Podcasts about pho4

The PHO5 and PHO8 genes in yeast provide typical examples for the role of chromatin in promoter regulation. Both genes are regulated by the same transcriptional activator, Pho4, which initiates nucleosome remodeling and transcriptional activation. In spite of this co-regulation, there are important differences in gene activity and in the way promoter chromatin undergoes chromatin remodeling. First, PHO5 belongs to one of the most strongly induced genes in yeast being 10-fold more active than the PHO8 gene (Oshima, 1997; Barbaric et al., 1992). Second, chromatin remodeling at the PHO5 promoter affects four nucleosomes (Almer et al., 1986), whereas only two nucleosomes are afffected at the PHO8 promoter (Barbaric et al., 1992). Third, neither the histone acetyl transferase Gcn5 nor chromatin remodeling complex Swi/Snf seem to be critically required for chromatin remodeling at the PHO5 promoter (Barbaric et al., 2001; Reinke and Hörz, 2003; Dhasarathy and Kladde, 2005; Neef and Kladde, 2003). At the PHO8 promoter, on the other hand, absence of Swi/Snf results in the complete loss of chromatin remodeling under inducing conditions. Furthermore, Gcn5 is required for full remodeling and transcriptional activation at this promoter (Gregory et al., 1999). Ever since these differences were recognized there have been speculations about the underlying reasons. This work shows that these discrepancies are not a direct consequence of the position or strength of the UASp elements driving the activation of transcription. Instead, these differences result from different stabilities of the two promoter chromatin structures. The basis for these results was the development of a competitive yeast in vitro assembly technique in which differences in nucleosome stability between promoter regions could be directly compared. This technique originated from a yeast in vitro chromatin assembly system that generated the characteristic PHO5 promoter chromatin structre (Korber and Hörz, 2004). As shown here, this system also assembles the native PHO8 promoter nucleosome pattern. Using the competitive assembly system it was shown that the PHO8 promoter has greater nucleosome positioning power, and that the properly positioned nucleosomes are more stable than at the PHO5 promoter. This provided for the first time evidence for the correlation of inherently more stable chromatin with stricter co-factor requirements. Remarkably, the positioning information for the in vitro assembly of the native PHO5 and PHO8 promoter chromatin patterns was specific to the yeast extract. Salt gradient dialysis or Drosophila embryo extract assemblies did not support the proper nucleosome positioning. However, nucleosomes in chromatin generated in these systems could be shifted to their in vivo-like positions by the addition of yeast extract. This indicates that the nucleosome positioning mechanisms in vitro are uncoupled from the nucleosome loading machinery. The nucleosome positioning at the PHO5 and PHO8 promoters was energy dependent suggesting a role of chromatin remodeling machines in generation of the repressed promoter chromatin structure. In spite of this, the chromatin remodeling machines Swi/Snf, Isw1, Isw2 and Chd1 were dispensable nucleosome positioning at both promoters.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Fragen zur Wechselbeziehung von Struktur und Funktion von Transkriptionsaktivatoren am PHO5-Promotor in Saccharomyces cerevisiae bearbeitet. Im ersten Teil der Arbeit wurden zwei Deletionsmutanten des Transkriptionsfaktors Pho4 hergestellt und charakterisiert. Dazu wurden aus der PHO4-Sequenz mit Hilfe einer PCR-gestützten Methode jeweils die für die Aminosäuren 97 bis 106 sowie 101 bis 110 kodierenden Sequenzen entfernt. Mit Hilfe von geeigneten Expressionsvektoren wurden beide Deletionsmutanten in S. cerevisiae exprimiert. Das Ausmaß der Transkriptionsaktivierung durch die Konstrukte wurde durch Messung der Aktivität der saueren Phosphatase bestimmt. Beide Mutanten bewirkten eine deutliche Aktivierung der Transkription am PHO5-Promotor. Daraus kann geschlossen werden, dass die hier deletierten Abschnitte von PHO4 keinen wesentlichen Anteil an der Transkriptionsaktivierung durch Pho4 haben. Zwischenzeitlich wurde der Nachweis einer minimalen transkriptionsaktivierenden Domäne von Pho4 publiziert. Die minimale transaktivierende Domäne besteht aus den Aminosäuren 79 bis 99. Dieser Abschnitt ist notwendig und ausreichend für die Öffnung der Chromatinstruktur des Promotors und die Aktivierung der Transkription. Die hier beschriebene Herstellung und Charakterisierung der Deletionsmutanten von PHO4 leistete einen wesentlichen Beitrag zur Eingrenzung der transaktivierenden Domäne von Pho4. Der zweite Teil der Arbeit befasste sich mit der Wirkung des als GAGA-Faktor (GAF) bezeichneten Transkriptionsfaktors aus Drosophila melanogaster am PHO5-Promotor von S. cerevisiae. Dazu wurden chimäre Konstrukte aus dem GAF und der DNA-bindende Domäne des Transkriptionsaktivators Pho4 hergestellt. Zudem wurden auch Fusionskonstrukte mit jeweils nur einer Hälfte des GAF und der DNA-bindende Domäne des Pho4 erzeugt. Diese Konstrukte wurden in S. cerevisiae exprimiert. Hier zeigte sich, dass die Verbindung aus dem gesamten GAF und der DNA-bindenden Domäne von Pho4, vermutlich aufgrund eines gestörten intrazellulären Transports oder aufgrund einer Instabilität des Proteins, keine Aktivität aufwies. Dagegen waren die Konstrukte, welche jeweils nur eine Hälfte des GAF enthielten, in der Lage, eine Öffnung der Chromatinstruktur und eine Aktivierung der Transkription am PHO5-Promotor zu bewirken.Um zu untersuchen, welche Veränderungen die chimären Konstrukte durch ihr Angreifen am PHO5-Promotor an der Chromatinstruktur des Promotors verursachen, wurden spezielle experimentelle Verfahren angewendet. Diese nutzen die unterschiedliche Zugänglichkeit der DNA für Enzyme bei geöffneter oder geschlossener Chromatinstruktur. Die Untersuchungen zeigten eine gleichartige Öffnung der Chromatinstruktur am PHO5-Promotor durch beide Konstrukte. Die gleichartige Öffnung der Chromatinstruktur korrelierte dabei nicht mit dem unterschiedlichen Umfang der Transkriptionsaktivierung von PHO5. Aufgrund der fehlenden Korrelation von Chromatinöffnung und Transkriptionsaktivierung stehen diese Ergebnisse im deutlichen Widerspruch zu der von vielen Autoren vertretenen Hypothese, der GAF würde die Transkription indirekt, nur durch die Öffnung repressiver Chromatinstrukturen aktivieren (Derepression). Vielmehr weisen diese Ergebnisse darauf hin, das der GAF auch als klassischer Transaktivator eine direkte Aktivierung der Transkription bewirken kann. Die Aktivierung der Transkription durch beide Hälften des GAF in den chimären Konstrukten war ein überraschendes Ergebnis. Es zeigt, dass GAF neben der glutaminreichen Domäne eine weitere Domäne enthält, die in vivo eine Aktivierung der Transkription bewirken kann. Diese Erkenntnis ist grundsätzlich neu und in der Literatur bisher nicht beschrieben worden.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Wechselwirkung zwischen Transkriptionsfaktoren und Elementen der Chromatinstruktur bei der Regulation zweier Promotoren des Phosphatase-systems der Hefe Saccharomyces cerevisiae untersucht. Als Modellsystem wurden die Promotoren der Gene PHO5 und PHO8 gewählt, die für eine saure bzw. eine alkalische Phosphatase kodieren und durch Phosphatmangel induziert werden. Während der Induktion findet eine charakteristische Chromatin-Umordnung am Promotor statt, die sich bei PHO5 über einen Bereich von vier Nukleosomen ausdehnt, bei PHO8 jedoch signifikant geringer ist. Für die transkriptionelle Aktivierung sind insbesondere zwei Transkriptionsfaktoren nötig: das bHLH-Protein Pho4 und das Homöodomänenprotein Pho2. Der PHO5-Promotor besitzt zwei Pho4-Bindestellen, die den regulatorischen Elementen UASp1 und UASp2 entsprechen. Während UASp1 in einem hypersensitiven Bereich zwischen den Nukleosomen liegt, ist UASp2 intranukleosomal lokalisiert. Mutagenese einer der beiden Bindestellen führte zu einer zehnfachen Abnahme der Promotoraktivität, während Mutagenese beider Stellen die Induzierbarkeit des Promotors völlig aufhob. Um die Bedeutung der Lokalisation der UAS-Elemente im Chromatin zu analysieren, wurde ein Operator für den a2-Repressorkomplex oberhalb des PHO5-Promotors eingebaut. Dieser Repressorkomplex bildet im Kontext bestimmter Promotoren eine zum a2-Operator benachbarte repressive Chromatinstruktur mit basenpaargenauer Nukleosomenposition aus. Im PHO5-Promotor führte der Einbau dieses Operators zur Repression der Promotoraktivität und einer leicht verminderten Chromatinzugänglichkeit. Demnach kann der a2-Operator transkriptionshemmende Strukturen initiieren, wobei die Repression durch verstärkte Chromatinkondenation und möglicherweise durch die Rekrutierung von reprimierenden Mediatorproteinen des RNA-PolymeraseII-Holoenzyms vermittelt wird. Durch Deletionen von Bereichen zwischen dem a2-Operator und den UAS-Elementen konnten Nukleosomen wie das Nukleosom -2 zwar stabilisiert, aber nicht gezielt verschoben werden. Rekonstitutionsexperimente mit einem 180 Bp-DNA-Fragment, das den Bereich des Nukleosoms -2 enthielt, zeigten zwar einen gewissen Beitrag der Sequenz zur Histon-DNA-Bindung, dieser allein kann jedoch keinesfalls die Positionierung erklären, vielmehr scheinen Wechselwirkungen der Histone mit anderen Chromatinkomponenten entscheidenden Anteil zu haben. Zusammenfassung E -144-Der Mechanismus der Chromatin-Umordnung am PHO5-Promotor durch die Transkriptions-faktoren Pho4 und Pho2 wurde zunächst durch in vitro Experimente unter Verwendung von rekombinantem Pho2-Protein analysiert. Es konnten mehrere Pho2-Bindestellen verschie-dener Affinität im PHO5-Promotor gefunden werden. Eine der hochaffinen Pho2-Binde-stellen überlappt größtenteils mit der Pho4-Bindestelle UASp1. Die kooperative DNA-Bindung der beiden Proteine an ihre überlappenden Bindestellen resultierte in einem hochaffinen ternären Komplex. Auch am UASp2-Element, bei dem zwei Pho2-Bindestellen eine Pho4-Bindestelle flankieren, findet eine kooperative Bindung von Pho2 und Pho4 an die DNA statt. Durch Mutation der mittels in vitro-Footprints entdeckten Pho2-Bindestellen konnte gezeigt werden, daß diese zur Promotoraktivität beitragen. Sie sind nicht nur wichtig, um Pho2 an den Promotor zu rekrutieren, sondern ermöglichen auch die kooperative DNA-Bindung mit Pho4 über direkte Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen Pho2 und Pho4. Eine Pho2-Interaktionsdomäne von Pho4 ist essentiell für die Aktivierung des PHO5-Promotors, wie durch Deletionsanalyse demonstriert wurde. Die kooperative DNA-Bindung dieser Faktoren scheint demnach sehr wichtig für die Transkriptionsregulation des PHO5-Gens zu sein. Getrennte Untersuchungen von UASp1 und UASp2 in einem CYC1-Promotor-Kontext zeigen einen eindrucksvollen Unterschied zwischen den zwei UAS-Elementen und verdeutlichen die duale Rolle von Pho2 in der Aktivierung des PHO5-Promotors. Es ist in entscheidender Weise für die Rekrutierung von Pho4 zur UASp1-Stelle nötig und verstärkt darüber hinaus das Pho4-Aktivierungspotential, während es an der UASp2-Stelle eher nur das Pho4-Aktivierungspotential erhöht. Trotz der koordinierten Regulation beider Promotoren ist der PHO8- fast 10mal schwächer als der PHO5-Promotor. Von den beiden Pho4-Bindestellen am PHO8-Promotor, welche früher in vitro bestimmt worden waren, ist nur eine in vivo funktional. Der Austausch des inaktiven PHO8-UASp1-Elements durch das UASp1-Element des PHO5-Promotors erhöht das Ausmaß der Chromatinöffnung im Bereich der Nukleosomen -3 und -2 und ergibt einen zweifachen Anstieg der Promotoraktivität. Im Gegensatz dazu verhindert der Austausch der hochaffinen UASp2-Stelle durch die entsprechende UASp2-Stelle von PHO5 die Chromatin-umordnung und Promotoraktivierung, obwohl eine effiziente Bindung von Pho4 an dieser Stelle besteht. Diese Daten zeigen, daß eine quantitative Bindung von Pho4 an ein UAS-Element ohne irgendeine Chromatin-Umordnung und Promotoraktivierung möglich ist. Die Deletion der Promotorregion, die normalerweise von den Nukleosomen -3 und -2 bedeckt wird, ergibt einen zweifachen Anstieg der Promotoraktivität, was die repressive Rolle dieser Zusammenfassung -145-Nukleosomen anzeigt. Die gute Korrelation zwischen Promotoraktivität und Ausmaß der Chromatin-Umordnung impliziert, daß für das Ausmaß der PHO8-Induktion im Vergleich zu PHO5 die Qualität der Histon-DNA-Wechselwirkung eine Rolle spielt, da auch bei Einführung des PHO5-UASp1-Elements in den PHO8-Promotor keine vollständige Chromatinöffnung beobachtet wird. Obwohl Pho4 in Pho2-unabhängiger Weise am PHO8-Promotor bindet und Chromatin remoduliert, ist Pho2 dennoch an der Promotoraktivität durch Erhöhen des Aktivierungspotentials von Pho4 beteiligt, ähnlich wie am UASp2-Element des PHO5-Promotors. Die Ergebnisse dieser Arbeit haben die Rolle des Homöoproteins Pho2 bei der Induktion des PHO5- und PHO8-Promotors aufgeklärt und unterstreichen die enorme Bedeutung des kooperativen Bindens der Transkriptionsfaktoren Pho4 und Pho2. Zum anderen haben sie das Wechselspiel zwischen Transkriptionsfaktoren und der Chromatinstruktur am Beispiel dieser Promotoren besser definiert.