen die Größenverhältnisse zu spielen. Beim zyklonalen Entwicklungsmuster hat sich ein relativ großskaliger Trog entwickelt, bei dem keine Verstärkung auftrat nach der Wechselwirkung. Durch das typische Ausdünnen des Troges im antizyklonalen Fall hatte der Trog in etwa die gleiche Größenordnung wie der Hurrikan und es gab eine Verst¨arkung nach der Wechselwirkung.

Im Rahmen einer Untersuchung der kognitiven und emotionalen Entwicklung zwischen dem 4. und 6. Lebensjahr hat sich ein Test bewährt, bei dem Kinder mit einer projektionsfördernden Miniaturlandschaft frei spielen ("Zwei Berge Experiment"). Projektive Verfahren werden wegen mangelhafter Auswertungsobjektivität in der wissenschaftlichen Psychologie kaum verwendet. Stattdessen werden Tests vorgezogen, die weniger komplexe aber auch weniger inhaltsreiche Daten produzieren (quantitative Methoden). Die intuitive, hermeneutische Auswertung "weicher" projektiver Daten (qualitative Methoden) ist wegen ihrer Subjektivität nicht verlässlich. Erst eine formalisierte, und damit objektive Auswertung, die der Komplexität von projektiven Verfahren gerecht wird, wird wissenschaftlich anerkannt werden. Zur Objektivierung der Auswertung dieses Tests wird jeder einzelne Spielschritt in einem hierfür entwickelten Computerprogramm formal codiert. Ein psychologisches Expertensystem erzeugt Assoziationen zu einzelnen Spielhandlungen, um deren Bedeutung im Computer verarbeitbar zu machen. Der Algorithmus fasst das Spielgeschehen in relevanten Aussagen zum gesamten Spiel zusammen. Anhand dieser erfolgt die Zuordnung zu einem Spieltypus durch neuronale Netze. Die Spieltypen, die sich während der intuitiven Auswertung bewährt hatten, waren: Harmonie, Instabilität, Spaltung und Konsolidierung. Die objektive Auswertung des Zwei-Berge-Experiments korrelliert hochsignifikant mit Theory of Mind (false-belief-Test) (rspearman=.73, p

Polyglutaminerkrankungen sind neurodegenerative Erkrankungen mit fatalem Verlauf, die sich durch selektive neuronale Degeneration und die Bildung intrazellulärer Aggregate auszeichnen. Verursacht werden sie durch eine Expansion einer Polyglutaminsequenz in einem für die Erkrankung spezifischen Protein, die Fehlfaltung und Aggregation des entsprechenden Proteins bewirkt. Die Aggregation wirkt dabei neurotoxisch, wobei Toxizität hauptsächlich durch lösliche Intermediate des Aggregationsprozesses vermittelt wird. Zur Untersuchung der frühen Aggregationsphase und der späteren Elongationsphase wurden in dieser Arbeit verschiedene fluoreszenzbasierte Methoden etabliert. Mit Hilfe dieser Methoden konnte gezeigt werden, dass nach proteolytischer Spaltung von GST-Htt-Exon1 das Monomer eine Konformationsumlagerung durchmacht, die von einer Dimerisierung oder Oligomerisierung gefolgt wird. Dimere oder Oligomere bilden dabei eine kompakte Struktur aus. Wachstum der Fibrillen erfolgt durch Anlagerung von Monomeren oder einer anderen bisher nicht identifizierten Spezies. Durch Distanzmessungen innerhalb verschiedener Spezies konnte gezeigt werden, dass unlösliche Spezies eine kompakte Struktur aufweisen, die spezifisch für unlösliche Spezies ist. Lösliche Spezies liegen dagegen in einer expandierteren Konformation vor. Molekulare Chaperone üben oftmals eine protektive Funktion auf Neuronen in neurodegenerativen Erkrankungen aus. In dieser Arbeit wurde untersucht, inwieweit das eukaryontische Chaperonin TRiC, das in einem RNA-interference screen als potentieller Suppressor der Huntingtin-Aggregation identifiziert wurde, Aggregation modulieren kann. Gereinigtes TRiC hat keinen Einfluss auf die frühe Phase der Htt-Exon1-Aggregation, vielmehr inhibiert es die Elongation von fibrillären Strukturen, indem es mit Htt-Exon1-Oligomeren interagiert. Diese Interaktion ist transient und ATP-unabhängig. Im Gegensatz dazu interagiert TRiC in Kooperation mit dem Hsp70/40-System mit Htt-Exon1-Monomeren und verhindert die Nukleation der Aggregation. Stattdessen wird ein „gefaltetes“ Htt-Exon1-Produkt mit einer neuartigen Konformation gebildet, das löslich, nicht-fibrillär und nicht-toxisch ist und ~500 kDa-Oligomere ausbildet. Diese Interaktion ist kooperativ, sequentiell und benötigt ATP, ähnelt also der kooperativen Interaktion von TRiC und Hsp70/40 in der de novo-Proteinfaltung und stellt möglicherweise einen natürlichen Faltungsweg für Huntingtin dar.

In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss des dreidimensionalen Strahlungstransportes, insbesondere der differentiellen Einstrahlung, auf die Wolkenbildung und -entwicklung untersucht. Hierzu wurde ein Verfahren zur Berechnung der Bestrahlungsstärke am Boden unter inhomogener Bewölkung entwickelt und in das Grobstruktursimulationsmodell EULAG implementiert. Durch Vergleich von Simulationen mit der originalen Modellversion und dem weiterentwickelten Modell wurde der Einfluss der differentiellen Einstrahlung, verursacht durch Wolkenschatten, auf die konvektive Grenzschicht untersucht. Das Verfahren beruht auf der tilted independent column approximation (TICA). Hierbei werden einzelne Säulen, die in Richtung der Sonne ausgerichtet sind, betrachtet und für diese die Strahlung unabhängig voneinander berechnet. Die Methode wurde optimiert, parallelisiert und dadurch so stark beschleunigt, dass die Rechenzeiten der in dieser Arbeit durchgeführten Simulationen mit EULAG-TICA nur maximal 3% über denen mit EULAG ohne Strahlung liegen. Durch Vergleich mit exakten dreidimensionalen Strahlungstransportrechnungen wurde gezeigt, dass die TICA eine sehr gute Näherung zur Berechnung solarer Bestrahlungsstärken am Boden für unterschiedliche Wolkensituationen und verschiedene Sonnenzenitwinkel darstellt. Hingegen ist die verbreitete independent column approximation (ICA) zur Berechnung von Bestrahlungsstärken am Boden nur für im Zenit stehende Sonne geeignet, da die ICA aufgrund der Beschränkung auf den Strahlungstransport in senkrechten Säulen keinen realistischen Schatten produziert. Die berechnete Bestrahlungsstärke wurde an die Modellphysik gekoppelt durch die Anpassung des Wärmeflusses am Boden. Dieser wirkt sich auf die Temperatur in der Atmosphäre aus. Anhand von Vergleichen mit Messreihen unter gleichen Wolkenbedingungen wurde gezeigt, dass die durch die Wolkenschatten verursachten Temperaturfluktuationen am Boden in Simulationen mit EULAG-TICA realistisch sind. Zur Untersuchung des Einflusses der differentiellen Einstrahlung auf die Wolkenbildung wurden Simulationen einer einzelnen konvektiven Wolke durchgeführt. Der Einfluss auf die Wolkenentwicklung wurde anhand von Simulationen der konvektiven Grenzschicht untersucht. Die Simulationen mit und ohne Wolkenschatten zeigen deutliche Unterschiede. Im Bereich des Wolkenschattens ist der Aufwind wie erwartet schwächer ausgeprägt als in der Referenzsimulation ohne Schatten. Als Folge des schwächeren Aufwindes reicht die Wolke in den Simulationen mit Schatten weniger hoch und weist daher ein geringeres Volumen und einen geringeren Flüssigwasserpfad auf. Ist das Wolkenwachstum nach oben durch eine Inversion begrenzt, so wie in der konvektiven Grenzschicht, zeigen sich kaum Unterschiede im Bedeckungsgrad und Wolkenvolumen zwischen den Berechnungen mit und ohne Wolkenschatten. In jedem Fall hat die differentielle Einstrahlung jedoch einen starken Einfluss auf die Zirkulation. Vertikalprofile der horizontalen Windgeschwindigkeiten zeigen mittleren Wind von der Wolke in Richtung ihres Schattens in Höhe der Wolken und in entgegengesetzter Richtung in Bodennähe. Dies bedeutet, dass die an konvektiven Wolken vorhandene Zirkulation (aufsteigende Luft unterhalb der Wolke, Ausfließen in der Höhe der Wolke aus der Wolke heraus in alle Richtungen, absinkende Luft neben der Wolke und am Boden Luftbewegung von allen Seiten unter die Wolke) in Richtung des Schattens orientiert wird. Des Weiteren zeigen die Ergebnisse eine Bewegung der Wolken weg von ihrem Schatten, bzw. eine Auflösung der Wolken oberhalb ihres Schattens und Wolkenwachstum auf der der Sonne zugewandten Seite. Steht die Sonne im Zenit ist die Lebensdauer der einzelnen Wolken kürzer. Sie lösen sich schneller wieder auf, da der sie bildende Aufwind durch den Schatten abgeschwächt wird.

Thu, 26 Apr 2007 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/6910/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/6910/1/Makowski_Marcus-Richard.pdf Makowski, Marcus Ri

Einleitung: In der operativen Versorgung von Frakturen der Tibia ist nach heutigem Standard die Marknagelung Methode der Wahl. Der neu konzipierte Titan US-Nagel Depuy ACE Aim Dynamic weist einige design- und funktionsspezifische Besonderheiten im Vergleich zum vorherigen Modell auf. Hierzu zählen die Bohrung des Nagels für die Verwendung von Führungsdrähten, welche am oberen Ende in eine Schlitzung mündet, und die konische Fräsung der Löcher für die erleichterte Einbringung der Verriegelungsbolzen. Vom Vorgängermodell wurden 220 Nägel eingesetzt, es kam in keinem Fall zu einem Materialversagen. Beantwortet sollte daher für die klinische Anwendung die Frage werden, ob die Änderung des Designs zu sog. Sollbruchstellen am Nagel bzw. im Nagel-Bolzen-System führt. Methode: Geprüft wurden zwei Gruppen á 5 Nägeln auf einer Zwick 010. Zur Untersuchung der maximalen Belastbarkeit (Peak load) von 8mm Nägeln am Übergang Zylinder- in U-Form (Schlitzung im proximalen Bereich) kam eine standartisierte Vier-Punkt-Biegung mit neu konzipierter Probenhalterung gemäß der Empfehlungen der ASTM (American Society for Testing and Materials) für die Prüfung intramedullärer Osteosynthesematerialien (Stützweite L=11,4cm; Last-Stütz-Abstand s=3,8cm; Lastweite c=3,8cm) zum Einsatz. Die Daten dieser Messungen im Schlitzbereich (5) wurden verglichen mit den Ergebnissen einer Belastungsprüfung im weiter distal gelegenen, zylindrischen Bereich des Nagels (5). Für die Prüfung des Nagel-Bolzensystems verwendeten wir auf Grund der zentralen Bohrung für Führungsdrähte eine modifizierte Vier-Punkt-Biegung mit ebenfalls neu konzipierter Probenhalterung. Die Peak load von 36mm Verriegelungsschrauben mit 4,5mm Gewindedurchmesser, eingeschraubt in eine Buchenhartholzhülse mit 19mm Stützweite, bei direkter Kraftübertragung mittels Standard-8mm-Nagels, wurde bestimmt. Ergebnisse: Die Grenze von elastischer zu plastischer Verformung der gepüften Nägel wurde im Schlitzbereich bei einer Last von F = 4.218 N, also einem um 17,68% geringeren Biegemoment erreicht (Rp0.1 bei 80,14 Nm;) als in zylindrischen Abschnitten (F = 5.049,5N). Im physiologischen Bereich kam es zu keinem Nagelbruch. Unter Verwendung des neuen Nagel-Bolzen-Systems kam es zum Bruch der geprüften Verriegelungsbolzen bei einer durchschnittlichen axialen Last von 2.510 N. Dies entspricht einem um 13,12% geringeren Biegemoment (Rp0.1 bei 8,16 Nm;) als unter Verwendung des Vorgängermodels. Zusammenfassung: Der zur operativen Versorgung von Tibiafrakturen neu konzipierte standardmäßig verwandte US-Nagel Depuy ACE Aim Dynamic ist ein außergewöhnlich sicheres System, was aus unseren Testergebnissen abgeleitet werden kann. Zwar zeigt dieser im Vergleich zu seinem Vorgängermodell Schwächen in der Belastbarkeit des Nagel-Bolzen-Systems. Dies erscheint aber unter Berücksichtigung der gängigen postoperativen Belastungssteigerung als unproblematisch.

Trotz des Einsatzes verschiedenster sehr potenter Antibiotika und Antiphlogistika in Verbindung mit einer ausgereiften Intensivmedizinischen Betreuung ist die Sepsis sowohl in der Human- als auch in der Tiermedizin heute immer noch eine der häufigsten Todesursachen. Die Immunpathogenese der Erkrankung ist gekennzeichnet durch eine systemische Entzündungsreaktion, hervorgerufen durch eine frühe Sekretion des Zytokins Tumor Nekrose Faktor alpha (TNFα). Im Vergleich zu TNFα gilt dagegen das erst kürzlich entdeckte Zytokin High Mobility Group Box 1 (HMGB1) als später proinflammatorischer Faktor. Um nun die Rolle dieser beiden Zytokine in der caninen Sepsis näher zu untersuchen, wurden neue sensitive Nachweismethoden etabliert und zusätzlich zwei bereits kommerziell erhältliche Substanzen aus der Humanmedizin zur Neutralisation von caninem TNFα in vitro getestet. Anhand bereits publizierter Sequenzen und mit Hilfe der Ensembl Datenbank konnten per PCR die Sequenzen für canines TNFα, TNFR1 (P60), HMGB1 und dessen Rezeptor RAGE kloniert und die Proteine rekombinant exprimiert werden. Die Bioaktivität und die Konzentration des rcanTNFα wurden in einem Zytotoxizitäts Assay mit der Zelllinie WEHI164 getestet. Die Bioaktivität des P60-Fc Fusionsproteins wurde durch seine neutralisierende Wirkung auf das zytotoxische rcanTNFα im gleichen Assay nachgewiesen. Mit Hilfe des P60-Fc Fusionsproteins und einem kommerziellen biotinylierten Ziege-anti-Hund TNFα Antikörper konnte ein entsprechender sensitiver ELISA aufgebaut werden. Gleichzeitig wurden ebenfalls im WEHI-Bioassay die zwei humanen anti-TNFα Therapeutika Infliximab und Ethanercept auf ihre Eigenschaft zur Bindung und Neutralisation von caninem TNFα hin getestet Nur Ethanercept konnte dabei das Zytokin binden und neutralisieren. Anschließend wurden Plasmaproben von 79 klinisch an Sepsis erkrankten Hunden analysiert und im TNFα ELISA quantifiziert. Keine der untersuchten Proben wies dabei jedoch einen erhöhten Spiegel an TNFα im Plasma auf. Aus diesem Grund wurden nun auch mit Hilfe zweier polyklonaler Seren gegen rcanHMGB1 und gegen eine spezifische Peptidsequenz des Zytokins ein Western Blot Verfahren und ein Capture ELISA für die Messung von HMGB1 aufgebaut. HMGB1 konnte dabei allerdings sowohl bei gesunden als auch bei sepsiskranken Hunden in vergleichbaren Mengen nachgewiesen werden.

Mon, 29 Jan 2007 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/7167/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/7167/1/Arnold_Simone.pdf Arnold, Simone

Fri, 17 Nov 2006 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/6551/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/6551/1/Schneiderhan_Tobias.pdf Schneiderhan, Tobias

Der Aufbau des Zellkerns und die höheren Organisationsmuster von Chromosomen gehorchen Regeln, die bisher in menschlichen Zellen und Zellen einiger Primaten bestätigt werden konnten. In dieser Arbeit sollte an einem anderen Säuger, der Maus, untersucht werden, in wie weit sich die bisher gewonnenen Erkenntnisse auch auf den molekularbiologisch intensiv studierten Modellorganismus der modernen Genomforschung übertragen lassen. Besonders interessant ist die Frage, weil der Karyotyp der Maus nur akrozentrische Chromosomen enthält und viel homogener in Bezug auf Chromosomengröße und Gendichte ist, als der Karyotyp des Menschen oder verschiedener Primaten. Die letzten gemeinsamen Vorfahren von Mäusen und Menschen lebten vor über 80 Mio. Jahren, in dieser Zeitspanne fanden die zahlreichen Veränderungen am Genom der Maus statt. Die vorliegende Arbeit untersucht, ob Gemeinsamkeiten in Bezug auf die Organisation des Chromatins nachzuweisen sind und ob evolutionär konservierte Organisationsmuster zu finden sind. Die quantitative Untersuchung der Topologie von Chromosomenterritorien und Zentromerregionen erfolgte mit Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung auf Zellkernen von vier Zelltypen der Maus. Auf Kerne von Lymphozyten, Fibroblasten, ES-Zellen und Makrophagen wurden die Territorien von sechs Chromosomen mittels Chromosomen-Paint-Sonden hybridisiert. Das ausgewählte Chromosomenset enthielt genreiche, genarme, große und kleine Chromosomen in verschiedenen Kombinationen. Bilddaten wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop aufgenommen und einer digitalen quantitativen Bildanalyse unterzogen. In allen Mauszelltypen zeigten sich klare Korrelationen zwischen sowohl Gengehalt als auch Größe und radialer Verteilung von Chromosomenterritorien. Bei kugeligen Lymphozytenkernen korreliert die Gendichte stärker mit der radialen Verteilung als es die Chromosomengrößen tun. In Fibroblasten sind beide Korrelationen schwächer, aber nachweisbar, in ES-Zellen sind die Korrelationskoeffizienten wieder etwas höher und für beide Verteilungsmodelle gleich, in Makrophagen überwiegt die größenabhängige Verteilung der Chromosomenterritorien. Das genreichste Chromosom MMU 11 zeigt in den Lymphozyten die meisten Unterschiede zu anderen Chromosomenterritorien, während sich das genarme MMU X in den untersuchten männlichen ES Zellen durch seine extreme Randlage von den anderen unterscheidet. Innerhalb der Fibroblasten und Makrophagen gibt es vergleichsweise wenig signifikante Unterschiede zwischen den radialen Positionen der untersuchten Chromosomenterritorien. Zelltypspezifische Verlagerungen von Chromosomenterritorien zeigten sich auch nach einem Differenzierungsschritt von ES-Zellen zu Makrophagen. Die Lage der Chromozentren ist zelltypspezifisch. Im Gegensatz zu den untersuchten Chromosomenterritorien liegen die Chromozentren in Fibroblasten und Makrophagen in relativ zentralen Positionen. In Lymphozyten sind die Chromozentren am weitesten nach außen zum Zellkernrand gelangt, gefolgt von den ES-Zellen. Die Anzahl der Chromozentren ist ebenfalls zelltypspezifisch. Ausgehend von der Chromozentrenzahl in ES Zellen nimmt die Zahl der Chromozentren in differenzierteren Zellen zu (Lymphozyten, Fibroblasten) oder bleibt gleich (Makrophagen). Aufgrund der Ergebnisse lässt sich ausschließen, dass die äußere Form des Zellkerns alleine für die beobachteten Verteilungsunterschiede verantwortlich ist. Allerdings waren die beobachteten Unterschiede kleiner als bei vergleichbaren menschlichen Zelltypen. Mit ein Grund dafür ist sicher die geringere Variabilität der Chromosomengröße und Gendichte im Genom der Maus. Zellkernvolumina lagen zwischen 470 und 650 µm3. Lymphozyten besitzen im Durchschnitt die kleinsten Kerne der zyklierenden Zelltypen, ES-Zellen die größten. Makrophagen befanden sich in der G0-Phase, ihre Zellkerne waren am kleinsten und wiesen die geringste Standardabweichung auf. Die Analyse der Winkel und Abstände innerhalb der Chromosomenterritorien zeigte eine sehr flexible Positionierung innerhalb der Grenzen radialer Ordnungsprinzipien. Diese Resultate sind unvereinbar mit einem früher vorgeschlagenen Modell der Trennung des parentalen Genoms. Es gibt keine Hinweise für eine Abweichung von einer zufälligen Verteilung, von einer Häufung nahe beieinanderliegender MMU 1 Homologen in Makrophagen abgesehen. Zur Untersuchung der Struktur von Chromosomenterritorien wurden Programme angewandt, bei denen steigende Schwellwerte zu Zerfällen von Objekten führten, die analysiert wurden. Zwei unabgängige Methoden zur Berechnung von Objektzahlen in Bildstapeln führten zu gleichen Ergebnissen. Mit dem Programm OC-2 konnten Unterschiede in der Textur von Chromosomenterritorien bei der Maus innerhalb eines Zelltyps, als auch zwischen Zelltypen festgestellt werden. Dabei wurden die individuellen Chromosomengrößen mit berücksichtigt. Es konnte kein allgemeiner Zusammenhang zwischen den durchschnittlichen maximalen Objektzahlen und dem Gengehalt der entsprechenden Chromosomen festgestellt werden, vielmehr scheint die Textur des Chromatins von noch unbekannten, zelltypspezifischen Faktoren beeinflusst zu sein. Die Analyse der Chromatinstruktur in normalen menschlichen Zelltypen und in Tumorzelllinien mit dem Objektzählprogramm OC-2 ergab allgemein erhöhte Objektzahlen in Tumorzellen, verglichen mit normalen Zelltypen. Davon unabhängig waren auch immer die genreichen HSA 19 durch höhere Objektzahlen charakterisiert als die etwas größeren genarmen HSA 18 in den selben Zell-typen. Vergleiche zwischen den Objektzahlen eines Chromosoms in normalen Zelltypen und Tumorzelllinien ergaben mehr Unterschiede, als Vergleiche nur innerhalb der normalen Zelltypen. Die hier untersuchten Tumorzelllinien weisen eine objektreichere Chromatinstruktur auf, als die ihnen gegenübergestellten normalen Zelltypen.

Die hohe genetische Variabilität von HIV stellt ein großes biologisches Hindernis für die Entwicklung erfolgreicher Medikamente und Impfstoffe dar. Im Laufe seiner Evolution hat HIV eine Vielzahl von Untergruppen und Subtypen entwickelt, die in unterschiedlichen geographischen Regionen und Bevölkerungsgruppen eigenständige Epidemien geschaffen haben, aus denen sich die weltweite Pandemie zusammensetzt. Die hohe Evolutionsrate von HIV wird verursacht durch seine Fähigkeit, schnell zu mutieren, zu rekombinieren und sich mit einer sehr kurzen Generationszeit zu replizieren. Während die kontinuierliche Akkumulation von Punktmutationen eher zu allmählichen Veränderungen der biologischen Eigenschaften des Virus führt, können durch Rekombinationsereignisse zwischen verschiedenen Virusisolaten plötzlich größere Genomabschnitte ausgetauscht und damit eventuell fittere Varianten generiert und selektiert werden. Eine rasche Bildung von Fluchtmutanten oder Resistenzen gegen antiretrovirale Therapie sind die Konsequenz. Voraussetzung für die Bildung derartiger Mosaikgenome ist zum einen die zeitgleiche Infektion einer Zielzelle mit mehreren Virionen und zum anderen die Koinfektion eines Individuums mit mehr als einer HIV-Variante. Koinfektionen und Rekombinationen mit verschiedenen HIV-1 Subtypen sind besonders wahrscheinlich in Regionen, in denen mehrere Virusvarianten kozirkulieren, wie in Tansania, wo man die HIV-1 Subtypen A, C und D nebeneinander findet. Zur Untersuchung der genauen Subtypenverteilung mit besonderem Fokus auf rekombinante Formen und Mehrfachinfektionen wurde in der Region Mbeya im Südwesten Tansanias eine Hochrisikokohorte von 600 Barfrauen gebildet, die alle drei Monate über einen Zeitraum von vier Jahren nachuntersucht wurden (HISIS-Studie). Die initiale HIV-1 Prävalenz in dieser Kohorte betrug 67,8%. 75 zufällig aus dieser Studie ausgewählte HIV-1 positive Frauen wurden in dreimonatigen Intervallen mit dem Multiregion-Hybridisation-Assay (MHAACD) auf ihren HIV-1 Subtyp hin getestet. Dieser sensitive und durchsatzstarke Subtypisierungstest beruht auf dem Prinzip einer real-time PCR mit subtypenspezifischen Hybridisierungssonden, die an die HIV-DNA in fünf Genomregionen binden. Neben reinen Subtypen kann der MHAACD auch rekombinante Viren und Doppelinfektionen mit hoher Vorhersagekraft nachweisen. Die Verteilung der reinen (nichtrekombinanten) Subtypen zu Beginn der Studie wurde dominiert von C mit 34%, gefolgt von A mit 9% bzw. D mit nur 5%. Damit wird der größere Einfluß der südlichen Nachbarn, in denen ebenfalls der Subtyp C überwiegt, auf die Region Mbeya im Vergleich zu den nördlich angrenzenden vor allem von Sutyp A und D dominierten Staaten deutlich. 52% aller Infektionen sind entweder verursacht durch rekombinante Viren (32%) oder Mehrfachinfektionen mit Beteiligung von Rekombinanten (20%). Dieser Prozentsatz liegt sehr viel höher als in der Allgemeinbevölkerung dieser Region und impliziert daher eine Korrelation zwischen dem Risikoverhalten der Infizierten und der Wahrscheinlichkeit einer HIV-1 Mehrfachinfektion und dem Auftreten von rekombinanten Formen. Die Mehrheit der Koinfektionen schienen nicht auf einer simultanen, sondern einer sequentiellen (Superinfektion) Transmission verschiedener Virusvarianten zu beruhen, was durch den Vergleich zweier Gruppen von Barfrauen belegt wird. Erstere befanden sich in einem mittleren Infektionsstadium der HIV-1 Infektion und wiesen eine signifikant geringere Prävalenz an Mehrfachinfektionen (9%) auf als die zweite Gruppe der Teilnehmerinnen, die sich zu Beginn der Studie schon in einem Spätstadium bzw. im AIDS-Stadium befand und mit 30% einen deutlich höheren Anteil an Mehrfachinfektionen zeigte. Aus den durch den MHAACD detektierten Mehrfachinfektionen wurde eine Studienteilnehmerin mit einer fortgeschrittenen HIV-1 Infektion zur detaillierten Analyse der viralen Populationen ausgewählt. Sie entwickelte innerhalb von 12 Monaten nach Eintritt in die Studie AIDS definierende Symptome und verstarb kurz darauf an den Folgen der Immunschwäche. Der an fünf aufeinanderfolgenden Zeitpunkten (0, 3, 6, 9, 12 Monate) durchgeführte MHAACD-Test enthüllte eine AC-Doppelinfektion in der vpu-Region. Diese konnte durch die Amplifikation, Klonierung und Sequenzierung von drei Genomfragmenten (gag/pol, vpu/GP120, GP41/nef) bestätigt werden. Eine detaillierte phylogenetische Sequenzanalyse der Region 2 (vpu/GP120) enthüllte eine zweite A-Variante, weshalb von einer Dreifachinfektion der Patientin ausgegangen werden kann. Zusätzlich wurden in allen drei untersuchten Genomregionen eine Reihe von aus den Elternformen gebildeten rekombinanten Viren identifiziert. Die komplexeste virale quasispecies mit mindestens acht verschiedenen molekularen Formen wurde in der Region 2 (vpu/GP120) gefunden. Die Anteile der verschiedenen viralen Varianten in den analysierten Regionen fluktierten sehr stark über den Untersuchungszeitraum von einem Jahr, weshalb eine longitudinale einer cross-sektionalen Analyse zur zuverlässigen Detektion von Koinfektionen vorzuziehen ist. Eine eindeutige Tendenz zu stärkerer Homogenisierung bzw. Diversifizierung der quasispecies mit der Manifestierung von AIDS und damit sinkendem Immundruck konnte nicht festgestellt werden. Für die Amplifikation der drei untersuchten Genomfragmente im Rahmen einer verschachtelten PCR wurden jeweils vier verschiedene Primerkombinationen verwendet. Es konnte gezeigt werden, dass der Einsatz multipler Primerpaare eine Selektion bestimmter Virusvarianten während der PCR verringern und damit die Wahrscheinlichkeit der Detektion einer Mehrfachinfektion im Vergleich zu einer konventionellen PCR erhöhen kann. Eine weitere Sensitivitätssteigerung der Methodik wäre zukünftig durch zusätzliche Primerpaare denkbar. Die detaillierte Untersuchung der viralen Formen spielt eine bedeutende Rolle vor allem im Hinblick auf zukünftige Studien zur Evaluierung von HIV-Vakzinen, wie sie unter anderem in der Region Mbeya in Tansania stattfinden werden. Ein unvollständiges Bild der zirkulierenden HIV-Varianten kann zu einer falschen Interpretation der Ergebnisse solcher Studien und in der Folge zu einer falschen Einschätzung der Wirksamkeit von Impfstoffkandidaten führen.

Die Dissertation ist Teil eines Kooperationsprojektes der Forschungs- und Beratungsstelle Frühentwicklung und Kommunikation am Institut für Soziale Pädiatrie und Jugendmedizin der Universität München sowie der Abteilung Psychoendokrinologie am Forschungszentrum für Psychobiologie und Psychosomatik der Universität Trier. Die Arbeit untersucht den Einfluss der postpartalen Stressbelastung der Mutter auf die Qualität der Mutter-Kind-Interaktion. Im Mittelpunkt stehen dabei die Ausprägung der intuitiven mütterlichen Kompetenzen sowie die regulatorische Abstimmung dieser Kompetenzen auf die kindlichen Bedürfnisse. Es wird davon ausgegangen, dass spezifische psychosoziale Risikofaktoren einen negativen Einfluss auf die Qualität der Mutter-Kind-Interaktion haben. Zur Untersuchung der Fragestellung wurden Mütter in der Interaktion mit ihren Kindern zu zwei Messzeitpunkten - drei Monate postpartum (N=71) und sechs Monate postpartum (N=68) - mit Video aufgenommen und anschließend mit hierfür entwickelten Kodiersystemen ausgewertet. Für die Erhebung psychosozialer Risikofaktoren wurden Fragebögen zu drei postpartalen Messzeitpunkten (sechs Wochen, drei Monate und sechs Monate postpartum) eingesetzt. Die Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die Ausprägung intuitiver mütterlicher Kompetenzen und deren regulatorische Abstimmung in engem Zusammenhang mit der kindlichen Blickzuwendung und der kindlichen Interaktionsbereitschaft im spontanen Zwiegespräch stehen. Zudem bestehen Zusammenhänge zwischen Gesamtstressbelastung, ungewollter Schwangerschaft, unglücklicher Kindheit der Mutter, sowie sozialer Belastungen und der Ausprägung intuitiver mütterlicher Kompetenzen. Für einige der erhobenen Stress- und Belastungsmaße (beispielsweise Depressivität und soziale Unterstützung) zeigen sich nur leichte oder keine Effekte in den Untersuchungen. Analysen zu einem späteren Messzeitpunkt – die Löffelfütterung im Alter von 6 Monaten – untermauern die Ergebnisse der Spielsituation mit 3 Monaten.

Mon, 3 Oct 2005 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/4279/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/4279/1/Cikala_Mihai.pdf Cikala, Mihai

Zur Untersuchung ultraschneller molekularer Quantendynamik und deren Dephasierung werden erstmals extrem kurze Lichtimpulse erzeugt, die aus nur wenigen Zyklen des elektrischen Feldes bestehen und sowohl im Sichtbaren als auch im Ultravioletten weit abstimmbar und untereinander phasengekoppelt sind. Im Sichtbaren gelingt die Erzeugung von 7-fs Impulsen durch nichtkollineare optisch-parametrische Verstärkung eines Weißlicht-Kontinuums und adaptive Kompression mit einem deformierbaren Spiegel in der Fourier-Ebene. Durch geeignete zeitliche Streckung aller beteiligten Impulse (optical parametric chirped pulse amplification) kann die spektrale Breite der Impulse stark erweitert und darüber hinaus leicht an experimentelle Fragestellungen angepasst werden. Bei einer hohen Repetitionsrate von 4 MHz werden nahinfrarote 12-fs Impulse mit Hilfe von cavity-dumping und Dauerstrich-Nachverstärkung erzeugt. Die Impulse haben eine ausreichende Intensität zur Erzeugung eines stabilen Weißlicht-Kontinuums in Saphir. Die spektrale Bandbreite von kollinearen optisch-nichtlinearen Frequenzmischprozessen ist generell durch die Phasenanpassung zwischen den beteiligten Wellen limitiert. Diese Beschränkung kann mit einem neuartigen Konzept zur achromatischen Phasenanpassung um zwei Größenordnungen überwunden werden. Dadurch gelingt erstmals die Erzeugung weit abstimmbarer ultravioletter 7-fs Impulse durch Frequenzverdopplung von spektral geeignet aufgespalteten Lichtfeldern. Diese Impulse sind die bisher kürzesten im ultravioletten Spektralbereich und eine Erzeugung von 2.5-fs-Impulsen ist möglich. Alternativ können ultraviolette 20-fs Impulse mit höherer Energie und größerem Abstimmbereich auch durch gestreckte Summenfrequenzmischung erzeugt werden. Ein neuartiges interferometrisches Messkonzept, zero-additonal-phase SPIDER, erlaubt erstmals die vollständige Charakterisierung der zeitlichen Impulsform und der spektralen Phase der extrem kurzen ultravioletten, sichtbaren und nahinfraroten Impulse direkt am Ort eines spektroskopischen Experiments. Die zeitlichen Eigenschaften der Impulse werden dabei erstmals durch die Messung nicht beeinflusst. Die interferometrische Kalibrierung erfolgt im bestehenden Aufbau und die Konsistenz der Messung kann mit einfachen Tests kontrolliert werden. Alternativ ermöglicht eine Autokorrelationsmessung ohne optischen Strahlteiler die dispersionsfreie Messung von Impulsdauern für sichtbare bis nahinfrarote sub-10-fs Impulse in einem besonders kompakten Aufbau. Unter Berücksichtigung von höheren Ordnungen der spektralen Phase wird eine analytische Theorie der Frequenzverdopplung entwickelt, die eine häufig beobachtete Frequenzverschiebung und über die Phasen-fehlanpassung hinausgehende spektrale Einengung erklärt. Theorie und Experiment zeigen, dass sich die verschiedenen Ordnungen der spektralen Phase unabhängig voneinander zur zweiten Harmonischen übertragen und höhere Ordnungen dabei unterdrückt werden. Das erlaubt die Erzeugung von nahezu Fourier-limitierten ultravioletten sub-20-fs Impulsen durch ausschließliche Kompression im Sichtbaren und durch Frequenzverdopplung zeitlich gestreckter Impulse. Die Impulse aus zwei getrennten parametrischen Verstärkern weisen zeitliche Schwankungen von weniger als einer Femtosekunde auf und sind zueinander phasenstarr. Die Phase der verstärkten Impulse ist nur durch die Phase des als Saat-Licht verwendeten Weißlicht-Kontinuums bestimmt. Dessen restliche Phasenfluktuationen sind direkt mit der Intensität des Pumpimpulses gekoppelt und einfache Überlegungen zur Filamentbildung erklären die Großenordnung und das Vorzeichen dieser Zusammenhänge. Die relativen Schwankungen der carrier-envelope-Phase können durch räumliche Interferometrie für jeden Einzelimpuls gemessen und mit experimentellen Daten korreliert werden. Für Impulszüge bei verschiedenen Wellenlängen wird eine relative Phase definiert und mit Hilfe eines optisch-nichtlinearen Interferometers gemessen, das auf kohärenter Anti-Stokes-Raman-Streuung basiert. Getrennte Spektralkomponenten eines Weißlicht-Kontinuums aus Saphir erweisen sich in hohem Maße als zueinander phasenstarr. Dies erlaubt die Erzeugung von weit abstimmbaren Impulszügen mit fester Phasenbeziehung trotz unterschiedlicher Zentralwellenlänge. Molekulare Quantenzustände verlieren ihre elektronischen und Schwingungs-Kohärenzen innerhalb kür-zester Zeit an die Lösungsmittelumgebung und makroskopische Polarisationen zerfallen durch homogene und inhomogene Dephasierung. Mit den nun verfügbaren kurzen Impulsen werden die Mechanismen der extrem schnellen elektronischen Dephasierung von verschiedenen Farbstoffen in Lösung durch Photon-Echo-Messungen untersucht. Es zeigt sich, dass die Dephasierungszeit von elektronischen Kohärenzen von der Flexibilität oder Starrheit der Molekülstruktur abhängt. Mit den phasengekoppelten Impulsen kann außerdem die unterschiedliche Dephasierungszeit von verschiedenen Schwingungsmoden ausgenutzt werden, um unter-schiedliche Moleküle trotz überlappender Energiebänder durch zeitlich verzögerte Heterodyn-Detektion zu unterscheiden. In der Raman-Mikroskopie wird dieser Effekte als neuartiger Kontrastmechanismus zur untergrundfreien und molekülspezifischen Bildgebung ausgenutzt.

Bartonella henselae ist der Erreger der Katzenkratzkrankheit und vaskuloproliferativer Erkrankungen des Menschen. Das Bakterium wurde erstmals 1989 korrekt klassifiziert und den oben genannten Krankheitsbildern zugeordnet. Es ist ein langsam wachsendes, nicht in Flüssigmedien kultivierbares Bakterium. Genetische Untersuchungen sind deswegen schwierig. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher die zweidimensionale Elektrophorese zur Untersuchung möglicher Pathogenitätsfaktoren von B. henselae etabliert. Mithilfe dieser Methode sollte es möglich sein, das gesamte Proteom von B. henselae unter verschiedenen Kulturbedingungen aufzutrennen und so Rückschlüsse auf Pathomechanismen dieses Erregers zu ziehen. Die vorliegende Dissertation lieferte folgende Ergebnisse: 1. Etablierung eines geeigneten Protokolls zum Aufschluss von B. henselae für die zweidimensionale Elektrophorese. 2. Erstellung einer Proteomkarte von auf Agarplatten kultivierten B. henselae. Hierdurch wurde die Grundvoraussetzung für weitere Proteom-basierte Studien geschaffen. Zudem wurden drei Proteine (Malatdehydrogenase, Pyruvatdehydrogenase und DnaK)erstmals bei B. henselae beschrieben. 3. Charakterisierung von vier monoklonalen anti-B. henselae-Antikörpern mithilfe von zweidimensionalen Proteom-Western-Blots. Dadurch wurden vier neue B. henselae–Proteine, unter anderem das Phagenprotein Pap31, als immunogen in der Maus beschrieben. Zudem wurde hier erstmalig die zweidimensionale Elektrophorese als schnelle und akkurate Methode zur Charakterisierung monoklonaler Antikörper eingesetzt. 4. Durch den Proteomvergleich hitzegestresster und nicht-hitzegestresster B. henselae wurde gezeigt, dass mit der hier etablierten Methodik regulative Vorgänge der Proteinsynthese von B. henselae erfasst werden können. Von den drei identifizierten Hitzestressproteinen (GroEL, GroES und DnaK) wurde DnaK für B. henselae zum ersten Mal beschrieben. 5. Zwei pilusassoziierte Proteine (220 kD und 43 kD) wurden durch Proteomvergleich gefunden. Bei dem in den zweidimensionalen Auftrennungen sichtbaren 43kD-Protein handelt es sich um die Phophoserinaminotransferase, ein bakterielles Stoffwechselenzym. Der Zusammenhang mit der Pilusexpression ist bis dato unklar. Die Identität dieses Proteins wurde mithilfe reverser Genetik verifiziert. Das zweite Protein erscheint aufgrund unterschiedlicher Gelsysteme nur in den eindimensionalen Auftrennungen und wurde daher im Rahmen dieser Arbeit nicht weiter untersucht. 6. Durch die in dieser Arbeit etablierte radioaktive Markierung von B. henselae-Proteinen mittels 35S-Pulse-Chase wurde die Untersuchung neu synthetisierter Proteine nach Kokultur mit humanen Zelllinien ermöglicht. 7. Untersuchung neu synthetisierter B. henselae-Proteine nach Kokultur des Erregers mit humanen Endothelzellen mittels 35S-Pulse-Chase. Durch Vergleich mit der Proteomkarte konnten folgende in der Kokultur neu synthetisierte Proteine identifiziert werden: die Hitzestressproteine GroES, GroEL und DnaK, die Stoffwechselenzyme Malatdehydrogenase und Pyruvatdehydrogenase, der Elongationsfaktor EF-Tu und das Phagenprotein Pap31. Die Expression von Pap31 bei B. henselae in Endothelzellkultur wurde hier erstmals gezeigt. Durch die vorliegende Arbeit wurde eine neue Methode für die weitergehende Erforschung von B. henselae etabliert, die in Zukunft die Untersuchung dieses genetisch schwer zugänglichen Organismus erleichtern wird. Eine Reihe von Proteinen wurde hier für B. henselae erstmals beschrieben bzw. wurde deren Expression unter bestimmten Lebensbedingungen zum ersten Mal beobachtet. Die Breite des methodischen Ansatzes dieser Arbeit legt den Grundstein für vielfältige weitere Untersuchungen. So konnte zwischenzeitlich die membranassoziierte Lage von Pap31 mithilfe eines in dieser Arbeit charakterisierten monoklonalen Antikörper aufgedeckt und Fibronektin als Bindungspartner von B. henselae–Pili identifiziert werden.

Der Eileiter spielt eine bedeutende Rolle im Reproduktionsgeschehen und ist dabei in viele wichtige Prozesse involviert. Er unterstützt durch das Milieu, das er bereit stellt, die Kapazitation der Spermien, die Reifung und die Befruchtung der Eizelle, und er fördert durch sezernierte Faktoren die frühe Embryonalentwicklung. Während des Zyklus durchläuft er deutliche morphologische und histologische Veränderungen, um seinen verschiedenen Aufgaben gerecht zu werden. Da viele Veränderungen in einem Gewebe mit einer Veränderung des Transkriptoms einhergehen, haben wir bovines Eileiterepithel als Ausgangsmaterial für Untersuchungen auf der Ebene der mRNA ausgewählt. Um ein homogenes und definiertes Probenmaterial erhalten zu können, musste die Schlachtung der Tiere zur Probengewinnung zu einem möglichst genau definierten Zykluszeitpunkt stattfinden. Hierfür wurde ein Protokoll zur Tiervorbereitung erarbeitet, mit dessen Hilfe alle Tiere für die Versuche einheitlich ausgewählt und zyklussynchronisiert wurden. Weiterhin wurde ein Entnahmeprotokoll für die Eileiterepithelproben entwickelt, das Schwankungen in der Probenqualität unabhängig von der durchführenden Person minimiert. Zur Untersuchung von Veränderungen des Transkriptoms wurde in einem ersten Ansatz eine Kombination aus subtraktiven cDNA-Banken und radioaktiver cDNA-Array-Hybridisierung verwendet. Zuerst wurde Eileiterepithel (Ampulle und Isthmus gemeinsam) von drei Tieren im Östrus und drei Tieren im Diöstrus untersucht. Insgesamt wurde die Expression von 3072 cDNA-Klonen (1536 cDNAs pro subraktiver Bank, eine Bank pro Zykluszeitpunkt) im Östrus versus Diöstrus verglichen. Dabei konnten 77 verschiedene cDNAs mit signifikanten Konzentrationsunterschieden zwischen den beiden Zykluszeitpunkten identifiziert werden. Davon waren 37 im Östrus und 40 im Diöstrus stärker exprimiert. Die identifizierten Gene wurden in Funktionsklassen eingeordnet. Dadurch konnten vereinfachte „Gene Ontologies“ gebildet werden, die einen Überblick geben, welche biologischen Prozesse und molekularen Funktionen zwischen Östrus und Diöstrus reguliert werden. So sind Gene, die für die Synthese und Sekretion von Proteinen wichtig sind, im Östrus hochreguliert, wohingegen Gene, die Aufgaben in der Regulation der körpereigenen Immunantwort und der Transkription haben, im Diöstrus hochreguliert sind. In einem zweiten Ansatz wurden die gewonnenen Einblicke in die Genexpressions-veränderungen während des Zyklus weiter vertieft. Dazu wurde ein Ovidukt-Array hergestellt, das auf vorangegangene Arbeiten zur Genexpression im Eileiterepithel aufbaute und durch alle cDNAs, die im Vergleich von Eileiterepithel im Östrus zu Diöstrus als differenziell exprimiert auffielen sowie durch einige Kandidatengene, erweitert wurde. Zusätzlich enthielt es, als interne Kontrolle, 94 cDNAs, von denen keine Veränderung der Genexpression im Zyklusverlauf zu erwarten waren. Auf dem Ovidukt-Array befanden sich insgesamt 549 cDNAs von 432 Genen. Mit diesem Array wurden Hybridisierungs-experimente mit bovinen Eileiterproben aus vier verschiedenen Zyklusstadien durchgeführt, jeweils drei Tiere an Tag 0, Tag 3,5, Tag 12 und Tag 18 des Sexualzyklus. Dabei wurden Proben aus Ampulle und Isthmus getrennt voneinander untersucht. Die Auswertung der Hybridisierungsergebnisse ergab 196 differenziell exprimierte Gene. Die mit den Ovidukt-Array erhaltenen Daten konnten die beim Östrus-Diöstrus-Vergleich erhaltenen Ergebnisse sehr gut bestätigen, weiter vertiefen und spezifizieren. Zusätzlich wurden Veränderungen der mRNA-Spiegel ausgewählter Gene durch quantitative Real-time RT-PCR genauer quantifiziert und Lokalisationsstudien im Eileiterepithel mittels in situ Hybridisierung durchgeführt. Weiterhin wurde damit begonnen, Veränderungen auf Proteinebene in den Eileiterepithelzellen im Zyklusverlauf für einzelne Kandidatengene zu untersuchen. Die vorliegende Arbeit ergab grundlegende Erkenntnisse zur Veränderung der mRNA-Zusammensetzung während des Sexualzyklus im bovinen Eileiterepithel aus der Ampulle und dem Isthmus. Damit wurden histologische Veränderungen des Epithels während des Zyklus auf molekularer Ebene charakterisiert. Auf dieser Grundlage können auch spezifische Reaktionen, die von anwesenden Spermien, befruchteten Eizellen oder Embryonen ausgelöst werden, untersucht werden.

Das kolorektale Karzinom (CRC) ist weltweit der zweithäufigste bösartige Tumor. Fernmetastasen eines CRC treten zumeist in Leber und Lunge auf, sind nur in seltenen Fällen operativ entfernbar und sprechen nicht auf derzeit verfügbare Chemotherapien an. Die Identifizierung von Genen und die Charakterisierung der molekularen Mechanismen, durch welche sie zur Tumorprogression eines CRC beitragen, liefert eine Grundlage für die Prävention oder Behandlung der zumeist tödlich verlaufenden Erkrankung. Das Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung von Genen, die für die Entwicklung des metastatischen Phänotyps in Kolonkarzinomzellen verantwortlich sind. Hierzu wurden mittels der Genchip-Technologie die Transkriptionsprofile von insgesamt fünf Tumor-Zelllinien erstellt und nach stringenten Auswahlkriterien miteinander verglichen. Zuerst wurde ein CRC-Zellmodell verwendet, das aus einer in der Nacktmaus nicht-metastasierenden humanen Primärtumor-Zelllinie KM12C und zwei davon abgeleiteten, stark zur Leber metastasierenden Zelllinien, KM12SM und KM12L4A bestand. In diesem überwiegend isogenen Zellmodell wurden 145 Gene in beiden metastasierenden Zelllinien als dereguliert im Vergleich zu der nicht-metastasierenden Zelllinie identifiziert. Die Transkriptionsprofile eines weiteren humanen CRC-Zellmodells, bestehend aus einer nicht-metastasierenden Zelllinie HCT116 und einer stark zur Lunge metastasierenden Zelllinie HCT116U5.5 wurden ebenfalls verglichen und 72 Gene als differentiell exprimiert identifiziert. Ein Vergleich der Datensätze aller Transkriptionsprofile ermöglichte die Identifizierung von Vimentin und Trop-2 (TACSTD2, „Tumorassoziierter Vermittler von Kalziumsignalen“) als in allen metastasierenden Zelllinien überexprimiert. Die hohe Homologie des bisher noch weitestgehend unerforschten Trop-2 zu Trop-1 (Ep-CAM), einem regulatorischen Zell-Zell-Adhäsionsmolekül, das überwiegend von aggressiven Tumorarten exprimiert wird und die Proliferation von Tumorzellen stimulieren kann, machten Trop-2 für weiterführende Expressions- und Funktionsstudien zu einem interessanten Zielgen. Im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte Expressionsstudien in einer Vielzahl von Tumorbiopsien zeigten deutlich erhöhte mRNA- und Proteinspiegel von Trop-2 in Metastasen aus CRC im Vergleich zu den Primärtumorgeweben. Zusätzlich zu diesem neuen Befund in CRC wurde in dieser Arbeit erstmalig eine erhöhte Expression von Trop-2 in Schild-drüsenkarzinomen und in nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomen im Vergleich zu den korrespondierenden Normalgeweben nachgewiesen. Zur Untersuchung der funktionellen Bedeutung von Trop-2 für die Metastasierung von Karzinomzellen des Kolons wurden stabile Transfektanten für Trop-2 in der nicht-metastasierenden Zelllinie KM12C generiert. Die konstitutiv Trop-2 exprimierenden Zellklone zeigten erhöhte Cyclin D1-Proteinspiegel bei unveränderter Zellproliferation gegenüber den Vektorkontrollen. Die Induktion von Cyclin D1 könnte mit der Identifizierung eines ebenfalls erhöhten Proteinspiegels von ß-Catenin in den Trop-2 exprimierenden Transfektanten in Zusammenhang stehen. Somit liefert diese Arbeit erste Hinweise auf einen möglichen Einfluss von Trop-2 auf den Tcf/ß-Catenin Signalweg. Zusätzlich demonstrierte ein Migrationstest erhöhte mobile Eigenschaften von Trop-2 exprimierenden Zellen in vitro, während sich die invasive Fähigkeit der Transfektanten, in vitro durch eine Matrigelschicht zu wandern, nicht von den Vektorkontrollen unterschied. Die induzierte Expression von Trop-2 in der Mehrzahl von Metastasen des kolorektalen Karzinoms sowie in Tumoren von Lunge und Schilddrüse war eine neue Beobachtung. Diese Ergebnisse demonstrieren das Potential von Hochdurchsatzmethoden wie die hier verwendete Genchip-Technologie in Kombination mit geeigneten Zellmodellen. In der vorliegenden Arbeit führte sie zur Identifizierung von Trop-2 als einen Marker der Tumorprogression und Metastasierung von verschiedenen humanen Karzinomen.

Die Kapillarsperre stellt ein alternatives Oberflächenabdichtungssystem für Deponien dar. Sie besteht aus einem geneigten Schichtenverbund, bei dem die feinkörnige Kapillarschicht (KS) von der gröberkörnigen Kapillarbruchschicht (KBS) unterlagert wird. Unter ungesättigten Bedingungen führt der ausgeprägte Texturunterschied an der Schichtgrenze zu einer Behinderung der vertikalen Wasserbewegung. Erst bei Überschreiten der lateralen Dränkapazität der KS setzt ein Wasserübertritt in die KBS ein. Bei Rückgang der Belastung regeneriert sich das System. Zur Untersuchung des Wassertransports in der KS wurden in einem Versuchstank zum einen Markierungsversuche mit einem Cocktail aus den Fluoreszenztracern Na-Naphthionat (Na), Uranin (U), Pyranin (P) und Sulforhodamin B (SRB) durchgeführt, wobei die Tracereingabe als momentane Eingabe in Form eines Dirac-Impulses erfolgte (Tm-Versuche). Zum anderen wurde eine Lösung aus dem Fluoreszenztracer U und NaBr als Salztracer mittels kontinuierlicher Eingabe zugeführt (Tk-Versuche). Die Beregnungsraten betrugen jeweils 20 l/d bis 80 l/d. Zur Abschätzung des Sorptions- und Transportverhaltens der Tracer erfolgten ergänzend Batch-Versuche (Schüttelversuche) sowie Säulenversuche unter ungesättigten Bedingungen mit Durchflussraten zwischen 2 l/d und 80 l/d. Die Tracereingabe bei den Säulenversuchen wurde analog zu den Tankversuchen ausgeführt (Sm- bzw. Sk-Versuche). In den Batch-Versuchen zeigt U eine geringe Sorptivität mit Verteilungskoeffizienten Kd bis max. 0,08 cm³/g, während die Kd-Werte von P (bis 1,18 cm³/g) und SRB (0,83 cm³/g bis 2,92 cm³/g) auf eine ausgeprägte Sorptionsneigung dieser beiden Fluoreszenzfarbstoffe hindeuten. Für Na ist keine messbare Wechselwirkung mit dem KS-Material festzustellen, so dass dieser Tracer als Referenz bei der Beurteilung des Transportverhaltens der Stoffe verwendet wird. Das in den Säulenversuchen mit momentaner Eingabe (Sm) ermittelte Transportverhalten der Fluoreszenztracer entspricht den Ergebnissen der Batch-Versuche. Die höchsten Retardationsfaktoren RD im Vergleich zu Na zeigt SRB mit 1,6 bis 2,3, gefolgt von P mit 1,2 bis 1,6 und U mit max. 1,15. Die Rückgewinnung der Tracer beträgt nahezu 100%, so dass eine irreversible Sorption ausgeschlossen werden kann. Die Auswertung der Sm-Versuche mit dem Programm FIELD (Version 5, MALOSZEWSKI 2000) ergibt eine Aufsplittung des Tracerdurchgangs in drei bis sechs Teilkurven. Ursache ist eine vermutlich durch die mangelhafte Funktion der eingesetzten Verteilerplatte hervorgerufene Ungleichverteilung des Wassergehalts in der Säule, die experimentell nachgewiesen werden konnte. Die Säulenversuche mit kontinuierlicher Eingabe (Sk) zeigen als wichtigstes Ergebnis ein nahezu identisches Verhalten von U und NaBr. Daher wird NaBr als geeignet für den Einsatz in den nachfolgenden Tankversuchen angesehen. Auch in den Tankversuchen mit momentaner Eingabe (Tm-Versuche) ist bei der Modellierung mit FIELD eine Aufsplittung des Tracerdurchgangs in bis zu zehn Teilkurven festzustellen. Ursache ist in diesem Fall die für eine Kapillarsperre typische Wassergehaltsverteilung in der KS, die durch eine Zunahme des Wassergehalts zur Schichtgrenze hin sowie hangabwärts charakterisiert ist. Das Transportverhalten der Fluoreszenzfarbstoffe ergibt ein ähnliches Bild wie in den Sm-Versuchen. U weist mit einem Retardationsfaktor von max. 1,12 eine geringe Sorptivität auf, die ebenso wie die Transportverzögerung von P mit RD-Werten zwischen 1,07 und 1,41 den Werten aus den Sm-Versuche entspricht. Lediglich SRB zeigt eine deutlich erhöhte Retardation, die RD-Werte liegen zwischen 2,67 und 4,38. Die Rückgewinnung beträgt für Na und U ca. 100%, dagegen erreichen P und SRB aufgrund des ausgeprägten Tailings der Durchgangskurven nur Werte von 98 % bzw. 96 %. Bei den Tankversuchen mit kontinuierlicher Tracereingabe (Tk-Versuche) erlaubt der Einbau von Leitfähigkeitssonden, die Veränderung der elektrischen Leitfähigkeit nach der Zugabe des Salztracers NaBr in einer vertikalen Ebene zu beobachten. Es ist ein wenige Zentimeter mächtiger Hauptfließweg direkt über der Schichtgrenze zu erkennen, in dem die höchsten Fließgeschwindigkeiten beobachtet werden. Tensiometermessungen deuten auf das Vorhandensein nahezu gesättigter Verhältnisse in diesem Bereich hin, die zu maximalen Fließgeschwindigkeiten führen.

Das zur Familie der Herpesviridae, Unterfamilie Gammaherpesvirinae, gehörende murine Herpesvirus 68 (MHV-68) besitzt mit 118 kbp wie die zu den Betaherpesvirinae gehörenden murinen und humanen Cytomegalieviren (MCMV und HCMV) mit ca. 230 kbp ein sehr großes Genom. Die Mehrzahl der 80 offenen Leserahmen wurde noch nicht charakterisiert. Zur Untersuchung dieser Gene ist die zufällige Herstellung viraler Mutanten die effiziente Methode, um zu neuen Erkenntnissen bezüglich ihrer Funktion zu gelangen. Aufgrund des großen Anteils nicht oder nur wenig charakterisierter Gene am viralen Genom und der oftmals nur geringen Homologie zu offenen Leserahmen anderer nah verwandter Herpesviren ist für MHV-68 ein Verfahren der „forward genetics“ diejenige Möglichkeit, welche den größten Erfolg verspricht. Dies beinhaltet eine ungezielte Mutagenese des viralen Genoms mit blinder Rekonstitution und nachfolgender Charakterisierung derjenigen Rekombinanten, welche einen interessanten Phänotypen zeigten. Bisher war die Herstellung rekombinanter MHV-68-Klone sehr arbeitsintensiv, da man diese gänzlich mit den Mitteln durchführen musste, welche die Methodik der Zellkultur zur Verfügung stellte. Aufgrund der Klonierung des MHV-68-Genoms als ein künstliches bakterielles Chromosom (BAC), der Etablierung des Verfahrens der Transposonmutagenese und mittels der Möglichkeit der Rekonstitution viraler Rekombinanten durch invasive Bakterien wurde diese Methode der klassischen oder forward genetics möglich. In dieser Arbeit wurde erstmals eine Mutagenese des Genoms von MHV-68 durchgeführt, die resultierenden viralen Rekombinanten rekonstituiert und einer phänotypischen Untersuchung unterzogen. Hierbei wurde das Wachstum der Mutanten auf sechs verschiedenen Zelllinien verglichen. Dies sollte grob augenscheinliche Unterschiede der rekombinanten Viren im Vergleich zu einer Wildtyp-Kontrolle nachweisen, wobei die von Brune et al. bereits etablierte Methodik an die Erfordernisse des MHV-68-Genoms angepasst werden konnte. Bezüglich des viralen Wachstums in Endothelzellen auffällig erscheinende Mutanten zeigten eine Häufung der Tn-Insertionen in der Genregion um ORF 10. Wachstumskurven bestätigten die Rolle von ORF 10 für die Fähigkeit des Virus in Endothelzellen zu replizieren. Dieses ist der erste Hinweis für eine interessante biologische Funktion dieses viralen ORFs, die in weiteren Arbeiten zu sichern und zu analysieren ist.

Die erfolgreiche Transplantation von Schweineorganen auf den Menschen, also die Xenotransplantation, ist angesichts der zunehmenden Knappheit von Allotransplantaten ein vorrangiges Ziel der modernen Transplantationsforschung. Zur Untersuchung dieser Möglichkeit wurden deshalb bereits viele experimentelle Studien mit Primaten als Empfänger durchgeführt. Neben medikamentöser Immunsuppression, Komplementhemmung und Toleranzinduktion ist die Entfernung xenoreaktiver Antikörper bei der Schwein-zu-Primat-Xenotransplantation von entscheidender Bedeutung. In der vorliegenden Studie untersuchten wir die Anwendbarkeit der Ig-Therasorb®-Immunadsorption zur extrakorporalen Elimination xenoreaktiver Antikörper in einem Schwein-zu-Primat-Modell, sowie die technische Durchführung, die Nebenwirkungen und die Effizienz der Behandlungen. Die Immunadsorption wurde dabei zur Vermeidung und Therapie der hyperakuten und akuten vaskulären Xenotransplantatabstoßung eingesetzt. Erstmals wurden auch hDAF-transgene Schweineherzen in Kombination mit Ig-Therasorb®-Immunadsorption verwendet, um eine zusätzliche Hemmung des Komplementsystems zu erreichen. Wir führten 2 Versuchsreihen mit 7 Cynomolgus- und Rhesusaffen sowie 4 Pavianen als Empfänger zur Evaluierung der Technik und Effizienz der Immunadsorption durch sowie 4 Versuchsreihen mit insgesamt 18 Pavianen zum Langzeitüberleben nach orthotoper und heterotoper Transplantation von Landrasse- und hDAF-transgenen Schweineherzen mit perioperativer Immunadsorption. Die Ig-Therasorb®-Immunadsorption ist eine effiziente und sichere extrakorporale Plasmaperfusionsmethode zur Entfernung xenoreaktiver Antikörper. Eine hyperakute Abstoßung kann durch die präoperative Behandlung mit Immunadsorption vermieden werden, wenngleich noch untersucht werden muss, ob die Immunadsorption auch bei der Vermeidung einer akuten vaskulären Abstoßung eine verlässliche Methode ist. Es konnte zudem bestätigt werden, dass hDAF-transgene Schweineherzen einen Schutz vor der hyperakuten Xenotransplantatabstoßung bieten. Die Ig-Therasorb®-Immunadsorption hat sich bereits in vielen Studien mit Patienten als sicher und effizient erwiesen, auch in der langfristigen Anwendung. Es ist zu erwarten, dass die Methode bei einer zukünftigen klinischen Xenotransplantation von den Patienten gut vertragen würde und einen entscheidenden Beitrag zur Vermeidung einer HAR und zur Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit leisten könnte.

Ziel dieser Arbeit war es, die physiologische Belastungssituation im Kniegelenk des Hundes darzustellen. Dazu wurden die Kniegelenke von Hunden (männlich, weiblich) verschiedenen Alters und unterschiedlicher Größe und Rassen untersucht. Es wurden nur Tiere in die Studie eingeschlossen, deren Gelenke frei von makroskopischen Knorpelschäden und arthrotischen Knochenzubildungen waren. Mit Hilfe der Spaltliniendarstellung konnte die Vorzugsrichtung der Kollagenfasern im Gelenkknorpel und im subchondralen Knochen als morphologisches Korrelat für Dehnungsspannungen nachgewiesen werden. Zur Untersuchung der Kontaktstellen der Art. femoro-tibialis wurde in Druckversuchen mit stufenweise ansteigender Kraft Silikonabdrücke angefertigt und mit Druckfilmen, die auftretenden Gelenkdrücke quantitativ bestimmt. Zur Beurteilung der Langzeitbelastung des Gelenks wurde die subchondrale Knochendichte bestimmt. Die CT-Daten der gescannten Gelenke wurden mit der CTOAM (CT-Osteoabsorptiometrie) ausgewertet. Mit Hilfe der Bildregistrierung konnten alle Individualdatensätze auf ein Normgelenk projiziert werden und durch Übereinanderlagern ein Summationsbild mit der durchschnittlichen Knochendichteverteilung gewonnen werden. Die radiäre Orientierung der Spaltlinien auf der Tibia und die sagittale Verlaufsrichtung auf der Trochlea ossis femoris lässt auf dominierende Dehnungsspannungen schließen, wohingegen die teilweise spaltlinienfreien Bereiche der Patella als ein Zeichen dort auftetender Druckbelastung zu werten sind. Das sehr uneinheitliche Spaltlinienmuster auf den untersuchten Patellae lässt auf unterschiedliche individuelle Belastungssituationen in der Art. femoro-patellaris schließen. Die Druckversuche gaben bei kontinuierlichem Kraftanstieg keine lineare Vergrößerung der Kontaktflächen, sondern zeigten nach einem deutlichen Anstieg während der niedrigen Belastungsstufen (25-50% des Körpergewichts) in der mittleren Belastung ein Plateau und erst bei hoher Belastung (200-250% des Körpergewichts) eine erneute deutliche Größenzunahme. Bei der Untersuchung mit drucksensiblen Filmen wurden im Vergleich kleinere Kontaktflächen gefunden. Die Knochendichteverteilung in der Tibia- und Femurgelenkfläche zeigen jeweils auf den Kondylen ein zentrales Dichtemaximum. Die konkave Facies articularis tibiae zeigt eine höhere Knochendichte als die korrespondierenden konvexen Femurkondylen. Die mittlere Knochendichte der Patella erreicht diese Werte nicht.

In der vorliegenden Arbeit sollte der Einfluss mehrfach ungesättigter Fettsäuren im Futter auf das Fettsäuremuster im Serum von Hunden und Katzen untersucht werden. Zur Untersuchung der Fettsäuren standen Serumproben von drei früher durchgeführten Fütterungsstudien an Hunden und Katzen zur Verfügung, in denen der potentielle Einfluss von Omega-3-Fettsäuren aus Fischöl bzw. aus Mikroalgen auf den Knochenstoffwechsel der Tiere untersucht worden war. Bei der Bestimmung des Gesamtfettsäuremusters unter Fischöleinfluss wurde sowohl bei den Hunden als auch bei den Katzen ein hoch signifikanter Anstieg der beiden Omega-3-Fettsäuren Eicosapentaensäure und Docosahexaensäure festgestellt. Bei den Hunden stieg die Eicosapentaensäure um das 10-fache und bei den Katzen um das 13-fache an. Bei beiden Tierarten erhöhte sich die Docosahexaensäure um das 4-fache.

Die Faltung und die Funktionsdynamik von Proteinen basieren auf schnellen Prozessen, die zum Teil im Zeitbereich der Pikosekunden bis Nanosekunden ablaufen. Zur Untersuchung dieser Dynamiken und der mit ihnen verbundenen strukturellen Änderungen werden häufig Molekulardynamik (MD)-Simulationen eingesetzt, die auf empirisch parametrisierten molekularmechanischen (MM) Kraftfeldern basieren. Die vorliegenden Arbeit stellt einen Ansatz zur Validierung solcher MM-Kraftfelder vor, der darin besteht, die Relaxationsdynamik kleiner lichtschaltbarer Modellpeptide zu simulieren und die dabei auftretenden Kinetiken mit Ergebnissen der Femtosekunden-Spektroskopie zu vergleichen. Erste Simulationen dieser Art zeigen eine überraschende Übereinstimmung zwischen den simulierten und den gemessenen Kinetiken. Weitere Untersuchungen, bei denen einzelne Details des eingesetzten Kraftfelds variiert werden, lassen jedoch erkennen, dass diese Übereinstimmung auf einer zufälligen Kompensation von Fehlern beruht. Es wird gezeigt, dass die simulierten Kinetiken sehr empfindlich auf Änderungen am MM-Kraftfeld reagieren und damit als Maßstab für die Güte seiner Parametrisierung dienen können. Besonders die Modellierung des Lösungsmittels DMSO hat einen entscheidenden Einfluss auf die beobachteten Kinetiken, und zwar nicht nur auf die Kühlzeiten der Wärmedissipation, sondern auch auf die Relaxationsdynamik des Peptidteils der Modellsysteme. Als Vorarbeit für die Simulation der Modellpeptide wird ein flexibles und explizites DMSO-Modell aus ersten Prinzipien abgeleitet und dessen thermodynamische und strukturelle Eigenschaften mit denen existierender Modelle verglichen. Ferner wird das eingesetzte Kraftfeld um Parameter für den in die Modellpeptide integrierten Farbstoff Azobenzol erweitert und dessen lichtinduzierte Isomerisierungsreaktion modelliert. Darüber hinaus werden neuartige Methoden zur statistischen Auswertung von MD-Trajektorien vorgestellt, die dazu dienen, eine strukturelle Klassifikation der Peptidgeometrien zu ermöglichen. Mit Hilfe dieser Klassifikation kann ein vertiefter Einblick in die während der Relaxation der Modellpeptide auftretenden Konformationsübergänge gewonnen werden. Ferner ermöglichen es die statistischen Auswertungsverfahren, aus Langzeitsimulationen der Modellpeptide deren Gleichgewichtskonformationen zu bestimmen. Der Vergleich dieser Konformationen mit Daten der NMR"=Spektroskopie zeigt schließlich die Leistungsfähigkeit der Methode der MD-Simulation für die Vorhersage von Peptidstrukturen.

In der Biomedizin haben Tiermodelle eine unentbehrliche Bedeutung erreicht. In den letzten Jahren wurde eine Methode zur Generierung von Tiermodellen eingeführt, welche auf willkürlichen genetischen Manipulationen mittels der mutagenen Substanz ENU basiert. Hierbei wurden relevante Mausvarianten ausschließlich aufgrund ihres Phänotyps selektiert und zur Gründung einer neuen Mauslinie verpaart. Da es sich hierbei um einen hypothesenfreien Ansatz handelt, wurde für die Verhaltensphänotypisierung ein komplexer Versuchsaufbau gewählt, welcher es erlaubte, eine Vielzahl von Verhaltensdimensionen in einem Test zu untersuchen. Aufgrund der schnellen und zuverlässigen Untersuchungsmöglichkeiten schien das mHB besonders gut geeignet als Hochdurchsatzverfahren im Rahmen des ENU-Projektes. Mit dieser Methode wurde eine dominante Mausvariante identifiziert, welche sich durch eine beeinträchtigte Objekterkennung von wt Tieren unterschied. Basierend auf diesem F1-Tier wurde die RO-Linie gegründet. Im Laufe der vorliegenden Arbeit wurde die RO-Linie über sieben Generationen gezüchtet und im mHB verhaltenscharakterisiert, um vor allem die Penetranz und Stabilität des Phänotyps über mehrere Generationen zu untersuchen. Dabei wurde gezeigt, dass RO-Mäuse einen sehr selektiven Verhaltensphänotyp darstellten, der sich ausschließlich in der Objekterkennung von wt-Tieren differenzieren ließ. Die Penetranz des Phänotyps lag mit 46% in einem idealen Bereich für einen dominanten Vererbungsgang. Zur weiteren Analyse des Verhaltensphänotyps von RO-Mäusen wurden diese in zwei selektiven Verhaltenstests, dem Objekterkennungstest und einem räumlichen Lerntest, untersucht. Während sich der Verhaltensphänotyp in dem selektiven Objekterkennungstest bestätigte, wurde in dem komplexen räumlichen Lerntest kein Unterschied zwischen RO--und wt-Mäusen beobachtet. Folglich konnte gezeigt werden, dass sich die beiden Linien in hippokampusabhängigen Aufgabestellungen nicht voneinander unterschieden. Durch immunhistologische als auch elektrophysiologische Untersuchungen sind Hirnareale im kortikalen Temporallappen definiert, welche zur Wahrnehmung und zur Verarbeitung der Informationen während eines Objekterkennungstests aktiviert werden. Auf dieser Kenntnis basierend wurde die c-Fos Expression nach einem Objekterkennungstest von RO-Tieren und wt-Mäusen untersucht. Die Resultate zeigten, dass bei RO-Tieren eine erhöhte sensorische Aktivität ausgelöst wurde, jedoch war in der Hirnregion zur Verarbeitung und Speicherung dieser Informationen weniger neuronale Aktivität zu erkennen. Folglich könnte die beeinträchtigte Fähigkeit zur Objekterkennung auf einen Unterschied der Tiere bei der Verarbeitung von Gedächtnisinhalten zurückzuführen sein. Zur Untersuchung der klinischen Relevanz der RO-Mäuse als Tiermodell wurde eine pharmakologische Validierung mit dem Acetylcholinesterasehemmer Metrifonate in einem selektiven Objekterkennungstest durchgeführt. Dabei wurde durch die Behandlung mit Metrifonate eine signifikante Verbesserung der Objektdiskriminierung bei RO-Tieren erreicht. Somit ist die RO-Linie als valides klinisches Tiermodell einzustufen. Als erster Versuch zur Ermittelung des manipulierten Gens sollte mittels einer Kopplungsanalyse die chromosomale Region der Mutation im Genom ausfindig gemacht werden. Dafür wurden Mikrosatellitenmarker über das komplette Genom verteilt und nach einer gekoppelten Vererbung mit dem Phänotyp in Form eines rekombinanten Locus abgesucht. Soweit wurde noch keine signifikante Kopplung zwischen dem Phänotyp und einem der genetischen Marker gefunden. Dies könnte darauf hindeuten, dass die Abstände zwischen den Mikrosatelliten zu groß gewählt waren. Eine zweite Erklärung wäre, dass der Verhaltensphänotyp nicht auf einer genetischen Grundlage basierte.

In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Fragestellungen zur funktionellen und dynamischen Organisation des Kerns von Säugerzellen untersucht. Der erste Teil der Arbeit widmete sich der Frage, in welchem Zusammenhang die Synthese naszenter RNA mit der Organisation des Chromatins im Zellkern steht. Dabei wurde speziell untersucht, ob naszente RNA bevorzugt in chromatinarmen Räumen lokalisiert, wie es das Chromosomen-Territorien/Interchromatin-Kompartiment Modell (CT/IC-Modell)(Cremer und Cremer, 2001) vorhersagt. Diese Untersuchungen wurden an HeLa-Zellen durchgeführt, die stabil eine Fusion zwischen dem „Green Fluorescent Protein” (GFP) und dem Histon H2B exprimierten (Kanda et al., 1998). Mit Hilfe dieses Fusionsproteins kann die Chromatinstruktur sehr gut dargestellt werden (Sadoni et al., 2001; Zink et al., 2003). Die naszente RNA wurde in diesen Zellen durch kurze Pulse von BrUTP markiert, das anschließend durch eine Immunfärbung nachgewiesen wurde. Die markierten Zellen wurden mit Hilfe hochaufl ösender konfokaler Laserscanning Mikroskopie aufgenommen. Für die Analyse der Bilddaten wurde eine Erosionsmethode entwickelt, welche die Auswertung der Daten unabhängig von subjektiv gewählten Schwellenwerten ermöglichte. Die Ergebnisse dieser Analysen zeigten keine bevorzugte Lokalisierung naszenter RNA in chromatinarmen Bereichen. Damit stützen die Ergebnisse nicht die entsprechenden Vorhersagen des ICD-Modells. Die hier gewonnenen Ergebnisse stehen nicht im Einklang mit den Ergebnissen anderer Studien (Politz et al., 1999; Verschure et al., 1999). Die unterschiedlichen Ergebnisse sind wahrscheinlich auf unterschiedliche Methoden zur Darstellung der Chromatinorganisation, beziehungsweise auf unterschiedliche Methoden zur Bildanalyse zurückzuführen. Eine weitere Fragestellung, die im Zusammenhang mit der dynamischen Organisation der RNA-Synthese und RNA-Prozessierung in der vorliegenden Arbeit untersucht wurde, war wie das Spleißfaktor-Kompartiment mit Chromatin interagierte. Diese Interaktion sollte in lebenden „Chinesischen Hamster Ovarien” (CHO)-Zellen untersucht werden. Speziell sollte der Frage nachgegangen werden, ob das Spleißfaktor-Kompartiment unterschiedlich mit funktionell unterschiedlichen Chromatinfraktionen assoziiert ist. Dafür wurde die DNA dieser Chromatinfraktionen mit Hilfe von Cy3-dUTP (Zink et al., 1998; Zink et al., 2003) spezifisch markiert. Das Spleißfaktor-Kompartiment der lebenden Zellen wurde simultan mit einem hier lokalisierenden GFP-Fusionsprotein dargestellt (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. M. C. Cardoso, MDC, Berlin). Die so markierten lebenden Zellen wurden mit Hilfe der konfokalen Laserscanning Mikroskopie aufgenommen. Die Auswertung der Bilddaten ergab eine generelle enge Assoziation des Spleißfaktor-Kompartiments mit früh-replizierendem und transkriptionell aktivem Chromatin. Dagegen bestand eine solche Assoziation nicht mit spät-replizierendem und transkriptionell inaktivem Chromatin. Eine Behandlung der Zellen mit dem Transkriptions-Inhibitor α-Amanitin zeigte, dass die enge Assoziation des Spleißfaktor-Kompartiments mit früh-replizierendem und transkriptionell aktivem Chromatin direkt vom Prozess der Transkription abhängig war. Insgesamt zeigten die Daten zum ersten Mal, dass es in lebenden Zellen eine definierte Interaktion des Spleißfaktor-Kompartiments mit funktionell unterschiedlichen Chromatinfraktionen gibt, die abhängig ist vom Prozess der Transkription. Ein weiterer dynamischer Prozess im Zellkern, der in der vorliegenden Arbeit an lebenden HeLa-Zellen untersucht werden sollte, war der Prozess der DNA-Replikation. Von besonderem Interesse war hierbei die Frage, welchen dynamischen Reorganisationen die DNA während der S-Phase unterliegt. Daneben sollte auch untersucht werden, wie der spezifische zeitlich-räumliche Verlauf der S-Phase in Säugerzellen koordiniert wird. Zur Untersuchung dieser Fragen wurde die zu replizierende oder die naszente DNA lebender Zellen mit fluoreszensmarkierten Nukleotiden dargestellt. Simultan wurde die Replikationsmaschinerie mit Hilfe eines GFP-PCNA Fusionsproteins markiert (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. M. C. Cardoso, MDC, Berlin). Diese Markierungstechniken erlaubten es zum ersten Mal, direkt die Interaktionen von replizierender DNA und der Replikationsmaschinerie zu beobachten und zu analysieren. Die Ergebnisse zeigten, dass die DNA während der S-Phase keine großräumigen Umlagerungen erfuhr. Nur einige lokal begrenzte Reorganisationen wurden beobachtet, die sich innerhalb von Distanzen von weniger als 1 µm abspielten. Die Ergebnisse zeigten ferner, dass DNA in stabile Aggregate organisiert war, die den Replikationsfoci entsprachen. 85 % dieser Aggregate, die auch als subchromosomale Foci bezeichnet werden (Zink et al., 1998), behielten ihren Replikationszeitpunkt von S-Phase zu SPhase stabil bei. Während des zeitlichen Fortschreitens der S-Phase schritt die Replikationsmaschinerie sequentiell durch benachbarte Gruppen von subchromosomalen Foci. Diese besaßen einen definierten Replikationszeitpunkt, und lokalisierten an de- finierten Positionen im Zellkern. Diese Ergebnisse legten nahe, dass die spezifische Anordnung von subchromosomalen Foci im Kern, die während der frühen G1-Phase etabliert wird (Dimitrova und Gilbert, 1999; Ferreira et al., 1997; Sadoni et al., 1999), die räumlich-zeitliche Organisation der S-Phase determiniert.