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Die Biogenese von Ribosomen ist Voraussetzung für die Neusynthese von Proteinen und somit auch für Zellwachstum unabdingbar. In den Nukleoli der Zellen muss eine Vielzahl von Ribosomenbiogenese-Faktoren funktionell reguliert und koordiniert werden, damit reife 40S- und 60S- ribosomale Untereinheiten entstehen. Die vorliegende Arbeit geht der Frage nach, wie das nucleostemin (nst) Gen an dem zellulären Prozess der Ribosomenbiogenese partizipiert. Zur Beantwortung dieser Frage wurden mehrere Punkt- und Deletionsmutanten von nst kloniert, exprimiert und zuerst auf ihren intrazellulären Lokalisationsphänotyp hin überprüft. Dabei wurde festgestellt, dass die vorwiegend nukleoläre Lokalisation von NST durch den N-Terminus des Proteins, bestehend aus der basischen- und Coiled-Coil Domäne, vermittelt und durch zirkulär permutierte GTP-Bindemotive reguliert wird. Die Überexpression der nst Mutanten verursachte des Weiteren keine nukleoplasmatische Translokation des nukleolären Stressdetektorproteins Nucleophosmin (B23). Ein weiterer Überexpressionsphänotyp des nst Wildtyp-Gens ist eine signifikante Proliferationserhöhung in p53-positiven Zellen. Ein knock-down von nst resultiert in einer deutlichen Proliferationsinhibition von p53 positiven- als auch p53 negativen Zellen und einem p53 vermittelten G1/S-Phase Zellzyklusarrest. Auf Ebene der ribosomalen RNA induziert die temporäre Herabregulation von nst einen 32S-rRNA-Prozessierungsdefekt, welcher in verringerten de novo prozessierten 28S rRNA Mengen resultiert. In einem miRNA/siRNA basierten knock-down knock-in Experiment wurde der N-Terminus des Proteins zudem als minimale Funktionseinheit identifiziert: die Expression einer Mutante, bestehend aus der basischen und Coiled Coil Domäne, konnte den durch RNAi induzierten 32S-rRNA-Prozessierungsdefekt kompensieren. Der N-Terminus von NST sedimentiert zudem in einem Sucrose-Gradienten in Wildtyp-ähnlicher Manier, im Gegensatz zu einer NST Proteinvariante, welcher dieser Teil des Proteins fehlt. Eine Interaktion des NST-Proteins mit dem PeBoW-Komplex oder dem p53 Regulator Hdm-2 konnte nicht gezeigt werden. Diese Arbeit beschreibt somit NST als 32S rRNA-Prozessierungsfaktor und definiert den N-Terminus des Proteins als minimale Funktionseinheit während der Ribosomenbiogenese.

TRADD spielt als Adaptermolekül eine zentrale Rolle in der Signaltransduktion von LMP1 und TNF-Rezeptor 1. Während es allerdings durch den TNFR1 neben der Aktivierung verschiedener Signalwege auch zur Induktion von Apoptose und Nekrose kommt, handelt es sich bei LMP1 um ein Protein mit transformierendem Potential. Bei den jeweiligen TRADD-Bindestellen von LMP1 und TNFR1 handelt es sich um zwei strukturell vollkommen unterschiedliche Domänen. Und auch auf der Seite von TRADD wird die Bindung über zwei verschiedene Domänen vermittelt. Im Rahmen dieser Doktorarbeit sollte die Frage beantwortet werden, ob die TRADD-Bindestelle intrinsisch die biologischen Effekte der Signaltransduktion bestimmt oder ob diese durch den Rezeptorkontext festgelegt werden. Zur Beantwortung dieser Frage wurde in einem Domain Swapping Experiment die TRADD-Bindestelle des konstitutiv aktiven LMP1-TNFR1 sowie des TNFR1 gegen die putative TRADD-Bindestelle von LMP1 ausgetauscht. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass die Aminosäuren 370-386 die vollständige TRADD-Bindestelle von LMP1 umfassen. Weiter konnte gezeigt werden, dass diese Aminosäuren im LMP1-TNFR1- sowie im TNFR1-Kontext ausreichend sind, um den NF-κB und den JNK1 Signalweg zu aktivieren. Die Aktivierung des JNK1 Signalweges durch LMP1-TNFR1-CTAR2 verläuft unabhängig von TRAF2 und abhängig von TRAF6 und auch die Aktivierung des NF-κB Signalweges durch dieses Rezeptorkonstrukt verläuft TRAF6-abhängig. Damit konnte gezeigt werden, dass die LMP1-spezifischen Charakteristika der Signaltransduktion durch die TRADD-Bindestelle festgelegt und mit ihr zusammen übertragen werden. Obwohl die Aminosäuren 370-386 von LMP1 funktionell sind, sind sie auch im LMP1-TNFR1 sowie im TNFR1 Kontext nicht in der Lage Apoptose zu induzieren. Damit konnte im Rahmen dieser Doktorarbeit gezeigt werden, dass die Aminosäuren 370-386 von LMP1 intrinsisch und unabhängig vom Rezeptorkontext den nicht-apoptotischen Phänotyp der Signaltransduktion festlegen. Außerdem wurde im Rahmen dieser Doktorarbeit die Beteiligung von TRAF7 an der Signaltransduktion von LMP1 untersucht. Dazu wurde traf7 aus einer cDNA kloniert. Zusätzlich wurden verschiedene Deletionsmutanten sowie Fusionen mit dem fluoreszierenden Protein mRFP hergestellt. Es konnte eine Threonin-Phosphorylierung von TRAF7(1-383) nachgewiesen werden. Mittels Fluoreszenzmikroskopie konnte eine Lokalisierung von TRAF7 in vesikulären Strukturen beobachtet werden. Eine Mutante, der der RING- sowie der Zink-Finger fehlen, zeigte hingegen eine gleichmäßige zytosolische Verteilung. Außerdem konnte in dieser Doktorarbeit mit Hilfe von spezifischer siRNA gezeigt werden, dass TRAF7 an der Aktivierung des JNK1 Signalweges durch LMP1 beteiligt ist.

Basierend auf der Genomsequenz von H. sal. R1 wurde ein genspezifischer Gesamt-Genom-DNA-Mikroarray konstruiert. Hierzu wurden für jeden ORF des Genoms ORF-spezifische Oligonukleotide abgeleitet und zur spezifischen Amplifizierung der Genabschnitte mittels PCR eingesetzt. Nach Amplifizierung und Reinigung der Genabschnitte deckten die Produkte über 97% des halobakteriellen Genoms ab. Zur Konstruktion des Gesamt-Genom-DNA-Mikroarrays wurde jede spezifische Gensonde in fünffacher Wiederholung auf den DNA-Array aufgebracht. Auf diese Weise wurde ein DNA-Mikroarray erstellt, der mit einer Gesamtzahl von 13545 genspezifischen Sonden, das bisher dichteste Raster eines archaealen DNA-Mikroarrays aufweist. Durch parallele genomweite Genexpressionsanalyse in H. sal. R1, wurde der Vergleich zwischen aerobem und phototrophem Wachstum in drei umfassenden DNA-Mikroarrayexperimenten gezogen. Die Mikroarrayexperimente wurden mit dem so genannten „common reference“ Experimentdesign durchgeführt, bei dem eine Mischung aller RNA-Proben eines Experiments als Referenz bei den Hybridisierungen dient. Als weitere Vorraussetzung zur späteren statistischen Datenanalyse wurden die Transkriptomexperimente alle vier- bis fünfmal in unabhängigen Experimenten wiederholt. Die Wahl der Referenz und die Anzahl der unabhängigen biologischen Replikate haben die Basis geschaffen, die erhobenen Expressionsdaten mit Hilfe des R/MAANOVA Paktes der flexiblen und leistungsstarken statistischen Programmoberfläche R auszuwerten. Eine leistungsstarke und flexible Programmoberfläche zur Datenanalyse war unerlässlich, denn mit steigender Komplexität eines Transkriptomexperiments, steigt auch die Anzahl der notwendigen Wiederholungen und damit einhergehend die Gesamtzahl der auszuwertenden Datenpunkte. Für ein durchgeführtes Zeitreihenexperiment vom Wechsel aerobes zu phototrophem Wachstum mit sechs Zeitpunkten, fallen ca. 384.000 Datenpunkte an, für deren Vorder- und Hintergrundwerte die statistischen Kennwerte berechnet werden mussten. Ein solcher statistischer Kennwert ist der so genannte p-Wert, der die Signifikanz eines Ergebnisses widerspiegelt. Auf der Basis dieser signifikanten p-Werte ist eine Liste von 242 Kandidatengenen erstellt worden, die als differentiell exprimiert angesehen werden. Ein Anteil von 54.5% dieser differentiell exprimierten Gene weist kein homologes Protein oder Funktion auf. Diese Tatsache, birgt die Chance sowohl die Existenz dieser ORFs, als auch ihre Funktion aufzuklären. In diesem Zusammenhang wurden für die hypothetischen ORFs OE3107F und OE3136F Deletionsmutanten hergestellt und näher charakterisiert. Dabei wurde festgestellt, dass die Deletionsmutanten R1D3107 und R1D3136 im Vergleich zum WT-Stamm H. sal. R1 deutliche Unterschiede in ihrer Pigmentzusammensetzung aufweisen. Beide Deletionsstämme weisen z.B. einen geringeren Gehalt an Bakteriorhodopsin auf. Somit hat die neu etablierte Methode der DNA-Mikroarray basierten Genexpressionsanalyse dazu beigetragen, zwei bisher unbekannte Kandidaten der Regulation der Expression des Bakteriorhodopsins in H. sal. R1 zu identifizieren. Durch zellfreie in vitro Expression des Gens OE3136F wurde ein möglicher Ansatz zur näheren Charakterisierung und Funktionsaufklärung aufgezeigt. Neben der Herstellung von Deletionsmutanten und deren Charakterisierung, wurde durch die Anwendung einer weiteren Datenanalyse mittels PCA (Hauptkomponentenanalyse) und dem Ansatz die erhobenen Transkriptomdaten auf Stoffwechselwegen abzubilden, zwei weitere denkbare Wege aufgezeigt, aus den ermittelten Expressionsdaten mehr Informationen zu erhalten. Die Ergebnisse aller Transkriptomexperimente für H. sal. R1 stimmen mit den Ergebnissen früherer Arbeiten überein und durch unabhängige Methoden wie RT-PCR, Nothern-Blot-Analysen und Proteomvergleich konnten die Resultate der Expressionsanalysen eindeutig verifiziert werden. Die Konstruktion und Herstellung der H. sal. R1 Gesamtgenom-Mikroarrays und Ausarbeitung eines Standardprotokolls zur Versuchsdurchführung, bilden die Grundlage aller Transkriptomexperimente der Arbeitsgruppe. Daneben ermöglicht die Schaffung einer bioinformatischen Infrastruktur zur statistisch signifikanten Auswertung der DNA-Mikroarray-Hybridisierungsergebnisse die Erstellung einer Transkriptomdatenbank, die durch Anknüpfung an die bereits vorhandene HaloLex-Datenbank jedem Nutzer für weitere Mikroarray-Experimente mit anderer Fragestellung in leichter Form zur Verfügung steht. Abschließend kann gesagt werden, dass die DNA-Mikroarray basierende Transkriptomanalyse von H. sal. R1 dazu beigetragen hat das Wissen über den Prozess der Anpassung an das phototrophe Wachstum zu erweitern. Die in der Arbeit erhobenen Daten bilden die Grundlage einer Datensammlung, die es zu einem späteren Zeitpunkt ermöglichen wird, über viele verschiedene Experimente hinweg neue Co-Regulationen von Genen zu erfassen und damit neue Gene und Verknüpfungen zwischen Stoffwechselwegen schnell und einfach zu detektieren. Die vorliegende Arbeit kann als Ausgangspunkt für genomweite funktionelle Charakterisierung haloarchaealer Genexpression und ihrer Regulation angesehen werden. Dieser Punkt ist im Hinblick auf die wachsende Bedeutung der Systembiologie von entscheidender Wichtigkeit, denn nur auf der Basis von soliden experimentellen Ergebnissen können Modelle aufgestellt und verbessert werden.

Proliferation erfordert die Koordination des Zellwachstums mit der Zellzyklusmaschinerie. Daten aus der Hefe belegen eine Funktion des Komplexes aus Nop7p, Ytm1p und Erb1p in der Ribosomenbiogenese, dem energieaufwendigsten Prozeß des Wachstums, und der Replikation. Die Beteiligung an diesen Schlüsselprozessen des Zellzyklus läßt die Vermutung zu, daß dieser Komplex eine Funktion bei der Koordination von Wachstum und Zellzyklusprogression innehat. In Säugern existiert ein trimerer Komplex, der sogenannte PeBoW-Komplex, der sich aus Pes1, WDR12 und Bop1 zusammensetzt, die einen hohen Grad an Homologie mit Nop7p, Ytm1p und Erb1p aufweisen. Der PeBoW-Komplex ist in Säugern an der Ribosomenbiogenese beteiligt, spielt eine Rolle in der Mitose, und dominant-negative Mutanten seiner Komponenten inhibieren die Zellzyklusprogression. Die Koordinatorfunktion des Komplexes scheint von der Hefe bis zum Menschen konserviert zu sein. In dieser Arbeit wurden Deletionsmutanten von Pes1 generiert und auf ihren Effekt auf die Zellzyklusprogression und die pre-rRNS Prozessierung hin untersucht. Die Expression zweier dieser Mutanten, Pes1 M1 mit einer N-terminalen und Pes1 M5 mit einer C-terminalen Deletion, induzierte einen reversiblen Zellzyklusarrest in der G1-Phase. Beide Mutanten zeigten zudem einen dominant-negativen Effekt auf die Prozessierung der 36S und 32S pre-rRNS. Mutante M5 blockierte zusätzlich die Reifung des 12S Vorläufers. Sowohl Mutante M1 als auch Mutante M5 induzierten eine p53-Akkumulation in proliferierenden, nicht jedoch in serumgehungerten Zellen, was eine Abhängigkeit der p53-Antwort von einer aktiven Ribosomenbiogenese nahelegt. Die p53-Antwort zog eine Akkumulation des Cdk-Inhibitors p21 nach sich, und die Coexpression des E6-Proteins schwächte den von M1 und M5 hervorgerufenen Zellzyklusarrest merklich ab. Die p53 Antwort konnte damit als Ursache des Zellzyklusarrests ausgemacht werden. Über native Gelelektrophorese und Immunpräzipitationen der Pes1-Mutanten konnten die BRCT-Domäne und ein Teil der NPLP-Domäne als essentielle Domänen für die Inkorporation von Pes1 in den PeBoW-Komplex bestimmt definiert werden. Die erhobenen Daten legen Inkorporation in den PeBoW-Komplex als Voraussetzung für die nukleoläre Lokalisation, wie auch für die Ausbildung eines dominant-negativen Phänotyps der Pes1-Mutanten nahe.

Im ersten Teil dieser Arbeit, der sich mit der Untersuchung der Bindung zytosolischer Chaperone am ribosomalen Polypeptid-Austrittstunnel beschäftigt, wurde die ribosomale Untereinheit Rpl25p, die in unmittelbarer Nähe des Polypeptid-Austrittstunnels liegt, als Bindestelle für zytosolische Chaperone, wie den naszente Ketten-assoziierten Komplex (NAC) identifiziert. Auch das Hsp70-Chaperon, Ssb1/2p, wurde in Assoziation mit Rpl25p gefunden. Diese Bindung wurde jedoch nicht näher untersucht. Bei der Etablierung einer Methode zur effizienten Anreicherung von Ribosomen aus Zellextrakten, mittels Präzipitation über einen Epitop-tag an einer ribosomalen Untereinheit, wurde beobachtet, dass ein 3HA-Epitop an Rpl25p, im Gegensatz zu einem 6HA-Epitop an der selben Stelle und an einer anderen ribosomalen Untereinheit, Rpl4ap, im entsprechenden Hefestamm Wachstums- und Translationsdefekte hervorruft. Co-Präzipitationsversuche ergaben, dass sowohl die Assoziation des generellen Hsp70-Chaperons Ssb1/2p, als auch von NAC mit Ribosomen im RPL25-3HA-Hintergrund stark reduziert ist und lieferten damit eine mögliche Erklärung für die beobachteten Defekte. Durch Two-Hybrid-Interaktionen und Co-Präzipitationsexperimente mit immobilisiertem MBP-Rpl25p und Zellextrakten, bzw. gereinigten Chaperonen, konnte gezeigt werden, dass der naszente Ketten-assoziierte Komplex NAC spezifisch, über den N-Terminus der -Untereinheit Egd1p, an Rpl25p bindet. Untersuchungen bezüglich der physiologischen Bedeutung der, nur in der Hefe vorhandenen, alternativen -Untereinheit Btt1p, zeigten, sowohl im Two-Hybrid, als auch in Bindeexperimenten mit Zellextrakten oder gereinigtem Btt1p, dass auch Btt1p direkt mit Rpl25p interagiert. Die starke Sequenzhomologie der N-Termini der -Untereinheiten, führte zu dem Schluss, dass auch Btt1p über seinen N-Terminus an Rpl25p bindet. Egd1p ist jedoch die vorwiegend im Komplex vorliegende -Untereinheit. In Abwesenheit von Egd1p wird die Expression von Btt1p stark erhöht, um das Fehlen dieser Untereinheit zu kompensieren. Sequenzhomologien zwischen Rpl25p und seinem Homolog Rl23p aus E. coli sollten als Ausganspunkt für die Identifizierung der Bindestelle zytosolischer Chaperone, wie NAC und Ssb1/2p an Rpl25p dienen. Versuche, Rpl25p funktionell durch Rl23p zu komplementieren, zeigten jedoch, dass weder Rl23p, noch ein chimäres Protein, in dem ein 50 Aminosäuren langer N terminaler Anhang aus Rpl25p an das E. coli-Protein fusioniert wurde, die Funktion von Rpl25p in der Hefe übernehmen können. Alternativ wurde ein konserviertes Aminosäuremotiv von Rpl25p mutiert, das im E. coli-Protein als Bindestelle für das Chaperon Triggerfaktor dient und dessen Veränderung die Bindung von Triggerfaktor an Rl23p stark reduziert. Die Veränderung dieses Motivs in Rpl25p bedingte zwar eine Reduktion der Bindung von Egd1p an Rpl25p, hatte jedoch keinen Effekt auf die Assoziation von Ssb1/2p mit Rpl25p. Daraus wurde gefolgert, dass nicht dieses Motiv allein für die Bindung zytosolischer Chaperone an Rpl25p verantwortlich ist. Dieser Befund führte außerdem zu der Spekulation, dass die Bindung von Egd1p und Ssb1/2p an Ribosomen durch verschiedene Bindestellen an Rpl25p vermittelt sein könnte. Im zweiten Teil der Arbeit, sollte der Beitrag, den einzelne Untereinheiten des Gim-Komplexes, GimC, zur Interaktion mit den Hauptsubstraten Aktin, α- und -Tubulin leisten untersucht werden. Dazu wurden für jede Untereinheit Verkürzungsmutanten hergestellt, denen die C- und N-terminalen hydrophoben Bereiche fehlen, die diese Wechselwirkung wahrscheinlich vermitteln. Im Gegensatz zu den zuvor untersuchten Deletionsmutanten, beeinträchtigen diese den Komplexaufbau nicht und erlauben daher direkte Rückschlüsse auf die Funktion der jeweiligen veränderten Untereinheit. Die Mutanten wurden zunächst einzeln bezüglich ihrer Sensitivität gegenüber LatrunculinA und Benomyl, Chemikalien, die das Aktin-, bzw. Tubulin-System der Zellen beeinflussen, in vivo charakterisiert. Des Weiteren wurde die Kinetik der Aktinfaltung bei ausgesuchten Mutanten (gim2NTCT, gim5NTCT) gemessen. Diese in vivo Experimente gaben erste Hinweise darauf, dass nicht alle GimC-Untereinheiten für die Bindung jedes Substrats gleich wichtig sind, sondern, in Abhängigkeit vom Substrat, unterschiedliche Rollen spielen. Zum Beispiel scheint die Interaktion mit den Tubulinen vor allem von Gim5p abhängig zu sein, während die anderen Untereinheiten dazu einen geringen (Gim1p, Gim2p, Gim3p) oder gar keinen (Gim4p, Gim6p) Beitrag leisten. Auch bei der Interaktion mit Aktin spielt Gim5p, neben Gim2p, eine tragende Rolle. In diesem Fall führt auch die Verkürzung von Gim3p oder Gim4p zu leichten Defekten, wogegen eine Veränderung von Gim1p oder Gim6p keine Auswirkungen hat. Um diese Ergebnisse durch weiterführende Experimente in vitro validieren zu können, wurde eine Strategie entwickelt, die es erlaubt, den Gim-Komplex und verschiedene Mischformen davon effizient in der Hefe zu exprimieren und daraus zu reinigen. Zu diesem Zweck wurde ein Plasmidsortiment geschaffen, das die starke Überproduktion des Wildtyp-Komplexes und von Mutanten, mit einer, oder bis zu sechs verkürzten Untereinheiten, unter Kontrolle des Kupfer-Promotors ermöglicht. Zur Reinigung dieser Komplexe aus der Hefe wurde ein bestehendes Protokoll abgewandelt und optimiert. Die Substrate, Aktin, α- und -Tubulin, wurden nach heterologer Expression in E. coli in Form von inclusion bodies gewonnen. Mit Hilfe dieser gereinigten Komponenten wurden der Wildtyp-Komplex und ausgewählte Mutanten, bei denen die α-Untereinheiten Gim2p oder Gim5p alleine oder Gim2p und Gim5p zusammen verkürzt waren, bezüglich ihrer Fähigkeit getestet, die Aggregation denaturierten Aktins in vitro zu verhindern. Es zeigte sich, dass die Verkürzung der Gim2p-Untereinheit die Aktinbindung nur wenig beeinträchtigt, wogegen eine Veränderung der Gim5p-Untereinheit eine starke Reduktion gegenüber dem Wildtyp bewirkt. Die entsprechende Doppelmutante ist schließlich nicht mehr in der Lage, die Aggregation denaturierten Aktins zu verhindern. Dieses Ergebnis konnte durch Translationsexperimente bestätigt werden, bei denen die verschiedenen Gim-Komplexe bezüglich ihrer Fähigkeit getestet wurden, de novo synthetisiertes Aktin in Lösung zu halten. Auch hier hatte die Veränderung von Gim2p nur einen geringen Effekt, während eine Verkürzung von Gim5p zu einer drastischen Anreicherung des neu-synthetisierten Aktins in der unlöslichen Proteinfraktion führte. In diesen Experimenten wurde erstmals auch der Beitrag dieser Untereinheiten zur Interaktion von GimC mit α-Tubulin untersucht. Hier zeigte sich, dass alleine die Verkürzung der Gim5p-Untereinheit ausreicht, um die Wechselwirkung von GimC mit diesem Substrat komplett zu verhindern.

Der labordiagnostische Nachweis von Mikrosporidieninfektionen bereitet immer noch Probleme. Auf Grund ihrer geringen Größe und ihrer unspezifischen Färbeeigenschaften ist der lichtmikroskopische Direktnachweis schwierig. Der elektronenmikroskopische Nachweis ist aufwendig und insbesondere aus dem Stuhl wenig sensitiv. Nicht alle Mikrosporidienarten können in Zellkulturen angezüchtet werden. Molekularbiologische Nachweisverfahren wie die PCR sind aufwendig, noch nicht standardisiert und derzeit noch Speziallaboratorien vorbehalten. Zuverlässige immundiagnostische Tests mit ausreichender Sensitivität und Spezifität fehlen, da das immunogene Spektrum von Mikrosporidien weitgehend unerforscht ist und somit bis heute die Wahl eines geeigneten Antigens das Grundproblem darstellt. Dabei wäre gerade vor dem Hintergrund aktuell zunehmender HIV-Infektionen zum Beispiel die Entwicklung eines Koproantigen-ELISA zum Nachweis von Mikrosporidien aus Stuhl von großem praktischem Nutzen. Ziel der hier vorgelegten Arbeit war es, die Voraussetzungen hierfür durch die Anwendung molekularbiologischer Methoden zu verbessern. Als Modellorganismus wurde die kultivierbare Mikrosporidienspezies Encephalitozoon cuniculi gewählt und in der Zellkultur angezüchtet und vermehrt. Aus der Kultur wurden die Sporen von E. cuniculi in hoher Anzahl und Reinheit gewonnen und aus ihnen die mRNA isoliert, um sie mit Hilfe der Reversen Transkriptase in cDNA zu transkribieren. Mit dieser cDNA wurde eine Genexpressionsbank angelegt, die mit polyklonalen Serum-Antikörpern gescreent wurde, die durch Immunisierung von Kaninchen mit E. cuniculi gewonnen worden waren. Hierbei konnten mehrere Klone identifiziert werden, die immunogene Proteine bildeten. Die Sequenzierung der isolierten Klone und Analyse der cDNA-Sequenzen ergab die vollständige Übereinstimmung mit einer einzigen Konsensussequenz. Durch die Suche in einer Gendatenbank konnte ein Sporenwandprotein als immunogenes Protein identifiziert werden. Des Weiteren war es möglich, mit Hilfe von Deletionsmutanten eine immunogene Domäne auf der gefundenen Sequenz ausfindig zu machen. Schließlich wurde in der Arbeit ein Vorschlag für die Verwendung dieser Sporenwanddomäne als Antigen für die Entwicklung immundiagnostischer Tests gemacht. Zusammengefasst wurde in der vorliegenden Arbeit (a) das immunogene Spektrum von Encephalitozoon cuniculi als im Wesentlichen auf das Sporenwandprotein beschränkt beschrieben, (b) bei dem identifizierten Protein eine immunogene Domäne charakterisiert und (c) dadurch die Voraussetzungen für die Entwicklung immundiagnostischer Tests bei Mikrosporidieninfektionen verbessert.

Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der funktionellen Bedeutung der multipel hydrophoben Proteine des Equiden Herpesvirus 1 (EHV-1) für die Replikation in polarisierten Zellen in vitro. Zu diesem Zweck musste einerseits ein Zellkulturmodell für die polarisierte Infektion etabliert werden und andererseits die notwendigen Reagenzien und initialen Daten über die Eigenschaften des UL43-Polypeptides des EHV-1 generiert werden. Die drei anderen bekannten multipel hydrophoben EHV-1-Proteine, gM, pUL20 und gK, waren dagegen bereits vor Beginn dieser Arbeit charakterisiert und entsprechende Deletionsmutanten standen zur Verfügung.

Das humane Zytomegalievirus (HCMV) ist ein speziesspezifisches, humanpathogenes Herpesvirus. Ein etabliertes System zur Untersuchung der CMV-Infektion in vivo ist das murine Zytomegalievirus (MCMV). Das 230 kb große Genom von MCMV liegt seit kurzem als bakterielles artifizielles Chromosom (BAC) kloniert vor. Damit eröffnen sich neue Strategien für gentechnologische Untersuchungen, die Gegenstand dieser Dissertation sind: Mit homologer Rekombination in E. coli und mit Transposonmutagenese wurden Insertionsmutanten und Deletionsmutanten des MCMV hergestellt und in NIH 3T3 Fibroblasten in vitro sowie BALB/c Mäusen in vivo charakterisiert. Insertionsmutanten: Zwei verschiedene sezernierbare und quantitativ nachweisbare Markergene (HBsAg; SEAP) wurden jeweils so in das MCMV-Genom inseriert, dass sie im Rahmen einer Infektion in vitro wie auch in vivo zur Expression kommen. Im Versuchstier korrelierte die Menge der in das Serum sezernierten Marker hochgradig mit mit den Virustitern in Milz und Leber. Die Markersekrtetion wurde mit einer hierfür neu etablierten quantitativen PCR-Methode (TaqMan™) bezüglich der Sensitivität verglichen. Bei immunkompetenten Mäusen war SEAP – vor der PCR und der Virusbestimmung - das empfindlichste Nachweisverfahren. Die entwickelten Methoden erlauben erstmals die longitudinale Beobachtung einer MCMV-Infektion in ein- und- demselben Versuchstier. Deletionsmutanten: Das Wachstumsverhalten von 576 MCMV-Transposon-Mutanten in Fibroblasten wurde analysiert. Identifiziert wurden 19 Mutanten mit wachstumsdefizitären Phänotypen, denen Veränderungen von sechs offenen Leserahmen (ORF) zugrunde lagen. Eine Trunkierung eines dieser bisher nicht näher definierten, offensichtlich nicht essentielle Gene, bewirkt ein signifikantes, quantifizierbares Wachstumsdefizit. Mit Hilfe von elektronen-mikroskopischen Aufnahmen konnte gezeigt werden, dass bei MCMV die Destruktion des Leserahmens M76 ein Exportdefizit aus dem Zellkern zur Folge hat.

Prion-Erkrankungen sind tödlich verlaufende, neurodegenerative Erkrankungen, die sporadischen, hereditären oder infektiösen Ursprungs sein können. Die Missfaltung des zellulären Prion-Proteins (PrPC) spielt eine zentrale Rolle bei der Pathogenese. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei verschiedene Themenbereiche bearbeitet: zum einen die Analyse der Faltung und Maturierung krankheitsassoziierter Mutanten und zum anderen die Wirkung einer Anti-Prion-Substanz auf die Biogenese von PrPC und die Propagierung von infektiösem PrPSc. Hierfür wurden verschiedene humanpathogene Mutanten, sowie andere Punkt- und Deletionsmutanten in Maus-Neuroblastomzellen untersucht. Im ersten Teil dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass zwei Mutationen, die Prion-Erkrankungen beim Menschen hervorrufen (T183A und F198S), die Faltung und Biogenese von PrP beeinträchtigen. Im Gegensatz zu PrPC, nehmen diese Mutanten im ER spontan eine missgefaltete Konformation an und erhalten weder eine komplexe Glykosilierung noch einen GPI-Anker. Die missgefalteten Mutanten werden nicht durch eine ER-assoziierte Degradierung eliminiert, sondern in ihrer High Mannose Form sekretiert. Darüber hinaus können die sekretierten Formen von benachbarten Zellen wieder aufgenommen werden. Diese Studie leistet einen wichtigen Beitrag zur Klärung der Missfaltung von T183A und F198S, welche offenbar mit einer Destabilisierung des hydrophoben Cores von PrP assoziiert ist und verdeutlicht außerdem, dass ein Zusammenhang zwischen der Faltung und den posttranslationalen Modifikationen von PrP besteht. Der zweite Teil der Arbeit konzentriert sich auf den Wirkungsmechanismus der Anti-Prion-Substanz Suramin. Es konnte gezeigt werden, dass der Effekt von Suramin auf einer Entfernung von PrPC von der Zelloberfläche beruht. So induziert Suramin eine Missfaltung von PrPC an der Plasmamembran, was eine anschließende Internalisierung und rasche Degradierung zur Folge hat. Dabei sind Missfaltung und Internalisierung zwei aufeinander folgende Prozesse, die von unterschiedlichen Domänen von PrPC vermittelt werden. Während die Suramin-induzierte Missfaltung vom proximalen Bereich des C-Terminus abhängt, ist der N-Terminus für die Endozytose verantwortlich. Diese Analyse verdeutlicht, dass in neuronalen Zellen eine Qualitätskontrolle zur Entfernung missgefalteter PrP-Formen von der Zelloberfläche besteht und liefert außerdem einen entscheidenden Ansatz für die Entwicklung effizienterer Anti-Prion-Strategien.

Die Pathogenität von Y. enterocolitica O:8 ist gekoppelt an das Vorhandensein des 70 kb großen Virulenzplasmides (pYV), das für die Gene eines Typ-III-Sekretionssystems kodiert und die Translokation von 6 Yop Effektorproteinen (YopE, YopH, YopM, YopO, YopP und YopT) in das Zytosol eukaryontischer Zellen ermöglicht. Intrazellulär interagieren Yop Proteine dabei mit verschiedenen Zellstrukturen und Signaltransduktionskaskaden, wodurch es zu einer Modulation der Immunantwort im Wirtsorganismus kommt. Durch systematische Mutagenese der yop-Gene und Untersuchung der yop Deletionsmutanten im Mausinfektionsmodell konnte in dieser Arbeit ein Einfluss der Yop Proteine auf die Virulenz und die Auslösung einer Immunantwort nachgewiesen werden. Die Translokation eines heterologen Antigens (YopE/LLO) durch das Typ-III-Sekretionssystem führte zur Induktion einer spezifischen CD4 und CD8 T-Zellantwort gegen Listeriolysin O (LLO) und ermöglichte die Verwendung von Y. enterocolitica als oralen Lebendimpfstoff zur Immunisierung gegen eine Listeria monocytogenes Wildtyp Infektion.

Morphologie und Dynamik der Mitochondrien spielen eine wichtige Rolle für die Vererbung der Organellen und die korrekte Ausübung ihrer physiologischen Pflichten. Über die molekularen Mechanismen, die der Gestaltgebung und Dynamik der Mitochondrien zugrunde liegen, ist relativ wenig bekannt. In der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae als Modellorganismus wurden einige Proteine identifiziert – das Verständnis vieler Prozesse, wie z. B. Fusion, Teilung und Bewegung der Mitochondrien, stellt jedoch nach wie vor eine Herausforderung für die zellbiologische Forschung dar. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde ein innovativer Ansatz verfolgt, um neue mitochondriale Morphologiekomponenten in S. cerevisiae zu identifizieren. Dabei wurde eine Stammsammlung verwendet, die Deletionsmutanten sämtlicher nicht-essentieller Hefegene enthält. Diese Stämme wurden systematisch durch Fluoreszenzmikroskopie nach Mutanten durchsucht, die eine veränderte mitochondriale Morphologie aufweisen. Dadurch konnte die Anzahl der bekannten Proteine, die einen Einfluss auf die mitochondriale Morphogenese besitzen, von bis dato neun auf 24 erhöht werden. Fünf der neuen Komponenten, von denen zehn bislang gänzlich uncharakterisiert waren, wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit entdeckt. Für eine eingehende Analyse im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit, wurden die beiden neuentdeckten Proteine Mdm31 und Mdm32 ausgewählt. Diese beiden Proteine sind Mitglieder einer neuen Proteinfamilie und liegen als höhermolekulare Proteinkomplexe in der mitochondrialen Innenmembran vor, die transient miteinander interagieren. Die Topologie von Mdm31 und Mdm32, deren Hauptteil im Intermembranraum liegt, ist ein Hinweis auf eine mögliche Kooperation der beiden Proteine mit Komponenten der mitochondrialen Außenmembran. Deletionsmutanten von MDM31 und MDM32 weisen sphärische Riesenmitochondrien auf, deren Motilität drastisch reduziert ist. Durch diesen Motilitätsdefekt kommt es zu einem verringerten Transport der Mitochondrien in die Tochterzellen bei der Zytokinese. Darüber hinaus ist das mitochondriale Genom in Δmdm31- und Δmdm32-Stämmen instabil und geht nach längerem Wachstum auf fermentierbaren Kohlenstoffquellen in einem Teil der Zellen verloren. Ferner ist die Struktur der Nukleoide, in denen die mitochondriale DNA verpackt ist, in diesen Stämmen verändert. Während man in Wildtyp-Zellen 10-15 Nukleoide beobachtet, weisen die Mitochondrien der Deletionsstämme ein oder zwei riesige diffuse DNA-Stukturen auf. Diese strukturellen Veränderungen der Mitochondrien und das Verhalten des mitochondrialen Genoms in den Δmdm31- und Δmdm32-Deletionsmutanten weisen Ähnlichkeiten zu Zellen auf, denen die Außenmembranproteine Mmm1, Mdm10, Mdm12 oder Mmm2 fehlen. Die Deletion von MDM31 oder MDM32 in Kombination mit MMM1, MDM10, MDM12 oder MMM2 ist synthetisch letal, d. h. die Doppelmutanten sind nicht lebensfähig. Dies ist ein Hinweis darauf, dass die beteiligten Komponenten eine Funktion in demselben zellulären Prozess spielen. Wahrscheinlich führt die Addition der Effekte, die die Einzeldeletionen auf die Struktur und Motilität der Mitochondrien haben, zur kompletten Hemmung der Vererbung der Organellen. Damit sind Mdm31 und Mdm32 die ersten mitochondrialen Innenmembranproteine, für die ein funktioneller Zusammenhang mit Komponenten der mitochondrialen Außenmembran bei der Vererbung und strukturellen Integrität der Mitochondrien gezeigt werden konnte. Ferner sind sie die ersten Proteine der mitochondrialen Innenmembran, die Einfluss auf die Struktur und Stabilität des mitochondrialen Genoms nehmen.

Vererbung und intrazelluläre Positionierung von Mitochondrien werden in eukaryotischen Zellen durch verschiedenartige Zytoskelett-abhängige molekulare Maschinerien vermittelt. Dabei spielen insbesondere Mikrotubuli eine herausragende Rolle in Säugetierzellen und in einigen Pilzen. Außer einzelnen Motorproteinen, welche an der Interaktion von Mitochondrien mit Mikrotubuli in Säugerzellen beteiligt sind, sind keine weiteren die Interaktion vermittelnden Komponenten bekannt. Ziel der Arbeit war, in dem filamentösen Pilz Neurospora crassa als Modellorganismus Proteine zu identifizieren, die an der Interaktion von Mitochondrien mit Mikrotubuli beteiligt sind und diese zu charakterisieren. Zuerst sollte die biochemische Grundlage der Wechselwirkung zwischen Mitochondrien und Mikrotubuli durch Entwicklung und Einsatz von in vitro-Testsystemen aufgeklärt werden. Hierfür wurde ein biochemisches Testsystem entwickelt, in dem isolierte Mitochondrien mit Taxol-stabilisierten Mikrotubuli unter verschiedenen Bedingungen inkubiert werden, um nach Saccharosegradienten-Zentrifugation die Assoziation zwischen Mitochondrien und Mikrotubuli zu analysieren. Zusätzlich sollten die Ergebnisse dieser Versuche in einem fluoreszenzmikroskopischen Testsystem verifiziert werden. Dafür wurde die Expression von mitochondrial zielgesteuertem GFP in N. crassa etabliert. Auf diese Weise konnte nicht nur das Verhalten und die Morphologie von Mitochondrien in verschiedenen Stadien des Lebenszyklusses in vivo beobachtet werden, sondern isolierte GFP-gefärbte Mitochondrien konnten zudem für eine mikroskopische Interaktionsanalyse mit Rhodamin-gefärbten Mikrotubuli verwendet werden. Unter Einsatz der beiden Testsysteme wurde eine spezifische ATP-abhängige Interaktion zwischen Mitochondrien und Mikrotubuli nachgewiesen, die durch peripher mit der mitochondrialen Außenmembran assoziierte Proteine vermittelt wird. Diese Ergebnisse deuteten auf eine Beteiligung von Motorproteinen an der Assoziation von Mitochondrien mit Mikrotubuli hin. Deshalb wurde im Genom von N. crassa gezielt nach Sequenzen gesucht, die Kinesine kodieren, die diese Rolle übernehmen könnten. Es wurden zwei neue Mitglieder der Unc104-Kinesinfamilie identifiziert und im Rahmen dieser Arbeit charakterisiert. Eines dieser Kinesine, Nkin2, ist peripher mit der Außenmembran von Mitochondrien assoziiert. Unter Verwendung der in vitro-Testsysteme wurde die Beteiligung von Nkin2 am Transport von Mitochondrien im Wildtyp belegt. Die Interaktion der Mitochondrien mit Mikrotubuli in vitro kann durch eine Präinkubation von Zusammenfassung Mitochondrien mit Antikörpern gegen Nkin2 geblockt werden. Um die Funktion von Nkin2 im Mitochondrientransport in vivo zu untersuchen, wurden nkin2-Deletionsmutanten erstellt und funktionell charakterisiert.Die Deletion von Nkin2 führt in vivo zu einem eingeschränkten Mitochondrientransport in auswachsenden Hyphen. Dieser Phänotyp wird durch Überexpression des zweiten neu identifizierten Mitglieds der Unc104-Familie, Nkin3, komplementiert. Zwar ist Nkin3 im Wildtypstamm nicht auf Mitochondrien lokalisiert, es wird aber bei Abwesenheit von Nkin2 hochreguliert und spezifisch an die Mitochondrien rekrutiert.In Abwesenheit von Nkin2 ist Nkin3 essenziell für die Interaktion in vitro von Mitochondrien mit Mikrotubuli. Diese Ergebnisse deuten auf eine funktionelle Redundanz von verschiedenen Motorproteinen im Mitochondrientransport in N. crassa hin, die in ähnlicher Weise auch in Säugerzellen vorliegen könnte. Da Transport und Vererbung von Mitochondrien nicht nur von dem beteiligten Motorprotein abhängen, sondern auch mit Fusions- und Teilungsvorgängen der mitochondrialen Membranen verknüpft sind, wurde eine Stammsammlung von Deletionsmutanten nichtessenzieller Gene in der Hefe Saccharomyces cerevisiae nach Komponenten mit einer Funktion in der Morphogenese von Mitochondrien durchmustert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden drei neue Gene identifiziert. Die aus der Deletion dieser Gene resultierenden Phänotypen werden beschrieben.

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der UL11- und UL20-Homologe des equinen Herpesvirus Typ 1 (EHV-1). Dabei sollte vor allem auf deren Funktionen in späten Stadien des Replikationszyklus und auf ein mögliches Zusammenspiel eingegangen werden. Zunächst wurde das UL20-Protein identifiziert und sowohl strukturell als auch funktionell charakterisiert. Ein in Kaninchen hergestelltes Antiserum reagierte in Western Blot-Analysen spezifisch mit zwei Proteinen mit apparenten Molekulargewichten von 25 und 75 kDa, und trotz zweier Konsensussequenzen im offenen Leserahmen UL20 führte eine Hemmung der N-Glykosylierung des Proteins zu keiner Veränderung dieser Laufeigenschaften. Das Protein, das ab 6 h p.i. in Zellen nachweisbar war, wurde der Klasse der γ1-Proteine zugeordnet und als Bestandteil der Virushülle identifiziert. Eine Assoziation des UL20-Proteins mit zellulären Membranen zeigte sich nach Fraktionierung infizierter Zellen und nach Immunfluoreszenzfärbung UL20-exprimierender Zellen. UL20-Deletionsmutanten der EHV-1-Stämme RacL11 und RacH wurden über BAC-Mutagenese hergestellt. Die negativen Viren führten in Einschritt-Wachstumskinetiken zu bis zu 1000fach geringeren extrazellulären Titern als die entsprechenden Wildtyp-Viren. Die intrazelluläre Infektiosität war dagegen nur um das 3fache erniedrigt. Diese Ergebnisse wiesen auf eine Funktion von pUL20 beim späten "viral egress" hin. Eine Bedeutung des Proteins im "cell-to-cell-spread" wurde durch Untersuchung des Plaquephänotyps gezeigt. Während die Ausgangsviren und Revertanten zu deutlichen Plaques führten, bestanden die Plaques der Deletionsmutanten aus nur wenigen infizierten Zellen. Eine initiale Charakterisierung des UL11-Proteins von EHV-1 liegt bereits vor. Das Tegumentprotein, das eine Konsensussequenz für eine N-Myristylierung aufweist, assoziiert in infizierten Zellen mit Membranen und spielt eine Rolle im "viral egress" und vor allem im "cell-to-cell-spread". Zur genaueren Einordnung dieser Funktionen wurden die Auswirkungen der Deletion des Großteils der UL11-spezifischen Sequenzen auf die Replikation von EHV-1 in Zellkultur vor dem genetischen Hintergrund verschiedener EHV-1-Isolate (RacL22, RacL11), -Stämme (KyA) und -Mutanten (L11Δ49) untersucht. Sämtliche rekombinante Viren waren auf nicht komplementierenden Zelllinien vermehrungsfähig. Das UL11-Protein ist daher auch in Verbindung mit der Deletion der für die Glykoproteine E und I kodierenden Gene (KyA) bzw. der fehlenden Expression des UL49-Proteins für die Replikation von EHV-1 in Zellkultur als nicht essentiell anzusehen. Die Bestimmung eines Wachstumswertes der Deletionsmutanten und Ausgangsviren ergab jedoch Hinweise auf eine mögliche Interaktion von pUL11 mit den Glykoproteinen E und I bzw. dem Tegumentprotein pUL49. Die Funktion des UL11-Proteins im "cell-to-cell-spread" konnte durch Untersuchung des Plaquephänotyps, bei dem die UL11-deletierten Viren zu deutlich kleineren Plaques als die Ausgangsviren führten, bestätigt, jedoch nicht genauer definiert werden. Untersuchungen eines in seiner Myristylierungs-Sequenz mutierten UL11-Proteins ergaben weder eine Verschiebung der Laufeigenschaften im Western Blot, noch eine veränderte Verteilung in der transfizierten Zelle. Allerdings konnte eine Assoziation von pUL11 mit Lipid Rafts gezeigt werden. Diese muss über eine Modifikation des Proteins durch Myristylierung oder Palmitylierung vermittelt sein. Das UL20-Protein dagegen war nicht spezifisch in den Lipid Rafts angereichert. Von einem Zusammenspiel der beiden Proteine in diesen Membranbereichen in ihrer Funktion beim "cell-to-cell-spread" ist daher nicht auszugehen.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Fragen zur Wechselbeziehung von Struktur und Funktion von Transkriptionsaktivatoren am PHO5-Promotor in Saccharomyces cerevisiae bearbeitet. Im ersten Teil der Arbeit wurden zwei Deletionsmutanten des Transkriptionsfaktors Pho4 hergestellt und charakterisiert. Dazu wurden aus der PHO4-Sequenz mit Hilfe einer PCR-gestützten Methode jeweils die für die Aminosäuren 97 bis 106 sowie 101 bis 110 kodierenden Sequenzen entfernt. Mit Hilfe von geeigneten Expressionsvektoren wurden beide Deletionsmutanten in S. cerevisiae exprimiert. Das Ausmaß der Transkriptionsaktivierung durch die Konstrukte wurde durch Messung der Aktivität der saueren Phosphatase bestimmt. Beide Mutanten bewirkten eine deutliche Aktivierung der Transkription am PHO5-Promotor. Daraus kann geschlossen werden, dass die hier deletierten Abschnitte von PHO4 keinen wesentlichen Anteil an der Transkriptionsaktivierung durch Pho4 haben. Zwischenzeitlich wurde der Nachweis einer minimalen transkriptionsaktivierenden Domäne von Pho4 publiziert. Die minimale transaktivierende Domäne besteht aus den Aminosäuren 79 bis 99. Dieser Abschnitt ist notwendig und ausreichend für die Öffnung der Chromatinstruktur des Promotors und die Aktivierung der Transkription. Die hier beschriebene Herstellung und Charakterisierung der Deletionsmutanten von PHO4 leistete einen wesentlichen Beitrag zur Eingrenzung der transaktivierenden Domäne von Pho4. Der zweite Teil der Arbeit befasste sich mit der Wirkung des als GAGA-Faktor (GAF) bezeichneten Transkriptionsfaktors aus Drosophila melanogaster am PHO5-Promotor von S. cerevisiae. Dazu wurden chimäre Konstrukte aus dem GAF und der DNA-bindende Domäne des Transkriptionsaktivators Pho4 hergestellt. Zudem wurden auch Fusionskonstrukte mit jeweils nur einer Hälfte des GAF und der DNA-bindende Domäne des Pho4 erzeugt. Diese Konstrukte wurden in S. cerevisiae exprimiert. Hier zeigte sich, dass die Verbindung aus dem gesamten GAF und der DNA-bindenden Domäne von Pho4, vermutlich aufgrund eines gestörten intrazellulären Transports oder aufgrund einer Instabilität des Proteins, keine Aktivität aufwies. Dagegen waren die Konstrukte, welche jeweils nur eine Hälfte des GAF enthielten, in der Lage, eine Öffnung der Chromatinstruktur und eine Aktivierung der Transkription am PHO5-Promotor zu bewirken.Um zu untersuchen, welche Veränderungen die chimären Konstrukte durch ihr Angreifen am PHO5-Promotor an der Chromatinstruktur des Promotors verursachen, wurden spezielle experimentelle Verfahren angewendet. Diese nutzen die unterschiedliche Zugänglichkeit der DNA für Enzyme bei geöffneter oder geschlossener Chromatinstruktur. Die Untersuchungen zeigten eine gleichartige Öffnung der Chromatinstruktur am PHO5-Promotor durch beide Konstrukte. Die gleichartige Öffnung der Chromatinstruktur korrelierte dabei nicht mit dem unterschiedlichen Umfang der Transkriptionsaktivierung von PHO5. Aufgrund der fehlenden Korrelation von Chromatinöffnung und Transkriptionsaktivierung stehen diese Ergebnisse im deutlichen Widerspruch zu der von vielen Autoren vertretenen Hypothese, der GAF würde die Transkription indirekt, nur durch die Öffnung repressiver Chromatinstrukturen aktivieren (Derepression). Vielmehr weisen diese Ergebnisse darauf hin, das der GAF auch als klassischer Transaktivator eine direkte Aktivierung der Transkription bewirken kann. Die Aktivierung der Transkription durch beide Hälften des GAF in den chimären Konstrukten war ein überraschendes Ergebnis. Es zeigt, dass GAF neben der glutaminreichen Domäne eine weitere Domäne enthält, die in vivo eine Aktivierung der Transkription bewirken kann. Diese Erkenntnis ist grundsätzlich neu und in der Literatur bisher nicht beschrieben worden.

Neurotrophine sind für die Entwicklung und Funktion des Nervensystems von Wirbeltieren unabdingbar. Sie entfalten ihre vielfältigen Funktionen über zwei Typen von Transmembranrezeptoren. Einerseits binden sie an die Trk-Rezeptoren, andererseits an den Neurotrophinrezeptor p75NTR. Obwohl p75NTR der erste klonierte Neurotrophinrezeptor war, wird die Wirkungsweise von Trk-Rezeptoren heute besser verstanden als von p75NTR. Erstens besitzen Trk-Rezeptoren als Rezeptortyrosinkinasen im Gegensatz zu p75NTR eine intrinsische enzymatische Aktivität, was die Aufklärung ihrer Signaltransduktionsmechanismen bedeutend erleichtert hat. Zweitens vermitteln Trk-Rezeptoren die klassische trophische Funktion der Neurotrophine, p75NTR hingegen neuartige Funktionen von Neurotrophinen, die zuvor noch nicht bekannt waren. Diese nicht-klassischen Funktionen, wie beispielsweise die Zelltod auslösende Wirkung von NGF, werden erst seit den letzten Jahren untersucht. Drittens konnte die Funktion der Trk-Rezeptoren in vollständigen Deletionsmutanten der Maus analysiert werden, wohingegen von p75NTR erst seit kurzem ein vollständiger Knockout existiert. In unserem Labor war nämlich gefunden worden, dass eine Spleißvariante von p75NTR in der bereits beschriebenen Deletionsmutante noch exprimiert wird. Am Beginn dieser Doktorarbeit stand die nähere Charakterisierung dieser Spleißvariante im Vordergrund. Um ihre physiologische Relevanz zu klären, wurde zunächst versucht, die Spleißvariante als endogenes Protein zu detektieren. Dies gelang in Kulturen aus primären Schwannzellen. Wie zudem gezeigt wurde, ist diese Rezeptorisoform in einer in unserem Labor generierten Deletionsmutante von p75NTR nicht mehr vorhanden. Darüber hinaus wurde ein erheblich stärkerer Schwannzellphänotyp in der neuen Deletionsmutante gefunden im Vergleich zur bereits beschriebenen. Letztere stellt somit einen Hypomorph dar. Die Funktion von p75NTR konnte nunmehr erstmals mit Hilfe eines vollständigen Knockouts untersucht werden. Wurde p75NTR zunächst lediglich eine die Trk-Rezeptoren modulierende Funktion zugeschrieben, war bei Beginn dieser Doktorarbeit in mehreren Ansätzen gezeigt worden, dass p75NTR unabhängig von den Trk-Rezeptoren eigenständige Signalaktivität besitzt, die zudem derjenigen der Trk-Rezeptoren entgegengerichtet sein kann. Für eine detaillierte molekulare Analyse der Funktion von p75NTR ist ein In-vitro-Assay unverzichtbar. Ein zentrales Ziel dieser Arbeit war deshalb die Etablierung eines solchen Assays. Ein In-vitro-Assay für p75NTR unter Verwendung der vollständigen Deletionsmutante konnte in cerebellären Körnerzellen etabliert werden. Aktivierung von p75NTR mit NGF führt zu einer Erhöhung der RhoA-Aktivität. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass auch TNFR, wie p75NTR ein Mitglied der TNFR-Überfamilie, RhoA aktiviert, obgleich mit einer klar unterschiedlichen Kinetik. Die TNFa-vermittelte Regulation von RhoA hemmte das Auswachsen von Neuriten. Im cerebellären Kultursystem konnte jedoch kein Effekt von NGF auf das Neuritenwachstum festgestellt werden. Weil Rho aber auch die Transkription steuern kann, wurde die Wirkung von NGF auf das Genexpressionsmuster von Körnerzellen mit einem ‘Gene-Profiling’-Experiment analysiert. Es wurden 69 Gene, die durch NGF entweder hoch- oder hinunterreguliert werden und zum Teil ‘Cluster’ bilden, gefunden. Mit Hilfe der vollständigen Deletionsmutante wurden bisher GAP-5 und GluR2 als neue Zielgene von p75NTR identifiziert. GluR2 kodiert für eine der vier AMPA-Rezeptor-Untereinheiten und spielt eine zentrale Rolle für die synaptische Plastizität. Da in einem unabhängigen Ansatz ein Defekt bei der Ausprägung von hippocampalem LTD (‘long term depression’), einer Form von synaptischer Plastizität, im vollständigen Knockout von p75NTR gefunden worden war, wurde der weitere Schwerpunkt dieser Arbeit auf den AMPA-Rezeptor gelegt. Die weitere Untersuchung aller AMPA-Rezeptor-Untereinheiten im Hippocampus ergab, dass neben GluR2 auch GluR3 ein Zielgen von p75NTR ist und dass zudem GluR2 wie auch GluR3, jedoch nicht GluR1 und GluR4, in vivo im p75NTR-Knockout im Vergleich zum Wildtyp in ihrer Expression signifikant verändert sind. Diese Befunde legen eine veränderte Stöchiometrie des AMPA-Rezeptors im p75NTR-Knockout nahe und liefern einen Erklärungsansatz für das veränderte LTD in der p75NTR-Deletionsmutante. Zudem erweitern sie das Konzept der Bedeutung von Neurotrophinen für die synaptische Plastizität im Allgemeinen und der von p75NTR im Speziellen.

In dieser Arbeit wurden vier Gene aus T. versicolor isoliert und charakterisiert, die an der Kupferversorgung des Trans-Golgi-Netzwerks, in dem Laccase mit Kupfer beladen wird,beteiligt sind. Die zwei Kupferpermease-Gene cupA und cupB (copper uptake permease) konnten durch Komplementation der S. cerevisiae Deletionsmutanten ∆ctr1 bzw. ∆cup5 mit einer T. versicolor cDNA-Bank isoliert werden. Die aus den beiden Genen abgeleiteten Proteinsequenzen zeigen strukturelle Homologien zu den Proteinen aus der Ctr-Familie und weisen ein in dieser Familie konserviertes MxxxM-Motiv auf. Die Expression beider Gene wird in T. versicolor durch Kupfermangel induziert und durch Kupfergabe reprimiert. Das Gen für das cytosolische Kupferchaperon TahA (Trametes ATX1 homolog) wurde mittels PCR mit degenerierten Primern isoliert. TahA zeigt deutliche Homologie zu Atx1 aus S. cerevisiae, HAH1 aus dem Menschen und CCH aus A. thaliana. TahA kann in Hefe Atx1 funktionell ersetzen: sowohl als Kupfertransportprotein zur im Golgi lokalisierten Kupfer-ATPase Ccc2, als auch bei der Entgiftung von reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS). Der Promotor des tahA-Gens enthält Motive, die im Promotor der durch Kupfer regulierten Gene Metallothionein (CUP1) und Cu/Zn-Superoxiddismutase (SOD1) aus S. cerevisiae konserviert sind. Das tahA-Gen wird unter erhöhten Kupferkonzentrationen (>0,25 µM) exprimiert und unter Kupfermangel reprimiert. Es unterscheidet sich somit in der Regulation deutlich vom ATX1-Gen, das unter Eisenmangel und oxidativem Stress induziert wird. Das Gen für die im Golgi-Netzwerk lokalisierte Kupfer-P-Typ-ATPase, ctaA (copper transport ATPase), wurde durch die funktionelle Komplementation einer Hefe ∆ccc2-Mutante mit einer T. versicolor cDNA-Bank isoliert. Dadurch wurde zugleich die physiologische Funktion des Proteins bei der Kupferversorgung des Golgi-Netzwerks gezeigt. CtaA weist deutliche Homologien zu den bekannten Kupfer-P-Typ-ATPasen aus dem Menschen (MNKP und WNDP), aus A. thaliana (RAN1) und S. cerevisiae (Ccc2) auf. CtaA enthält alle wichtigen Motive, die für die Kupfertransport- und ATPase-Funktionen in allen anderen Kupfer-P-Typ-ATPasen konserviert sind. Durch die deregulierte Koexpression von tahA und ctaA in S. cerevisiae sowie in T. versicolor konnte eine im Vergleich zum Wildtypstamm bis zu achtfach höhere Laccase-Expression erreicht werden. Dies zeigt, dass die Überexpression von Genen, die an der Versorgung des sekretorischen Systems mit Kupfer beteiligt sind, ein Mittel darstellt, um die Expression von sekretierten, kupferabhängigen Enzymen zu steigern. Durch Anzucht von T. versicolor unter Kupfermangel wurde eine Apo-Form der Laccase hergestellt und gereinigt, die kein für blaue Oxidasen typisches Absorptionsmaximum bei 600 nm besaß und die kaum Aktivität aufwies. AAS-Untersuchungen zeigten, dass weniger als ein Kupferion pro Laccase-Molekül in dieser Proteinpräparation vorhanden war. Durch die in vitro Beladung dieser Apo-Laccase mit Kupfer konnte die Enzymaktivität wiederhergestellt werden. Die Bedingungen hierfür waren ein niedriger pH-Wert,reduzierende Bedingungen und das Vorhandensein von NaCl. Eine spontane Beladung der Laccase im Golgi scheint daher ohne Mitwirkung eines weiteren Faktors möglich zu sein.

6.1. Die PH-Domäne als Paratop Die Pleckstrin-homologe (PH-) Domäne des humanen Cytohesin-1 besteht aus einem Proteingerüst sowie vier längeren Loops. Von diesen weisen drei in eine Richtung und bilden eine komplexe, flexible Oberflächenstruktur aus. Sollte man diese Oberflächenstruktur durch Mutation der Loops als Bindungstasche (Paratop) für Epitope von Schlüsselmolekülen etablieren können, wäre ein breiter Einsatz der PH-Domäne als Wirkstoff oder spezifisches Nachweisreagenz interessant, zumal sie sich in E. coli mit hohen Ausbeuten cytoplasmatisch löslich exprimieren läßt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß sich die drei Loops verändern lassen, ohne daß die PH-Domäne ihre Struktur verliert; von daher eignet sich die PH-Domäne als Proteingerüst. Sie wurde insgesamt in 29 Aminosäurepositionen mit einem neuartigen Verfahren gewichtet randomisiert, indem an jeder Position die Wildtyp-Aminosäure bevorzugt wird. In Anbetracht der Zahl randomisierter Positionen sollte damit gegenüber einer ungewichteten Randomisierung kein Verlust an Komplexität für die Bibliothek zu befürchten sein, durch den möglichen Erhalt lokaler und nicht lokaler Wechselwirkungen aber die Zahl stabiler (damit exprimierbarer und selektierbarer) Mutanten deutlich erhöht werden. Die Randomisierung erfolgte dabei mit drei Oligodesoxynukleotiden, die in den randomisierten Positionen jeweils eine definierte Basenverteilung aufweisen. Zur Klonierung einer Bibliothek wurden sie im dazu entwickelten Verfahren der „asymmetrischen PCR-Reaktion“ eingesetzt und daraufhin zu einem in drei Segmenten randomisierten DNA-Fragment assembliert. Mit dieser Strategie konnten 6 · 107 Mutanten erzeugt werden. (Aus deutlich kleineren Bibliotheken anderer Proteine ließen sich bereits bindende Mutanten isolieren.) Die randomisierten Mutanten der PH-Domäne wurden im phage-display-Verfahren zur Selektion gegen drei Zielsubstanzen eingesetzt. Danach konnten ausschließlich Deletionsmutanten und Mutanten mit stop-Codons nachgewiesen werden, die keine Expression von PH-Domänen erlauben. Zurückgeführt wird dieses Ergebnis auf die schlechten Transporteigenschaften der PH-Domäne bei der Translokation in das Periplasma von E. coli, weshalb nicht auf bindende Paratope aus der Bibliothek selektiert werden konnte. Nach Verbesserung der Translokationseigenschaften von PH-Domänen sollte sich das phage-display-Verfahren zur Selektion bindender Mutanten fortsetzen lassen. 6.2. Die PH-Domäne als Substrat für Translokationen Die im phage-display-Verfahren eingesetzten M13-Bakteriophagen assemblieren in der inneren Membran von E. coli. Dies setzt die Translokation der mit dem g3-Protein fusionierten PH-Domäne in das Periplasma voraus. Die geringe periplasmatische Expression bei mehrheitlich aberranten Prozessierungen im Bereich des Signalpeptids und die geringe Darstellung auf der Phagenoberfläche veranlaßten zur Translokationsoptimierung der PH-Domäne. Während der allgemeine sekretorische Transportmechanismus von E. coli durch die beteiligten Membranproteine strukturell und funktionell gut verstanden ist, sind die Eigenschaften und Voraussetzungen für die Translokation von Substratproteinen (mit Signalpeptid als Präprotein bezeichnet) bislang weniger gut charakterisiert. Der „translokationskompetente“ Zustand beschreibt die Präproteine nur phänomenologisch. Für die schlechte Translokation wurden mehrere biochemische und biophysikalische Eigenschaften der PH-Domäne in Betracht gezogen und verschiedene Mutanten hergestellt, die demzufolge eine verbesserte Translokationseigenschaft aufweisen sollten. Dabei erwies sich weder die Verringerung der thermodynamischen Stabilität noch das engineering ausgewählter, spezifischer Sequenzelemente als translokationsbegünstigend. Wird dagegen durch Einführung neuer N- und C-Termini sowie der Verbrükkung der ursprünglichen Termini mit einem Linker die Topologie verändert, können bei zwei dieser sogenannten Circularpermutanten bis zu 30-fach höhere Expressionsausbeuten im Periplasma erzielt werden. Die Circularpermutation wurde damit erstmalig erfolgreich im rationalen Proteindesign angewendet. Die vorliegenden Ergebnisse legen nahe, daß die Mutanten der PH-Domäne vor der Translokation in einem nativ-ähnlichen Zustand gefaltet vorliegen und zur Translokation entfaltet werden müssen. Das in dieser Arbeit vorgeschlagene „Kräftemodell“ erklärt die verbesserte Translokation der Circularpermutanten CP X.6. gegenüber dem Wildtyp. Danach ist die maximale Kraft zur Entfaltung des Proteins die translokationslimitierende Größe, was sich mit Hilfe von Einzelmolekül-Kraft-Spektroskopie weiter untersuchen ließe. Wie sich die Mutationen an der PH-Domäne bei weiteren Transportprozessen auswirken, wurde beim mitochondrialen Import analysiert. Die untersuchten Mutanten zeigten unabhängig von ihrer thermodynamischen Stabilität und ihrer periplasmatischen Expression eine Unterbrechung des Imports. Ursache dafür ist eine Peptidsequenz von 27 Aminosäuren, die sich mit Hilfe der Circularpermutanten eindeutig identifizieren läßt. Sie führt bei der Circularpermutante CP 2.6. zu einer stabilen Expression im Intermembranraum und beim Wildtyp sowie bei der Circularpermutante CP 2.7. zu einem Verharren in der inneren Membran. Bei Mitochondrien konnte zuvor noch nie eine importunterbrechende Peptidsequenz nachgewiesen werden. Sie sollte sich zur stabilen Expression von Proteinen im Intermembranraum einsetzen lassen. In der (modellierten) Raumstruktur der PH-Domäne interagieren 19 der 27 Aminosäuren in einem Faltblatt/turn/Faltblatt-Motiv. Sie könnten als stabile Subdomäne den Import unterbrechen. Diese Interpretation ergänzt ein Modell zur Translokation von Präproteinen, wonach das Präprotein vom Intermembranraum schrittweise durch die innere Membran (bzw. den TIM-Komplex) in die Matrix diffundiert und dort arretiert wird. Dadurch wird die Rückdiffusion verhindert. Die Unterbrechung des weiteren Imports währt solange, bis aufgrund des thermodyamischen Gleichgewichts die Peptidsequenz vor der Membran entfaltet vorliegt und dann in die Matrix diffundieren kann. Ergänzende Experimente zum mitochondrialen Import sind in Vorbereitung. In dieser Arbeit konnte die PH-Domäne mit ihren Mutanten somit als Substrat für die Untersuchung von Transportprozessen etabliert werden. Die zukünftige Anwendung dieser Mutanten auf weitere Transportsysteme liegt dabei auf der Hand. Die Bibliothek randomisierter PH-Domäne wird in Kooperation mit anderen Arbeitskreisen zur Selektion spezifisch bindender und inhibierender Mutanten eingesetzt.

Biochemische Untersuchungen beschreiben NC2 als einen Transkriptionsrepressor, welcher stabil an das TATA-Box bindende Protein (TBP) bindet. Die spezifische Bindung von NC2 an TBP inhibiert die weitere Anlagerung der generellen Transkriptionsfaktoren TFIIA und TFIIB und führt dadurch zur Unterbrechung der Bildung des Initiationskomplexes. NC2 besteht aus zwei Untereinheiten, NC2a und NC2b, die starke Homologien zu den Histonen H2A bzw. H2B aufweisen. Alle Erkenntnisse zu Beginn dieser Arbeit basierten auf Beobachtungen, die in vitro erhalten wurden. Unklar sind die Funktionen von NC2 in der Zelle. Die Aufgabe dieser Arbeit bestand darin, ein in vivo-Modellsystem zu etablieren. Als Modellorganismus wurde die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae ausgewählt. Hefe hat zwei Proteine, die stark homolog zum menschlichen NC2 sind. Beide sind essentiell für das vegetative Wachstum von Hefe. Für Plasmid-Austausch-Experimente wurden Hefestämme konstruiert, bei denen die chromosomalen Gene für NC2a und NC2b durch Wildtyp-Kopien auf einem URA3-Plasmid ersetzt wurden. Mit Hilfe einer negativen Selektion gegen das URA3-Gen in Anwesenheit von 5-FOA gelang es, die humanen NC2a- und NC2b-Gene als episomale Kopien in Hefe stabil einzubringen. So zeigte sich unter anderem, daß die beiden humanen NC2-Untereinheiten, sowohl einzeln in Kombination mit ihrem Dimerisierungspartner aus Hefe als auch gemeinsam in Form des menschlichen binären Komplexes, fähig waren, die physiologische Funktion ihres Gegenstückes aus Hefe zu übernehmen. Das gleiche System wurde auch eingesetzt, um Deletionsmutanten der humanen NC2-Gene in vivo zu untersuchen. Es wurde festgestellt, daß in beiden NC2-Untereinheiten die Domänen, welche für die in vivo-Funktion notwendig sind, die vom Mensch zur Hefe konservierten Regionen enthalten. Ein wesentlicher Teil dieser Arbeit bestand darin, spontane Suppressoren einer limitierenden NC2-Funktion in vivo zu isolieren und Suppressoren mit genomischen Punktmutationen zu charakterisieren. Gefunden wurde eine Punktmutation in der großen Untereinheit (Toa1) des Hefe-TFIIA, welche einen einzigen Aminosäure-Austausch von Valin zu Phenylalanin verursacht. Hefezellen, die diese Suppressor-Mutation in Toa1 (mt- Toa1) tragen, weisen einen Kälte-sensitiven Phänotyp auf und sind trotz fehlender NC2-Gene lebensfähig. Die biochemischen Eigenschaften des rekombinanten Proteins der Suppressor-Mutante wurden durch Gelretardations-, Footprinting- und in vitro Transkriptionsexperimente untersucht. Das Protein mt-Toa1 war in der Lage, stabile TFIIA-Komplexe zusammen mit der kleinen Untereinheit Toa2 auszubilden und die Rekrutierung von TBP an die TATA-Box auf dem Promotor zu unterstützen. Allerdings zeigten weitere Untersuchungen der Suppressor-Mutante, daß der ternäre Komplex aus mt-yTFIIA, TBP und DNA weniger stabil ist. Hinweise darauf gab die reduzierte Menge an Protein-DNA-Komplexen im Fall von mtyTFIIA in Gelretardationsexperimenten unter sättigenden Bedingungen. Das mt-yTFIIA verlor zugleich seine Antirepressionsaktivität in in vivo-Transkriptionsexperimenten in Anwesenheit von NC2. Die Isolierung und Charakterisierung der Suppressor-Mutante von NC2 lieferten zum ersten Mal den Beweis, daß die Genregulation in vivo eine präzise Balance zwischen positiv und negativ wirkenden Aktivitäten erfordert. Gleichzeitig bestätigen sie die in vitro Beobachtungen, insbesondere das Gleichgewicht zwischen TFIIA und NC2 in der Kompetition um das TATA-bindende Protein TBP. Eine weitere Aufgabe der Arbeit waren Mutagenese-Studien von humanem NC2 in vivo und in vitro. Innerhalb des Histone-Fold-Motives beider NC2-Untereinheiten wurden Punktmutanten isoliert, die ihre essentielle Funktion in der Hefezelle vollständig verloren haben. Es konnten Mutanten identifiziert werden, die Einfluß auf das Wachstum der Hefe mit dem Verlust der in vitro-Aktivität korrelierten. Die Charakterisierung dieser Mutanten lieferte erste Hinweise auf funktionelle Oberflächen von NC2, die für die ternäre Komplexbildung (NC2-TBP-DNA) und die Repressionsfunktion wichtig sind. Zusammengefaßt schafft die vorliegende Arbeit einen Einblick in die NC2-Funktion in der Zelle und erweitert unser Verständnis über den molekularen Mechanismus der Transkriptionsregulation während der Initiation der Klasse II-Transkription.