Podcasts about nukleosomen

Derzeit gibt es keinen Parameter, der die Effizienz einer neoadjuvanten Chemotherapie bei Patientinnen mit Mammakarzinom sicher vorhersagen kann. Das Therapieansprechen kann erst nach Applikation mehrerer Chemotherapiezyklen anhand der Klinik und bildgebender Verfahren beurteilt werden. Eine präzise Beurteilung der biochemischen Reaktionen des Tumors auf die Therapie ist so nicht möglich. Aus diesem Grund sollte in dieser prospektiv angelegten Studie die Wertigkeit verschiedener zirkulierender Biomarker zur Vorhersage und frühzeitigen Beurteilung der Effizienz einer neoadjuvanten Chemotherapie bei Patientinnen mit Mammakarzinom untersucht werden. Mit MIF, sFAS, sICAM, tPAI-1, M30 und Nukleosomen wurden Biomarker ausgewählt, die apoptoseabhängig im Serum nachgewiesen werden können. Da die Apoptoserate bei malignen Erkrankungen dereguliert ist und durch Zytostatika gezielt beeinflusst wird, erschienen diese Apoptosemarker vielversprechend.

Thu, 7 Mar 2013 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15609/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15609/1/Fahmueller_Yvonne.pdf F

Thu, 24 Jan 2013 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15546/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15546/1/Kohles_Nikolaus.pdf Kohles, Nikolaus Josef

Thu, 26 Jun 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8693/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8693/1/geiger_sandra.pdf Geiger, Sandra Manuela ddc:600, ddc:610, Medizinische Fakultät

Thu, 24 Jan 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8010/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8010/1/Mueller_Susanne.pdf Müller, Susanne

Diese Promotionsschrift versucht zu klären, ob die Freisetzung von Nukleosomen innerhalb der ersten Tage einer Radiochemotherapie frühzeitig die Effizienz der Therapie und damit das progressionsfreie Intervall erkennen lässt. Dazu wurden 32 Patienten mit einem Karzinom der Bauchspeicheldrüse und 25 Patienten mit einem Malignom des Dickdarms in eine prospektive Studie eingeschlossen. Mehrere Serumproben wurden im Verlauf der Therapie abgenommen und darin die Konzentration an Nukleosomen gemessen und mit den etablierten biologischen Markern CEA, CA 19-9 und CYFRA 21-1 sowie den Resultaten bildgebender Verfahren korreliert. Patienten mit postoperativer Radiochemotherapie nach kompletter Resektion (R0-Resektion) eines kolorektalen Karzinoms wiesen niedrige Nukleosomenwerte mit geringer Schwankungsbreite auf. Signifikant höhere Konzentrationen der Nukleosomen wurden bei Patienten mit noch vorhandenen Tumormassen gemessen, die sich einer präoperativen oder Rezidiv-Radiochemotherapie unterzogen. Dieses Ergebnis korrelierte auch mit anderen biologischen Markern wie CEA, CA 19-9 und CYFRA 21-1. Bei kolorektalen Malignomen konnte in der Gruppe der präoperativ behandelten Patienten frühzeitig das Therapieansprechen vorhergesagt werden. Hier korrelierte eine kleine Fläche unter der Kurve (area under the curve, AUC) mit fehlender Progression, eine hohe AUC mit Progression der Tumorerkrankung unter Therapie. Bei Patienten mit Pankreaskarzinom während Radiochemotherapie konnte anhand der Nukleosomenkonzentrationen im Serum frühzeitig das progressionsfreie Intervall abgeschätzt werden. Eine kleine Fläche unter der Kurve korrelierte dabei mit einem langen progressionsfreien Intervall. Dagegen erlitten Patienten mit einer großen AUC frühzeitig eine Progression. Biologische Marker und bildgebende Verfahren ermöglichen oft erst nach Wochen bis Monaten die Beurteilung einer Therapie. Nukleosomen dagegen, insbesondere die AUC, ergeben frühzeitig wertvolle prognostische Hinweise für das Ansprechen von Pankreas- und kolorektalen Karzinomen auf eine Radiochemotherapie. Nukleosomen stellen somit einen einfach und günstig zu bestimmenden Laborparameter dar, der sich zum Therapiemonitoring während Radiochemotherapien eignet. Werden die hier vorliegenden Daten in umfangreicheren, prospektiven, klinischen Studien bestätigt, könnten Nukleosomen als wertvolles laborchemisches Instrument dienen, um das therapeutische Vorgehen bei Patienten mit einer Tumorerkrankung individuell zu optimieren.

In der vorgelegten Arbeit wurden Histonmethyltransferasen untersucht. Die beiden SET-Proteine, Enhancer of Zeste (E(z)) und PRset7 methylieren jeweils spezifische Lysine in den N-Termini der Histonmoleküle H3 bzw. H4 und wurden zu Beginn in E. coli exprimiert. In Histonmethyltransferase-(HMTase)-Versuchen konnte mit E(z) keine Aktivität erzielt werden. Mit einer eingeführten Mutation des aktiven Zentrums („E(z)mut“) und mit E(z) konnte nach der Inkubation mit Drosophila-Kernextrakten an beiden Proteinen die Histondeacetylase Rpd3 nachgewiesen werden, die enzymatisch aktiv war. Unsere Arbeitsgruppe konnte die HMTase-Aktivität eines E(z)-Komplexes bestätigen, die von einer (nicht-mutierten) SET-Domäne abhängt (Czermin et al., 2002). Die Untersuchungen zur Histonmethyltransferase PRset7 begannen mit Aktivitäts- und Spezifitätsversuchen an verschiedenen Substraten. Die nukleosomale Spezifität von PRset7 bestätigte sich gemäß den Ergebnissen von Fang et al. und Nishioka et al. (Fang et al., 2002; Nishioka et al., 2002b). PRset7 unterschied klar zwischen rekombinanten Nukleosomen (Histone rekombinant in E.coli exprimiert) und nativen Nukleosomen (Histone aus Drosophila-Embryos gereinigt), wobei letztere deutlich vermindert methyliert wurden. An rekombinanten, mit PRset7 methylierten Nukleosomen, konnte mit einem H4 K20-methyl-Antikörper eine H4 K20-Methylierung detektiert werden. Mit Hilfe verschiedener, rekombinanter Nukleosomen, deren H4-Moleküle N-terminal unterschiedlich lang waren, konnte die Substraterkennung bzw. -bindung von PRset7 auf maximal 9 Aminosäuren vor Lysin 20 eingegrenzt werden. Durch die Reinigung des Proteins wurde deutlich, dass kürzere Degradationsprodukte von PRset7 den wesentlichen Anteil der detektierten HMTase-Aktivität ausgemacht hatten, ohne die hohe nukleosomale Substratspezifität zu verlieren. Für die Substratherstellung weiterer in vitro-Versuche zur Beziehung zwischen H4-Acetylierung (K12 bzw. K16) und H4-Methylierung (K20) wurde die Histonacetyltransferase MOF rekombinant hergestellt, gereinigt und die enzymatische Aktivität bestätigt. Es ergab sich keine eindeutige positive oder negative gegenseitige Beeinflussung der beiden Modifikationen. Abschließend wurden die verwendeten Antikörper bezüglich ihrer Spezifität untersucht, welche gegeben war.

In der vorliegenden Arbeit sollte die Auswirkung unterschiedlicher Strahlendosen auf verschiedene Kultivierungsformen der Bronchialschleimhaut und eine Lungenkarzinomzelllinie untersucht werden. Untersuchungen zur Wirkung ionisierender Strahlen auf normales Bronchialepithel sind eher selten, obwohl die Affektion von tumorfreiem umgebendem Gewebe eine wichtige Rolle bezüglich der Nebenwirkungen einer Radiotherapie spielt. Gerade im palliativen Bereich, in dem die endoluminale Bestrahlung von Bronchus-Stenosen einen wichtigen Faktor für die Verbesserung der Lebensqualität darstellt, ist durch den engen Kontakt der Strahlenquelle zum gesunden Bronchialepithel eine Strahlenauswirkung gegeben. Die bisherige Datenlage legt eine relativ hohe Strahlentoleranz des Bronchialepithels nahe. Ob sich diese Ergebnisse bestätigen lassen, sollte anhand verschiedener Bronchial-Epithel-Kultivierungsformen untersucht werden. Primäres Ziel der Untersuchung war die Frage, ob die Art der Kultivierung einen Einfluss auf die Effektivität ionisierender Strahlen hat und ob Tumorzellen eine andere Reaktion zeigen. Die verwandten Modelle waren: - BEAS-2B Zelllinien - Primärkulturen aus Patientenmaterial - dreidimensionale Organkulturen - EPLC-32M1 Tumorzelllinien Als „handelsübliche“ Bronchialepithel-Zelllinie zur Monolayer-Kultivierung wurden die BEAS-2B-Zellen verwendet, hier handelt es sich um immortalisierte, humane bronchoepitheliale Zelllinie, die mit einem Adenovirus 12-SV40 Virus-Hybrid transfiziert war. Zwar sind viele Eigenschaften der normalen Bronchialschleimhaut in diesem Modell vorhanden, aber auch genetische Abweichungen wie Veränderungen des Chromosomensatzes sind beschrieben. Mit zunehmender Passagezahl können die Zellen auch eine kanzerogene Wirkung zeigen. Zum direkten Vergleich wurden Primärkulturen aus Patientenmaterial gewonnen, welche als Monolayer kultiviert wurden. Problematisch war hier die schwierige Kultivierbarkeit. Die dreidimensionalen Organkulturen stellen vom Aufbau her eine in vivo-nahe Kulturform dar. Zentrum der Organkultur ist ein bindegewebiger Kern, welcher von einem respiratorischen Epithel umgeben ist. Morphologisch ist das kultivierte Epithel nicht von dem in vivo zu unterscheiden. Als Tumormodell wurde eine EPLC-32M1 Zelllinie verwandt, die wie die BEAS-2B Linie und die Primärkulturen als Monolayer wachsen. Hier handelt es sich um eine squamöse Karzinom Zelllinie, deren Ursprungsgewebe ein Plattenepithelkarzinom der Lunge war. Die Ähnlichkeit zum Primärtumor ist nur noch gering ausgeprägt. Bekannterweise gehört das Plattenepithelkarzinom der Lunge zu den nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinomen, welche im Vergleich zu Kleinzellern nur eine geringe Strahlensensitivität aufweisen. Als Parameter für die Zellschädigung wurde die Lactatdehydrogenase verwandt, ein zytoplasmatisches Enzym, welches bei Zellmembranläsionen freigesetzt wird. Mit der LDH steht ein klinisch häufig eingesetzter, etablierter Parameter zu Detektion von Zellschäden zur Verfügung. Hier konnte eine Bestimmung im Kulturmedium erfolgen, wodurch Verlaufsbeobachtungen ohne Beeinflussung der Kulturen möglich waren. Ferner wurde die Zellzahlen nach Bestrahlung ermittelt, um eine Aussage über das Zellüberleben machen zu können. Zusammenfassung der Ergebnisse: - Die Organkulturen und Primärkulturen zeigten nach einer Latenz von 48 Stunden nach der Bestrahlung eine gesteigerte LDH-Aktivität, die hier gleichzeitig ihr Maximum erreichte. - Bei der BEAS-2B Linie kam es innerhalb der ersten 24 Stunden zu einem deutlichen LDH-Anstieg. - Tumorzellen zeigten ein gänzlich anderes Verlaufsmuster bezüglich der LDH. Hier kam es nach 3 Tagen zu einem kontinuierlichen Anstieg. - Die Zellzahlen im Organkulturmodell wiesen 4 Tage nach Bestrahlung keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Versuchsgruppen auf. - Bei den Primärkulturen und den BEAS-2B Zellen fand sich in den bestrahlten Gruppen eine signifikant, nicht dosisabhängig erniedrigte Zellzahl. - Im Tumorzell-Modell war dosisabhängig eine Zellzahlminderung in den bestrahlten Gruppen zu beobachten. Schlussfolgerungen: Sowohl vom LDH-Verhalten, als auch von den Ergebnissen der Zellzahlbestimmung zeigten sich die dreidimensionalen Organkulturen wenig anfällig für die Wirkung ionisierender Strahlen. Nachdem dieses Modell die in vivo-Situation gut wiederspiegelt, unterstützen die Ergebnisse die Daten, welche eine hohe Strahlentoleranz von Bronchialepithel nahe legen. Von den übrigen Kultivierungsformen scheinen die aus Patientenmaterial gewonnenen Primärkulturen die höchste Strahlenresistenz aufzuweisen, wahrscheinlich sind hierfür Zelleigenschaften verantwortlich, die in den gentechnisch veränderten Zelllinien nicht mehr in der Art und Weise ausgeprägt sind wie in vivo. So nehmen viele intrazelluläre Faktoren wie Zytokine, Wachstumsfaktoren, Proteinkinasen oder auch Onkogene Einfluss auf die Strahlensensibilität einer Zelle. Entscheidend scheint besonders der p53- Status zu sein. Am strahlensensitivsten zeigten sich die BEAS-2B und die EPLC-32M1 Linien. Das hängt womöglich mit der Veränderung des genetischen Materials durch die Immortalisationsprozesse und die im Vergleich höhere Proliferationsrate zusammen. Möglich ist auch eine erhöhte Strahlensensibilität aufgrund des im Vergleich zu den Organkulturen schwächer ausgeprägten Zell-Zell-Kontaktes, der fehlenden dreidimensionalen Struktur und dem geringeren Anteil differenzierter Zellen. Nicht außer Acht lassen darf man individuelle Einflüsse, welche womöglich in den von Patientenmaterial stammenden Kulturen eine Rolle spielen. Zusammenfassend konnten wir zeigen, dass der dreidimensionale Aufbau und die hierarchische Struktur des Bronchialepithels maßgeblich die Strahlensensibilität beeinflussen. Monolayer sind zur Untersuchung von Strahlenfolgen in vivo nur sehr bedingt geeignet. Ausblick auf zukünftige Fragestellungen: Nachdem in der vorliegenden Arbeit nur eine Tumorzelllinie untersucht wurde, wäre es von Interesse, die Auswirkung ionisierender Strahlung auf verschiedene Lungenkarzinom- Zelllinien zu vergleichen, welche in vivo deutliche Unterschiede in der Strahlenempfindlichkeit aufweisen. Anbieten würde sich hier der Vergleich mit strahlensensiblen kleinzelligen Bronchialkarzinom. Möglicherweise kann auch hier eine dreidimensionale Kultivierung von Tumorzellen aus Patientenmaterial etabliert werden, um einen größeren Zell-Zell-Kontakt im Tumor-Modell zu ermöglichen. Auch wäre hier durch die fehlenden gentechnischen Veränderungen eine bessere Vergleichbarkeit mit der in vivo- Situation möglich. Auch die Untersuchung von Ko-Kulturen aus normaler Bronchialschleimhaut und verschiedenen Bronchialkarzinomzelllinien bietet die Möglichkeit, Auswirkungen von Interaktionen zwischen Normalgewebe und Tumorgewebe nach Einwirkung ionisierender Strahlen näher zu eruieren. Dieses Modell käme der Situation beim Patienten am nächsten. Interessant wäre in diesen Modellen auch die Überprüfung weiterer Zelltod-Parameter. So könnten hier verschiedene Apoptosemarker wie zum Beispiel die Nukleosomen im Überstand verschiedener Ko-Kulturmodelle bestimmt werden, um eine bessere Aussage über das Ausmaß der Zellschädigung zu erhalten. Im Kontext mit der Untersuchung von Nukleosomen scheint auch die Bestimmung von Calcium eine sinnvolle Ergänzung darzustellen. Hier bieten sich verschiedene Möglichkeiten an, das Verhalten von Zellkulturen nach Bestrahlung, gerade hinsichtlich einer möglichen Resistenzbildung zu untersuchen.

Die Organisation der DNA in Nukleosomen hat einen großen Einfluss auf die Regulation von grundliegenden Prozessen wie Transkription, Replikation oder Reparatur der DNA im Zellkern. Um die hinderliche Natur des Chromatins bei diesen fundamentalen Prozessen zu überwinden, existieren mehrere verschiedene Chromatin modifizierende Proteinkomplexe im Zellkern. Chromatin Remodelling Komplexe nützen die Energie der ATP-Hydrolyse um die Position der Nukleosomen so zu verändern, dass verschiedene Abschnitte der DNA für die Interaktion mit regulierenden Faktoren zugänglich werden. Ein Klasse solcher Remodelling Faktoren beinhalten die ATPase ISWI als katalytische Untereinheit. Das Protein wurde zuerst in Drosophila entdeckt und die drei verschiedenen ISWI enthaltenden Komplexe, nämlich NURF, ACF und CHRAC, wurden ausführlich in diesem Modellorganismus untersucht. Homolog zur Fruchtfliege existieren sehr ähnliche Protein Komplexe beim Menschen. Wir haben das humane ISWI mit den Isoformen Snf2h und Snf2L im Prostatakarzinom untersucht. In einem Tissue Microarray wurden Gewebeproben mit Hilfe von polyklonalen Antikörpern gegen ISWI gefärbt. Es folgte ein quantitativer Vergleich der Färbungsintensitäten im Karzinomgewebe sowie in gutartigem Gewebe der Prostata durch Anwendung von digitaler Bildanalyse. Das Ergebnis war eine signifikant stärkere Färbung im neoplastischen Gewebe. Eine Anreicherung von ISWI in Krebszellen ist besonders interessant im Kontext der bekannten Funktionen des Proteins für DNA-Replikation, Zellproliferation und Regulation der Chromatinstruktur. In einem zweiten Projekt sind wir zum Modell der Fruchtfliege zurückgekehrt und entwickelten monoklonale Antikörper gegen Toutatis, das zu einer Proteinfamilie gehört, die auch einige bekannte Interaktionspartner von ISWI umfasst. Die Proteine dieser Familie haben vermutlich eine regulatorische Funktion in den Remodelling Komplexen, denn am Beispiel von Acf1 wurde gezeigt, dass sie die nukleosomale Bindung sowie die Effizienz und Richtung der Mobilisierung von Nukleosomen modifizieren. Unsere Antikörper wurden etabliert, um Toutatis enthaltende Komplexe durch Western Blot Analyse von gereinigten Drosophila-Extrakten und Immunfluoreszenz zu charakterisieren. Mit diesen Methoden fanden wir eine Koelution von Toutatis mit der ATPase Brahma und dem Strukturprotein Spectrin alpha sowie eine Lokalisation in der Lamina des Zellkerns. Ein mögliches Zusammenspiel dieser Proteine in einem neuen Chromatin Remodelling Komplex mit einer Beteiligung an der DNA-Reparatur wird diskutiert.

In der vorliegenden Arbeit wurden die beiden Histon-Methyltransferasen Su(var)3-9 und E(Z) aus Drosophila melanogaster charakterisiert. Die Histonmethylierung als Modifikation war schon länger bekannt gewesen, bis zum Jahr 2000 war jedoch vor allem die Acetylierung etwas genauer untersucht worden. Su(var)3-9 war die einzige bekannte Histon-Lysin-Methyltransferase, als diese Arbeit begonnen wurde. Zur Charakterisierung wurde das myc-getagte Enzym aus Drosophila-Kernextrakt durch Affinitätschromatographie aufgereinigt und zunächst die Substratspezifität festgestellt. Wie das humane Enzym Suv39H1 methyliert es ebenfalls spezifisch H3-K9 (Lysin 9 im Histon H3). Das aus den Kernextrakten aufgereinigte Enzym besitzt aber auch die Fähigkeit, ein an H3-K9 präacetyliertes Substrat zu methylieren. Die Vermutung, dass Su(var)3-9 mit einer Histondeacetylase assoziiert ist, konnte durch Verwendung von TSA als HDAC-Inhibitor bestätigt werden. Es stellte sich heraus, dass HDAC1 (Rpd3) mit Su(var)3-9 assoziiert ist. Um das Enzym besser untersuchen zu können, wurde es als Volllängenprotein und als Deletionsmutante in E. coli exprimiert. Die Aufreinigung des rekombinanten Enzyms sowie seine Lagerbedingungen wurden optimiert. Das Volllängenprotein Su(var)3-9 liegt – wie durch Gelfiltration festgestellt - als Dimer vor, die Interaktion mit sich selbst ist über den N-Terminus vermittelt. Su(var)3-9 bindet an sein eigenes, bereits methyliertes Substrat. Dies wurde an Peptiden untersucht, die den ersten 20 Aminosäuren des Histons H3 entsprechen, und entweder an Lysin 9 dimethyliert oder unmodifiziert waren. Die Interaktion mit dem methylierten Substrat ist auf die Chromodomäne von Su(var)3-9 zurückzuführen, ist jedoch schwächer als die Wechselwirkung von HP1 mit methyliertem H3-K9. Des weiteren wurde eine Drosophila-Zelllinie stabil mit Su(var)3-9 transfiziert. Das überexprimierte Protein ist jedoch nur schwach aktiv. Die Tatsachen, dass Su(var)3-9 mit HDAC1 interagiert sowie mit seinem eigenen Substrat assoziiert, ermöglichen die Aufstellung von Hypothesen über die bis jetzt kaum erhellte Ausbreitung von Heterochromatin in euchromatische Bereiche. Durch die Wechselwirkung mit der Deacetylase könnte Su(var)3-9 auch in aktiv transkribierte Bereiche vordringen und diese methylieren. Die Acetylierung, Zeichen für aktive Transkription, würde durch die Methylierung ersetzt werden. Die Interaktion mit seinem umgesetzten Substrat könnte verhindern, dass das Enzym sich nach der Reaktion entfernt, vielmehr könnte Su(var)3-9 entlang eines DNA-Stranges sukzessive alle Nukleosomen methylieren. Die darauffolgende Bindung von HP1 an methyliertes H3-K9 könnte den heterochromatischen Charakter des Chromatins verstärken und für längere Zeit festlegen. Aus Drosophila-Kernextrakten gelang es weiterhin, den E(Z)/ESC-Komplex über Säulenchromatographie aufzureinigen. Dieser enthält neben E(Z), ESC, p55 und Rpd3 auch Su(z)12. E(Z), ESC und Su(z)12 gehören der Polycomb-Gruppe an. Deren Funktion ist die dauerhafte Repression der homöotischen Gene. Sie spielen daher eine wichtige Rolle im „Zellgedächtnis“ während der frühen Entwicklung von Drosophila. Es konnte gezeigt werden, dass der E(Z)/ESC-Komplex Lysin 9 sowie Lysin 27 im Histon H3 methyliert. Außerdem wurde in vitro ein Teilkomplex aus rekombinantem E(Z), p55 und ESC rekonstituiert, der das Histon H3 methylieren kann. Ein Teilkomplex, der E(Z) mit mutierter SET-Domäne enthält, ist nicht in der Lage, H3 zu methylieren. Die Vorhersage, dass E(Z) aufgrund seiner SET-Domäne eine Methyltransferase sein müsse, konnte durch vorliegende Untersuchungen bestätigt werden. Polycomb ist ein weiteres Protein aus der Polycomb-Gruppe. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass dieses Protein spezifisch an das Histon H3 bindet, das an K27 trimethyliert ist. Polycomb besitzt wie HP1 eine Chromodomäne. Aus den vorliegenden Daten kann folgendes Modell aufgestellt werden: Nach der Methylierung von H3-K9 sowie H3-K27 durch den E(Z)/ESC-Komplex in homöotischen Genen, die schon abgeschaltet sind und weiterhin reprimiert werden müssen, bindet Polycomb an dieses Methylierungsmuster. Polycomb befindet sich in einem großen Komplex mit weiteren Polycomb-Gruppen-Proteinen. Die Bindung dieses Komplexes an Chromatin könnte ein denkbarer Mechanismus sein, wie die dauerhafte Repression der homöotischen Gene vermittelt wird. Um den E(Z)/ESC-Komplex genauer untersuchen zu können, wurden Viren für das Baculosystem hergestellt, so dass eine Einzel- oder auch Coexpression der Proteine möglich ist. Die Aktivität von E(Z), das im Baculosystem exprimiert wurde, ist nicht besonders hoch. Es bindet unter den in dieser Arbeit verwendeten Bedingungen weder an DNA, noch an Histone noch an H3-Peptide, die methyliert sind. Innerhalb des E(Z)/ESC-Komplexes bindet E(Z) an p55, Rpd3, ESC sowie Su(z)12. Su(z)12 interagiert mit p55, Rpd3 und E(Z). Die weiteren Interaktionen werden am besten durch eine bildliche Darstellung (siehe Abb. 86) vermittelt. In einem Luciferase-Assay wurde eine repressive Wirkung von E(Z) festgestellt. Dieses Experiment bedarf allerdings eines aktivierten Systems. Ferner muss durch Mutationsanalysen sichergestellt werden, dass die repressive Wirkung auf die Methyltransferase-Aktivität von E(Z) zurückzuführen ist. Kürzlich wurde entdeckt, dass E(Z) sowie Su(z)12 in verschiedenen Tumoren überexprimiert sind. Noch ist weder deren Funktion in den Tumorzellen klar, noch weiss man, ob die Überexpression der Grund oder eine Folge der Tumorbildung ist, noch kennt man alle Zielgene, die durch eine Überexpression von E(Z) und Su(z)12 beeinflusst werden. In nächster Zeit sind hier Einsichten in die Wirkungsweise von E(Z), Su(z)12 und anderen Polycomb-Gruppen-Proteinen zu erwarten.

Thu, 15 Jan 2004 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/1811/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/1811/1/Holdenrieder_Stefan.pdf Holdenrieder, Stefan ddc:610, ddc:600, Medizinische Fakultät

Nach der Aufklärung der Basenabfolge des Genoms von Saccharomyces cerevisiae ist die Funktion der 30.000-40.000 Gene und insbesondere das Zusammenspiel der Regulation der einzelnen Gene ein zentrales Thema der Molekularbiologie. Die DNA eukaryonter Zellen liegt durch Bindungen an Histon-Proteine im Zellkern als Chromatin vor. Die Chromatinstruktur dient nicht nur der Komprimierung der DNA auf engstem Raume, sondern hat auch starke Auswirkungen auf die Funktion der DNA. So müssen Gene bei ihrer Aktivierung durch Veränderung ihrer Chromatinstruktur, die bis zur Ablösung der Histone führen kann, den für die Transkription benötigten Enzymen und Faktoren erst zugänglich gemacht werden. Das PHO5-Gen der Hefe Saccharomyces cerevisiae stellt ein sehr gut untersuchtes Modell dar, bei dem Veränderungen der Chromatinstruktur genau untersucht und mit dem funktionellen Zustand des Gens korreliert worden sind. PHO5 kodiert für eine saure Phosphatase, die bei Verbrauch der Phosphatreserven der Zelle in den periplasmatischen Raum sezerniert wird, um aus dort eventuell vorhandenen organischen Phosphatverbindungen Phosphat zu gewinnen. Ist im Medium genügend Phosphat vorhanden, ist PHO5 reprimiert. In diesem Zustand ist die Chromatinstruktur des PHO5-Promotors durch vier dicht aufeinander folgende Nukleosomen gekennzeichnet, wodurch der Promotor Enzymen und regulatorischen Proteinen allgemein schlecht zugänglich ist. Nur zwischen dem zweiten und dem dritten Nukleosom ist die dichte Anordnung der Nukleosomen durch einen etwa 70 bp langen gut zugänglichen Bereich unterbrochen. In dieser sogenannten hypersensitiven Region bindet bei Phosphatmangel der aktivierende Transkriptionsfaktor Pho4 gemeinsam mit dem Faktor Pho2 an ein UAS-Element und induziert die PHO5-Expression. Dabei lösen sich die vier Nukleosomen vom DNA-Strang ab. Sin4 ist ein Transkriptionsfaktor der Hefe Saccharomyces cerevisiae, der auf mehrere Promotoren zumeist reprimierenden Einfluss ausübt. Ausgangspunkt der hier vorliegenden Arbeit war der Befund, dass in Abwesenheit von Sin4 die Gegenwart der prokaryontischen lacZ Sequenz stromaufwärts des PHO5-Promotors zu einer Derepression des PHO5-Gens führt, und zwar in Gegenwart von Phosphat, also unter eigentlich reprimierenden Bedingungen. Dieser Effekt wurde ursprünglich bei der Verwendung der kodierenden Sequenz von lacZ als dem PHO5-Promotor nachgeschalteten Reporter-Gen in sin4-Hefezellen entdeckt. Eine Frage der hier vorliegenden Arbeit galt der Ursache der Derepression von PHO5 durch die lacZ kodierenden DNA-Sequenz. Dazu interessierte uns, ob die Derepression ein spezielles Phänomen der lacZ-Sequenz ist oder ob es sich hierbei eher um eine allgemeine Eigenschaft von DNA-Fragmenten handelt. Außerdem interessierte uns, ob die Herkunft der DNA aus prokaryonten oder eukaryonten Zellen eine Rolle spielen könnte. Dazu wurde jeweils eine große Anzahl zufällig ausgewählter DNA-Fragmente einer Länge zwischen 900bp und 1200bp aus den Genomen der Hefe Saccharomyces cerevisiae und der Bakterien Escherichia coli und Micrococcus lysodeikticus an entsprechender Stelle vor den PHO5-Promotor integriert. Die so konstruierten Plasmide wurden in einen Hefestamm transformiert, in dem das SIN4-Gen zerstört worden war. Insgesamt wurden 400 Klone mit integrierten Hefe-DNA-Fragmenten, 300 Klone mit integrierten M. lysodeikticus-DNA-Fragmenten und 14 Klone mit integrierten E. coli-DNA-Fragmenten untersucht. Die Bestimmung der Phosphatase-Aktivitäten der einzelnen Klone ergab für fast alle Plasmide mit integrierten E. coli- und M. lysodeikticus-DNA-Fragmenten eine erhöhte Aktivität trotz phosphatreichen Mediums. Im Gegensatz dazu zeigten die wenigsten Plasmide mit integrierten Hefe-DNA-Fragmenten eine Erhöhung der PHO5-Expression unter denselben Bedingungen. Von den insgesamt 400 getesteten Plasmiden wiesen nur neun eine gesteigerte PHO5-Expression auf. In allen Fällen, also für alle E. coli-, M. lysodeikticus- und Hefe-DNA-Fragmente, wurde nur in Abwesenheit von Sin4 eine erhöhte Phosphatase-Aktivität gemessen. Bei seiner Anwesenheit wurden in phosphatreichem Medium nie gesteigerte Aktivitäten beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass die hier beobachtete Derepression typischerweise eine Eigenschaft prokaryonter DNA ist. Nur ein Bruchteil der eukaryonten DNA-Fragmente aus dem Hefe-Genom führt zu einer Derepression der Promotoraktivität, während dies nahezu alle prokaryonten DNA-Fragmente aus Escherichia coli- bzw. Micrococcus lysodeikticus tun. Um die neun Hefe-DNA-Fragmente, die zu einer Aktivierung des PHO5-Promotors führten, auf eventuelle Besonderheiten zu untersuchen, wurden ihre DNA-Sequenzen bestimmt und analysiert. Außerdem wurden noch zwei E. coli-DNA-Fragmente sequenziert, die zu keiner gesteigerten PHO5-Expression geführt haben. Diese sehr eindeutigen Ergebnisse werfen Fragen nach dem zugrunde liegenden Mechanismus auf. Eventuelle DNA-Methylierungen oder kryptische Promotoren schieden als Erklärung des Phänomens aus. Unterschiede des G-C-Gehalts der einzelnen DNA-Fragmente könnten besonders für die prokaryonte DNA teilweise eine Erklärung liefern. Die beiden prokaryonten Genome haben mit 51% bzw.72% einen wesentlich höheren G-C-Gehalt als das Hefegenom mit 38%. Besonders die beiden E. coli-DNA-Fragmente, die zu keiner gesteigerten PHO5-Expression führten, besitzen einen wesentlich geringeren G-C-Gehalt als der Durchschnitt des gesamten E. coli-Genoms (44,7% bzw. 38,0% im Vergleich zu 51%). Eukaryonte DNA besitzt in ihrer Sequenz im Gegensatz zu der aus Prokaryonten eine gewisse Periodizität, die sich etwa alle 10,5bp wiederholt und die Ausbildung von Nukleosomen erleichtert. Das Fehlen dieser Periodizität in prokaryonter DNA könnte sich ebenfalls auswirken, z.B. über eine labile Chromatinstruktur, die sich auch auf den benachbarten PHO5-Promotor auswirkt und dadurch eine Dereprimierung von PHO5 in sin4-Zellen auslöst. Die Dereprimierung des PHO5-Promotors durch die wenigen Hefe-DNA-Fragmente trotz reprimierender Bedingungen könnten aufgrund anderer Mechanismen zustande zu kommen. Die neun Hefe-DNA-Fragmente, die zu einer Aktivierung des PHO5-Promotors führten, zeigten auch keinen vom Hefegenom abweichenden G-C-Gehalt. Es ist auffällig, dass alle 9 DNA-Fragmente intergenische Bereiche enthalten. In diesen Bereichen gibt es oft regulatorische Elemente, die häufig in hypersensitiven Regionen gefunden werden. Hypersensitive Regionen sind nicht in Nukleosomen gepackt und könnten dadurch auch die umgebene Chromatinstruktur beeinflussen. Unabhängig von den mechanistischen Überlegungen zeigen diese Untersuchungen, dass die Aktivität eines Promotors von der Umgebung beeinflusst werden kann und dass daher der Einsatz von heterologen Reportergenen mit Vorsicht betrachtet werden muss.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Wechselwirkung zwischen Transkriptionsfaktoren und Elementen der Chromatinstruktur bei der Regulation zweier Promotoren des Phosphatase-systems der Hefe Saccharomyces cerevisiae untersucht. Als Modellsystem wurden die Promotoren der Gene PHO5 und PHO8 gewählt, die für eine saure bzw. eine alkalische Phosphatase kodieren und durch Phosphatmangel induziert werden. Während der Induktion findet eine charakteristische Chromatin-Umordnung am Promotor statt, die sich bei PHO5 über einen Bereich von vier Nukleosomen ausdehnt, bei PHO8 jedoch signifikant geringer ist. Für die transkriptionelle Aktivierung sind insbesondere zwei Transkriptionsfaktoren nötig: das bHLH-Protein Pho4 und das Homöodomänenprotein Pho2. Der PHO5-Promotor besitzt zwei Pho4-Bindestellen, die den regulatorischen Elementen UASp1 und UASp2 entsprechen. Während UASp1 in einem hypersensitiven Bereich zwischen den Nukleosomen liegt, ist UASp2 intranukleosomal lokalisiert. Mutagenese einer der beiden Bindestellen führte zu einer zehnfachen Abnahme der Promotoraktivität, während Mutagenese beider Stellen die Induzierbarkeit des Promotors völlig aufhob. Um die Bedeutung der Lokalisation der UAS-Elemente im Chromatin zu analysieren, wurde ein Operator für den a2-Repressorkomplex oberhalb des PHO5-Promotors eingebaut. Dieser Repressorkomplex bildet im Kontext bestimmter Promotoren eine zum a2-Operator benachbarte repressive Chromatinstruktur mit basenpaargenauer Nukleosomenposition aus. Im PHO5-Promotor führte der Einbau dieses Operators zur Repression der Promotoraktivität und einer leicht verminderten Chromatinzugänglichkeit. Demnach kann der a2-Operator transkriptionshemmende Strukturen initiieren, wobei die Repression durch verstärkte Chromatinkondenation und möglicherweise durch die Rekrutierung von reprimierenden Mediatorproteinen des RNA-PolymeraseII-Holoenzyms vermittelt wird. Durch Deletionen von Bereichen zwischen dem a2-Operator und den UAS-Elementen konnten Nukleosomen wie das Nukleosom -2 zwar stabilisiert, aber nicht gezielt verschoben werden. Rekonstitutionsexperimente mit einem 180 Bp-DNA-Fragment, das den Bereich des Nukleosoms -2 enthielt, zeigten zwar einen gewissen Beitrag der Sequenz zur Histon-DNA-Bindung, dieser allein kann jedoch keinesfalls die Positionierung erklären, vielmehr scheinen Wechselwirkungen der Histone mit anderen Chromatinkomponenten entscheidenden Anteil zu haben. Zusammenfassung E -144-Der Mechanismus der Chromatin-Umordnung am PHO5-Promotor durch die Transkriptions-faktoren Pho4 und Pho2 wurde zunächst durch in vitro Experimente unter Verwendung von rekombinantem Pho2-Protein analysiert. Es konnten mehrere Pho2-Bindestellen verschie-dener Affinität im PHO5-Promotor gefunden werden. Eine der hochaffinen Pho2-Binde-stellen überlappt größtenteils mit der Pho4-Bindestelle UASp1. Die kooperative DNA-Bindung der beiden Proteine an ihre überlappenden Bindestellen resultierte in einem hochaffinen ternären Komplex. Auch am UASp2-Element, bei dem zwei Pho2-Bindestellen eine Pho4-Bindestelle flankieren, findet eine kooperative Bindung von Pho2 und Pho4 an die DNA statt. Durch Mutation der mittels in vitro-Footprints entdeckten Pho2-Bindestellen konnte gezeigt werden, daß diese zur Promotoraktivität beitragen. Sie sind nicht nur wichtig, um Pho2 an den Promotor zu rekrutieren, sondern ermöglichen auch die kooperative DNA-Bindung mit Pho4 über direkte Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen Pho2 und Pho4. Eine Pho2-Interaktionsdomäne von Pho4 ist essentiell für die Aktivierung des PHO5-Promotors, wie durch Deletionsanalyse demonstriert wurde. Die kooperative DNA-Bindung dieser Faktoren scheint demnach sehr wichtig für die Transkriptionsregulation des PHO5-Gens zu sein. Getrennte Untersuchungen von UASp1 und UASp2 in einem CYC1-Promotor-Kontext zeigen einen eindrucksvollen Unterschied zwischen den zwei UAS-Elementen und verdeutlichen die duale Rolle von Pho2 in der Aktivierung des PHO5-Promotors. Es ist in entscheidender Weise für die Rekrutierung von Pho4 zur UASp1-Stelle nötig und verstärkt darüber hinaus das Pho4-Aktivierungspotential, während es an der UASp2-Stelle eher nur das Pho4-Aktivierungspotential erhöht. Trotz der koordinierten Regulation beider Promotoren ist der PHO8- fast 10mal schwächer als der PHO5-Promotor. Von den beiden Pho4-Bindestellen am PHO8-Promotor, welche früher in vitro bestimmt worden waren, ist nur eine in vivo funktional. Der Austausch des inaktiven PHO8-UASp1-Elements durch das UASp1-Element des PHO5-Promotors erhöht das Ausmaß der Chromatinöffnung im Bereich der Nukleosomen -3 und -2 und ergibt einen zweifachen Anstieg der Promotoraktivität. Im Gegensatz dazu verhindert der Austausch der hochaffinen UASp2-Stelle durch die entsprechende UASp2-Stelle von PHO5 die Chromatin-umordnung und Promotoraktivierung, obwohl eine effiziente Bindung von Pho4 an dieser Stelle besteht. Diese Daten zeigen, daß eine quantitative Bindung von Pho4 an ein UAS-Element ohne irgendeine Chromatin-Umordnung und Promotoraktivierung möglich ist. Die Deletion der Promotorregion, die normalerweise von den Nukleosomen -3 und -2 bedeckt wird, ergibt einen zweifachen Anstieg der Promotoraktivität, was die repressive Rolle dieser Zusammenfassung -145-Nukleosomen anzeigt. Die gute Korrelation zwischen Promotoraktivität und Ausmaß der Chromatin-Umordnung impliziert, daß für das Ausmaß der PHO8-Induktion im Vergleich zu PHO5 die Qualität der Histon-DNA-Wechselwirkung eine Rolle spielt, da auch bei Einführung des PHO5-UASp1-Elements in den PHO8-Promotor keine vollständige Chromatinöffnung beobachtet wird. Obwohl Pho4 in Pho2-unabhängiger Weise am PHO8-Promotor bindet und Chromatin remoduliert, ist Pho2 dennoch an der Promotoraktivität durch Erhöhen des Aktivierungspotentials von Pho4 beteiligt, ähnlich wie am UASp2-Element des PHO5-Promotors. Die Ergebnisse dieser Arbeit haben die Rolle des Homöoproteins Pho2 bei der Induktion des PHO5- und PHO8-Promotors aufgeklärt und unterstreichen die enorme Bedeutung des kooperativen Bindens der Transkriptionsfaktoren Pho4 und Pho2. Zum anderen haben sie das Wechselspiel zwischen Transkriptionsfaktoren und der Chromatinstruktur am Beispiel dieser Promotoren besser definiert.