Podcasts about Ubiquitin

In this episode, Will sat down with Dr. Aaron Ciechanover, biologist and Distinguished Research Professor in the Rappaport Faculty of Medicine at the Technion, Israel Institute of Technology. Dr. Ciechanover is renowned for his work in studying the method that cells use to degrade and recycle proteins. While in the laboratory of Avram Hershko, they discovered that small proteins, called ubiquitin, were attached in chains to targeted proteins, marking them for degradation by a proteasome. This system is highly regulated and was subsequently found to be a factor in many diseases and areas of biology, so much that in 2004, Dr. Ciechanover was awarded the Nobel Prize in Chemistry while on faculty at Washington University. Enjoy!

While DNA captures most of the fanfare, proteins are the catalytic and structural superstars of the cell. However, they can also become problematic. Cells have intricate mechanisms to remove damaged or mis-expressed proteins that could be deleterious to cellular function. This process is mediated by a process called ubiquitination, mediated by a special class of proteins called E3 ligases. Ubiquitin is the tag that's added that signals that a protein should be moved to the biochemical garbage can.  Dr. Juliet WIlliams of Kymera describes how their company has used modeling and A.I. to design molecular linkers that connect a protein that needs to be degraded with the machinery to tag it for destruction. The goal of this line of therapeutics is to target a suite of proteins that need to be degraded for normal health and development. Their pipeline contains multiple clinical and pre-clinical trials, and the approach is an exciting complement to other drug discovery methods. 

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2023.07.24.550360v1?rss=1 Authors: del Pino, R. C., Zoltner, M., Yamada, K., Butterfield, E. R., Field, M. Abstract: Post-translational modifications (PTMs) modulate protein function, with ubiquitylation a pre-eminent example with major roles in protein turnover. Ubiquitylation utilises a ligase enzyme cascade for conjugation of ubiquitin to client proteins and cullin-RING ligases are amongst the most complex known. We reconstructed evolution of cullin-RING E3 ubiquitin ligases across eukaryotes and experimentally characterised two cullin complexes in trypanosomatids, a taxon highly divergent from animals and fungi. We find considerable diversity within cullins and, in particular, trypanosomatids share only a minority of cullins with other lineages. Furthermore, we identify expansions in cullin client adaptor protein families, novel client adaptors and demonstrate client specificity. Finally we show that ornithine decarboxylase (TbODC), an important target of the drug trypanosome eflornithine, is a substrate for TbCul-A and overturn earlier models for eflornithine specificity. These studies highlight lineage-specific roles for cullin E3s and their contributions towards eukaryotic complexity. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info Podcast created by Paper Player, LLC

TWiM highlights viral defense and counter-defense: cGAS mediated ubiquitination to counter infection, and viral sponges that sequester nucleotide signals to inactivate immunity. Hosts: Vincent Racaniello, Michael Schmidt, Michele Swanson, Petra Levin. Become a patron of TWiM. Links for this episode Ubiquitin-like conjugation by bacterial cGAS (Nature) Jumpin' Jack Flash (TWiV 222) Viral sponges inactivate anti-phage immunity (Trends Micro) cGAS and CD-NTase enzymes (Curr Opin Struct Biol) Take the TWiM Listener survey! Send your microbiology questions and comments (email or recorded audio) to twim@microbe.tv

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2023.06.25.546446v1?rss=1 Authors: Waite, K. A., Vontz, G., Lee, S. Y., Roelofs, J. Abstract: Stress conditions can cause the relocalization of proteasomes to condensates in yeast and mammalian cells. The interactions that facilitate the formation of proteasome condensates, however, are unclear. Here, we show that the formation of proteasome condensates in yeast depends on long K48-linked ubiquitin chains together with the proteasome shuttle factors Rad23 and Dsk2. These shuttle factors colocalize to these condensates. Strains deleted for the third shuttle factor gene, DDI1, show proteasome condensates in the absence of cellular stress, consistent with the accumulation of substrates with long K48-linked ubiquitin chains that accumulate in this mutant. We propose a model where the long K48-linked ubiquitin chains function as a scaffold for the ubiquitin binding domains of the shuttle factors and the proteasome, allowing for the multivalent interactions that further drive condensate formation. Indeed, we determined different intrinsic ubiquitin receptors of the proteasome (Rpn1, Rpn10, and Rpn13) are critical under different condensate inducing conditions. In all, our data support a model where the cellular accumulation of substrates with long ubiquitin chains, potentially due to reduced cellular energy, allows for proteasome condensate formation. This suggests that proteasome condensates are not simply for proteasome storage, but function to sequester soluble ubiquitinated substrates together with inactive proteasomes. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info Podcast created by Paper Player, LLC

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2023.04.05.535705v1?rss=1 Authors: Yang, L., Parajuli, N., Wu, P., Liu, J., Wang, X. Abstract: Background: A better understanding of the regulation of proteasome activities can facilitate the search for new therapeutic strategies. A cell culture study shows that cAMP-dependent protein kinase (PKA) activates the 26S proteasome by phosphorylating Ser14 of RPN6 (pS14-RPN6), but this discovery and its physiological significance remain to be established in vivo. Methods: Male and female mice with Ser14 of Rpn6 mutated to Ala (S14A) or Asp (S14D) to respectively block or mimic pS14-Rpn6 were created and used along with cells derived from them. cAMP/PKA were manipulated pharmacologically. Ubiquitin-proteasome system (UPS) functioning was evaluated with the GFPdgn reporter mouse and proteasomal activity assays. Impact of S14A and S14D on proteotoxicity was tested in mice and cardiomyocytes overexpressing the misfolded protein R120G-CryAB (R120G). Results: PKA activation increased pS14-Rpn6 and 26S proteasome activities in wild-type (WT) but not S14A embryonic fibroblasts (MEFs), adult cardiomyocytes (AMCMs), and mouse hearts. Basal 26S proteasome activities were significantly greater in S14D myocardium and AMCMs than in WT counterparts. S14D::GFPdgn mice displayed significantly lower myocardial GFPdgn protein but not mRNA levels than GFPdgn mice. In R120G mice, a classic model of cardiac proteotoxicity, basal myocardial pS14-Rpn6 was significantly lower compared with non-transgenic littermates, which was not always associated with reduction of other phosphorylated PKA substrates. Cultured S14D neonatal cardiomyocytes displayed significantly faster proteasomal degradation of R120G than WT neonatal cardiomyocytes. Compared with R120G mice, S14D/S14D::R120G mice showed significantly greater myocardial proteasome activities, lower levels of total and K48-linked ubiquitin conjugates and of aberrant CryAB protein aggregates, less reactivation of fetal genes and cardiac hypertrophy, and delays in cardiac malfunction. Conclusions: This study establishes in animals that pS14-Rpn6 mediates the activation of 26S proteasomes by PKA and that the reduced pS14-Rpn6 is a key pathogenic factor in cardiac proteinopathy, thereby identifies a new therapeutic target to reduce cardiac proteotoxicity. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info Podcast created by Paper Player, LLC

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2023.03.16.533063v1?rss=1 Authors: Farrukh, A., Musabyimana, J.-P., Distler, U., Tenzer, S., Pradel, G., Julius Ngwa, C. Abstract: Some proteins have acquired both ubiquitin ligase activity and RNA-binding properties and are therefore known as RNA-binding Ubiquitin ligases (RBULs). These proteins provide a link between the RNA metabolism and the ubiquitin proteasome system (UPS). The UPS is a crucial protein surveillance system of eukaryotes primarily involved in the selective proteolysis of proteins which are covalently marked with ubiquitin through a series of steps involving ubiquitin E1 activating, E2 conjugating and E3 ligating enzymes. The UPS also regulates other key cellular processes such as cell cycle, proliferation, cell differentiation, transcription and signal transduction. While RBULs have been characterized in other organisms, little is known about their role in Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest human malaria, malaria tropica. In this study, we characterized a previously identified putative P. falciparum RING finger E3 ligase PfRNF1. We show that the protein is highly expressed in sexual stage parasites and mainly present in immature male gametocytes. Using proximity interaction studies with parasite lines expressing PfRNF1 tagged with the Biotin ligase BirA, we identified an interaction network of PfRNF1 in both the asexual blood stages and gametocytes composed mainly of ribosomal proteins, RNA-binding proteins including translational repressors such DOZI, CITH, PUF1 and members of the CCR4-NOT complex, as well as proteins of the UPS such as RPN11, RPT1 and RPT6. Our interaction network analysis reveals PfRNF1 as a potential RNA-binding E3 ligase which links RNA dependent processes with protein ubiquitination to regulate gene expression. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info Podcast created by Paper Player, LLC

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2023.03.17.533093v1?rss=1 Authors: Frion, J., Meller, A., Marbach, G., Levesque, D., Roucou, X., Boisvert, F.-M. Abstract: Ubiquitination is a post-translational modification responsible for one of the most complex multi-layered communication and regulation system in the cell. Over the past decades, new ubiquitin variants and ubiquitin-like proteins arose to further enrich this mechanism. Among them, the recently discovered ubiquitin variant UbKEKS can specifically target several proteins and yet, functional consequences of this new modification remain unknown. The absence of UbKEKS induces accumulation of lamin A in the nucleoli, highlighting the need for deeper investigations about protein composition and functions regulation of this highly dynamic and membrane-less compartment. By using data independent acquisition mass spectrometry and microscopy, we show here that despite not impacting protein stability, UbKEKS is required to maintain normal nucleolar organization. The absence of UbKEKS increases nucleoli size and accentuate their circularity while disrupting dense fibrillar component and fibrillar center structures. Moreover, depletion of UbKEKS leads to distinct changes in nucleolar composition. Notably, lack of UbKEKS favors nucleolar sequestration of known apoptotic regulators such as IFI16 or p14ARF, resulting in an increase of apoptosis in UbKEKS knockout cells observed by flow cytometry and real-time cellular growth monitoring. Overall, the results presented here identifies the first cellular functions of the UbKEKS variant and lay the foundation stone to establish UbKEKS as a new universal layer of regulation in the already complex ubiquitination system. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info Podcast created by Paper Player, LLC

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2023.03.14.532537v1?rss=1 Authors: Cristiani, A., Dutta, A., Poveda-Cuevas, S. A., Kern, A., Bhaskara, R. M. Abstract: Selective autophagy receptors (SARs) are central to cellular homeostatic and organellar recycling pathways. Over the last two decades, more than 30 SARs have been discovered and validated using a variety of experimental approaches ranging from cell biology to biochemistry, including high-throughput imaging and screening methods. Yet, the extent of selective autophagy pathways operating under various cellular contexts e.g., under basal and starvation conditions, remains unresolved. Currently, our knowledge of all known SARs and their associated cargo components is fragmentary and limited by experimental data with varying degrees of resolution. Here, we use classical predictive and modeling approaches to integrate high-quality autophagosome content profiling data with disparate datasets. We identify a global set of potential SARs and their associated cargo components active under basal autophagy, starvation-induced, and proteasome-inhibition conditions. We provide a detailed account of cellular components, biochemical pathways, and molecular processes that are degraded via autophagy. Our analysis yields a catalog of new potential SARs that satisfy the characteristics of bonafide, well-characterized SARs. We categorize them by the subcellular compartments they emerge from and classify them based on their likely mode of action. Our structural modeling validates a large subset of predicted interactions with the human ATG8 family of proteins and shows characteristic, conserved LC3-interacting region (LIR)--LIR-docking site (LDS) and Ubiquitin-interacting motif (UIM)--UIM-docking site (UDS) binding modes. Our analysis also revealed the most abundant cargo molecules targeted by these new SARs. Our findings expand the repertoire of SARs and provide unprecedented details into the global autophagic state of HeLa cells. Taken together, our findings provide motivation for the design of new experiments, testing the role of these novel factors in selective autophagy. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info Podcast created by Paper Player, LLC

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2023.01.31.526442v1?rss=1 Authors: Marchesan, E., Nardin, A., Mauri, S., Di Paola, S., Chinellato, M., von Stockum, S., Chakraborty, J., Herkenne, S., Basso, V., Schrepfer, E., Marin, O., Cendron, L., Medina, D. L., Scorrano, L., Ziviani, E. Abstract: Selective removal of dysfunctional mitochondria via autophagy is crucial for the maintenance of cellular homeostasis. This event is initiated by the translocation of the E3 ubiquitin ligase Parkin to damaged mitochondria, and it requires the Serine/Threonine-protein kinase PINK1. In a coordinated set of events, PINK1 operates upstream of Parkin in a linear pathway that leads to the phosphorylation of Parkin, Ubiquitin, and Parkin mitochondrial substrates, to promote ubiquitination of outer mitochondrial membrane proteins. Ubiquitin decorated mitochondria are selectively recruiting autophagy receptors,which are required to terminate the organelle via autophagy. In this work we show a previously uncharacterized molecular pathway that correlates the activation of the Ca2+-dependent phosphatase Calcineurin to Parkin-dependent mitophagy. Calcineurin downregulation or genetic inhibition prevents Parkin translocation to CCCP-treated mitochondria, and impairs stress-induced mitophagy, whereas Calcineurin activation promotes Parkin mitochondrial recruitment and basal mitophagy. Calcineurin interacts with Parkin, and promotes Parkin translocation in the absence of PINK1, but requires PINK1 expression to execute mitophagy in MEF cells. Genetic activation of Calcineurin in vivo boosts basal mitophagy in neurons, and corrects locomotor dysfunction and mitochondrial respiratory defects of a Drosophila model of impaired mitochondrial functions. Our study identifies Calcineurin as a novel key player in the regulation of Parkin translocation and mitophagy. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info Podcast created by Paper Player, LLC

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2023.01.31.526464v1?rss=1 Authors: Liu, J., Nagy, N., Aguilar-Alonso, F., Esteves, F., Ayala-Torres, C., Xu, S., Masucci, M. G. Abstract: The strategies adopted by viruses to reprogram the protein translation and quality control machineries to promote infection are poorly understood. Here, we discovered that the viral ubiquitin deconjugase (vDUB) encoded in the large tegument protein of Epstein-Barr virus (EBV) regulates ribosomal stress responses. The vDUB participates in protein complexes that include the ubiquitin ligases ZNF598 and LTN1 and the UFM1 ligase UFL1. Upon ribosomal stalling, the vDUB counteracts the ubiquitination of 40S ribosome subunits, inhibits the degradation of translation-stalled polypeptides by the proteasome, and prevents UFMylation of the 60S particle, which impairs the ER-phagy-dependent clearance of stalled products. Inhibition of the ribosome quality control activates a GCN2-dependent integrated stress response that decreases global protein translation while promoting the readthrough of stall-inducing mRNAs. The vDUB enhances viral mRNAs translation and virus release during productive infection, pointing to a pivotal role in cell reprogramming that enables virus production and underlies the pathogenesis of EBV-associated cancers and autoimmune diseases. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info Podcast created by Paper Player, LLC

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2023.01.06.522988v1?rss=1 Authors: Kassouf, T., Shrivastava, R., Meszka, I., Bailly, A., Polanowska, J., Trauchessec, H., Mandrioli, J., Carra, S., Xirodimas, D. Abstract: In Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) motor neuron disease, mutations in proteins that upon stress localize within cytoplasmic protein inclusions called Stress Granules (SGs), are linked to the formation of aberrant inclusions, which are related to neuronal cell death. By combining studies in human cells and C. elegans including the use of Nanobodies, we found that inhibition of NEDP1, the enzyme responsible for the processing and deconjugation of the Ubiquitin-like molecule NEDD8 from substrates, promotes the elimination both of physiological and pathological SGs. The hyper-NEDDylation of Poly-(ADP-ribose) polymerase-1 enzyme upon NEDP1 inhibition compromises PAR production and is a key mechanism for the observed SG phenotype. Importantly, the above-described effects are related to improved cell survival in human cells, and in C. elegans, NEDP1 deletion ameliorates ALS-phenotypes related to animal motility. Our studies reveal NEDP1 as potential therapeutic target for ALS, based on the elimination of aberrant SGs. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info Podcast created by Paper Player, LLC

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2022.12.29.522265v1?rss=1 Authors: Le, T. K., Hirano, Y., Asakawa, H., Okamoto, K., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. Abstract: Aberrant accumulation of inner nuclear membrane (INM) proteins has been associated with deformed nuclear morphology and certain mammalian diseases. However, the mechanisms by which INM homeostasis is maintained remain poorly understood. In this study, we explored the degradation mechanisms of the INM protein Bqt4 in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. We have previously shown that Bqt4 interacts with the transmembrane protein Bqt3 at the INM and is degraded in the absence of Bqt3. Here, we revealed that excess Bqt4 unassociated with Bqt3 was targeted for degradation by the ubiquitin-proteasome system localized in the nucleus and that Bqt3 antagonized this process. The degradation process involves the Doa10 E3 ligase complex at the INM. Bqt4 is a tail-anchored protein and extraction from the membrane by the Cdc48 complex is required for its degradation. The C-terminal transmembrane domain of Bqt4 is necessary and sufficient for proteasome-dependent protein degradation. Accumulation of Bqt4 at the INM impaired cell viability with nuclear envelope deformation, suggesting that the quantity control of Bqt4 plays an important role in nuclear membrane homeostasis. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info Podcast created by Paper Player, LLC

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2022.11.11.516094v1?rss=1 Authors: Jiang, H., Cao, Y. Abstract: Mitophagy is a fundamental quality control mechanism of mitochondria. Its regulatory mechanisms and pathological implications remain poorly understood. Here via a mitochondria-targeted screen, we found that knockout (KO) of FBXL4, a mitochondrial disease gene, hyperactivates mitophagy at basal conditions. Subsequent counter screen revealed that FBXL4-KO hyperactivates mitophagy via two mitophagy receptors BNIP3 and NIX. We determined that FBXL4 functions as an integral outer-membrane protein that forms an SCF-FBXL4 ubiquitin E3 ligase complex. SCF-FBXL4 ubiquitinates BNIP3 and NIX to target them for degradation. Pathogenic FBXL4 mutations disrupt SCF-FBXL4 assembly and impair substrate degradation. Fbxl4-/- mice exhibit elevated BNIP3 and NIX proteins, hyperactive mitophagy, and perinatal lethality. Importantly, knockout of either Bnip3 or Nix rescues metabolic derangements and viability of the Fbxl4-/- mice. Together, beyond identifying SCF-FBXL4 as a novel mitochondrial ubiquitin E3 ligase restraining basal mitophagy, our results reveal hyperactivated mitophagy as a cause of mitochondrial disease and suggest therapeutic strategies. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info Podcast created by Paper Player, LLC

From chemotherapy to immunotherapy and targeted drug delivery, what's next for breast cancer treatment? In this episode, Jessica is joined by cancer research expert Associate Professor Pieter Eichhorn, who is co-leading an Australian Government subsidised drug delivery project that aims to change the behaviours of proteins found in breast cancer. Together, they discuss what conventional treatments exist and where they're going, Associate Professor Eichhorn's exciting new drug treatment, and what he believes needs to change to drastically reduce the rates of breast cancer going into the future.Associate Professor Eichhorn's research project is supported by the Curtin Health Innovation Research Institute and the National Drug Discovery Centre at the Walter and Eliza Hall Institute.How breast cancer develops [01:15]Predicting future rates of breast cancer [04:26]Progress in conventional treatments [07:56]What's unique about the drug delivery project? [13:27]Associate Professor Eichhorn's research journey [17:34]Reducing rates of cancer through tumour sequencing [19:45] Content note: This episode predominantly covers the experiences of women who are cisgender. Cisgender women are those women whose sense of their gender matches the sex they were assigned at birth and who are the population group at greatest risk of contracting breast cancer.Learn moreWEHI: National Drug Discovery Centre announces new projectsNational Breast Cancer Foundation websiteBreast Cancer Now websiteConnect with our guestPieter Eichhorn is the Dean of Research Infrastructure at Curtin University, and an Associate Professor at the world-renowned Curtin Health Innovation Research Institute.He has devoted his career to developing targeted treatments for breast cancer and melanoma patients. Prior to Curtin, he has worked at a variety of prestigious institutes including Harvard Medical School, Massachusetts General Hospital, the Cancer Science Institute of Singapore and the Netherlands Cancer Institute. Associate Professor Eichhorn's staff profileAssociate Professor Eichhorn's LinkedIn profileCurtin Health Innovation Research Institute websiteJoin Curtin UniversityThis podcast is brought to you by Curtin University. Curtin is a global university known for its commitment to making positive change happen through high-impact research, strong industry partnerships and practical teaching.Partner with CurtinStudy a research degreeStart postgraduate educationGot any questions, or suggestions for future topics?Email thefutureof@curtin.edu.auSocialshttps://twitter.com/curtinunihttps://www.facebook.com/curtinuniversityhttps://www.instagram.com/curtinuniversity/https://www.youtube.com/user/CurtinUniversityhttps://www.linkedin.com/school/curtinuniversity/ Transcripthttps://thefutureof.simplecast.com/episodes/breast-cancer-treatment/transcriptBehind the scenes teamJessica Morrison, HostAnita Shore, Executive ProducerAnnabelle Fouchard, ProducerDaniel Jauk, Episode Researcher, Recordist and EditorAlexandra Eftos, Assistant ProducerAmy Hosking, Social Media. Curtin University supports academic freedom of speech. The views expressed in The Future Of podcast may not reflect those of Curtin University. First Nations AcknowledgementCurtin University acknowledges the traditional owners of the land on which Curtin Perth is located, the Whadjuk people of the Nyungar Nation, and on Curtin Kalgoorlie, the Wongutha people of the North-Eastern Goldfields; and the First Nations peoples on all Curtin locations. MusicOKAY by 13ounce Creative Commons — Attribution-ShareAlike 3.0 Unported — CC BY-SA 3.0 Music promoted by Audio Library.

Dr. Adam Zaretsky of NADLinc is a nomadic Wet-Lab Art Practitioner mixing Ecology, Biotechnology, Non-human Relations, Body Performance and Gastronomy. Zaretsky stages lively, hands-on bioart production labs based on topics such as: foreign species invasion (pure/impure), radical food science (edible/inedible), jazz bioinformatics (code/flesh), tissue culture (undead/semi-alive), transgenic design issues (traits/desires), interactive ethology (person/machine/non-human) and physiology (performance/stress). A former researcher at the MIT department of biology, Adam runs labs on DIY-IGM (Do-It-Yourself Inherited Genetic Modification of the Human Genome). His art practice focuses on an array of legal, ethical, social and libidinal implications of biotechnological materials and methods with a focus on transgenic humans, methods of transgenesis and germline aesthetics. http://artsci.ucla.edu/node/1128 What he has been reading: Genbank Online Bioinformatics Database meet the genome of the Dolphin Lipotes vexillifer UBE3D for fun reading: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=Lipotes+vexillifer+UBE3D Czech out the HECT_2; HECT-like Ubiquitin-conjugating enzyme (E2) binding FASTA and Sequence Viewer (Graphics) too! For further research, the links Mentioned: https://www.hackteria.org/workshops/thgap/ https://www.makery.info/en/author/adam-zaretsky/ https://www.makery.info/en/2021/09/01/english-human-germline-gene-editing-is-bioart-an-open-letter-to-lulu-and-nana/ Warplanes for Vultures – the failure of Art or Science to stop endless collateral damage, interspecies enrichment, sympathetic magick, eating the war machine, eaten by vultures during “Animal and Other Non-Human Enrichment in Parks and Preserves (Seeking Provisioning Advice)”, Bambi Seminar, Smithsonian Tropical Research Institute, Panama, 2019. Hybrid DNA Isolation, Vivoarts: Biology and Art Studio Master Class, University of Leiden, 2007

In today's podcast Professor Selina Wray from University College London, meets four early career researchers, who know a great deal about the brain, human iPSC derived cells and the ubiquitin-proteasome pathway (not that isn't a new type of electric car). We'll be discussing their research, discovering more about super resolution microscopy, and how they're researching the ubiquitin proteasome system, and its connection to dementia. We're delighted to welcome our guests: PhD Students Liina Sirvio, Katiuska Daniela Pulgar Prieto from the UK Dementia Research Institute at Imperial College London. Georgie Lines, PhD Student from University College London and Dr Emma Mee Haynes a Postdoctoral Research Associate also from the UK Dementia Research Institute at Imperial College London. What is the purpose of ubiquitin proteasome system? In eukaryotic cells, proteasomes perform crucial roles in many cellular pathways by degrading proteins to enforce quality control and regulate many cellular processes such as cell cycle progression, signal transduction, cell death, immune responses, metabolism, protein-quality control, and development. You can find out more about our guests, and access a full transcript of this podcast on our website at: https://www.dementiaresearcher.nihr.ac.uk/podcast _________________________ Finally, please review, like, and share our podcast - and don't forget to subscribe to ensure you never miss an episode. Register on our website to receive your weekly bulletin, and to access more great content – blogs, science, career support + much more https://www.dementiaresearcher.nihr.ac.uk This podcast is brought to you in association with Alzheimer's Research UK and Alzheimer's Society, who we thank for their ongoing support.

In this episode of the Personalized Medicine Podcast, we sat down with the guru of bioinformatics, Dr. John Castle. John is a physicist by training who found a passion for answering complex questions in drug development using a data-driven approach. He led bioinformatics teams at multiple successful companies including Rosetta Inpharmatics, Merck and Agenus. John was also employee number 5 at BioNTech, a company best known for its development of the first approved COVID vaccine. While at BioNTech John established and led the Computational Medicine team that was focusing on anti-cancer mRNA-based vaccines. Currently, John is a Chief Data Scientist Officer at Monte Rosa Therapeutics, where he helps the company develop their novel therapeutic approach based on targeted protein degradation.This episode is full of inspirational moments and funny anecdotes. Make sure to check it out. Together with John we discussed: ° Targeted protein degradation as a new approach in the pharma industry ° Combining genomics and protein structure data in drug development ° AlphaFold and progress in deciphering 3D protein structure ° Using bioinformatics to develop more efficient monoclonal antibodies ° Advantages of bispecific antibodies in oncology ° Early days of BioNTech ° mRNA vaccines for the treatment of cancer and infectious diseases ° Differences between doing science in Europe and the US ° Advice to aspiring bioinformaticiansGet in touch with John: ° Linkedin: https://www.linkedin.com/in/john-castle-b1a1458/ ° Twitter: @joccastle ° Web (Monte Rosa): https://www.monterosatx.com Make sure to download the full show notes with our guest's bio, links to their most notable work, and our recommendations for further reads on the topic of the episode at pmedcast.com

TWiV 688: We put COVID-19 papers through a sieve December 2, 2020 On this episode, UK grants EUA for Pfizer vaccine, advice for CDC on who to immunize first, news from Das Coronavirus, SARS-CoV-2 protease regulates innate responses, and viral mRNAs are not an indication of viral replication. Hosts: Vincent Racaniello, Rich Condit, Kathy Spindler, and Brianne Barker Subscribe (free): iTunes, Google Podcasts, RSS, email Become a patron of TWiV! Links for this episode UK grants EUA for Pfizer vaccine (NY Times) ACIP advice on who to vaccinate first (NY Times) Das coronavirus update SARS-CoV-2 protease regulates innate response (Nature) Viral mRNAs do not indicate viral replication (Nat Comm) Addendum to SARS-CoV-2 discovery paper (Nature) 16:15 SARS-CoV-2 mRNA vaccine and GC formation (Immunity) 29:35 What scientists say about masks (NY Times) 1:29:03 Letters read on TWiV 688 Timestamps by Jolene. Thanks! Weekly Picks Brianne – Pedromics Kathy – Global map at Mars opposition Rich – Janeway’s Immunobiology Vincent – Janet Iwasa’s Animation Lab Listener Pick Cheryl – BioRender.com holiday card templates Intro music is by Ronald Jenkees Send your virology questions and comments to twiv@microbe.tv

TWiV 688: We put COVID-19 papers through a sieve December 2, 2020 On this episode, UK grants EUA for Pfizer vaccine, advice for CDC on who to immunize first, news from Das Coronavirus, SARS-CoV-2 protease regulates innate responses, and viral mRNAs are not an indication of viral replication. Hosts: Vincent Racaniello, Rich Condit, Kathy Spindler, and Brianne Barker Subscribe (free): iTunes, Google Podcasts, RSS, email Become a patron of TWiV! Links for this episode UK grants EUA for Pfizer vaccine (NY Times) ACIP advice on who to vaccinate first (NY Times) Das coronavirus update SARS-CoV-2 protease regulates innate response (Nature) Viral mRNAs do not indicate viral replication (Nat Comm) Addendum to SARS-CoV-2 discovery paper (Nature) 16:15 SARS-CoV-2 mRNA vaccine and GC formation (Immunity) 29:35 What scientists say about masks (NY Times) 1:29:03 Letters read on TWiV 688 Timestamps by Jolene. Thanks! Weekly Picks Brianne – Pedromics Kathy – Global map at Mars opposition Rich – Janeway’s Immunobiology Vincent – Janet Iwasa’s Animation Lab Listener Pick Cheryl – BioRender.com holiday card templates Intro music is by Ronald Jenkees Send your virology questions and comments to twiv@microbe.tv

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2020.11.12.380584v1?rss=1 Authors: Hatstat, A. K., Pupi, M. D., McCafferty, D. G. Abstract: The Nedd4 family contains several structurally related but functionally distinct HECT-type ubiquitin ligases. The members of the Nedd4 family are known to recognize substrates through their multiple WW domains, which recognize PY motifs (PPxY, LPxY) or phospho-threonine or phospho-serine residues. To better understand substrate specificity across the Nedd4 family, we report the development and implementation of a python-based tool, PxYFinder, to identify PY motifs in the primary sequences of previously identified interactors of Nedd4 and related ligases. Using PxYFinder, we find that, on average, half of Nedd4 family interactions are PY-motif mediated. Further, we find that PPxY motifs are more prevalent than LPxY motifs and are more likely to occur in proline-rich regions. Further, PPxY regions are more disordered on average relative to LPxY-containing regions. Informed by consensus sequences for PY motifs across the Nedd4 interactome, we rationally designed a peptide library and employed a computational screen, revealing sequence- and biomolecular interaction-dependent determinants of WW-domain/PY-motif interactions. Cumulatively, our efforts provide a new bioinformatic tool and expand our understanding of sequence and structural factors that contribute to PY-motif mediated substrate recognition across the Nedd4 family. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2020.10.05.326363v1?rss=1 Authors: Shaofan, H., Yuancai, X., Lu, Q., Meng, W., Zhang, Y. Abstract: The membrane-bound transcription factor Nrf1 (i.e., encoded by Nfe2l1) is activated by sensing glucose deprivation, cholesterol excess, proteasomal inhibition and oxidative stress, and then mediates distinct signaling responses in order to maintain cellular homeostasis. Here, we found that Nrf1 stability and transactivity are enhanced by USP19, a tail-anchored ubiquitin-specific protease in the endoplasmic reticulum (ER). Further experiments revealed that USP19 directly interacts with Nrf1 in proximity to the ER and acts as a deubiquitinating enzyme to remove ubiquitin moieties from this protein and hence circumvent potential proteasomal degradation. Such USP19-mediated effect takes place only after Nrf1 is retrotranslocated by p97 out of ER membranes. Conversely, knockout of USP19 causes significant decreases in Nrf1 abundance and its active isoform entering the nucleus, resulting in down-regulation of its target proteasomal subunits. This led to a modest reduction of USP19-/-derived tumor growth in xenograft mice, when compared with wild-type controls. Altogether, these demonstrate that USP19 serves as a novel mechanistic modulator of Nrf1, but not Nrf2. In turn, our additional evidence has also unraveled that transcriptional expression of endogenous USP19 and its promoter-driven reporter genes is regulated by Nrf2, as well by Nrf1, at distinct layers within a complex hierarchical regulatory network. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2020.08.26.268649v1?rss=1 Authors: Kato, K., Ahmad, S., Zhu, Z., Young, J., Mu, X., Park, S., Malik, H., Hur, s. Abstract: RNA helicases and ubiquitin E3 ligases mediate many critical functions within cells, but their actions have been studied largely in distinct biological contexts. Here, we uncover evolutionarily conserved rules of engagement between RNA helicases and tripartite motif (TRIM) E3 ligases that lead to their functional coordination in vertebrate innate immunity. Using cryo-electron microscopy and biochemistry, we show that RIG-I-like receptors (RLRs), viral RNA receptors with helicase domains, interact with their cognate TRIM/TRIM-like E3 ligases through similar epitopes in the helicase domains. Their interactions are avidity-driven, restricting the actions of TRIM/TRIM-like proteins and consequent immune activation to RLR multimers. Mass-spectrometry and phylogeny-guided biochemical analyses further reveal that similar rules of engagement apply to diverse RNA helicases and TRIM/TRIM-like proteins. Our analyses thus reveal not only conserved substrates for TRIM proteins but also unexpectedly deep evolutionary connections between TRIM proteins and RNA helicases, thereby linking ubiquitin and RNA biology throughout animal evolution. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info

Host Kevin Patton summarizes the 2019 Nobel Prize in Physiology or Medicine to three scientists "for their discoveries of how cells sense and adapt to oxygen availability." A special bonus episode. 00:41 | Introduction to Bonus Episode 02:00 | Sponsored by HAPS 02:24 | Summary of Discovery 04:13 | Oxygen at Center Stage 05:24 | HIF Enters the Scene08:08 | Sponsored by AAA 08:26 | VHL - An Unexpected Partner 11:37 | Oxygen sHIFts the Balance 13:20 | Oxygen Shapes Physiology & Pathology 15:15 | Sponsored by HAPI Online Graduate Program 15:48 | Our Course 23:46 | Staying Connected If you cannot see or activate the audio player click here. Questions & Feedback: 1-833-LION-DEN (1-833-546-6336) Follow The A&P Professor on Twitter, Facebook, Blogger, Nuzzel, Tumblr, or Instagram! Singing is like a celebration of oxygen. (Björk)   1 | Introduction to the Bonus Episode 1 minute Kevin introduces the bonus episode, explaining that he's sharing the press release for the 2019 Nobel Prize in Physiology or Medicine. It's chunked for clarity. Press release: The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2019. NobelPrize.org. Nobel Media AB 2019. Mon. 7 Oct 2019.   2 | Sponsored by HAPS 2 minutes The Human Anatomy & Physiology Society (HAPS) is a sponsor of this podcast.  You can help appreciate their support by clicking the link below and checking out the many resources and benefits found there. There are a bunch of 1-day regional workshops scattered all over the continent. There's probably one near you coming up this year (or next)! Anatomy & Physiology Society  theAPprofessor.org/haps     3 | Summary of the Discovery 2 minutes 2019-10-07: The Nobel Assembly at Karolinska Institutet has today decided to award the 2019 Nobel Prize in Physiology or Medicine jointly to William G. Kaelin Jr., Sir Peter J. Ratcliffe, and Gregg L. Semenza for their discoveries of how cells sense and adapt to oxygen availability. They identified molecular machinery that regulates the activity of genes in response to varying levels of oxygen.   4 | Oxygen at Center Stage 1 minute During evolution, mechanisms developed to ensure a sufficient supply of oxygen to tissues and cells.   5 | HIF Enters the Scene 3 minutes Gregg Semenza studied the EPO (erythropoietin) gene and how it is regulated by varying oxygen levels. In cultured liver cells he discovered a protein complex that binds to the identified DNA segment in an oxygen-dependent manner. He called this complex the hypoxia-inducible factor (HIF). HIF was found to consist of two different DNA-binding proteins, so called transcription factors, now named HIF-1α and ARNT.   6 | Sponsored by AAA 0.5 minutes A searchable transcript for this episode, as well as the captioned audiogram of this episode, are sponsored by the American Association for Anatomy (AAA) at anatomy.org. Searchable transcript Captioned audiogram      7 | VHL - An Unexpected Partner 3 minutes When oxygen levels are high, cells contain very little HIF-1α. However, when oxygen levels are low, the amount of HIF-1α increases so that it can bind to and thus regulate the EPO gene as well as other genes with HIF-binding DNA segments. See figure (if you can't see it, go to https://my-ap.us/35fm0O6). At about the same time as Semenza and Ratcliffe were exploring the regulation of the EPO gene, cancer researcher William Kaelin, Jr. was researching an inherited syndrome, von Hippel-Lindau's disease (VHL disease). VHL is part of a complex that labels proteins with ubiquitin, marking them for degradation in the proteasome. Ratcliffe and his research group then made a key discovery: demonstrating that VHL can physically interact with HIF-1α and is required for its degradation at normal oxygen levels. This conclusively linked VHL to HIF-1α. When oxygen levels are low (hypoxia), HIF-1α is protected from degradation and accumulates in the nucleus, where it associates with ARNT and binds to specific DNA sequences (HRE) in hypoxia-regulated genes (1). At normal oxygen levels, HIF-1α is rapidly degraded by the proteasome (2). Oxygen regulates the degradation process by the addition of hydroxyl groups (OH) to HIF-1α (3). The VHL protein can then recognize and form a complex with HIF-1α leading to its degradation in an oxygen-dependent manner (4). https://my-ap.us/35fm0O6   8 | Oxygen sHIFts the Balance 1.5 minutes It was also shown that the gene activating function of HIF-1α was regulated by oxygen-dependent hydroxylation. The Nobel Laureates had now elucidated the oxygen sensing mechanism and had shown how it works.   9 | Oxygen Shapes Physiology & Pathology 2 minutes Thanks to the groundbreaking work of these Nobel Laureates, we know much more about how different oxygen levels regulate fundamental physiological processes. For example, muscles, blood vessel formation, immunity, RBC production, placenta development, etc. Oxygen sensing is central to a large number of diseases. For example, patients with chronic renal failure often suffer from severe anemia due to decreased EPO expression. See figure (if you cant's see it, go to https://my-ap.us/2LW2cIb) The awarded mechanism for oxygen sensing has fundamental importance in physiology, for example for our metabolism, immune response and ability to adapt to exercise. Many pathological processes are also affected. Intensive efforts are ongoing to develop new drugs that can either inhibit or activate the oxygen-regulated machinery for treatment of anemia, cancer and other diseases. https://my-ap.us/2LW2cIb   10 | Sponsored by HAPI Online Graduate Program 1 minute The Master of Science in Human Anatomy & Physiology Instruction—the MS-HAPI—is a graduate program for A&P teachers. A combination of science courses (enough to qualify you to teach at the college level) and courses in contemporary instructional practice, this program helps you power up  your teaching. Kevin Patton is a faculty member in this program. Check it out! nycc.edu/hapi     11 | Our Course 8 minutes This set of discoveries touches on many of the core concepts of our course (the big ideas of our story of the human body). Nobel Prizes are a cultural touchstone that students can related to, and thus increase interest and motivation. Nobel Prizes can be a starting point for discussion the role of science in the context of society and culture. Additional resources: Main page for this prize: my-ap.us/31Wuc3Z Publications Semenza, G.L, Nejfelt, M.K., Chi, S.M. & Antonarakis, S.E. (1991). Hypoxia-inducible nuclear factors bind to an enhancer element located 3' to the human erythropoietin gene. Proc Natl Acad Sci USA, 88, 5680-5684 my-ap.us/2ontmP8 Wang, G.L., Jiang, B.-H., Rue, E.A. & Semenza, G.L. (1995). Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension. Proc Natl Acad Sci USA, 92, 5510-5514 my-ap.us/2IxLUD5 Maxwell, P.H., Wiesener, M.S., Chang, G.-W., Clifford, S.C., Vaux, E.C., Cockman, M.E., Wykoff, C.C., Pugh, C.W., Maher, E.R. & Ratcliffe, P.J. (1999). The tumour suppressor protein VHL targets hypoxia-inducible factors for oxygen-dependent proteolysis. Nature, 399, 271-275 my-ap.us/2op4XbP Mircea, I., Kondo, K., Yang, H., Kim, W., Valiando, J., Ohh, M., Salic, A., Asara, J.M., Lane, W.S. & Kaelin Jr., W.G. (2001) HIFa targeted for VHL-mediated destruction by proline hydroxylation: Implications for O2 sensing. Science, 292, 464-468 my-ap.us/2IxIf8t Jakkola, P., Mole, D.R., Tian, Y.-M., Wilson, M.I., Gielbert, J., Gaskell, S.J., von Kriegsheim, A., Heberstreit, H.F., Mukherji, M., Schofield, C.J., Maxwell, P.H., Pugh, C.W. & Ratcliffe, P.J. (2001). Targeting of HIF-α to the von Hippel-Lindau ubiquitylation complex by O2-regulated prolyl hydroxylation. Science, 292, 468-472 my-ap.us/35i4wR9   If the hyperlinks here are not active, go to TAPPradio.org to find the episode page. More details at the episode page. Transcript available at the script page. Listen to any episode on your Alexa device. Need help accessing resources locked behind a paywall? Check out this advice from Episode 32 to get what you need! https://youtu.be/JU_l76JGwVw?t=440   Sponsors   Transcript and captions for this episode are supported by the  American Association for Anatomy. anatomy.org     The Human Anatomy & Physiology Society  also provides marketing support for this podcast.  theAPprofessor.org/haps     Distribution of this episode is supported by  NYCC's online graduate program in  Human Anatomy & Physiology Instruction (HAPI)  nycc.edu/hapi   Clicking on sponsor links  helps let them know you appreciate their support of this podcast!   Referrals also help defray podcasting expenses.  Amazon TextExpander Snagit & Camtasia The A&P Professor Logo Items   Follow The A&P Professor on  Twitter, Facebook, Blogger, Nuzzel, Tumblr, or Instagram!   The A&P Professor® and Lion Den® are registered trademarks of Lion Den Inc. (Kevin Patton)  

Raul Andino joins Vincent and Amy to talk about the finding that a cricket paralysis virus protein restricts RNA-based immunity in insects by regulating the activity and stability of the Argonaute protein. Hosts: Vincent Racaniello and Amy Rosenfeld Guest: Raul Andino Subscribe (free): iTunes, Google Podcasts, RSS, email Become a patron of TWiV! Links for this episode TWiV 138: RISCy business with Raul Andino TWiV 33: Live in Philly Viral protein restricts insect immunity (Cell Host Micr) Timestamps by Jolene. Thanks! Weekly Science Picks Amy - Insectropolis Vincent- Genome-edited baby Intro music is by Ronald Jenkees. Send your virology questions and comments to twiv@microbe.tv

This month, three researchers explain how quantum theory is being applied to their own work in this cutting-edge field of scientific discovery. Nigel Scrutton explores proton tunnelling in enzymes, Alexandra Olaya-Castro discusses her latest research in photosynthesis and Jenny Brookes explains her work on a quantum model of olfaction. Nigel Scrutton is Professor of Molecular Enzymology at the University of Manchester and Director of the Manchester Institute of Biotechnology. His research focusses on the mechanisms, structures and exploitation of enzyme catalysts and light-activated proteins. https://twitter.com/nigel_scrutton Alexandra Olaya-Castro leads a research group on the quantum mechanics of biomolecular processes in the Department of Physics and Astronomy, University College London. They explore the possible roles that quantum phenomena may play in biomolecular functions. http://www.ucl.ac.uk/~ucapaol/ Jennifer Brookes is a researcher at London Centre for Nanotechnology, UCL, and carries out computer simulations on the quantum physics at work in biological processes. https://twitter.com/jcbrookes Image credit: Khopkins2010, Ubiquitin-activating enzyme bound to the ubiquitin substrate Check out our website: http://www.rigb.org/ Twitter: https://twitter.com/Ri_Science YouTube: https://www.youtube.com/user/TheRoyalInstitution And Patreon: https://www.patreon.com/TheRoyalInstitution

The entire TWiV team visits The University of Texas in Austin to record episode #500 with guests Jinny Suh, Jason McClellan, and Jon Huibregtse. Hosts: Vincent Racaniello, Dickson Despommier, Alan Dove, Rich Condit, and Kathy Spindler Guests: Jinny Suh, Jason McClellan, and Jon Huibregtse Become a patron of TWiV! Links for this episode A big list of science podcasts Immunize Texas McClellan Lab Huibregtse Lab John Ring LaMontagne Center for Infectious Disease Video of this episode (YouTube) Weekly Science Picks Alan - The Airplane Cabin Microbiome Rich - Coalition for Epidemic Preparedness Innovations (CEPI)(wiki) Dickson - The Big Five Mass Extinctions Kathy - Virus scarves at Red Bubble phage-specific     variety Vincent - Science podcasts Listener Pick Maureen- 12 year old takes on Flint's Water Crisis Intro music is by Ronald Jenkees. Send your virology questions and comments to twiv@microbe.tv

Tauseef Butt, CEO of Progenra Inc. speaks to CHI on September 8, 2017. Dr. Butt will be presenting during Immunomodulatory Small Molecules and Targeting the Ubiquitin Proteasome System, taking place this September 27-28 at Discovery on Target in Boston, MA. Topics include the benefits and challenges of immunomodulatory small molecules, Ubiquitin Protease (USP7) Inhibitors performance in animal models, Progenra’s discovery platform and their plans for developing other immunomodulatory strategies.

Kiki Sanford examines the molecule that holds the balance between life and death

Vincent, Dickson, and Daniel discuss how a secreted protein from the protozoan parasite Theileria transforms its host cells via a cellular proto-oncogene. Hosts: Vincent Racaniello, Dickson Despommier, and Daniel Griffin Links for this episode: Leishmania (TWiP #14) Transformation by a prolyl isomerase (Nature) Theileria.org Prolyl isomerase (Wikipedia) Image from Transformation & Oncogenesis Letters read on TWiP 88 Contact Send your questions and comments (email or mp3 file) to twip@twiv.tv Subscribe Subscribe to TWiP (free) in iTunes, by the RSS feed or by email

Philipp Kahle, Functional Neurogenetics, Department of Neurodegeneration, Hertie Institute for Clinical Brain Research and German Center for Neurodegenerative Diseases, Faculty of Medicine, University of Tübingen - GERMANY speaks on "UBE2E ubiquitin-conjugating enzymes and ubiquitin isopeptidase Y regulate TDP-43 ubiquitinylation - RNA Metabolism: Changing Paradigms in Neurodegeneration”. This seminar has been recorded at Area Science Park Trieste by ICGEB Trieste

Hosts: Vincent Racaniello, Dickson Despommier, Alan Dove, Rich Condit, and Kathy Spindler The complete TWiV team reviews evidence for sensing of herpesviral DNA in the nucleus by the cell protein IFI16.  Links for this episode IFI16 is a nuclear pathogen sensor (Cell Host Micr) Nuclear IFI16 sensing of and antagonism by herpesvirus (PNAS) Acetylation regulates IFI16 location (PNAS) Letters read on TWiV 269 Weekly Science Picks Kathy - Female conveners and speakersAlan - SandgrainsRich - 2013 Lamborghini AventadorVincent - Happy Birthday Mac and 128K Mac teardownDickson - Farmdominion Listener Pick of the Week Peter - The Microscope and The Next Global KillerRichard - Glass viruses Send your virology questions and comments (email or mp3 file) to twiv@twiv.tv

Die Nemalin-Myopathie (NM) und die Einschlusskörpermyopathie mit M. Paget und frontotemporaler Demenz (IBMPFD) sind zwei hereditäre Myopathien mit pathologischen Proteinaggregaten und Gegenstand der Untersuchungen, die in dieser Arbeit behandelt werden. Ziel dieser Arbeit ist die Erweiterung des Genotyp-Phänotyp-Spektrums der NM und der IBMPFD. Die NM gehört zu den kongenitalen Myopathien mit Strukturbesonderheiten und ist deren häufigster Vertreter. Der klinische Phänotyp ist sehr variabel v. a. bzgl. der Schwere der Erkrankung. Muskelbioptisch finden sich sarkoplasmatische „nemaline rods“. Der Vererbungsmodus ist ebenfalls sehr variabel: Die Erkrankung weist sowohl einen dominanten sowie einen rezessiven Vererbungsmodus auf; in vielen Fällen finden sich aber auch de novo Mutationen. Mutationen im ACTA1-Gen sind unter anderem für die Entstehung der NM verantwortlich. Das ACTA1-Gen kodiert das skelettmuskuläre Strukturprotein α-Aktin, das den Hauptbestandteil der Aktinfilamente bildet und unerlässlich für die Muskelkontraktion ist. Bislang wurden 177 krankheitsverursachende ACTA1 Mutationen beschrieben. Die IBMPFD ist eine seltene, autosomal dominante, degenerative progrediente Erkrankung mit der Symptomtrias Einschlusskörpermyopathie, Morbus Paget und vorzeitig einsetzender frontotemporaler Demenz. Muskelbioptisch findet sich eine vakuoläre Myopathie mit VCP-, TPD-43-, Ubiquitin-positiven und tubulofilamentösen Einschlüssen. Nur 12% der Patienten weisen das volle Spektrum der Erkrankung auf, wobei die Myopathie das häufigste Symptom ist. Mutationen im VCP-Gen sind für die Entstehung dieser Erkrankung verantwortlich. Das VCP-Gen kodiert das VCP-Protein, eine AAA-ATPase, die als molekulares Chaperon beim Proteinabbau über das Ubiquitin-Proteasom-System arbeitet und an einer Vielzahl von Zellfunktionen beteiligt ist. Bislang wurden bei der IBMPFD neunzehn krankheitsverursachende VCP-Mutationen beschrieben. Im Rahmen dieser Arbeit wurden 23 klinisch ausführlich charakterisierte Patienten auf Mutationen im ACTA1-Gen untersucht. Bei einem neugeborenen Patienten mit einem schweren klinischen Phänotyp einer Nemaline-Myopathie und mit muskelbioptischem Nachweis einer Störung der myofibrillären Organisation und Nemalin-Rods wurde eine Doppelmutation E74D und H75Y im Exon 3 nachgewiesen, eine außergewöhnliche monoallelische de novo Mutation zweier benachbarter Aminosäurepositionen. Der ungewöhnliche Genotyp ist mit dem Schweregrad des klinischen Phänotyps des Patienten vereinbar. Auf Grund eines möglichen Keimbahnmosaiks wurde auch Pränataldiagnostik durchgeführt. IBMPFD-Patienten können zu Beginn der Erkrankung einen Phänotyp aufweisen, der einer Schultergürteldystrophie ähnelt. 31 klinisch gut charakterisierte Patienten mit Paresen im Bereich des Schultergürtels, fehlender Scapula alata und fazialer Schwäche wurden auf Mutationen im VCP-Gen untersucht, bei denen im Vorfeld bereits eine Fazio-Scapulo-Humerale-Muskeldystrophie (FSHD) molekulargenetisch ausgeschlossen wurde. Bei keinem dieser Patienten wurden Mutationen in der kodierenden Sequenz des VCP-Gens identifiziert, was nahelegt, dass VCP-Mutationen wahrscheinlich keine häufige Ursache einer Schultergürteldystrophie sind. Es ist im klinischen Alltag eine Herausforderung, die seltene IBMPDF zu diagnostizieren. Wichtig ist es, bei einem passenden klinischen Bild mit einer möglichen positiven Familienanamnese hinsichtlich der bekannten Symptomtrias diese seltene Erkrankung in den differentialdiagnostischen Überlegungen nicht zu vernachlässigen. Die hereditären Myopathien sind eine Gruppe höchst heterogener Erkrankungen bezüglich ihrer Ätiologie und des klinischen Bildes. Es gelingt selbst bei hervorragender Phänotypcharakterisierung nicht immer, die molekulargenetische Diagnose zu stellen. Dies liegt daran, dass die Phänotypen einiger Myopathien sich zum Teil überlappen. Darüber hinaus können Mutationen in verschiedenen Genen ähnliche Phänotypen hervorrufen, wodurch eine exakte Genotyp-Phänotyp-Korrelation erschwert wird. Es ist daher die Erweiterung der Patientenkohorten unerlässlich, wie im Rahmen dieser Arbeit geschehen, um den Phänotyp näher zu charakterisieren, neue Gene bzw. Mutationen zu identifizieren und die zugrunde liegenden Pathomechanismen im Zusammenhang mit dem Phänotyp zu analysieren. Auf diese Weise kann ein besseres Verständnis der Erkrankungen gewonnen werden, um Strategien für potenzielle kausale Behandlungsansätze und eine verbesserte Patientenversorgung zu entwickeln

Fri, 30 Nov 2012 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15182/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15182/1/Chu_Yuanyuan.pdf Chu, Yuanyuan ddc:540, ddc:500, Fakultät für Chemie und Pharmazie

Germana Meroni, CBM - Consorzio per il Centro di Biomedicina Molecolare S.c.ar.l., Trieste, ITALY speaks on "The TRIM family of ubiquitin ligases in health and disease". This seminar has been recorded by ICGEB Trieste

In February's episode Keith Matthews describes a new cattle vaccination and Kelly Jobling explains how she found ubiquitin in bacteria. We hear how stem cells could lead to new treatments for Parkinson's disease, and find out how the university has been engaging with the public.

Dr Benedikt Kessler tells us how proteomics helps find biomarkers. In most living organisms, the ubiquitin-proteasome system is responsible for the degradation of proteins, either because they're damaged or they reach the end of their life span. Ubiquitin marks a protein for elimination. Alterations in this process are responsible for many human diseases. Dr Benedikt Kessler studies the role of deubiquitylating enzymes that remove ubiquitin from substrate proteins.

Dr Benedikt Kessler tells us how proteomics helps find biomarkers. In most living organisms, the ubiquitin-proteasome system is responsible for the degradation of proteins, either because they're damaged or they reach the end of their life span. Ubiquitin marks a protein for elimination. Alterations in this process are responsible for many human diseases. Dr Benedikt Kessler studies the role of deubiquitylating enzymes that remove ubiquitin from substrate proteins.

Oxidative stress induces separation of the catalytic and regulatory portions of the yeast 26S proteasome, enabling the catalytic core to degrade toxic oxidized proteins.

Mon, 14 Dec 2009 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/11029/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/11029/1/Westendorf_Jens.pdf Westendorf, Jens ddc:570, ddc

Fri, 20 Nov 2009 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/11656/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/11656/1/Siepe_Dirk.pdf Siepe, Dirk ddc:570, ddc:500, F

Die vorliegende Arbeit untersucht die Frage, ob humanes CFTR-Protein (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) sumoyliert wird und welche funktionelle Bedeutung die Sumoylierung des CFTRs hat. In der kaukasischen Bevölkerung gilt die Cystischen Fibrose (CF) oder Mukoviszidose als eine der häufigsten Erbkrankheiten. Mutationen im CFTR-Gen, die zu einer drastischen Beeinträchtigung der Funktion des CFTR-Proteins führen, bilden die molekulare Basis der Entstehung der CF. So sind häufig die Reifung und der Transport von CFTR an die Plasmamembran betroffen. Diese Prozesse und verschiedene Aktivitätszustände im CFTR werden u.a. durch posttranslationale Modifikationen (z.B. Phosphorylierungen) spezifischer Konsensus-Motive reguliert. In diesem Zusammenhang führte eine genaue Betrachtung der Primärsequenz von CFTR zur Identifikation von zwei hoch konservierten Motiven, die dem publizierten SUMO-Konsensus-Motiv (ψKxE, nachfolgend SUMO-Motiv genannt) an Position 447 und 1486, bezogen auf das zentrale Lysin, an welchem die Sumoylierung stattfindet, entsprachen. Die Sumoylierung, als eine Form der posttranslationale Modifikationen, wird durch kleine Ubiquitin-ähnliche Proteine (small ubiquitin-like modifier, SUMO) vermittelt. Diese stellen eine Klasse von regulatorischen Proteinen dar, die die Aktivität des Zielproteins, dessen Lokalisation oder die Interaktion mit anderen Proteinen steuern. Damit ergab sich ein relevanter Anknüpfungspunkt, die Rolle der bislang für die CFTR-Regulation noch nicht beschriebenen Form der posttranslationalen Kontrolle durch Sumoylierung zu untersuchen. Als Resultat der hier beschriebenen Untersuchungen konnte die Sumoylierung als notwendiger Bestandteil der Regulation des intrazellulären Transportes von CFTR identifiziert werden. Konkret wurde mit dem Yeast-Two-Hybrid-Verfahren gezeigt, dass CFTR-Domänen an den identifizierten SUMO-Motiven in der Nukleotid-bindedomäne 1 (NBD-1) und am C-Terminus von CFTR sumoyliert werden. Im Säugerzellsystem wurde die spezifische Sumoylierung kompletten CFTRs durch transiente Transfektion von CFTR- und SUMO-Expressionskonstrukten sowie in Zellen, welche CFTR und SUMO endogen exprimieren, verifiziert. Verhindert man weiterhin auf transiente Weise in Säugerzellen die Sumoylierung, durch Mutation der beiden SUMO-Motive oder durch Überexpression der SUMO-spezifischen Protease (SENP1), erreicht CFTR nicht die apikale Plasmamembran. Im Gegensatz zu F508, welches im ER verbleibt, wird CFTR, welches Mutationen in den SUMO-Motiven trägt, im Golgi-Apparat zurückgehalten. Diese Beobachtung konnte mit Hilfe der Dichtegradientenzentrifugation und anschließendem Nachweis der Proteine in den entsprechenden Fraktionen über die Western-Blot-Methode gezeigt werden. Abschließend wurden am Beispiel eines zum SUMO-Motiv benachbart gelegenen Di-Leucin-Motives erste experimentelle Hinweise erhalten, wonach beide CFTR-Motive in der Interaktion mit dem für den vesikulären Transport funktionell wichtigem Adaptor-Protein (AP) Komplex zusammenwirken. Mit den vorliegenden Resultaten konnte erstmals die Hypothese formuliert werden, dass die hier beschriebene Sumoylierung eine Form der Modifikation ist, welche am Transport von CFTR an die Plasmamembran maßgeblich beteiligt ist.

Wed, 13 May 2009 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/10077/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/10077/1/Matic_Ivan.pdf Matic, Ivan ddc:540, ddc:500, Fakultät für Chemie und Pharmazie

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Mutationen im Parkin-Gen sind verantwortlich für eine autosomal rezessiv vererbbare Form der Parkinson-Erkrankung. Der Funktionsverlust von Parkin spielt eine zentrale Rolle bei der Pathogenese. Zu Beginn der vorliegenden Arbeit war lediglich bekannt, dass Parkin eine E3-Ubiquitin-Ligase-Aktivität besitzt und dass ein Funktionsverlust von Parkin offensichtlich zur Parkinson-Erkrankung führen kann. In der vorliegenden Doktorarbeit wurden zwei fundamentale Themenbereiche der Parkin-Forschung bearbeitet: 1. Die Analyse der Mechanismen der Inaktivierung von pathogenen Parkin-Mutanten. 2. Untersuchungen zur physiologischen Funktion von Parkin. Im ersten Teil dieser Arbeit konnten verschiedene Mechanismen der Parkin-Inaktivierung aufgeklärt werden, welche den Funktionsverlust von Parkin erklären. Pathogene C-terminale Deletionsmutationen führten zur Missfaltung und Aggregation von Parkin. Im Gegensatz zu Wildtyp-Parkin nahmen diese Mutanten spontan eine missgefaltete Konformation an und lagen in Form von zytosolischen Aggregaten vor. Pathogene Punktmutationen in der N-terminalen Ubiquitin-like (UBL)-Domäne verringerten die Stabilität von Parkin. Diese Mutanten wurden rasch über das Proteasom abgebaut. Im Rahmen dieser Untersuchungen konnte ferner gezeigt werden, dass in vivo zusätzlich zu Volllängen-Parkin eine kleinere Parkin-Spezies entsteht. Diese kleinere Parkin-Spezies ist gekennzeichnet durch das Fehlen der N-terminalen UBL-Domäne und wird aufgrund des Vorhandenseins eines internen Startcodons an Position 80 der humanen Parkin-Sequenz gebildet. Der zweite Teil der Arbeit konzentrierte sich auf die physiologische Funktion von Parkin. In Zellkultur-Modellen konnte festgestellt werden, dass Parkin nach Stressbehandlung hochreguliert wird und vor Stress-induziertem Zelltod schützt. Die Analyse von protektiven Signaltransduktionswegen konnte erstmalig zeigen, dass die Parkin-mediierte Aktivierung der NF-kappaB-Signaltransduktion essentiell ist für das neuroprotektive Potential von Parkin. Die vorliegende Arbeit lieferte Evidenz dafür, dass die E3-Ubiquitin-Ligase Parkin die NF-kappaB-Signalkaskade durch eine vermehrte regulierende Ubiquitylierung der zwei Signalmoleküle, IKK und TRAF2 aktiviert. Die in dieser Doktorarbeit dargestellten Ergebnisse ermöglichen Einblicke in die physiologische Funktion von Parkin sowie die Mechanismen, die zum Funktionsverlust von Parkin führen. Darüber hinaus können diese neuen Erkenntnisse einen Beitrag leisten zum besseren Verständnis pathogener Mechanismen der Parkinson-Erkrankung.

Zusammenfassung Die Protease Separase trägt zur Regulation mitotischer und meiotischer Vorgänge entscheidend bei. Ihre klassische Funktion ist die Induktion der Schwesterchromosomen-trennung durch Spaltung des Cohesin-Proteinkomplexes, der die Schwesterchromatiden von der S-Phase bis zur Mitose gepaart hält. Separase wird am Ende der Metaphase durch Ubiquitin-abhängigen Abbau ihres Inhibitors Securin aktiviert. Ein zweiter Separase-Inhibitionsmechanismus ist die Hemmung durch Cyclin B1/Cdk1 („Cyclin Dependent Kinase 1“). Dafür ist Separase-Phosphorylierung durch Cdk1 notwendig (Stemmann et al., 2001). In vielen Modellorganismen hat Separase Funktionen, die über die Anaphase-Induktion hinausgehen. So trägt sie in S. cerevisiae beispielsweise zur Cdk1-Inaktivierung beim Meiose I-Meiose II-Übergang bei. Diese Separase-Funktion benötigt die proteolytische Separase-Aktivität nicht, ist jedoch abhängig vom Securin-Abbau. Für andere Funktionen der Separase hingegen könnte die Separase-abhängige Spaltung noch nicht identifizierter Substrate notwendig sein. In der vorliegenden Arbeit wird deshalb die Etablierung der IVEC-Methode („In Vitro Expression Cloning“) zur Identifizierung neuer Separase-Substrate vorgestellt. Mittels IVEC wurde - basierend auf der proteolytischen Separase-Aktivität - aus einer menschlichen cDNA-Bibliothek das In-vitro-Separase-Substrat GASP isoliert. Des Weiteren wurde die Separase-Hemmung durch Cyclin B1/Cdk1 näher untersucht. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Phosphorylierung von Separase durch Cyclin B1/Cdk1 für ihre Inhibition zwar notwendig, aber nicht hinreichend ist. Nach Phosphorylierung der Separase assoziiert die Kinase stabil mit der Protease, und erst diese Komplexbildung führt letztendlich zur Inhibition der proteolytischen Separase-Aktivität. Cyclin B1/Cdk1 ist also ein nicht-katalytisch wirkender Separase-Inhibitor. Die zeitlich korrekte Separase-Aktivierung ist für die fehlerlose Chromosomentrennung essentiell. Da Zellen ohne Securin ihre Chromosomen jedoch akkurat und zum richtigen Zeitpunkt trennen, muss es alternative Separase-Inhibitionsmechanismen geben. Die Separase-Hemmung durch Cyclin B1/Cdk1-Bindung könnte dieser gesuchte Securin-unabhängige Mechanismus sein, da der Separase-Cyclin B1/Cdk1-Komplex in Zellen bereits vor der Anaphase nachgewiesen werden kann und Cyclin B1 - wie Securin - am Ende der Metaphase Ubiquitin-vermittelt abgebaut wird. Securin und Cyclin B1/Cdk1 können nicht gleichzeitig an Separase binden. Die beiden Inhibitoren sind also Komponenten parallel und nicht konvergent wirkender Regulationsmechanismen. Die Phosphorylierung von Separase an Serin 1126 ist für ihre Cyclin B1/Cdk1-abhängige Inhibition essentiell (Stemmann et al., 2001). Daneben konnte in der hier vorgestellten Arbeit eine zweite Domäne in Separase identifiziert werden, die ebenfalls sowohl für die Inhibition der proteolytischen Separase-Aktivität als auch für die Komplexbildung mit Cyclin B1/Cdk1 nötig ist. Da diese zweite Cyclin B1/Cdk1-Bindungsdeterminante Sequenzhomologie zu dem Cdc6-Protein aufweist, wurde sie CLD („Cdc6 Like Domain“) genannt. Cdc6 ist ein konserviertes Protein, das in S. cerevisiae Cdk1-Inhibitionsaktivität besitzt. Dazu bindet es abhängig von der Phosphorylierung seines Aminoterminus direkt an B-Typ-Cycline, die sich im Komplex mit ihren Cdks befinden (Mimura et al., 2004). Durch Phosphatase-behandlung und Mutationsanalyse konnte bewiesen werden, dass die Interaktion zwischen Separase und Cyclin B1/Cdk1 auch von Phosphorylierung der Protease innerhalb ihrer CLD abhängt. Dies legt nahe, dass die Separase-CLD wie der Cdc6-Aminoterminus direkte Kontakte mit der Cyclin-Untereinheit der Kinase ausbildet. Serin 1126-Phosphorylierung ist dagegen indirekt an der Kinase-Bindung beteiligt. Denn erstens wird sie nach der Etablierung des Komplexes für seinen Erhalt nicht mehr benötigt (Holland et al., 2006), und zweitens ist sie für die Wechselwirkung zwischen CLD-enthaltenden Separasefragmenten und der Kinase abkömmlich. Ein zunächst favorisiertes Bindungsmodell, bei dem die Polo-Kinase an phosphoryliertes Serin 1126 bindet, um danach die Bindung von Cyclin B1 durch Phosphorylierung der CLD zu vermitteln, konnte ausgeschlossen werden. Stattdessen bewirkt die Phosphorylierung von Serin 1126 wohl eine Konformationänderung der CLD, die dadurch in die Lage versetzt wird, starke Wechselwirkungen mit der Cyclin B1-Untereinheit der Kinase einzugehen. Überraschenderweise ist im Separase-Cyclin B1/Cdk1-Komplex auch die Kinase inaktiv. Diese unerwartete Separase-Funktion als Cdk1-Inhibitor ist in Oozyten der Maus für den Übergang von der Meiose I in die Meiose II von entscheidender Bedeutung. Denn die Inhibition der Separase-Cyclin B1/Cdk1-Komplexbildung durch Mikroinjektion entsprechender Antikörper in Maus-Oozyten verhindert den Ausstoß des ersten Polkörpers, d.h., die Eizellen können den Meiose I-Meiose II-Übergang nicht vollziehen. In diesen Oozyten sinkt die Cdk1-Aktivität am Ende der Meiose I nicht wie bei Kontroll-Oozyten ab. Diese persistente Cdk1-Aktivität ist der Grund für den verhinderten Übergang von Meiose I nach -II, da künstliche Cdk1-Inhibition in Anwesenheit des inhibitorischen Antikörpers den Polkörperausstoß wiederherstellt. In mitotischen Zellen steigt der unter endogenen Bedingungen mit Separase assoziierte Anteil von Cyclin B1/Cdk1 in der Anaphase - d.h. nach dem Abbau seines Bindungskompetitors Securin - an. Übertragen auf die Meiose bedeutet das, dass Securin-Abbau die Induktion der Anaphase mit der Separase-abhängigen Cdk1-Inaktivierung koppelt.

Abläufe in der Zelle eines multizellulären Organismus im Rahmen des Zellzyklus oder beim Vorgang der Differenzierung unterliegen strengen Kontrollmechanismen. Ein prominentes Regulationsprotein dieser Mechanismen ist der Retinoblastoma Tumorsuppressor (pRB). Im Zellzyklus liegt die Hauptfunktion pRBs in der Kontrolle des Übergangs von der G1- in die S-Phase. In der aktiven, nichtphosphorylierten Form reprimiert pRB die Expression von S-Phase Genen durch Inaktivierung des Transkriptionsfaktors E2F. Cyclin-abhängige Kinasen überführen pRB in eine mehrfach phosphorylierte, inaktive Form, wodurch die S-Phase eingeleitet wird. Im Gegensatz dazu übt pRB bei Differenzierungsvorgängen aber auch koaktivierende Funktionen aus und wird im Rahmen dieser Prozesse acetyliert. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass pRB nicht nur phosphoryliert und acetyliert wird, sondern darüber hinaus durch den small ubiquitin-like modifier (SUMO) modifiziert wird. Aktives pRB stellt das bevorzugte Substrat dieser Modifikation dar. Das Akzeptorlysin 720 ist konserviert und liegt in einer für die pRB-Funktion entscheidenden Domäne, der sogenannten pocket B Region. Zusammen mit der pocket A Region bildet sie die pocket Domäne, deren strukturelle Integrität sowohl für die Tumorsuppressorfunktion pRBs als auch für die Modifikation durch SUMO essenziell ist. An die pocket B Region binden neben zellulären Regulationsproteinen des Zellzyklus und der Differenzierung auch virale Onkoproteine, die pRB inaktivieren und dadurch für die Transformation einer Zelle verantwortlich sind. Diese viralen Onkoproteine und bestimmte zelluläre Proteine inhibieren die SUMO-Modifikation pRBs. Umgekehrt steigt die SUMOylierung von pRB an, wenn mutierte pRB-Versionen eingesetzt werden, die keine viralen oder zellulären Proteine mehr über die pocket B Region binden können. Eine Version von pRB, bei der das Lysin 720 zu Arginin ausgetauscht wurde und die somit nicht mehr SUMOyliert werden kann, besitzt ein stärkeres Repressionspotenzial auf die E2F-abhängige Genexpression, wie Reportergenversuche zeigten. Die SUMOylierung vermindert also pRBs Potenzial zur E2F-Reprimierung. Möglicherweise wird durch die SUMO-Modifikation von pRB die Zusammensetzung der Bindungspartner an der wichtigen pocket B Region moduliert.

Die evolutionär stark konservierte AAA-ATPase Cdc48 aus Hefe (p97 in Säugern) ist an einer Vielzahl zellulärer Prozesse beteiligt, unter anderem an homotypischer Membranfusion und Ubiquitin-vermitteltem Proteinabbau. Verschiedene Adaptoren rekrutieren das hexamere Cdc48 an diverse, meist ubiquitinierte Substrate, die unter ATP-Verbrauch aus Proteinkomplexen oder Membranstrukturen herausgezogen werden. Als bekannte Adaptoren wirken das Heterodimer Ufd1-Npl4 und Shp1, deren Bindung an Cdc48 sich wechselseitig ausschließt. Shp1 gehört zur Familie der UBX (“Ubiquitin regulatory X”)-Domänen-Proteine, deren Vertreter bislang weitgehend uncharakterisiert sind. Ziel dieser Arbeit war es, sowohl allgemeine Eigenschaften als auch spezifische zelluläre Funktionen von UBX-Domänen-Proteinen aufzuklären. Für alle sieben UBX-Proteine aus Saccharomyces cerevisiae (Shp1 und Ubx2 bis Ubx7) konnte eine Interaktion mit Cdc48 nachgewiesen werden. Dabei wurde die UBX-Domäne als allgemeines Cdc48-Bindemodul identifiziert. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass UBX-Proteine, die eine “Ubiquitin-associated” (UBA)-Domäne enthalten, mit ubiquitinierten Proteinen interagieren. Für die UBA/UBX-Proteine Shp1 und Ubx2 wurde außerdem ein Einfluss auf die Degradation eines Modellsubstrats des Ubiquitin/Proteasom-Systems festgestellt. Darüber hinaus wurde Ubx2 als neue Komponente des ER-assoziierten Proteinabbauweges (ERAD) identifiziert, über den falsch gefaltete Proteine des Endoplasmatischen Retikulums (ER) abgebaut werden. Bevor ERAD-Substrate ubiquitiniert und durch das Proteasom degradiert werden können, müssen sie aus dem ER ins Zytosol retrotransloziert werden. An diesem Prozess ist der Cdc48-Ufd1-Npl4 Komplex entscheidend beteiligt. Das integrale ER-Membranprotein Ubx2 kann gleichzeitig mit Ufd1-Npl4 an Cdc48 binden und rekrutiert Cdc48-Ufd1-Npl4 an ERAD-Substrate und Komponenten der ERAD-Maschinerie, so dass verschiedene für ERAD benötigte Aktivitäten stabil miteinander verbunden werden. Ubx2 wirkt somit als Koadaptor für Cdc48-Ufd1-Npl4 in ERAD und unterstreicht damit die Bedeutung der UBX-Proteine als neue Familie von Kofaktoren im Cdc48-System.

Neurodegenerative Polyglutamin (polyQ)-Erkrankungen sind durch neuronalen Zellverlust und die Bildung von intrazellulären Proteinablagerungen (Aggregaten) charakterisiert, deren Rolle nicht exakt geklärt ist. Es wird jedoch davon ausgegangen, daß sie die Pathogenese reflektieren und untrennbar mit dem Erkrankungsprozeß verbunden sind. In dieser Arbeit wurde das polyQ-Protein Ataxin-3 (AT3) untersucht, welches, wenn es einen verlängerten polyQ-Bereich besitzt, die Spinozerebellare Ataxie 3 (SCA3) hervorruft. Mit Hilfe von AT3-Deletionsmutanten wurde gezeigt, daß die Entfernung des N-Terminus von polyQ-verlängertem AT3 zu dessen Aggregation in vitro, in Hefe und in Neuroblastomazellen führt. Entsprechend löst die proteolytische Spaltung von pathologischem Volllängen-AT3 die SDS-resistente Aggregation in vivo aus. Hinweise auf die Calcium-abhängigen Calpaine als AT3-schneidende Proteasen wurden in vitro mit Säugetierzell-Lysaten erhalten. Gereinigtes Calpain II generiert mehrere AT3-Fragmente in vitro, einschließlich C-terminaler Fragmente, die den polyQ-Bereich enthalten. In Zellkultur resultiert die Aktivierung von Calpainen in einer verstärkten AT3-Proteolyse, während eine Inhibition von endogenem Calpain durch Calpeptin oder Calpastatin zu einer verringerten AT3-Spaltung und reduzierter Aggregation in Säugerzellen führt. Zusammenfassend unterstützen diese Daten die "toxic fragment"-Hypothese, die als Voraussetzung für Pathogenese und Aggregation von polyQ-Proteinen deren proteolytische Spaltung postuliert. Toxizität der polyQ-Proteine soll unter anderem aus der Rekrutierung von anderen zellulären Proteinen wie Transkriptionsfaktoren, Chaperonen, Ubiquitin und Proteasomen in die polyQ-Aggregate resultieren. Obwohl Wildtyp-AT3 nicht selbständig aggregiert, koaggregiert es mit polyQ-verlängertem AT3-Fragment, was mit einer verringerten AT3-Konzentation in der Zelle korreliert. Einer Konformationsänderung des Wildtyp-AT3, induziert von pathologischem polyQ, folgt in vitro eine Rekrutierung in frühe Aggregationsintermediate und letztendlich die Integration in stabile Koaggregate. Weitere Experimente zeigten, daß die Expression der molekularen Chaperone (Hitzeschockproteine) Hsp70 und Hsp40 zusammen mit polyQ-verlängertem AT3-Fragment die Aggregation vermindert und den proteasomalen AT3-Abbau in vivo verstärkt. Das Chaperon p97 (VCP) zeigt eine konzentrationsabhängige Modulation der Aggregation in vitro. Schließlich konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, daß eine Veränderung der zellulären Lokalisation durch Fusion von AT3-Konstrukten mit Kernlokalisations- und Kernexportsignalen keinen Einfluß auf die Aggregationsfähigkeit in Neuroblastomazellen hat. Das putative endogene Kernlokalisationssignal von AT3 mit der Sequenz RKRR (282-285) wurde nicht verifiziert.

Eine akkurate DNA-Replikation ist notwendig, um die Stabilität der genetischen Information zu gewährleisten. Dieser Prozess wird durch DNA-Läsionen erschwert, die durch eine Vielzahl von Ursachen entstehen und häufig nicht vor dem Erreichen der S-Phase repariert werden können. Nicht nur kann durch Läsionen geschädigte DNA häufig nicht dupliziert werden, angehaltene Replikationsgabeln können auch zusammenbrechen und so zu DNA-Strangbrüchen führen. Die Funktion des RAD6-pathways liegt darin, die Umgehung (Bypass) von DNA-Läsionen während der Replikation zu ermöglichen, wodurch eine Toleranz gegenüber Schädigungen der DNA erreicht wird. In dieser Arbeit wurde die Regulation des RAD6-vermittelten Bypass von DNA-Läsionen durch posttranslationale Ubiquitin- und SUMO-Modifikationen des Replikationsfaktors PCNA untersucht. PCNA bildet einen trimeren Ring um die DNA und verstärkt durch Bindung der replikativen Polymerase deren Assoziation zur DNA und somit die Prozessivität der Replikation. Als DNA gebundener Faktor des Replikations-komplexes ohne katalytische Aktivität ist PCNA ideal geeignet, um durch seine Modifikation Replikations-assoziierte Prozesse zu regulieren. Die Ubiquitinierung von PCNA durch Enzyme des RAD6-pathways erfolgt als spezifische Antwort auf DNA-Läsionen während der Replikation und ermöglicht deren Bypass. Dabei bewirken unterschiedliche Ubiquitin-Modifikationen verschiedene Arten des Bypass. Die Mono-Ubiquitin-Modifikation führt zum Einsatz von speziellen Transläsions-Polymerasen, die eine größere Toleranz für geschädigte DNA haben, aber auch für die Entstehung von Mutationen verantwortlich sind. Einen mechanistisch anderen Bypass von DNA-Schäden bewirkt die Modifikation von PCNA mit einer Lysin K63-verknüpften Multi-Ubiquitinkette. Für diesen wird wahrscheinlich der neureplizierte, unbeschädigte Schwester-Strang als Vorlage benutzt. Unabhängig von Schädigungen der DNA wird PCNA während der S-Phase zusätzlich mit dem ubiquitin-ähnlichen Protein SUMO modifiziert. Dies führt zu einer Interaktion mit der Helikase Srs2, die als Antagonist zu dem zentralen Rekombinationsprotein Rad51 wirkt. Dadurch wird spezfisch die homologe Rekombination zwischen Schwesterchromatiden an der Rekombinationsgabel inhibiert, nicht jedoch andere Rekombinationsereignisse, wie. z.B. Rekom-bination zwischen homologen Chromosomen. Deshalb ist es wahrscheinlich, dass spezifisch die Replikationsgabel durch PCNA-SUMO-Srs2 geschützt wird, um schädliche Rekombination oder Rekombinationsstrukturen zu vermeiden, die mit Replikations-assoziierten Prozessen interferieren. Ubiquitin- und SUMO-Modifikation regulieren demnach unabhängige Prozesse. Interessanterweise haben diese aber eine verwandte Funktion im Bypass von DNA-Läsionen während der Replikation. Die Inhibition der Schwesterchromatid-Rekombination durch PCNA-SUMO-Srs2 lenkt den Bypass von DNA-Läsionen in einen durch PCNA-Ubiquitinierung gesteuerten Mechanismus.

BRUCE (BIR repeat-containing ubiquitin-conjugating enzyme) ist ein konserviertes, 528 kDa großes, peripheres Membranprotein des trans-Golgi-Netzwerks und ein strukturell neuartiges Ubiquitin-Konjugationsenzym (UBC) der Maus. Zusätzlich zu der am C-Terminus befindlichen UBC-Domäne enthält BRUCE im N-terminalen Bereich ein BIR (baculovirus inhibitor of apoptosis repeat)-Motiv, die charakteristische Domäne aller BIRPs (BIR-domain containing proteins). Die meisten dieser Proteine haben anti-apoptotische Eigenschaften und werden deshalb in der IAP (inhibitor of apoptosis proteins)-Familie zusammengefasst. Auch BRUCE konnte in vitro als Inhibitor apoptotischer Prozesse beschrieben werden. Um die Funktion von BRUCE in vivo zu untersuchen, wurde eine BRUCE-defiziente Mauslinie etabliert und im Rahmen dieser Arbeit phänotypisch charakterisiert. Die vollständige Inaktivierung des BRUCE-Gens führte zu einer Verzögerung des embryonalen Wachstums sowie zum perinatalen Tod der Knockout-Organismen. BRUCE wird in fast allen embryonalen Geweben exprimiert, deutlich sichtbare morphologische Veränderungen in Folge seiner Deletion traten jedoch hauptsächlich im extra-embryonalen Gewebe der Plazenta auf. Nach störungs-freier Initiierung der Organogenese zeigte sich mit zunehmender Reifung der Plazenta eine Verzögerung der Ausbildung des Labyrinthsystems sowie eine deutliche Reduktion der Spongiotrophoblast-Schicht. Dieses Entwicklungsdefizit kann Ursache einer stark eingeschränkten Effizienz der Nähr- und Sauerstoffversorgung des Embryos sein und sowohl zu Wachstumsretardierung als auch zu perinataler Letalität der transgenen Organismen führen. Die morphologischen Veränderungen im Gewebe wurden nicht, wie ursprünglich angenommen, durch eine erhöhte Apoptoserate der Zellen hervorgerufen. Stattdessen konnten in den defekten plazentalen Geweben drastische Veränderungen in Proliferationsverhalten und Differenzierungsstatus der Trophoblast-Zellen beobachtet werden. Die in dieser Arbeit beschriebenen Auswirkungen des BRUCE-Verlusts auf den Modellorganismus zeigen einerseits die essentielle Bedeutung von BRUCE für die Entwicklung sowie den funktionellen Erhalt der Plazenta und damit für die gesamte Embryonalentwicklung der Maus. Andererseits geben die Ergebnisse Hinweise darauf, dass dieses ungewöhnliche Enzym möglicherweise eine überlebensnotwendige regulative Funktion der Inhibition Apoptose-induzierter oder nicht-apoptotischer Caspase-Aktivität bei Proliferations- und/oder Differenzierungs-ereignissen bestimmter Zelltypen besitzt.

In eukaryontischen Zellen wird eine Vielzahl von Proteinen nach einer Modifikation mit Ubiquitin durch spezielle Substrat-Rezeptoren zum 26S Proteasom transportiert. Die AAA-ATPase CDC48, deren Kofaktoren und andere Ubiquitin-bindende Faktoren scheinen in diesen Prozess involviert zu sein. Die genaue Funktion von CDC48 und das Zusammenspiel der Faktoren in Degradationsprozessen sind jedoch nur unzureichend aufgeklärt. In dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass die Faktoren der Substrat- Rekrutierung, der Multiubiquitylierung und der Substratweitergabe zum Proteasom physikalisch interagieren und ein Netzwerk bilden, welches Substrate gezielt zum Proteasom leitet. CDC48 spielt in diesem Abbauweg eine zentrale Rolle, da es mit Hilfe der Kofaktoren UFD1/NPL4 in der Erkennung und Übertragung des Substrats auf das E4-Enzym UFD2 wirkt. Weiterhin wird durch CDC48 eine Termination der Ubiquitylierung erreicht, die einer exzessiven Bildung nicht-linearer Ubiquitinketten entgegenwirkt und so den Degradationsprozess optimiert. Die Multiubiquitylierung durch UFD2 ist über die Rezeptorproteine RAD23 und DSK2 mit dem Proteasom gekoppelt. Die Weiterleitung des Substrats zum Proteasom erfolgt in einem konzertierten Mechanismus, der über ternäre Komplexe aus RAD23, UFD2 und CDC48 bzw. durch Assoziation der beteiligten Ubiquitin-bindenden Faktoren am Proteasom erfolgt. Das in Gegenwart von CDC48 durch UFD2 ubiquitylierte Substrat kann über die UBA-Domänen der Rezeptoren RAD23 und DSK2 spezifisch gebunden und zum Proteasom übertragen werden. In vivo kontrolliert der dargestellte Abbauweg die Inaktivierung des Transkriptionsfaktors SPT23, welcher massgeblich über diesen UFD2-abhängigen Abbauweg degradiert wird. Zudem scheint SPT23 über einen parallelen Degradationsweg mittels des Proteins RPN10 abgebaut zu werden. Die Proteolyse von missgefalteten Proteinen des Endoplasmatischen Retikulums (ERAD) erfolgt ebenfalls über den hier dargestellten Abbauweg.

Der Großteil der in eukaryontischen Zellen ablaufenden chemischen Reaktionen finden in Zellkompartimenten statt, die durch Membranen eingeschlossen werden. SNARE-Proteine sind essentielle Komponenten für die Fusion von gleichartigen (homotypischen) als auch verschiedenartigen (heterotypischen) Membranen. SNAREs sind meist über eine C-terminale Transmembran-Domäne in der „Geber“-Membran verankert. N-terminale 60-70 Aminosäuren lange Hepta-Peptide (SNARE-Motiv) können über Coiled-Coil Formierung den Kontakt mit einem SNARE an der „Empfänger“-Membran herstellen (trans-SNARE Komplex). In der vorliegenden Arbeit wurden die Plasmamembran SNAREs SNC1 und SNC2 in Saccharomyces cerevisiae auf posttranslationale Modifikation durch Ubiquitin untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass die Ubiquitylierung an mindestens zwei Lysinen im Substrat erfolgt. Die kovalente Verknüpfung erfolgt durch die Ubiquitin-Ligase RSP5. In Mutanten, die die Sekretion von SNC1/SNC2 zur Plasmamembran inhibieren (sec17-1, sec18-1, sed5-1 und sec1-1), liegen die SNAREs in nicht-modifizierter Form vor. In den Endozytose-Mutanten end3 und end4, die für die Invagination von endozytotischen Vesikeln defekt sind, akkumuliert ubiquityliertes SNC1 an der Plasmamembran. Die Ubiquitylierungs-Reaktion muß daher an der Plasmamembran erfolgen. Eine der Ubiquitylierungsstellen, Lysin-63, befindet sich in der Coiled-Coil-Domäne der SNAREs. Der Austausch des Lysins durch ein Arginin an dieser Stelle führt dazu, dass SNC1 nicht mehr in das Lumen der Vakuole lokalisiert wird. Stattdessen verbleibt das Protein in der Membran der Vakuole. Die zweite Ubiquitylierungsstelle konnte noch nicht identifiziert werden. Das Ubiquitin Bindeprotein DDI1 interagiert mit SNC1/SNC2, und beeinflußt die Verfügbarkeit des SNAREs für den trans-SNARE Komplex. Ob DDI1 über die interne UBA (ubiquitin-associated)-Domäne mit ubiquityliertem SNC1/SNC2 interagiert, ist noch unbekannt.

Two projects are described within the scope of this thesis. The first project characterizes the ubiquitin-specific protease UBP41 as a protein which upon overexpression causes apoptosis induction in several mammalian cancer cell lines. The second project investigates a possible involvement of the lysosomal cysteine proteases cathepsin-L and cathepsin-B in apoptosis pathways induced by distinct death stimuli, in particular by the tumor necrosis factor a (TNF-a). Therefore, both projects examine a possible regulation of apoptosis induction by proteases that are part of one of the two major systems of protein degradation. UBP41 as a protease with deubiquitylating activity is expected to play a role in the ubiquitin/proteasome system which is the major proteolytic apparatus for the degradation of cytosolic proteins. Cathepsins, on the other hand, are lysosomal proteases that participate in the breakdown of membrane-associated proteins and of extracellular proteins that are taken up by endocytosis. Both, the ubiquitin/proteasome system as well as lysosomal proteases have been previously implicated in the regulation and mediation of apoptosis, and it therefore appeared particularly attractive to further study the effect of UBP41 and cathepsins on cell death signalling in more detail.

Das Protein Ubiquitin kann posttranslational an Proteine geknüpft werden. Dieser Vorgang ist für den Abbau von Proteinen durch das Proteasom notwendig.Neben dieser Funktion hat die Modifikation mit Ubiquitin noch weitere Funktionen,die nicht zum Abbau des Proteins führen.Ubiquitin- ähnlichen Proteine,wie beispielsweise SUMO,sind ebenfalls nicht direkt am Proteinabbau beteiligt.Die Konsequenz der Modifikation,und das Zusammenspiel Ubiquitin-ähnlicher-Systeme mit dem Ubiquitin-System sind bisher allerdings wenig verstanden. PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen)ist eine zentrale Komponente der DNA-Replikation und DNA-Reparatur.Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden,daß PCNA über drei verschiedene posttranslationale Modifikationen reguliert wird.In der S-Phase des Zellzyklus wird PCNA durch SUMO modifiziert.Nach DNA-Schädigung wird PCNA dagegen durch Komponenten des RAD6 -DNA-Reparaturwegs mono-oder multiubiquitiniert. Alle drei Modifikationen finden am gleichen,zwischen eukaryontischen Spezies kon servierten Lysin statt.Der RAD6 -DNA-Reparaturweg reguliert postreplikative DNA-Reparatur.Eine Schlüsselstellung innerhalb dieses Reparaturwegs nehmen zwei Ubiquitin-konjugierende Enzyme,RAD6 sowie das Heterodimer UBC13/MMS2,die über die RING-Finger Prote ine RAD18 bzw.RAD5 an das Chromatin rekrutiert werden,ein.Interessanterweise interagiert neben PCNA auch das SUMO-konjugierende Enzym UBC9 mit den beiden RING-Finger Proteinen sowie mit PCNA selbst und ist so ebenfalls mit dem RAD6 -Reparaturweg assoziiert.Nach DNA-Schädigung wird PCNA von RAD6/RAD18 monoubiquitiniert.Alternativ kann PCNA durch das hierfür zusätzlich notwendige Heterodimer UBC13/MMS2 und das RING-Finger- Protein RAD5 mit speziellen,Lysin-63-verknüpften Ubiquitinketten, multiubiquitiniert werden.PCNA-Ubiquitinierung ist essentiell für DNA- Reparatur,da eine PCNA-Mutante,die nicht mehr modifiziert wird,starke Sensitivität gegenüber DNA-Schädigung besitzt. Es konnte gezeigt werden,daß die verschiedenen Modifikationen unterschiedlich auf die Funktionen von PCNA einwirken können. SUMOylierung von PCNA wirkt inhibierend auf RAD6 -abhängige DNA- Reparatur.PCNA-Multiubiquitinierung durch Lysin-63-verknüpfte Ubiquitinketten aktiviert PCNA in dem UBC13/MMS2/RAD5-abhängigen Zweig RAD6 -abhängiger DN A -Reparatur,der fehlerfrei arbeitet.PCNA- Monoubiquitinierung scheint dagegen den fehlerhaften Zweig RAD6 - abhängiger DNA-Reparatur zu aktivieren.ˇ