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Die Nemalin-Myopathie (NM) und die Einschlusskörpermyopathie mit M. Paget und frontotemporaler Demenz (IBMPFD) sind zwei hereditäre Myopathien mit pathologischen Proteinaggregaten und Gegenstand der Untersuchungen, die in dieser Arbeit behandelt werden. Ziel dieser Arbeit ist die Erweiterung des Genotyp-Phänotyp-Spektrums der NM und der IBMPFD. Die NM gehört zu den kongenitalen Myopathien mit Strukturbesonderheiten und ist deren häufigster Vertreter. Der klinische Phänotyp ist sehr variabel v. a. bzgl. der Schwere der Erkrankung. Muskelbioptisch finden sich sarkoplasmatische „nemaline rods“. Der Vererbungsmodus ist ebenfalls sehr variabel: Die Erkrankung weist sowohl einen dominanten sowie einen rezessiven Vererbungsmodus auf; in vielen Fällen finden sich aber auch de novo Mutationen. Mutationen im ACTA1-Gen sind unter anderem für die Entstehung der NM verantwortlich. Das ACTA1-Gen kodiert das skelettmuskuläre Strukturprotein α-Aktin, das den Hauptbestandteil der Aktinfilamente bildet und unerlässlich für die Muskelkontraktion ist. Bislang wurden 177 krankheitsverursachende ACTA1 Mutationen beschrieben. Die IBMPFD ist eine seltene, autosomal dominante, degenerative progrediente Erkrankung mit der Symptomtrias Einschlusskörpermyopathie, Morbus Paget und vorzeitig einsetzender frontotemporaler Demenz. Muskelbioptisch findet sich eine vakuoläre Myopathie mit VCP-, TPD-43-, Ubiquitin-positiven und tubulofilamentösen Einschlüssen. Nur 12% der Patienten weisen das volle Spektrum der Erkrankung auf, wobei die Myopathie das häufigste Symptom ist. Mutationen im VCP-Gen sind für die Entstehung dieser Erkrankung verantwortlich. Das VCP-Gen kodiert das VCP-Protein, eine AAA-ATPase, die als molekulares Chaperon beim Proteinabbau über das Ubiquitin-Proteasom-System arbeitet und an einer Vielzahl von Zellfunktionen beteiligt ist. Bislang wurden bei der IBMPFD neunzehn krankheitsverursachende VCP-Mutationen beschrieben. Im Rahmen dieser Arbeit wurden 23 klinisch ausführlich charakterisierte Patienten auf Mutationen im ACTA1-Gen untersucht. Bei einem neugeborenen Patienten mit einem schweren klinischen Phänotyp einer Nemaline-Myopathie und mit muskelbioptischem Nachweis einer Störung der myofibrillären Organisation und Nemalin-Rods wurde eine Doppelmutation E74D und H75Y im Exon 3 nachgewiesen, eine außergewöhnliche monoallelische de novo Mutation zweier benachbarter Aminosäurepositionen. Der ungewöhnliche Genotyp ist mit dem Schweregrad des klinischen Phänotyps des Patienten vereinbar. Auf Grund eines möglichen Keimbahnmosaiks wurde auch Pränataldiagnostik durchgeführt. IBMPFD-Patienten können zu Beginn der Erkrankung einen Phänotyp aufweisen, der einer Schultergürteldystrophie ähnelt. 31 klinisch gut charakterisierte Patienten mit Paresen im Bereich des Schultergürtels, fehlender Scapula alata und fazialer Schwäche wurden auf Mutationen im VCP-Gen untersucht, bei denen im Vorfeld bereits eine Fazio-Scapulo-Humerale-Muskeldystrophie (FSHD) molekulargenetisch ausgeschlossen wurde. Bei keinem dieser Patienten wurden Mutationen in der kodierenden Sequenz des VCP-Gens identifiziert, was nahelegt, dass VCP-Mutationen wahrscheinlich keine häufige Ursache einer Schultergürteldystrophie sind. Es ist im klinischen Alltag eine Herausforderung, die seltene IBMPDF zu diagnostizieren. Wichtig ist es, bei einem passenden klinischen Bild mit einer möglichen positiven Familienanamnese hinsichtlich der bekannten Symptomtrias diese seltene Erkrankung in den differentialdiagnostischen Überlegungen nicht zu vernachlässigen. Die hereditären Myopathien sind eine Gruppe höchst heterogener Erkrankungen bezüglich ihrer Ätiologie und des klinischen Bildes. Es gelingt selbst bei hervorragender Phänotypcharakterisierung nicht immer, die molekulargenetische Diagnose zu stellen. Dies liegt daran, dass die Phänotypen einiger Myopathien sich zum Teil überlappen. Darüber hinaus können Mutationen in verschiedenen Genen ähnliche Phänotypen hervorrufen, wodurch eine exakte Genotyp-Phänotyp-Korrelation erschwert wird. Es ist daher die Erweiterung der Patientenkohorten unerlässlich, wie im Rahmen dieser Arbeit geschehen, um den Phänotyp näher zu charakterisieren, neue Gene bzw. Mutationen zu identifizieren und die zugrunde liegenden Pathomechanismen im Zusammenhang mit dem Phänotyp zu analysieren. Auf diese Weise kann ein besseres Verständnis der Erkrankungen gewonnen werden, um Strategien für potenzielle kausale Behandlungsansätze und eine verbesserte Patientenversorgung zu entwickeln

The yeast plasma membrane contains at least three microdomains – membrane compartment containing Pma1 (MCP), membrane compartment containing TORC2 (MCT) and membrane compartment containing Can1 (MCC). Eisosomes underlie the MCC domain defined by the marker protein arginine permease (Can1). Eisosomes are large protein assemblies composed of Pil1 and Lsp1 proteins, of which Pil1 is essential for plasma membrane organization. We found that the uncharacterized AAA-ATPase protein Yta6 dynamically colocalizes with eisosomes. Yta6 physically interacts with eisosome components, specifically with Pil1. In PIL1 deletion cells, Yta6 is unable to localize normally to the plasma membrane. Yta6 foci colocalize with the intermediates of FM4-64 on the plasma membrane. The number of these intermediates is increased upon overexpression of Yta6. Overexpressed Yta6 is also able to rescue the defects of endocytosis in cells devoid of amphiphysins. Together rescue experiments and colocalization of a protein cargo Hxt3 with eisosomes suggest that Yta6 likely plays a role in endocytosis at eisosomes. To identify genes whose products function together with eisosome components, we independently carried out a genetic interaction study (epistatic mini array profile) which revealed the protein Emp70. EMP70 showed the strongest correlation in genetic profile with PIL1. Emp70 localizes to a subset of eisosomes in addition to its localization in endosomes and vacuoles. We found eisosomes are required for normal numbers of Emp70 plasma membrane foci. Deletion of Emp70 misdirected endosomal protein Kex2 to vacuole, implicating its essential role in maintaining the architecture of the endosomal compartment. In summary, Yta6 likely plays a role in initiation of endocytosis at eisosomes and Emp70 during intracellular trafficking from plasma membrane to vacuole.

Late mitotic events are chiefly controlled by proteolysis of key regulatory proteins via the ubiquitin-proteasome pathway. In this pathway ubiquitin ligases modify substrates by attachment of ubiquitin (“ubiquitylation”), which usually results in their subsequent degradation by the 26S proteasome. The crucial ubiquitin ligase involved in late mitosis is the anaphase-promoting complex or cyclosome (APC/C). Among the many substrates of the APC/C is the anaphase inhibitor securin, whose destruction leads to activation of separase, which in turn triggers sister chromatid separation by proteolytic cleavage of cohesin. The APC/C also targets cyclin B1, an activating subunit of Cdk1 kinase, whose inactivation is a prerequisite for mitotic exit. The unstable APC/C substrates are often found in association with stable partner proteins. How single subunits of multi-protein complexes are selectively extracted and eventually degraded is largely unknown, but there is increasing evidence that additional factors assist to extract ubiquitin-carrying subunits from stable binding partners. One such factor is vertebrate p97 (Cdc48 in yeast), an abundant and highly conserved member of the AAA-ATPase family. It is involved in such diverse processes as transcriptional regulation, membrane fusion, and ER-associated protein degradation (ERAD). The unifying scheme in these seemingly unrelated functions is that p97 is able to “extract” preferentially ubiquitylated proteins from their environment. Roles of p97 in mitosis have recently emerged: p97 was reported to be required for spindle disassembly and for nuclear envelope reformation during mitotic exit in Xenopus. Furthermore, a genetic interaction between p97, separase and securin, as well as a requirement of p97 for separase stability, were discovered in fission yeast. Given these hints and the importance of ubiquitylation in both mitosis and p97 pathways, this study intended to elucidate additional mitotic roles of p97 in vertebrates. Towards this end, tools to interfere with p97 function in Xenopus egg extracts were developed. These included immunodepletion of the p97 adaptors Npl4, Ufd1 and p47 and addition of recombinant dominant-negative p97-mutants. ERAD, which could be established here for the first time in Xenopus egg extracts, was greatly impaired in the absence of p97 function. However, many aspects of mitosis were found to be unaffected. Importantly, p97’s proposed role in spindle disassembly was clearly falsified within this thesis. Furthermore, p97 was shown to be dispensable for activity and stability of vertebrate separase. Disassembly of the mitotic checkpoint complex, which prevents premature APC/C activation by sequestering its activator Cdc20, did also not require functional p97 despite its dependence on ubiquitylation of Cdc20. However, a novel function of p97 at fertilization was discovered. p97 was found to interact with nucleoplasmin, a histone-binding chaperone that catalyzes the exchange of sperm-specific basic proteins (SBPs) to histones. Indeed, interference with p97 function delayed sperm decondensation in Xenopus egg extracts, thereby confirming a novel role of this AAA-ATPase in sperm chromatin remodelling. In another project the role of securin in human cells was investigated. Human cells lacking securin had been reported to suffer from massive chromosome missegregation, which was in sharp contrast to the mild phenotype of securin knockout mice. In collaboration with the group of M. Speicher it could be demonstrated that chromosome losses in securin-/- cells are transient and give way to a stable segregation pattern after just a few passages. This was despite persisting biochemical defects such as reduced level and activity of separase. These data demonstrate that securin is dispensable for chromosomal stability in human cells.