Podcasts about promotoren

Achtung (Werbung in eigener Sache):  Jetzt mein Buch "Die perfekte Candidate Journey & Experience" unter folgenden Links bestellen: https://link.springer.com/book/10.1007/978-3-662-66875-7 https://bit.ly/3KEgwDF https://amzn.to/3mbzhUO Der inhaltliche Fokus liegt auf Recruiting für mittelständische Unternehmen sowie Startups und darum, wie die Candidate Journey und deren Touchpoints so gestaltet werden können, dass eine hervorragende Candidate Experience möglich wird.   Gudrun Happich (C-Level Executive Business Coach) Gudrun Happich ist C-Level Executive Business Coach, Autorin zahlreicher Bücher und verfügt über mehr als 30 Jahre Erfahrung als Führungskräfte-Coach. Diese Tätigkeit ist für Gudrun gleichermaßen Beruf und Berufung, denn die studierte Biologin hat während ihrer eigenen Führungslaufbahn selbst erlebt, was aus Führungssicht so alles passieren kann. Diese Erfahrungen hat Gudrun unter anderem als Geschäftsführerin mit einer Verantwortung für mehr als 1.000 Mitarbeitende im DACH-Raum aufbauen können. Seit vielen Jahren ist sie nun als Inhaberin des Galileo Instituts für Human Excellence unternehmerisch tätig und bietet Unternehmen und deren Führungskräften zahlreiche Möglichkeiten im Bereich des Führungskräfte-Coaching. Das Thema Transformation hat dabei insbesondere in den letzten Jahren eine starke Bedeutung bekommen. Und genau darüber sprechen wir heute.   Themen  Mit Gudrun Happich (C-Level Executive Business Coach) konnte ich in der GainTalents-Podcastfolge 358 darüber sprechen, wie Führungskräfte das Thema Transformation vorantreiben können. Ich bedanke mich ganz herzlich bei Gudrun für die klasse Tipps und für den sehr guten Talk. Wie kannst Du als Führungskraft die Transformation vorantreiben? Führungskräfte können das Thema Transformation nicht einfach delegieren! Vorleben, was vom Team erwartet wird, ist essenziell weder intern, noch extern an z.B. Unternehmensberatungen Aktive Einbindung von Mitarbeitenden ist notwendig (rational und emotional!) Achtung: primäres Ziel ist, erst die Mitarbeitenden aktiv einzubinden, die auch bereit sind, die Transformation mit zu gestalten interne Promotoren für die Transformation finden und zur Überzeugung aller Mitarbeitenden einbinden Transformation ist kein einzelnes isoliertes Projekt, sondern eine lang angelegte Veränderung Führungskräfte sollten vor der Übernahme einer Transformationsaufgabe Bedingungen stellen  Ziele der Transformation definieren (was soll erreicht werden) Reflektion der Aufgabe durch Führungskraft (was bedeutet die Übernahme der Transformationsaufgabe für mich als Führungskraft?) dann Rahmenbedingungen festlegen und Forderungen stellen Start der Transformation das ob (also, das die Transformation startet) wird nicht mehr diskutiert “Spielregeln” müssen definiert werden (z.B. Fehlerkultur und Entscheidungsspielräume) Den/die Hauptentscheider/in einer Transformation muss die beauftragte Führungskraft im Fokus haben wie bekomme ich ein Commitment für das Vorgehen und die erforderlichen Maßnahmen, die dafür notwendigen Budgets, etc. von den Hauptentscheider:innen? welche Benefits haben Hauptentscheider:innen von einer erfolgreichen Transformation? #Leadership #Transformation #Changemanagement #GainTalentspodcast Shownotes Links - Gudrun Happich LinkedIn       https://www.linkedin.com/in/gudrunhappich/ Website        https://www.galileo-institut.de/gudrun-happich/ Bücher         https://www.galileo-institut.de/buecher/              Buchempfehlungen: 1. C-Level: Im Top-Management erfolgreich werden, sein und bleiben!  Hier gleich der Link zu amazon: https://amzn.to/3HJ2rBR 2. Herausforderungen im Führungsalltag: 28 Führungsthemen auf dem Weg ins Topmanagement.  Hier gleich der Link zu amazon: https://amzn.to/48Qyr2I   Links Hans-Heinz Wisotzky:  Website https://www.gaintalents.com/podcast und https://www.gaintalents.com/blog Buch: https://www.gaintalents.com/buch-die-perfekte-candidate-journey-und-experience LinkedIn https://www.linkedin.com/in/hansheinzwisotzky/ LinkedIn https://www.linkedin.com/company/gaintalents XING https://www.xing.com/profile/HansHeinz_Wisotzky/cv Facebook https://www.facebook.com/GainTalents Instagram https://www.instagram.com/gain.talents/ Youtube https://bit.ly/2GnWMFg

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Forscher des Baylor College of Medicine haben ein KI-System zur Diagnose seltener genetischer Störungen entwickelt.https://medicalxpress.com/news/2024-04-ai-diagnosis-rare-genetic-disorders.html Forscher des MIT haben ein Spiel entwickelt, um das Textverständnis und die Textgenerierung von KI zu verbessern.https://news.mit.edu/2024/consensus-game-elevates-ai-text-comprehension-generation-skills-0514 Forscher am UT Southwestern Medical Center haben Deep-Learning-Modelle entwickelt, um Promotoren zu verstehen.https://medicalxpress.com/news/2024-05-machine-gene-transcription.html Das KI-Klonen verstorbener Verwandter ist in China eine wachsende Branche.https://futurism.com/the-byte/cheap-ai-clones-dead-relatives Visit www.integratedaisolutions.com

Seit den 70iger Jahren sprechen deutsche Innovationsforscher von den drei notwendigen Rollen in Innovationsprozessen: den Fach-, Macht- und Prozesspromotoren. Agile Methoden wie Scrum, SAFe, LeSS oder OKR haben diese Rollen aufgegriffen und zu neuer Berühmtheit geführt. Aber wie sieht die Realität aus: Haben wir in unseren (digitalen) Innovations- und Veränderungsprojekten die richtigen Fachexperten mit der passenden Motivation? Gibt es Entscheider mit Visionen, Willen, Rückgrat und Budget, um Projekte wirtschaftlich erfolgreich zu machen? Und gibt es jemanden, der das Projekt mit allen Beteiligten konsequent zu dem gewünschten Ergebnis führt?

Si occupa di politica da quando aveva 14 anni, militando in diversi movimenti di sinistra. In Germania era iscritto alla Linke e, dalla fondazione di Sinistra Italiana fa parte dell'assemblea nazionale del partito. A livello territoriale ricopre la carica di segretario provinciale di “Sinistra/Die Linke”.Luca Di Biasio ist das Model eines modernen Südtirolers. Studium in Neapel und Düsseldorf lebt er mit seiner Familie seit 2009 in Südtirol. Der Lehrer ist einer der Promotoren des Bündnisses zwischen SI und den Grünen. Er tritt zusammen mit Annamaria Molin auf der grünen Liste zu den Landtagswahlen an.  --- Send in a voice message: https://podcasters.spotify.com/pod/show/saltobz/message

Bis vor Kurzem waren Olympische Spiele in der Schweiz nicht mehr denkbar. Zu oft sind entsprechende Vorhaben gescheitert. Doch jetzt ist die Schweiz plötzlich möglicher Austragungsort für die Olympischen Winterspiele 2030. Die Olympischen Spiele sind in den letzten Jahrzehnten stetig gewachsen. Dem Internationalen Olympischen Komitee (IOC) wurde Gigantismus vorgeworfen. Unter den bestehenden Rahmenbedingungen gab es immer weniger Kandidaturen. Für die Winterspiele 2030 gibt es noch gar keine. Der Mangel an möglichen Durchführungsorten, scheint zu einem Umdenken zu führen. Im März dieses Jahres ist das IOC auf Swiss Olympic zugekommen und hat völlig neue Rahmenbedingungen präsentiert. Auch kleinere, dezentrale und nachhaltige Konzepte sollen möglich sein. Swiss Olympic hat eine Machbarkeitsstudie für Olympische Winterspiele in der Schweiz in Auftrag gegeben. Im Gegensatz zu früheren Bewerbungen soll nicht ein Kanton oder eine Stadt Austragungsort sein, sondern die Schweiz als ganzes Land. Die Vorteile: die Infrastruktur wäre grösstenteils vorhanden und man müsste nicht viel bauen. Am realistischsten wäre eine Durchführung im 2030. Die Kritiker rechnen nicht damit, dass das IOC seine Versprechen hält und tatsächlich nachhaltige Spiele ermöglicht. Und ob eine private Finanzierung möglich ist, wie es die Promotoren vorschlagen, ist offen. Sind Olympische Winterspiele in der Schweiz unter neuen Rahmenbedingungen eine gute Idee? Darüber diskutiert die Live-Sendung «Forum». Gäste: * Philipp Bärtsch, Swiss Ski Kommunikation * Kaspar Schuler, Direktor Internationale Alpenschutzkommission CIPRA * Martin Müller, Professor für Geografie und Nachhaltigkeit an der Universität Lausanne (per Telefon zugeschaltet)

Wer Erfolg im Verkauf will muss sich laufend verändern Veränderungen sind für unsere Verkäufer zur Daueraufgabe geworden. Erfolg im Verkauf geht aber nur durch diese Veränderung der Verkäufer selbst. Die Veränderung des Verkäufers selbst durch die Veränderungen in verschiedenen Bereichen. Der Grund: Ohne Veränderung gibt es keinen Erfolg, kein Wachstum, keine Weiterentwicklung. Allerdings ist die Veränderung lediglich Voraussetzung, aber nicht Garant für den Erfolg. Denn Veränderungen können auch schief gehen. Sie werden zwar von außen angestoßen über den Markt, das Internet als Verkaufsmaschine oder eben durch das Unternehmen selbst, aber sie werden von innen gefördert oder – und das ist die entscheidende Erkenntnis – von innen gebremst. Verkauf und Veränderungen Folglich ist es für jedes Unternehmen von existentieller Bedeutung, die Treiber und Bremser von Veränderungen, die es nahezu in jeder Abteilung gibt, ausfindig zu machen. Mitarbeiter, die Veränderungen (wie z.B. Wachstumsinitiativen, Merger/Demerger, organisatorische Neuformierung) eher fördern und unterstützen, werden als Promotoren bezeichnet. Bremser dagegen – und die sind zumeist in der Mehrzahl – verhindern oder verlangsamen den Veränderungsprozess. Sie sind die Opponenten. Promotoren und vor allem Opponenten aufzuspüren, ist also eine sehr wichtige Aufgabe für den Vertriebsleiter in seiner Vertriebsmannschaft, denn die geplanten Veränderungen sollen Wachstum oder wenigstens Stabilität mit sich bringen – sonst hätte man sie ja nicht initiiert. Wachstum entsteht zwar am Markt und wird von diesem angestoßen, doch der eigentliche Wachstumsprozess wird von innen gefördert oder von innen gebremst. Veränderung des Verkäufers Promotoren und Opponenten lassen sich folgendermaßen klassifizieren: Machtpromotoren bzw. -opponenten beeinflussen den Veränderungsprozess aufgrund ihrer hierarchischen Stellung in der Organisation. Fachpromotoren bzw. -opponenten nehmen Einfluss aufgrund ihrer entsprechenden fachlichen Expertise und ihres Informationsstands. Prozesspromoten bzw. -opponenten sind zumeist die größte und wichtigste Gruppe. Prozesspromotoren beeinflussen den Veränderungsprozess aufgrund der formellen Kommunikationswege, in dem sie Verbindungen zwischen Macht- und Fachpromoten herstellen und dadurch Barrieren überwinden. Prozessopponenten dagegen konzentrieren sich mehr auf die informellen Kommunikationsbeziehungen und behindern den Veränderungsprozess, in dem sie organisatorische und fachliche Hindernisse errichten und Verbindungen zwischen Machtopponenten und Fachopponenten herstellen. Erfolg im Verkauf Da die Opponenten bzw. Bremser sehr häufig am längeren Hebel sitzen, gilt es, solche informellen Strukturen zu erkennen und aufzubrechen. Dabei kommt den Führungskräften eine ganz wesentliche Vorbildfunktion zu, um die Mitarbeiter als Träger des Wachstums zu begeistern. Ein Lösungsansatz sind altersgemischte Verkaufsteams, die idealerweise aus drei Gruppen bestehen: Junge Verkäufer sorgen für neues Denken und neue Ideen. Sie sind offener für digitale Entwicklungen, zeigen mehr Mut zu grundlegenden Veränderungen und legen ein anderes Tempo vor. Die Jungen öffnen vor allem Türen zu neuen Technologien. Die zweite Gruppe sind erfahrene „Quereinsteiger” im Verkauf  aus anderen Unternehmen. Sie leiden nicht unter Betriebsblindheit und haben aufgrund ihrer Seniorität mehr Durchsetzungsvermögen bei Veränderungen. Bestehende Produkte hingegen werden vor allem von der dritten Gruppe, des älteren Verkäufers vorangetrieben. Sie haben die notwendige Erfahrung, Weitsicht und Durchsetzungskraft. Diese drei Gruppen können sich perfekt ergänzen und so die informellen Opponentenstrukturen aufbrechen. Aktionsfelder im Verkauf Insgesamt sind es vier Aktionsfelder im Verkauf, auf denen sich Veränderungsprozesse (also das Change Management) im Tagesgeschäft des Verkäufers abspielen: Das erste Aktionsfeld ist die Strategie. Die Strategie – also der Weg zum Ziel – wird durch bereits eingetretene oder noch zu erwartende Veränderungen beeinflusst. Die Formulierung einer neuen Strategie wirkt nicht nur nach außen, sondern auch nach innen, d. h. sie bleibt in aller Regel nicht ohne Auswirkungen auf alle Mitarbeiter. Sie sollte deshalb von allen geteilt werden. Das zweite Aktionsfeld ist die Kultur. Gegenüber den „harten“ Faktoren gewinnt die Unternehmenskultur als „weiches“ Handlungsfeld für ein erfolgreiches Veränderungsmanagement zunehmend an Bedeutung. Verkäufer müssen rechtzeitig über Veränderungen informiert und in den Veränderungsprozess eingebunden werden. Geschieht dies nicht oder nicht rechtzeitig, so meldet sich allzu häufig das „natürliche Immunsystem“ einer Organisation – meist in Form von Opponenten Verkäufer. Das dritte Aktionsfeld ist die Organisation. Hiermit sind typische Maßnahmen der Reorganisation im Verkauf von Unternehmen angesprochen. Dazu zählen der Abbau von Hierarchieebenen ebenso wie die Einrichtung von Cost- und Profit-Centern oder der Übergang von einer funktionalen zu einer prozessorientierten Struktur. Restrukturierungsmaßnahmen sind dabei die konsequenteste Form eines transformativen Wandels. Das vierte und wohl wichtigste Aktionsfeld ist die Kommunikation des Verkäufers. Eine rechtzeitige, klare und offene Information des Verkäufer über die Ursachen, Ziele und Fortschritte des Wandels stellt sicher, dass die Gründe für die Einleitung eines Veränderungsprozesses auch verstanden werden. Führungskräfte und Verkäufer werden sich nur dann für den Wandel einsetzen am Markt, wenn sie ausreichend über das Veränderungsvorhaben informiert sind und den Gesamtzusammenhang zur Unternehmens- bzw. Marktstrategie kennen. Ein gut informierter Verkäufer ist zumeist auch ein guter Verkäufer.

Oppositionserfahrungen. Wohnungspolitik und sozialdemokratische Erneuerung in Deutschland und Großbritannien 1979–1998. Der Vortrag von Flemming Falz (Universität Jena) beleuchtet die britische und deutsche Sozialdemokratie in ihrer Oppositionszeit, von 1979/82 bis 1997/98 am Beispiel der Wohnungspolitik. Warum und wie haben sich die britische und die deutsche Sozialdemokratie in ihrer 20jährigen Oppositionszeit, von 1979/82 bis 1997/98, von den wichtigsten Befürwortern eines sozialstaatlich eingehegten Kapitalismus in engagierte Promotoren des Marktliberalismus gewandelt? Am Beispiel der Wohnungspolitik geht Flemming Falz (Universität Jena) in seinem Vortrag dieser Frage nach. Dazu setzt er nicht bloß auf der Ebene der Programmatik an, sondern fragt insbesondere nach den prägenden Oppositionserfahrungen sozialdemokratischer Politikerinnen und Politiker auf diesem Politikfeld. Das Kolloquium zur Zeitgeschichte findet in Kooperation mit dem Institut für Zeitgeschichte München–Berlin statt. Das Kolloquium fand am 21. Juni 2022 im Forum Willy Brandt Berlin statt. Zeitgleich wurde die Veranstaltung als Livestream auf dem YouTube-Kanal der Bundeskanzler-Willy-Brandt-Stiftung übertragen.

Unten sollen die Lastwagen fahren, darüber eine Trockenwiese gedeihen. mit diesem Projekt hoffen die Promotoren des dritten Hafenbeckens, genügend ökologische Ausgleichsflächen geschaffen zu haben. Die Umweltverbände bleiben skeptisch. Ausserdem: Gummi in den Tramgeleisen soll Velounfälle verhindern. Doch auf der Teststrecke weist der Gummi bereits Löcher auf. Der Grüne Landrat Klaus Kirchmayer tritt nach 15 Jahren zurück. Basel Area hilft so viele Firmen anzusiedeln wie noch nie.

In dieser Episode sprechen wir mit Nick Sohnemann. Es ist CEO der Innovationsagentur Future Candy. Im ersten Teil thematisieren wir die Notwendigkeit Innovationen nicht nur theoretisch zu kennen, sondern sie intensiv auszuprobieren, sie zu testen und von ihnen zu lernen. Nicks These ist, je mehr praktisches Erfahrungswissen Innovationverantwortliche haben, desto mehr Leadership können sie ihren Teams geben. Im zweiten Teil zeigt Nick Möglichkeiten auf, wie sich Innovationserfahrungen aus erster Hand aufbauen lassen. Denn Innovationsentscheider sollten mehr als ein gutes Vorbild sein. Als echte Promotoren müssen sie mit Mut und Überzeugungskraft vorangehen. Welche weiteren Faktoren dabei eine Rolle spielen, erfahrt ihr am Ende. Habt ihr Fragen an Nick? Kontaktiert ihn unter nick@futurecandy.com oder auf LinkedIn https://www.linkedin.com/in/nicksohnemann Jetzt zum Innovators Webinar anmelden https://www.trendone.com/webinare Teste den Trendmanager 14 Tage lang kostenlos https://www.trendmanager.com/de/testen/ Die Host: Peter von Aspern https://www.linkedin.com/in/peter-von-aspern Sebastian Metzner https:/www.linkedin.com/in/sebastianmetzner Sendet uns gern eine Whatsapp Sprachnachricht an: +49 172 67 82 736 Schreibt uns Feedback per Mail an: podcast@trendone.com

Das geplante Eissportzentrum bei der Signal-Bahn in St. Moritz wird nicht gebaut. Der Gemeinderat lehnt das Projekt ab. Die Regionalplaner der Region Maloja müssen nun einen anderen Standort für eine Eishalle finden. Der Katzenjammer bei den Promotoren ist gross.  Weitere Themen: * Regierungsratskandidat Marcus Caduff im Gespräch * Thurgauer will Sternenlicht als Energiequelle für die Erde nutzen

Was ist die AMIGO Community und wie werde ich Promoter? Hört rein, findet es heraus!Schreibt uns gerne ein E-Mail mit Themenvorschlägen.Besucht uns auch auf unserer Webseite. Decke fällt euch auf den Kopf? Wir schaffen Abhilfe. Einfach mal hier klicken,...

Ref.: Claudia Wieland , Koordinatorin "Radio Horeb Team Deutschland“

Ref.: Sabine Römer, Leiterin "Radio Horeb Team Deutschland“

Claudia Wieland, Leiterin Team Deutschland zusammen mit vielen ehrenamlichen Mitarbieter.

Ref.: Sabine Römer, von der Radio Horeb Öffentlichkeitsarbeit, Studio München Mod.: Sabine Böhler „Wovon das Herz überfließt, davon spricht der Mund“.

Thema heute:    DAB+ zur IFA: Thementag und bundesweite  Aktionsphase ARD, Deutschlandradio, private Anbieter und weitere Mitglieder des Vereins Digitalradio Deutschland bewerben im Umfeld der Internationalen Funkausstellung Berlin 2018 (IFA) wieder gemeinsam den Radiostandard von heute. Vom 27. August bis 08. September steht die Freude am Radiohören zum zweiten Mal in diesem Jahr im Mittelpunkt. Zu den crossmedialen Maßnahmen zählen unter anderem TV- und Funkspots, Print- und Onlinemotive sowie Programmhinweise.   Die neu vorgelegten Hörfunkspots setzen einen Schwerpunkt auf den klaren, digitalen Empfang, zum Beispiel im Auto oder in der Freizeit unter dem Slogan „DAB+, denn so geht Radio heute.“ Die Betonung liegt auf dem freien Empfang, besonders unterwegs. Unter dem Markenclaim „DAB+. Mehr Radio“ setzen Anzeigen und Social Media Postings auf prägnante, saisonal passende Schlagzeilen und verweisen auf die Webseite dabplus.de sowie den Fachhandel. Die im Auftrag des Vereins Digitalradio Deutschland agierenden Promotoren schulen derzeit das Verkaufspersonal und platzieren DAB+ Werbematerial in hunderten Elektromärkten. Bundesweite Schwerpunkte bilden die Ballungsräume sowie ab Mitte September die Region Berlin/Brandenburg. Wer auf der Suche nach einem neuen DAB+ Radio ist, kann in der Hauptstadtregion von Handelskooperationen zwischen Herstellern und Elektromärkten profitieren, die Kundenvorteile ausloben. Welche DAB+ Neuheiten gibt es auf der IFA? Wie ist der Empfang von DAB+ im Auto? Welche neuen DAB+ Programme sind in den vergangenen Monaten auf Sendung gegangen? Diese und mehr Fragen beantworten die Beiträge, Interviews und Reportagen anlässlich des DAB+ Thementags. Dreimal im Jahr werben die Mitglieder des Vereins Digitalradio Deutschland in bundesweiten Aktionszeiträumen, um auf DAB+ und die fortschreitende Digitalisierung des Hörfunks aufmerksam zu machen. Die Maßnahmen werden branchenübergreifend getragen, also von Herstellern, Netzbetreibern, den öffentlich-rechtlichen und vielen privaten Programmanbietern. Der dritte gemeinsame Aktionszeitraum ist zum Weihnachtsgeschäft geplant.  In den letzten Monaten hat die DAB+ Programmvielfalt weiter zugenommen: Es gibt inzwischen über 200 unterschiedliche regional ausgestrahlte Angebote öffentlich-rechtlicher und privater Anbieter. DAB+ ist auf 98 Prozent der Fläche verfügbar, die Autobahnen sind fast voll ausgebaut.   Diesen Beitrag können Sie nachhören oder downloaden unter:

Was beeinflusst die Kaufentscheidung des Kunden? Und warum muss ich mich als Verkäufer verändern, um erfolgreich verkaufen zu können? Wer Erfolg im Verkauf will muss sich verändern Veränderungen sind für unsere Verkäufer zur Daueraufgabe geworden. Die Veränderung des Verkäufers selbst durch die Veränderungen in verschiedenen Bereichen. Der Grund: Ohne Veränderung gibt es keinen Erfolg, kein Wachstum, keine Weiterentwicklung. Allerdings ist die Veränderung lediglich Voraussetzung, aber nicht Garant für den Erfolg. Denn Veränderungen können auch schief gehen. Sie werden zwar von außen angestoßen über den Markt, das Internet als Verkaufsmaschine oder eben durch das Unternehmen selbst, aber sie werden von innen gefördert oder – und das ist die entscheidende Erkenntnis – von innen gebremst. Verkauf und Veränderungen Folglich ist es für jedes Unternehmen von existentieller Bedeutung, die Treiber und Bremser von Veränderungen, die es nahezu in jeder Abteilung gibt, ausfindig zu machen. Mitarbeiter, die Veränderungen (wie z.B. Wachstumsinitiativen, Merger/Demerger, organisatorische Neuformierung) eher fördern und unterstützen, werden als Promotoren bezeichnet. Bremser dagegen – und die sind zumeist in der Mehrzahl – verhindern oder verlangsamen den Veränderungsprozess. Sie sind die Opponenten. Viele wertvolle Tipps erhalten Sie in dieser Folge. Ihre Ulrike Knauer.

Das Paprika Resistenzgen Bs4C aus Capsicum pubescens vermittelt Resistenz gegenüber Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv)-Stämmen, die den (transcription activator-like) TAL-Effektor AvrBs4 exprimieren. Vorangegangene Arbeiten ließen vermuten, dass AvrBs4 die Expression von Bs4C transkriptionell induziert. In einem “proof of principle”-Experiment, wurde Bs4C unter Verwendung eines RNA-Seq-basierten Ansatzes isoliert. Unter 68 differentiell AvrBs4-induzierten Paprikagenen war jedoch nur eines, das ausschließlich in der resistenten und nicht in der suszeptiblen Akzession induziert war und für das kein Transkript in Abwesenheit von AvrBs4 in der resistenten Akzession nachgewiesen wurde. Kopplungs- und Komplementationsanalysen bestätigten dieses Kandidatengen als das gesuchte Resistenzgen Bs4C. Im Bs4C-Promoter konnte ein Effektorbindeelement (EBE) für AvrBs4 identifiziert werden, das notwendig und ausreichend für die AvrBs4-Bindung an und transkriptionelle Aktivierung von Bs4C ist. Bindungsstudien ließen erkennen, dass zwei Nukleotidpolymorphismen in der korrespondierenden Region der suszeptiblen Akzession eine stark reduzierte Affinität (10fach) gegenüber AvrBs4 bedingen. Außerdem zeigten GUS-Studien, dass der Promoter des suszeptiblen Allels nicht durch AvrBs4 induzierbar ist. Folglich bestimmt ein Substitutionspolymorphismus von zwei Basenpaaren in den Promotoren des resistenten und suszeptiblen Bs4C-Allels über Resistenz oder Suszeptibilität gegenüber AvrBs4-exprimierenden Xanthomonaden. Bs4C kodiert für ein 164-AS großes Protein, das keine Homologie zu Proteinen mit bekannter Funktion aufweist. In silico Proteinstrukturanalysen sagen vier Transmembranhelices in Bs4C vorher und demzufolge stellt es einen neuen Typ von Exekutorproteinen dar, welcher Resistenz gegen TALE-exprimierende Xanthomonas-Stämme vermittelt. Zudem konnten Sequenzanalysen mindestens ein Homolog in C. pubescens und mindestens sieben Homologe in C. annuum identifizieren. Interessanterweise kodieren die meisten von ihnen aufgrund von Nukleotidaustauschen, Leserahmenverschiebungen und Insertions/Deletionspolymorphismen nicht für Volllängen Bs4C-ähnliche Proteine. Folglich könnten diese homologen Sequenzen duplizierte Gene repräsentieren, die nicht mehr funktional sind.

Helicobacter pylori ist ein gramnegatives, spiralförmiges Bakterium, dessen natürliches Habitat der menschliche Magen darstellt. Ungefähr 50% der weltweiten Bevölkerung gelten als infiziert, wobei die Infektion nur in 10% der Fälle symptomatisch ist. Komplikationen einer H. pylori Infektion sind chronische Gastritis, Ulcus ventriculi et duodeni, Magenkarzinom und gastrales MALT-Lymphom. Obwohl die gemeinsame Geschichte von Homo sapiens und Helicobacter pylori weit zurückreicht, wurde H. pylori und sein Zusammenhang mit diversen Magenerkrankungen erst in den 80iger Jahren des 20. Jahrhunderts bekannt, was dazu führt, dass noch viele Fragen unbeantwortet sind. Biolumineszenz Bildgebung in vitro und in vivo könnte bei der Antwortsuche behilflich sein. Die Möglichkeit durch biolumineszierende Erreger Infektionen longitudinal und quasi unmittelbar im lebenden Tier darstellen zu können ohne das Versuchsobjekt bei der Untersuchung zu zerstören, stellt eine große Chance dar, die schon bei vielen verschiedenen Bakterien genutzt wurde. Ziel dieser Arbeit war es mit Hilfe des Luciferase-Operons des Bakteriums Photorhabdus luminescens biolumineszierende H. pylori zu konstruieren und im Weiteren deren Überleben im Tiermodell zu testen. Dabei wurden verschiedene Konstrukte gewählt, die entweder das Lux-Operon (luxCDABE) im Ganzen exprimierten oder geteilt in seine funktionellen Einheiten luxAB und luxCDE. Weiter wurden verschiedene Insertionsorte und verschiedene Promotoren ausprobiert. Es gelang schließlich 7 verschiedene biolumineszierende H. pylori Mutanten mit verschiedenen Biolumineszenzintensitäten zu generieren. Von diesen H. pylori Mutanten konnte eine 8 Wochen nach Infektion aus dem Tier rückisoliert werden, wobei die Fähigkeit zur Biolumineszenz erhalten blieb. Die ersten Schritte auf dem Weg zu einem biolumineszierenden H. pylori und der Biolumineszenz Bildgebung desselben in vivo sind getan. Verbesserungen der Konstrukte, andere Promotoren, Insertionsorte, Modelltiere und neuartige CCD-Kameras lassen eine große Bandbreite an Variationen und Möglichkeiten zu, deren Ergebnisse sich in Zukunft weiter zeigen werden.

Der in der Evolution hochkonservierte Wnt-Signalweg spielt in der Embryonalentwicklung, der Stammzellbiologie sowie in der Entstehung von Tumoren eine tragende Rolle. Es werden dabei verschiedene Arten der Wnt-vermittelten Signalübertragung unterschieden: Einerseits der sogenannte kanonische, über β-Catenin vermittelte Wnt-Signalweg und andererseits der Wnt/Ca2+- sowie der planar cell polarity (PCP)-like-Weg, die beide die Signaltransduktion unabhängig von β-Catenin übermitteln. Bislang sind die Mechanismen des Wnt/β-Catenin-Signalweges nur teilweise aufgeklärt, wobei insbesondere das Zusammenspiel von Wnts, Frizzleds und deren Korezeptoren auf funktioneller und struktureller Ebene bis heute nur rudimentär beschrieben wurden. In unserer Arbeitsgruppe konnte in vorangegangenen Arbeiten gezeigt werden, dass der Frizzled-8-Rezeptor (Fzd8) in HT1080-Fibrosarkomzellen im Verhältnis zu den übrigen Fzds sehr stark exprimiert wird und seine erhöhte Expression mit einer Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Signalweges sowie mit einer erhöhten Invasivität und Proliferation assoziiert ist (Leitenstern et al., mündliche Mitteilung). Ferner wurde gezeigt, dass die Expression von Fzd8 durch Wnt3a bzw. den kanonischen Wnt-Signalweg negativ reguliert wird (Karow 2008; Kolben, Perobner et al. 2012). Vor diesem Hintergrund sollte nun im Rahmen dieser Arbeit mit Hilfe von Reportergenexperimenten die transkriptionelle Regulation von Fzd8 im Detail untersucht werden. Hierzu wurden die Fzd8-Promotorregion und verschiedene 5’- und 3’-terminale Verkürzungsvarianten in den Vektor pGLuc-Basic kloniert, der eine Quantifizierung der Promotoraktivität mittels des Reporterproteins Gaussia Luciferase erlaubt. Der Fzd8-Promotor konnte durch dieses Verfahren in aktivierende und repressive Elemente unterteilt werden, wobei auch ein putatives Enhancer-Element identifiziert werden konnte. Unter Wnt3a-Stimulation zeigten alle untersuchten Promotorkonstrukte eine verringerte Reporterproteinaktivität, was auf eine negative Regulation von Fzd8 durch Wnt3a hinweist. Interessanterweise aber führten Manipulationen am Wnt/β-Catenin-Signalweg weiter downstream zu entgegengesetzten Ergebnissen. So führte ein APC-Knockdown, der mit einer starken Aktivitätszunahme des Wnt/β-Catenin-Signalweges einhergeht, zu einer Zunahme der Fzd8-Promotoraktivität. Im Gegensatz hierzu ging ein Knockdown von β-Catenin, der einer Inhibierung des Wnt/β-Catenin-Signalweges gleichkommt, mit einer verminderten Fzd8-Promotoraktivität einher. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Wnt3a-vermittelte Repression von Fzd8 auch unabhängig vom kanonischen Wnt/β-Catenin-Signalweg erfolgen könnte. Des Weiteren wurde die Fzd8-Promotorregion einer in silico-Analyse mit der Software MatInspector unterzogen, um mögliche Transkriptionsfaktoren zu identifizieren, die für die Fzd8-Regulation maßgeblich sein könnten. Dabei zeigte sich, dass der Transkriptionsfaktor ZF5, der sowohl aktivierend als auch reprimierend an verschiedenen Promotoren wirken kann, aufgrund des Verteilungsmusters seiner Bindungsstellen am Fzd8-Promotor als möglicher Regulator fungieren könnte. ZF5 konnte dabei als putativ positives Wnt/β-Catenin-Zielgen charakterisiert werden. Es konnte ferner gezeigt werden, dass Fzd8 indirekt über ZF5 durch den Wnt/β-Catenin-Signalweg induziert werden kann. Da ZF5 wie auch Fzd8 in HT1080-Fibrosarkomzellen stark exprimiert wird und die ZF5-Überexpression mit einer Zunahme des Wnt/β-Catenin-Signals einhergeht, könnte hier ein positiver feedback loop vorliegen. Somit könnte diese Amplifikation des Wnt/β-Catenin-Signals von maßgeblicher Bedeutung für die verstärkte Proliferation und Invasivität von mesodermalen Tumoren sein.

Om hun onafhankelijkheid te behouden gaan oudere echtgenoten met toenemende gezondheidsproblemen steeds meer activiteiten samen doen. Mannen met fysieke beperkingen behouden hun sociale participatie als hun vrouw gezond is. De sociale participatie van diezelfde gezonde vrouwen vermindert echter als hun echtgenoot fysieke beperkingen heeft. Dit concludeert ergotherapeut Fenna van Nes. Zij onderzocht hoe echtparen zich aanpassen als zij door gezondheidsproblemen hun dagelijkse activiteiten niet meer kunnen doen zoals zij gewend waren. De ervaringen van 80+ echtparen stonden centraal. Daarnaast analyseerde zij in een 50+ groep de invloed van fysieke gezondheidsproblemen van de ene echtgenoot op de sociale participatie van de partner. Van Nes laat zien dat het veranderingsproces van dagelijkse activiteiten gefaseerd verloopt, waarbij echtgenoten met toenemende gezondheidsproblemen steeds meer activiteiten samen gaan doen, zodat zij zo lang mogelijk samen hun zelfstandigheid kunnen behouden. Tijdens dit veranderingsproces krijgen activiteiten voor hen een andere betekenis. Daardoor kunnen zij hun individuele en gezamenlijke identiteit behouden. Daarnaast toont het onderzoek een verschil aan tussen mannen en vrouwen. Mannen met fysieke beperkingen behouden hun sociale participatie als hun vrouw gezond is. De sociale participatie van gezonde vrouwen vermindert echter als hun echtgenoot fysieke beperkingen heeft. Dit onderzoek laat de onderlinge beïnvloeding van oudere echtgenoten zien. Steeds meer echtgenoten zullen samen oud worden en zelfstandig thuis blijven wonen, ook met toenemende gezondheidsproblemen. Specifieke aandacht lijkt gewenst voor de sociale participatie van gezonde vrouwen met een echtgenoot met gezondheidsproblemen. Promotoren: prof.dr. D.J.H. Deeg, prof.dr. T.A. Abma, Copromotor: dr. H. Jonsson. Datum: 13-06-2013

Om hun onafhankelijkheid te behouden gaan oudere echtgenoten met toenemende gezondheidsproblemen steeds meer activiteiten samen doen. Mannen met fysieke beperkingen behouden hun sociale participatie als hun vrouw gezond is. De sociale participatie van diezelfde gezonde vrouwen vermindert echter als hun echtgenoot fysieke beperkingen heeft. Dit concludeert ergotherapeut Fenna van Nes. Zij onderzocht hoe echtparen zich aanpassen als zij door gezondheidsproblemen hun dagelijkse activiteiten niet meer kunnen doen zoals zij gewend waren. De ervaringen van 80+ echtparen stonden centraal. Daarnaast analyseerde zij in een 50+ groep de invloed van fysieke gezondheidsproblemen van de ene echtgenoot op de sociale participatie van de partner. Van Nes laat zien dat het veranderingsproces van dagelijkse activiteiten gefaseerd verloopt, waarbij echtgenoten met toenemende gezondheidsproblemen steeds meer activiteiten samen gaan doen, zodat zij zo lang mogelijk samen hun zelfstandigheid kunnen behouden. Tijdens dit veranderingsproces krijgen activiteiten voor hen een andere betekenis. Daardoor kunnen zij hun individuele en gezamenlijke identiteit behouden. Daarnaast toont het onderzoek een verschil aan tussen mannen en vrouwen. Mannen met fysieke beperkingen behouden hun sociale participatie als hun vrouw gezond is. De sociale participatie van gezonde vrouwen vermindert echter als hun echtgenoot fysieke beperkingen heeft. Dit onderzoek laat de onderlinge beïnvloeding van oudere echtgenoten zien. Steeds meer echtgenoten zullen samen oud worden en zelfstandig thuis blijven wonen, ook met toenemende gezondheidsproblemen. Specifieke aandacht lijkt gewenst voor de sociale participatie van gezonde vrouwen met een echtgenoot met gezondheidsproblemen. Promotoren: prof.dr. D.J.H. Deeg, prof.dr. T.A. Abma, Copromotor: dr. H. Jonsson. Datum: 13-06-2013

Tue, 15 Feb 2011 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/12740/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/12740/1/Bergbauer_Martin.pdf Bergbauer, Martin ddc:570, ddc:500, Fakultät für Biologie

Ypie, ich hab mal wieder Zeit gefunden - Toure gerade für m2b durch Österreich und darf unsere neuen Promotoren schulen - Party kommt auch nicht zu kurz :-) Weiters war ich auch noch am Frequency-Festvial

Embryonale Stammzellen stellen aufgrund ihrer Fähigkeit, in vitro in verschiedene Subtypen von Kardiomyozyten zu differenzieren, eine vielversprechende Quelle für eine spezifische Zellersatztherapie ischämischer Herzerkrankungen dar. Ein wesentliches Hindernis, das große therapeutische Potenzial embryonaler Stammzellen für klinische Zelltransplantationen zu nutzen, besteht darin, dass es bisher kein geeignetes Verfahren gibt, den gewünschten Zelltyp zu isolieren. Die Applikation hochaufgereinigter definierter Subpopulationen ist jedoch Voraussetzung, um optimale funktionelle Effekte zu erzielen und andererseits eine potenzielle intramyokardiale Teratomformation aus mittransplantierten undifferenzierten ES-Zellen zu vermeiden. Die Verwendung Zelltyp-spezifischer Promotoren zur Expression eines transgenen Oberflächenmarkers könnte die zellschonende und nicht immunogene Aufreinigung eines gewünschten aus ES-Zellen gewonnenen Zelltyps mit hoher Ausbeute ermöglichen und damit eine wichtige Basis für künftige Zelltransplantationen liefern. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Protokoll etabliert, um mittels der magnetischen Zellsortierung (MACS), dem gegenwärtigen Goldstandard einer zellschonenden und effizienten Zellseparation, stabil transfizierte murine embryonale Stammzellen aufzureinigen. Für MACS wurden ES-Zellen markiert, die ein intrazellulär trunkiertes CD4-Oberflächenprotein (∆CD4) unter der Kontrolle des konstitutiv aktiven PGK-Promotors stabil exprimierten. Um die markierten Zellen in vivo fluoreszenzmikroskopisch detektieren zu können, erfolgte in einem Parallelansatz eine Fusion des ∆CD4 mit einem intrazellulären EGFP-Teil (∆CD4EGFP). Die Funktionalität dieses Fusionsproteins wurde ebenso gezeigt wie dessen Eignung für die MACS-Aufreinigung, mit welcher Reinheiten von über 97% erzielt wurden. Die Expression des ∆CD4-Moleküls ohne EGFP-Anteil führte nach MACS zu über 98% positiven vitalen Zellen. Dabei waren die jeweils erzielten Reinheiten unabhängig von dem Differenzierungszustand der Zellen und der initialen Frequenz positiver Zellen (0,6% bis 16%). Die Vitalität der aufgereinigten Zellen nach dem MACS-Prozess wurde dadurch belegt, dass diese in der Lage waren, zu reaggregieren und normale „Embryoid Bodies“ auszubilden, die Marker aller drei embryonaler Keimblätter exprimierten. Parallel zur Etablierung der MACS-Methode wurde der kardial spezifische humane 2,75kb Nkx2.5-Promotor über die Expression des in vivo-Markers EGFP in murinen embryonalen Stammzellen untersucht. Die fluoreszenzmikroskopischen und durchflusszytometrischen Ergebnisse korrelierten mit dem erwarteten embryonalen Aktivitätsprofil des Nkx2.5-Promotors. RT-PCR-Analysen früher kardialer Marker zeigten, dass der hNkx2.5-Promotor Zellen markiert, deren Expressionsmuster dem früher kardial determinierter Zellen entspricht. Der 2,75 kb lange hNkx2.5-Promotor bietet damit einen vielversprechenden Ansatz, kardiale Vorläuferzellen innerhalb des heterogenen Zellspektrums sich differenzierender ES-Zellen zu identifizieren. Ein Transfer auf das in dieser Arbeit etablierte MACS-System könnte die effiziente, zellschonende und nicht immunogene Aufreinigung kardialer Vorläuferzellen aus humanen ES-Zellen ermöglichen. Dieser Ansatz könnte die Therapie ischämischer Herzmuskelerkrankungen mit embryonalen Stammzellen der klinischen Anwendung einen entscheidenden Schritt näher bringen.

Die ersten transgenen Tiere wurden durch viralen Gentransfer erzeugt. Für die initialen Versuche wurden prototypische Retroviren, wie der murine Leukämievirus (MuLV), verwendet. Es stellte sich jedoch heraus, daß die proviralen Gene in diesen Mäusen stark methyliert waren und nicht oder nur in geringen Mengen exprimiert wurden ("gene silencing"). Ein Durchbruch für die virale Transgenese kam erst mit der Verwendung lentiviraler Vektoren. Lentiviren sind in der Lage eine Vielzahl verschiedener Zelllinien (auch terminal differenzierte Zellen) effizient zu transduzieren und ihre virale DNA stabil in das Wirts-Chromosom zu integrieren. Obwohl bereits transgene Nagetiere durch lentivirale Vektoren erzeugt werden konnten, waren initiale Versuche in höheren Säugetieren (Affen) nicht erfolgreich. Dies warf die Frage auf, ob lentiviraler Gentransfer in höheren Säugetieren anwendbar ist. Transgene Schweine und Rinder wären von großer biomedizinischer Bedeutung. Ihre potentiellen Anwendungsmöglichkeiten reichen von der Produktion pharmazeutisch relevanter Proteine über klinische Modelle zur Untersuchung humaner Erkrankungen bis hin zur Xenotransplantation. Obwohl mit der klassischen DNA-Mikroinjektion transgene Schweine und Rinder erzeugt werden können, ist das Verfahren in diesen Spezies jedoch sehr ineffizient und dementsprechend kostenintensiv. Da hohe Produktionskosten den möglichen Anwendungen entgegenstehen, wurde versucht ein effizientes Verfahren, daß auf lentiviralem Gentransfer beruht, zu entwickeln. Für die Entwicklung der lentiviralen Transgenese in Schweinen wurden Zygoten mit Lentiviren infiziert und in Empfänger transferiert. Die verwendeten Vektoren trugen einen eGFP-Reporter, um die Effizienz der Transduktion schnell und einfach beurteilen zu können. Von den 46 geborenen Ferkeln waren 32 transgen und 30 zeigten Transgen-Expression (65%). Die hohe Transgenese-Rate, die mit dem lentiviralen Gentransfer erreicht werden konnte, stellt eine 27fache Steigerung der Effizienz im Vergleich zur klassischen DNA-Mikroinjektion dar. Die Untersuchung der transgenen Ferkel zeigte Transgen-Expression in allen Organe und keinen sichtbaren Mosaicismus der F0-Tiere. Des weiteren konnte eine nahezu lineare Korrelation zwischen der Anzahl der integrierten Proviren und der Höhe der Transgen-Expression gezeigt werden. Die Expression der lentiviralen Transgene war stabil und wurde nicht nach der Geburt der Tiere abgeschaltet. Durch die Wahl geeigneter Promotoren war es möglich sowohl ubiquitäre, als auch Gewebe-spezifische Expression (in der Haut) zu erreichen. Die integrierten Proviren wurden über die Keimbahn an die nächste Generation weitergegeben und in der F1-Generation unverändert stark exprimiert. Die Weitergabe der integrierten Proviren an die nächste Generation ist die Basis für Erzeugung transgener Linien. Zur Erzeugung transgener Rinder wurden initial ebenfalls Zygoten infiziert. Diese wurden in vitro bis zum Blastozysten-Stadium (Tag 7) kultiviert. Überraschenderweise zeigten die Blastozysten nur sehr geringe Transgen-Expression. Nachdem durch Transfer solcher Blastozysten keine transgenen Nachkommen erzeugt werden konnten, wurde zur Infektion von Oozyten (vor der Befruchtung) gewechselt. In den aus Oozyten-Infektion stammenden Blastozysten war die Gentransfer-Rate wesentlich höher (insgesamt 83% eGFP+ Blastozysten) und die eGFP-Fluoreszenz um ein Vielfaches intensiver. Acht eGFP-positive Blastozysten wurden in vier Empfänger transferiert, was zur Geburt von vier transgenen Rindern führte. Alle erzeugten transgenen Rinder zeigten stabile Expression des Transgens in allen untersuchten Organen. Als eine weitere Methode zur Erzeugung lentiviral transgener Rinder wurde der Kerntransfer (NT) untersucht. Hierzu wurden Haut-Fibroblasten vom Rind lentiviral transduziert und als Donor-Zellen verwendet. Dieser Ansatz war zwar wesentlich ineffizienter als die direkte Infektion von Oozyten, trotzdem konnte ein transgenes Rind erzeugt werden, das starke Transgen-Expression zeigte. Da die Expression lentiviraler Integranten offenbar durch das klassische Klonen nicht abgeschaltet wird, eröffnet diese Methode viele Möglichkeiten für die Produktion transgener Tiere. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde die epigenetische Regulation lentiviraler Vektoren untersucht. Dazu wurden transgene Founder-Schweine verpaart, um Tiere mit einzelnen lentiviralen Integranten (F1-Generation) zu erzeugen. Die Expressions-Analyse dieser Schweine zeigte, daß etwa 1/3 der Proviren nur schwach bzw. gar nicht exprimierten. Durch Southern Blot Analysen mit Methylierungs-sensitiven Restriktions-Enzymen wurde der Grad der proviralen Methylierung bestimmt. Dieser korrelierte negativ mit der Transgen-Expression. Zur genaueren Analyse der Methylierungs-Dichte wurden die verschiedenen Proviren mittels Bisulfit-Sequenzierung untersucht. Es stellte sich heraus, daß in den schwach bzw. nicht-exprimierenden Integranten nahezu alle CpG-Dinukleotide innerhalb der untersuchten Sequenzen methyliert waren. Um den Einfluß der Methylierung auf die Expression zu untersuchen, wurde von einem nicht-exprimierenden Schwein Haut-Fibroblasten isoliert und mit dem Methylase-Inhibitor 5-AzaC inkubiert. Dadurch konnte die abgeschaltete eGFP-Expression wieder reaktiviert werden. Dagegen hatte der Histon-Deacetylase Inhibitor TSA keinen starken Einfluß auf die Transgen-Expression. Chromatin-Modifikationen durch TSA-abhängige HDACs scheinen also bei der epigenetischen Regulation lentiviraler Vektoren in Schweinen keine entscheidende Rolle zu spielen. Abschließend konnte durch einen Methylierungs-sensitiven Southern Blot gezeigt werden, daß der Grad der DNA-Methylierung durch Hemmung zellulärer Methylasen (mit 5-AzaC) signifikant reduziert wurde. Lentiviraler Gentransfer stellte sich als eine sehr effiziente Methode zur Erzeugung transgener Schweine und Rinder heraus. Das Verfahren zeichnet sich insbesondere durch hohe Transgenese-Raten und hohe Transgen-Expression aus. Außerdem werden die lentiviralen Integranten über die Keimbahn an die nächste Generation weitergegeben. Obwohl die Transkription einiger Proviren epigenetisch reguliert wurde, ist die Häufigkeit des aufgetretenen Silencings deutlich geringer als bei prototypischen Retroviren.

Hintergrund und Fragestellung Eines der schwerwiegenden Probleme der interventionellen Kardiologie stellte bislang die koronare Restenose im Stent dar. Erst durch die Einführung eines Rapamycin- freisetzenden-Stents konnte die Restenoserate erheblich gesenkt werden. Trotz dieses therapeutischen Erfolges sind die transkriptionellen pathophysiologischen Mechanismen der Neointimahyperplasie, die zu über 90% für den Lumenverlust nach koronarer Stentimplantation verantwortlich ist, sowie deren Beeinflussung durch Rapamycin nur teilweise verstanden. Methodik Die vorliegende Arbeit untersuchte deshalb in einem humanen Organkulturmodell auf genregulatorischer Ebene die molekularen Mechanismen, die der Neointimaformation im Menschen zu Grunde liegen, sowie die Beeinflussung dieser Mechanismen durch eine Behandlung mit Rapamycin. Ergebnisse Es konnte gezeigt werden, dass (1) die Veränderungen in der Genexpression einem zeitlichen Muster folgen mit maximalen Veränderungen 21 Tage nach Ballondilatation; (2) die inflammatorische Komponente zu den frühen Zeitpunkten eine wichtigere Rolle spielt während Proliferation und Apoptose die späteren Veränderungen in der Genexpression dominieren; (3) die Ballonangioplastie ein Genexpressionsprofil induziert, welches die Rekrutierung und Aktivierung sowohl inflammatorischer als auch hämatopoetischer Vorläuferzellen erleichtert; (4) Rapamycin die Induktion eines solchen pro-adhäsiven, proinflammatorischen Genexpressionsmusters als auch die Induktion von HPC-stimulierenden Genen verhindert. Diskussion Eine zeitlich gestaffelte Genexpressionsanalyse menschlicher Arterien nach Ballonangioplastie ist bisher nicht veröffentlicht worden. In dieser Arbeit zeigte sich, dass die Veränderungen in der Genexpression einem zeitlichen Muster folgen mit einer maximalen Alteration nach 21 Tagen und nur wenigen ausschließlich nach 56 Tagen regulierten Genen. Somit lässt sich schlussfolgern, dass eine spätere Restenose die Folge einer frühen, gestörten Wundheilung ist. Diese Auffassung wird durch die beeindruckende Verminderung der In-Stent-Restenose durch Rapamycin-freisetzende Stents unterstützt, da diese Stents etwa 80% der totalen Medikamentendosis innerhalb der ersten 30 Tage freisetzen. Während die Proliferation bekanntermassen eine wichtige Rolle für die Neointimaformation spielt, wurde die Bedeutung inflammatorischer Prozesse, welche zur Rekrutierung von Leukozyten und hämatopoetischen Vorläuferzellen führen, erst später vermehrt beschrieben. Die koordinierte Induktion eines in dieser Arbeit nachgewiesenen proinflammatorischen Genexpressionsmusters stellt eine beeindruckende Rationale für eine umfangreiche Rekrutierung von Leukozyten nach Ballondilatation dar. Zytokine wie IL-8, EMAP-II, NAP-2 oder GCP-2 waren nach Angioplastie vermehrt exprimiert und verstärken die Migration von Granulozyten. Die mechanisch induzierte Aktivierung dieses Genexpressionsmusters begünstigt somit die Leukozytenrekrutierung und dadurch auch die Restenose, da die Dichte inflammatorischer Zellen in der Neointima mit dem Ausmass der Restenose korreliert. Als weiterer Mechanismus der Neointimaformation wurde kürzlich die Rekrutierung hämatopoetischer Vorläuferzellen im Tiermodell nachgewiesen. Es war jedoch bisher nicht bekannt, ob sich diese Beobachtungen auf den Menschen übertragen lassen. Im Organkulturmodell zeigte sich nach Angioplastie die vermehrte Expression von einigen mit hämatopoetischen Vorläuferzellen assoziierten Genen. Dies weist daraufhin, dass diese Mechanismen auch im Menschen eine Rolle spielen. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde der Einfluss des Makrolidantibiotikums Rapamycin auf die transkriptionellen Mechanismen nach Ballonangioplastie untersucht. Zunächst spiegelten sich die bekannten antiproliferativen Effekte von Rapamycin in einer deutlich verminderten Expression von wachstumsassoziierten Genen wie verschiedenen Transkriptionsfaktoren und Kinasen wie JAK1 oder AKT1 wieder. Darüberhinaus führte die Rapamycinbehandlung zu einer koordinierten Hemmung der CXC Chemokine 6-8 (GCP-2, β- Thromboglobulin, IL-8) und von EMAP-II, welche alle eine wichtige Rolle in der Adhäsion, der Migration und der Aktivierung von Neutrophilen und Monozyten spielen. Folglich könnte eine durch Rapamycin veminderte Rekrutierung und Aktivierung dieser Zellen ein wesentlicher Mechanismus in der Reduktion der Neointimaformation sein. Zusätzlich unterstützt diese Arbeit die Hypothese, dass Rapamycin auch direkte Effekte auf hämatopoetische Vorläuferzellen hat. Im Organkulturmodell führte eine Rapamycinbehandlung zur veminderten Expression verschiedener Gene wie des Oncostatin M Rezeptors beta und JAK1, welche das Wachstum immaturer, noch differenzierender Zellen in der Gefässwand fördern. Es lässt sich zusammenfassen, dass Rapamycin neben seiner anti-proliferativen Wirkung nach Ballonangioplastie tiefgreifende hemmende Effekte auf das pro-inflammatorische Genexpressionsmuster und auf Promotoren hämatopoetischer Vorläuferzellen verübt. Somit zeigt diese Arbeit erstmals eine Rationale auf, wie Rapamycin auch im Menschen die Rekrutierung hämatopoetischer Vorläuferzellen in die Gefässwand verhindern könnte. Dies vermag möglicherweise seine hohe Effektivität in der Reduzierung der Restenose erklären.

Maligne Erkrankungen sind die zweithäufigste Todesursache in den industrialisierten Nationen. Trotz intensiver Forschung in den letzten Jahrzehnten haben sich die Prognosen nur bei einigen Tumorentitäten signifikant verbessert. Die Hauptprobleme sind nach wie vor das Fehlen valider Marker für die Frühdiagnose und hohe Rezidivraten, die aufgrund mangelnder Detektion von disseminierten Tumorzellen entstehen. Tumorantigene erlangen eine immer wichtigere Bedeutung, da sie zur Visualisierung von okkulten Tumorzellen und als Zielstrukturen der spezifischen adoptiven Immuntherapie dienen können. Tumorantigene (TAs) bzw. eine gesteigerte humorale Antwort gegen TAs, besitzen außerdem ein großes Potenzial als zirkulierender Biomarker in der Frühdiagnose. In dieser Arbeit wurde am Beispiel von Karzinomen der oberen Atemwege eine neue Technik zur Identifizierung von TAs entwickelt (AMIDA, Autoantibody Mediated Identification of Antigens), welche einige Limitationen der bereits etablierten SEREX- und PROTEOMEX-Technik umgeht. AMIDA ermöglicht es, im Gegensatz zu SEREX, TAs zu identifizieren, die durch posttranslationale Modifikationen oder aberrante Lokalisationen immunogen wurden. Diese TAs sind häufig tumorspezifisch und eignen sich hervorragend als Biomarker oder als Zielstrukturen für Therapien. Der Vorteil von AMIDA gegenüber PROTEOMEX ist die Immunpräzipitation von Antigenen aus primären Tumorbiopsien mit autologen Serumantikörpern, vor der Auftrennung in einer 2D-Gelelektrophorese und der anschließenden Identifizierung der TAs im Massenspektrometer. Dadurch können TAs aus dem kompletten Proteom identifiziert werden und nicht nur aus der Proteinauswahl, die in einer klassischen 2D-Gelelektrophorese auftrennbar ist. AMIDA führte zur Identifizierung von 27 unterschiedlichen, potenziellen Tumorantigenen, wobei sechzehn TAs bis zum Zeitpunkt ihrer Identifizierung nicht mit malignen Erkrankungen und weitere vier nicht mit HRK assoziiert wurden. Hierbei stellte sich Zytokeratin 8 (CK8) als interessanter Marker für okkulte Tumorzellen heraus, da es bereits in hyperplastischem Rachenepithel vermehrt gebildet und in Neoplasien bzw. Metastasen ausschließlich von Tumorzellen stark überexprimiert wird. CK8 ist zudem ein interessantes Zielmolekül für Immuntherapien mit monoklonalen Antikörpern, da es auf Karzinomzellen ektopisch an der Zelloberfläche lokalisiert. Darüber hinaus zeigten Patienten mit HR-Karzinomen im Vergleich zu gesunden Probanden bereits in sehr frühen Tumorstadien eine deutlich gesteigerte humorale Antwort gegen CK8, was Serumantikörper gegen CK8 zu einem potenziellen zirkulierenden Biomarker in der Frühdiagnose macht. Zwei weitere AMIDA-TAs, AAA-TOB3 bzw. das hypothetische Protein KIAA1273, werden ebenfalls in HRK überexprimiert. Es konnte gezeigt werden, dass es sich bei AAA-TOB3 und KIAA1273 um zwei Isoformen handelt, die von einem Genlokus kodiert, jedoch von zwei unterschiedlichen Promotoren reguliert werden. Beide Isoformen sind Transmembranproteine, die in Mitochondrien lokalisieren und deren Expression direkt von c-Myc reguliert wird. Eine frühere Studie von Da Cruz (2003) zeigte, dass das murine Homolog von AAA-TOB3 pro-apoptotische Eigenschaften hat, wenn es in humanen Zellen überexprimiert wird. Dies konnte in dieser Arbeit für die humanen Isoformen nicht belegt werden. Im Gegenteil, die Repression der beiden Proteine führte zu einer vermehrten Apoptose. Dies lässt eher auf eine für das Zellwachstum bzw. die Zellproliferation notwendige Funktion dieser beiden Proteine schließen und könnte die Überexpression in Tumoren erklären.

Um die Therapiemöglichkeiten bei depressiven Störungen zu verbessern, ist die Kenntnis der molekularen Grundlagen dieser Erkrankungen notwendig. Die erhöhten basalen Cortisolwerte im Serum von depressiven Patienten und die gestörte negative Rückkopplung der HPA-Achse sind Hinweise darauf, daß die Funktionsweise der Rezeptoren für Corticoide wie Cortisol eingeschränkt ist. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit den Cochaperonen für die Corticoid-Signaltransduktion, insbesondere den Immunophiline FKBP51 und FKBP52, sowie p23. Für die Immunophiline wurde entdeckt, daß für ihren Beitrag zu einer effizienten Aktivierung Corticoid-abhängiger Promotoren drei Eigenschaften von Bedeutung sind: 1. Interaktion mit Hsp90, um überhaupt den Zugang zum Heterokomplex zu erhalten, 2. Wechselwirkung mit Dynein, um den nukleären Transport der Rezeptoren zu begünstigen und 3. die Peptidyl-Prolyl-Isomerase-Aktivität. Diese Postulate gründen sich auf die folgenden experimentellen Befunde: Das Immunophilin FKBP51 reduziert als Bestandteil des Heterokomplexes mit Hsp90 und den Corticoidrezeptoren sowohl die Bindungsaffinität (Denny et al., 2000) als auch die nukleäre Translokation des Glucocorticoidrezeptors (GRs) und des Mineralocorticoidrezeptors (MRs). Im Gegensatz zu seinem Homologen FKBP52 zeigt FKBP51 nur eine geringe Interaktion mit dem Motorprotein Dynein, welches für den retrograden Transport verantwortlich ist. Durch Einführung einer Punktmutation, die die Peptidyl-Prolyl-Isomerase-Aktivität inaktiviert, konnte gezeigt werden, daß FKBP51 diese Aktivität nicht für seine inhibierende Wirkung benötigt. Im Gegensatz dazu liefert die PPIase-Aktivität von FKBP52 einen aktiven Beitrag für die Funktionalität der Corticoidrezeptoren, weil die analoge Mutation in FKBP52 zur einer Hemmung der Transaktivierung und nukleären Translokation des GRs und des MRs führt. Da diese Mutante immer noch mit Dynein interagiert, ist allein die Wechselwirkung mit diesem Motorprotein offensichtlich nicht ausreichend für die volle GR-Aktivität. Des weiteren konnte gezeigt werden, daß Polymorphismen im FKBP51-Gen nicht nur mit dem Erfolg einer Antidepressivabehandlung korrelieren, sondern auch mit den Proteinmengen von FKPB51 in Lymphozyten. Schließlich wurde die Bedeutung von p23 analysiert, einem kleinen Cochaperon von Hsp90, dem aber auch eigene Chaperonaktivität zugeschrieben wurde. Durch gezielte Mutationen im p23-Protein war es möglich, seine Chaperonaktivität getrennt von seiner Cochaperon-Funktion zu untersuchen. Dabei stellte sich heraus, daß p23 für die Hemmung der GR-abhängigen Transkription nur als Hsp90-Cochaperon fungiert, weil zwar seine Interaktion mit Hsp90 für diesen Effekt notwendig war, nicht aber seine Chaperonaktivität. Um die beschriebene nukleäre Rolle von p23, die zum Zerfall von GR-Transkriptionskomplexen führt, zu untersuchen, wurde ein konstitutiv nukleärer GR verwendet. Auch hier benötigt p23 für die Hemmung des Rezeptors seine Hsp90-Interaktion, nicht aber seine Chaperonaktivität. Diese Arbeit leistet einen Beitrag zum Verständnis der Rolle von Chaperonen in der Steroid-Signaltransduktion. Darüber hinaus wurden starke Hinweise für eine mögliche Rolle von FKBP51 bei der Depression entdeckt.

Nach der Aufklärung der Basenabfolge des Genoms von Saccharomyces cerevisiae ist die Funktion der 30.000-40.000 Gene und insbesondere das Zusammenspiel der Regulation der einzelnen Gene ein zentrales Thema der Molekularbiologie. Die DNA eukaryonter Zellen liegt durch Bindungen an Histon-Proteine im Zellkern als Chromatin vor. Die Chromatinstruktur dient nicht nur der Komprimierung der DNA auf engstem Raume, sondern hat auch starke Auswirkungen auf die Funktion der DNA. So müssen Gene bei ihrer Aktivierung durch Veränderung ihrer Chromatinstruktur, die bis zur Ablösung der Histone führen kann, den für die Transkription benötigten Enzymen und Faktoren erst zugänglich gemacht werden. Das PHO5-Gen der Hefe Saccharomyces cerevisiae stellt ein sehr gut untersuchtes Modell dar, bei dem Veränderungen der Chromatinstruktur genau untersucht und mit dem funktionellen Zustand des Gens korreliert worden sind. PHO5 kodiert für eine saure Phosphatase, die bei Verbrauch der Phosphatreserven der Zelle in den periplasmatischen Raum sezerniert wird, um aus dort eventuell vorhandenen organischen Phosphatverbindungen Phosphat zu gewinnen. Ist im Medium genügend Phosphat vorhanden, ist PHO5 reprimiert. In diesem Zustand ist die Chromatinstruktur des PHO5-Promotors durch vier dicht aufeinander folgende Nukleosomen gekennzeichnet, wodurch der Promotor Enzymen und regulatorischen Proteinen allgemein schlecht zugänglich ist. Nur zwischen dem zweiten und dem dritten Nukleosom ist die dichte Anordnung der Nukleosomen durch einen etwa 70 bp langen gut zugänglichen Bereich unterbrochen. In dieser sogenannten hypersensitiven Region bindet bei Phosphatmangel der aktivierende Transkriptionsfaktor Pho4 gemeinsam mit dem Faktor Pho2 an ein UAS-Element und induziert die PHO5-Expression. Dabei lösen sich die vier Nukleosomen vom DNA-Strang ab. Sin4 ist ein Transkriptionsfaktor der Hefe Saccharomyces cerevisiae, der auf mehrere Promotoren zumeist reprimierenden Einfluss ausübt. Ausgangspunkt der hier vorliegenden Arbeit war der Befund, dass in Abwesenheit von Sin4 die Gegenwart der prokaryontischen lacZ Sequenz stromaufwärts des PHO5-Promotors zu einer Derepression des PHO5-Gens führt, und zwar in Gegenwart von Phosphat, also unter eigentlich reprimierenden Bedingungen. Dieser Effekt wurde ursprünglich bei der Verwendung der kodierenden Sequenz von lacZ als dem PHO5-Promotor nachgeschalteten Reporter-Gen in sin4-Hefezellen entdeckt. Eine Frage der hier vorliegenden Arbeit galt der Ursache der Derepression von PHO5 durch die lacZ kodierenden DNA-Sequenz. Dazu interessierte uns, ob die Derepression ein spezielles Phänomen der lacZ-Sequenz ist oder ob es sich hierbei eher um eine allgemeine Eigenschaft von DNA-Fragmenten handelt. Außerdem interessierte uns, ob die Herkunft der DNA aus prokaryonten oder eukaryonten Zellen eine Rolle spielen könnte. Dazu wurde jeweils eine große Anzahl zufällig ausgewählter DNA-Fragmente einer Länge zwischen 900bp und 1200bp aus den Genomen der Hefe Saccharomyces cerevisiae und der Bakterien Escherichia coli und Micrococcus lysodeikticus an entsprechender Stelle vor den PHO5-Promotor integriert. Die so konstruierten Plasmide wurden in einen Hefestamm transformiert, in dem das SIN4-Gen zerstört worden war. Insgesamt wurden 400 Klone mit integrierten Hefe-DNA-Fragmenten, 300 Klone mit integrierten M. lysodeikticus-DNA-Fragmenten und 14 Klone mit integrierten E. coli-DNA-Fragmenten untersucht. Die Bestimmung der Phosphatase-Aktivitäten der einzelnen Klone ergab für fast alle Plasmide mit integrierten E. coli- und M. lysodeikticus-DNA-Fragmenten eine erhöhte Aktivität trotz phosphatreichen Mediums. Im Gegensatz dazu zeigten die wenigsten Plasmide mit integrierten Hefe-DNA-Fragmenten eine Erhöhung der PHO5-Expression unter denselben Bedingungen. Von den insgesamt 400 getesteten Plasmiden wiesen nur neun eine gesteigerte PHO5-Expression auf. In allen Fällen, also für alle E. coli-, M. lysodeikticus- und Hefe-DNA-Fragmente, wurde nur in Abwesenheit von Sin4 eine erhöhte Phosphatase-Aktivität gemessen. Bei seiner Anwesenheit wurden in phosphatreichem Medium nie gesteigerte Aktivitäten beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass die hier beobachtete Derepression typischerweise eine Eigenschaft prokaryonter DNA ist. Nur ein Bruchteil der eukaryonten DNA-Fragmente aus dem Hefe-Genom führt zu einer Derepression der Promotoraktivität, während dies nahezu alle prokaryonten DNA-Fragmente aus Escherichia coli- bzw. Micrococcus lysodeikticus tun. Um die neun Hefe-DNA-Fragmente, die zu einer Aktivierung des PHO5-Promotors führten, auf eventuelle Besonderheiten zu untersuchen, wurden ihre DNA-Sequenzen bestimmt und analysiert. Außerdem wurden noch zwei E. coli-DNA-Fragmente sequenziert, die zu keiner gesteigerten PHO5-Expression geführt haben. Diese sehr eindeutigen Ergebnisse werfen Fragen nach dem zugrunde liegenden Mechanismus auf. Eventuelle DNA-Methylierungen oder kryptische Promotoren schieden als Erklärung des Phänomens aus. Unterschiede des G-C-Gehalts der einzelnen DNA-Fragmente könnten besonders für die prokaryonte DNA teilweise eine Erklärung liefern. Die beiden prokaryonten Genome haben mit 51% bzw.72% einen wesentlich höheren G-C-Gehalt als das Hefegenom mit 38%. Besonders die beiden E. coli-DNA-Fragmente, die zu keiner gesteigerten PHO5-Expression führten, besitzen einen wesentlich geringeren G-C-Gehalt als der Durchschnitt des gesamten E. coli-Genoms (44,7% bzw. 38,0% im Vergleich zu 51%). Eukaryonte DNA besitzt in ihrer Sequenz im Gegensatz zu der aus Prokaryonten eine gewisse Periodizität, die sich etwa alle 10,5bp wiederholt und die Ausbildung von Nukleosomen erleichtert. Das Fehlen dieser Periodizität in prokaryonter DNA könnte sich ebenfalls auswirken, z.B. über eine labile Chromatinstruktur, die sich auch auf den benachbarten PHO5-Promotor auswirkt und dadurch eine Dereprimierung von PHO5 in sin4-Zellen auslöst. Die Dereprimierung des PHO5-Promotors durch die wenigen Hefe-DNA-Fragmente trotz reprimierender Bedingungen könnten aufgrund anderer Mechanismen zustande zu kommen. Die neun Hefe-DNA-Fragmente, die zu einer Aktivierung des PHO5-Promotors führten, zeigten auch keinen vom Hefegenom abweichenden G-C-Gehalt. Es ist auffällig, dass alle 9 DNA-Fragmente intergenische Bereiche enthalten. In diesen Bereichen gibt es oft regulatorische Elemente, die häufig in hypersensitiven Regionen gefunden werden. Hypersensitive Regionen sind nicht in Nukleosomen gepackt und könnten dadurch auch die umgebene Chromatinstruktur beeinflussen. Unabhängig von den mechanistischen Überlegungen zeigen diese Untersuchungen, dass die Aktivität eines Promotors von der Umgebung beeinflusst werden kann und dass daher der Einsatz von heterologen Reportergenen mit Vorsicht betrachtet werden muss.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die vorhandenen experimentellen und epidemiologischen Studien zum Zusammenhang zwischen der Exposition gegenüber elektromagnetischen Feldern und dem Krebsrisiko zusammenzustellen und zu bewerten. Dafür wurden mittels Medline – Recherche 165 Originalarbeiten und Übersichtsarbeiten analysiert. Die experimentellen Studien können die Frage, wie Krebs durch elektromagnetische Felder entstehen könnte, nicht beantworten. Es gibt allerdings vielversprechende Ansätze mit nachvollziehbaren Hypothesen, die in Zukunft eine Erklärung liefern könnten, wie z. B. die Melatoninhypothese oder den Ansatz, elektromagnetische Felder als Promotoren oder Copromotoren zu untersuchen. Die epidemiologischen Studien belegen keinen Zusammenhang zwischen nicht-beruflicher Exposition mit elektromagnetischen Feldern extrem niedriger Frequenz und Krebsrisiko, weder bei Kindern noch bei Erwachsenen. Im beruflichen Bereich dagegen gibt es Hinweise auf eine Korrelation langandauernder, gleichbleibender Belastung mit starken Feldern und einem erhöhten Leukämie- und Gehirntumorrisiko. Zukünftige Studien auf diesem Gebiet müssen diverse relevante mögliche Confounder berücksichtigen, die Exposition jedes Probanden am Arbeitsplatz und zu Hause muß gemessen werden, adäquate Poweranalysen zur Ermittlung der benötigten Fallzahlen sind unerläßlich. Zu den Auswirkungen hochfrequenter Felder gibt es nur wenige Studien. Die vorliegenden Ergebnisse geben keine Hinweise auf ein erhöhtes Krebsrisiko.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Wechselwirkung zwischen Transkriptionsfaktoren und Elementen der Chromatinstruktur bei der Regulation zweier Promotoren des Phosphatase-systems der Hefe Saccharomyces cerevisiae untersucht. Als Modellsystem wurden die Promotoren der Gene PHO5 und PHO8 gewählt, die für eine saure bzw. eine alkalische Phosphatase kodieren und durch Phosphatmangel induziert werden. Während der Induktion findet eine charakteristische Chromatin-Umordnung am Promotor statt, die sich bei PHO5 über einen Bereich von vier Nukleosomen ausdehnt, bei PHO8 jedoch signifikant geringer ist. Für die transkriptionelle Aktivierung sind insbesondere zwei Transkriptionsfaktoren nötig: das bHLH-Protein Pho4 und das Homöodomänenprotein Pho2. Der PHO5-Promotor besitzt zwei Pho4-Bindestellen, die den regulatorischen Elementen UASp1 und UASp2 entsprechen. Während UASp1 in einem hypersensitiven Bereich zwischen den Nukleosomen liegt, ist UASp2 intranukleosomal lokalisiert. Mutagenese einer der beiden Bindestellen führte zu einer zehnfachen Abnahme der Promotoraktivität, während Mutagenese beider Stellen die Induzierbarkeit des Promotors völlig aufhob. Um die Bedeutung der Lokalisation der UAS-Elemente im Chromatin zu analysieren, wurde ein Operator für den a2-Repressorkomplex oberhalb des PHO5-Promotors eingebaut. Dieser Repressorkomplex bildet im Kontext bestimmter Promotoren eine zum a2-Operator benachbarte repressive Chromatinstruktur mit basenpaargenauer Nukleosomenposition aus. Im PHO5-Promotor führte der Einbau dieses Operators zur Repression der Promotoraktivität und einer leicht verminderten Chromatinzugänglichkeit. Demnach kann der a2-Operator transkriptionshemmende Strukturen initiieren, wobei die Repression durch verstärkte Chromatinkondenation und möglicherweise durch die Rekrutierung von reprimierenden Mediatorproteinen des RNA-PolymeraseII-Holoenzyms vermittelt wird. Durch Deletionen von Bereichen zwischen dem a2-Operator und den UAS-Elementen konnten Nukleosomen wie das Nukleosom -2 zwar stabilisiert, aber nicht gezielt verschoben werden. Rekonstitutionsexperimente mit einem 180 Bp-DNA-Fragment, das den Bereich des Nukleosoms -2 enthielt, zeigten zwar einen gewissen Beitrag der Sequenz zur Histon-DNA-Bindung, dieser allein kann jedoch keinesfalls die Positionierung erklären, vielmehr scheinen Wechselwirkungen der Histone mit anderen Chromatinkomponenten entscheidenden Anteil zu haben. Zusammenfassung E -144-Der Mechanismus der Chromatin-Umordnung am PHO5-Promotor durch die Transkriptions-faktoren Pho4 und Pho2 wurde zunächst durch in vitro Experimente unter Verwendung von rekombinantem Pho2-Protein analysiert. Es konnten mehrere Pho2-Bindestellen verschie-dener Affinität im PHO5-Promotor gefunden werden. Eine der hochaffinen Pho2-Binde-stellen überlappt größtenteils mit der Pho4-Bindestelle UASp1. Die kooperative DNA-Bindung der beiden Proteine an ihre überlappenden Bindestellen resultierte in einem hochaffinen ternären Komplex. Auch am UASp2-Element, bei dem zwei Pho2-Bindestellen eine Pho4-Bindestelle flankieren, findet eine kooperative Bindung von Pho2 und Pho4 an die DNA statt. Durch Mutation der mittels in vitro-Footprints entdeckten Pho2-Bindestellen konnte gezeigt werden, daß diese zur Promotoraktivität beitragen. Sie sind nicht nur wichtig, um Pho2 an den Promotor zu rekrutieren, sondern ermöglichen auch die kooperative DNA-Bindung mit Pho4 über direkte Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen Pho2 und Pho4. Eine Pho2-Interaktionsdomäne von Pho4 ist essentiell für die Aktivierung des PHO5-Promotors, wie durch Deletionsanalyse demonstriert wurde. Die kooperative DNA-Bindung dieser Faktoren scheint demnach sehr wichtig für die Transkriptionsregulation des PHO5-Gens zu sein. Getrennte Untersuchungen von UASp1 und UASp2 in einem CYC1-Promotor-Kontext zeigen einen eindrucksvollen Unterschied zwischen den zwei UAS-Elementen und verdeutlichen die duale Rolle von Pho2 in der Aktivierung des PHO5-Promotors. Es ist in entscheidender Weise für die Rekrutierung von Pho4 zur UASp1-Stelle nötig und verstärkt darüber hinaus das Pho4-Aktivierungspotential, während es an der UASp2-Stelle eher nur das Pho4-Aktivierungspotential erhöht. Trotz der koordinierten Regulation beider Promotoren ist der PHO8- fast 10mal schwächer als der PHO5-Promotor. Von den beiden Pho4-Bindestellen am PHO8-Promotor, welche früher in vitro bestimmt worden waren, ist nur eine in vivo funktional. Der Austausch des inaktiven PHO8-UASp1-Elements durch das UASp1-Element des PHO5-Promotors erhöht das Ausmaß der Chromatinöffnung im Bereich der Nukleosomen -3 und -2 und ergibt einen zweifachen Anstieg der Promotoraktivität. Im Gegensatz dazu verhindert der Austausch der hochaffinen UASp2-Stelle durch die entsprechende UASp2-Stelle von PHO5 die Chromatin-umordnung und Promotoraktivierung, obwohl eine effiziente Bindung von Pho4 an dieser Stelle besteht. Diese Daten zeigen, daß eine quantitative Bindung von Pho4 an ein UAS-Element ohne irgendeine Chromatin-Umordnung und Promotoraktivierung möglich ist. Die Deletion der Promotorregion, die normalerweise von den Nukleosomen -3 und -2 bedeckt wird, ergibt einen zweifachen Anstieg der Promotoraktivität, was die repressive Rolle dieser Zusammenfassung -145-Nukleosomen anzeigt. Die gute Korrelation zwischen Promotoraktivität und Ausmaß der Chromatin-Umordnung impliziert, daß für das Ausmaß der PHO8-Induktion im Vergleich zu PHO5 die Qualität der Histon-DNA-Wechselwirkung eine Rolle spielt, da auch bei Einführung des PHO5-UASp1-Elements in den PHO8-Promotor keine vollständige Chromatinöffnung beobachtet wird. Obwohl Pho4 in Pho2-unabhängiger Weise am PHO8-Promotor bindet und Chromatin remoduliert, ist Pho2 dennoch an der Promotoraktivität durch Erhöhen des Aktivierungspotentials von Pho4 beteiligt, ähnlich wie am UASp2-Element des PHO5-Promotors. Die Ergebnisse dieser Arbeit haben die Rolle des Homöoproteins Pho2 bei der Induktion des PHO5- und PHO8-Promotors aufgeklärt und unterstreichen die enorme Bedeutung des kooperativen Bindens der Transkriptionsfaktoren Pho4 und Pho2. Zum anderen haben sie das Wechselspiel zwischen Transkriptionsfaktoren und der Chromatinstruktur am Beispiel dieser Promotoren besser definiert.

Trotz ständiger Verbesserung der konventionellen Therapiemöglichkeiten zur Behandlung des humanen Pankreaskarzinoms rangiert diese relativ seltene Erkrankung auf Platz vier der Krebs verursachtenTodesfälle. Bisherige Behandlungsmöglichkeiten sind die Resektion, die allerdings nur bei ca 10 % der Patienten möglich ist, eine Strahlen- oder Chemotherapie. Bei einer konventionellen Chemotherapie mit Ifosfamid wird dieses Cytostatikum fast ausschließlich in der Leber aktiviert und muß damit über den Blutkreislauf an den Wirkort (Tumor) gelangen. Während dieses Transports reagiert ein Teil des kurzlebigen aktivierten IFOs mit gesundem Gewebe, wodurch die antitumorigene Wirkung verringert wird und Nebenwirkungen auftreten können. Daher wäre es sinnvoll eine direkte Aktivierung von IFO im Tumorgewebe zu bewirken um damit die antitumorigen Wirkung zu steigern bzw. die Nebenwirkungen zu reduzieren. Die zellvermittelte IFO-Aktivierung durch das hepatische Enzym Cytochrom P450 2B1 (CYP2B1) wurde in Klone verschiedener Zelllinien, die stabil die CYP2B1-cDNA von einem nicht-viralen Vektor exprimieren, untersucht. Die Präsenz und Funktion des CYP2B1-Proteins konnte mittels Western-Blot und eines enzymatischen Nachweissystems demonstriert werden. Durch Zugabe von IFO konnte eine Population CYP2B1-exprimierender Zellen in ihrem Wachstum in vitro stark gehemmt werden. Diese cytotoxische Wirkung betraf auch umgebenden nicht CYP2B1-exprimierende Zellen (bystander effect). Unter Vermeidung eines direkten Zell- Zell-Kontakts konnten als Ursache für die toxische Wirkung frei diffundierbare Metaboliten nachgewiesen werden. Ein Teil der Zellen, die von der toxischen Wirkung betroffen waren, zeigten im späteren Verlauf morphologische Veränderungen, die sich deutlich von denen apoptotischer Zellen unterschieden und damit der Nekrose zuzuordnen sind. In Zusammenarbeit mit der Universität Rostock wurden CYP2B1-exprimierende Zellen, die zuvor in Zellulosesulfatkapseln verpackt wurden, in humane Pankreastumoren von Nacktmäusen implantiert und dadurch eine deutliche Verstärkung eines antitumoralen Effekts nach systemischer Chemotherapie mit IFO im Vergleich zur konventionellen Chemotherapie nachgewiesen. Zusammen mit der Universität Rostock und dem Allgemeinen Krankenhaus Wien wurde eine Methode zur mikroinvasiven intraarteriellen Instillation verkapselter Zellen in das humane Pankreas an einem porcinen Modell etabliert. Diese Ergebnisse waren Basis für eine klinische Studie der Phase I, in der verkapselte CYP2B1-exprimierende Zellen in das humane Pankreas implantiert wurden und anschließend die Patienten systemisch mit IFO behandelt wurden. Dabei konnte die mittlere Überlebensrate im Vergleich zu retrospektiven Daten einer vergleichbaren Kontrollgruppe fast verdoppelt werden. Gleichzeitig wurde die Einjahresüberlebensrate im Vergleich mit unbehandelten Patienten verdreifacht bzw. gegenüber Patienten, die das derzeit wirkungsvollste Chemotherapeutikum für pankreatische Karzinome - Gemzar - erhielten, verdoppelt. Zur Verbesserung der intratumoralen IFO-Aktivierung wurden CYP2B1-transduzierende retrovirale Vektoren basierend auf dem murinen Leukämievirus (MLV), hergestellt. Pankreatische Tumorzellen zeigten nach Infektion mit diesen Viren im Vergleich zu leicht infizierbaren Mausfibroblasten eine geringere Infektionseffizienz und eine niedrigere Aktivität des MLV-Promotors. Denoch konnte für CYP2B1-transduzierte pankreatische Tumorzellpopulationen, eine CYP2B1-vermittelte erhöhte Sensitivität gegenüber IFO nachgewiesen werden. Um die Wirkung dieser schwachen intrazellulären IFO-Aktivierung in Tumorzellen in vivo untersuchen zu können, wurden mehrere murine Pankreastumormodelle etabliert. In einem syngenem Tumormodell wurden schließlich parentale oder CYP2B1- transduzierte pankreatische Tumorzellen in immunkompetente Mäuse injiziert und daraus subkutane Tumoren etabliert. Bei der anschließenden IFO-Behandlung wuchsen CYP2B1- transduzierte Tumoren langsamer als Tumoren, die aus nicht-CYP2B1-exprimierenden Zellen entstanden. Es wurde somit ein System für eine zellvermittelte Gentherapie für pankreatische Tumoren etabliert und in vitro, in vivo und in einer klinischen Studie in Zusammenarbeit mit anderen Gruppen untersucht. Um die Wirksamkeit weiter zu verbessern wurde die Möglichkeit einer Gentherapie mittels einer zusätzlichen Übertragung des Suizidgens durch retrovirale Vektoren getestet. Obwohl dieser Ansatz durch eine bessere Suizidgenexpression in pankreatischen Tumoren mittels geeigneter Promotoren noch weiter optimiert werden muss, konnte das ?proof of concept” mit dieser Arbeit etabliert werden.