Podcasts about promotors

A l'Al Dia Terres de l'Ebre d'avui divendres, 22 de novembre: - Obrim l'Informatiu amb les nostres emissores per conèixer que està marcant l'actualitat de la jornada al territori. - A l'Entrevista del Dia: amb Anna Zaera, comissària del Festival Femme in Arts Visibles a escena, un festival que porta a escena el coneixement creat per dones i persones dissidents. Donava el tret de sortida ahir, dijous 21 de novembre i s’allargarà fins este pròxim diumenge. - A de Poble en Poble: anem fins a l’Ametlla de Mar per conversar amb el cantautor calero Miquel del Roig un dels artistes guardonats en la 22a edició dels premis ARC de la música en directe, que atorga l’Associació Professional de Representants, Promotors i Mànagers de Catalunya. - Avui a "Setciències": les defenses del cos humà amb Nil Ferré des de La Plana Ràdio. - Redacció Oberta: les activitats de cap de setmana, la música i el cinema i sèries prenen el protagonisme amb Núria Caro, Aleyda Baz i Víctor Montecino Valls.

Welcome Ladies and Gentlemen to another episode of The Open Mic Podcast! With your host Tom Hirst, brought to you by Richland Source and Newsroom After Hours! This week we brought on Jake and Jill Henry, as well as Andrew kleiman, owner of AK Hair Collective to talk about the shows they have been putting on in the Salon's basement.  Like the one tonight, 1/26/24! They've been putting together a lot of thought and craft behind this show series they have been doing for the last year now.  All four of us go way back, so it's mostly a massive nostalgia fest with lots of stories from when we were in highschool running shows in downtown Mansfield.  Check out AK HAIR COLLECTIVE here Check out HENRY SCREEN PRINTING here Please make sure to like, share, and give us that much appreciated 5 star rating, that I'm sure you will agree, is well deserved! Also if you have Instagram, check us out: @openmicpdcast Check out The Richland Source and The Newsroom After Hours for all things happening in the great and beautiful Mansfield, Ohio! Also Check out The Mothership and Relax It's Just Coffee and Two Cousins Pizza Co. and Bonfire NAtion LTD and The Electric Co. for local shows! Mansfield, Ohio is the greatest city in the continental U.S!

Steven and Mark casually talk about the end of 2023 and how much buzz has been on social media.

Interview by Kris PetersGerman metal outfit Accept have rightfully carved their horns into metal history.Arguably the most influential and definitive heavy band to ever emerge from the German music scene, Accept left in their wake a score of classic albums such as Breaker, Restless & Wild, Balls To The Wall and Metal Heart that have defined heavy music for decades.Frontman UDO Dirkschneider was a large part of the bands drawing power with his tenure with Accept the most successful and recognised chapters in the bands history.Despite since forging a massively successful solo career, Dirkschneider has yet to perform a full set of the songs that made him a global name in Australia - a blemish that is about to be rectified with two select shows in Sydney on April 6 and Melbourne on April 8 where he will play nothing but tracks made popular by Accept.Not only that, his current backing band also includes original Accept bass player Peter Baltes, adding further authenticity and excitement to the shows.On the eve of the first show Dirkschneider joined HEAVY to discuss the upcoming history making performances."We tried it many times and it was sometimes very close to coming off, but it never happened," he shrugged, "so now I'm really looking forward after over 40 years for me personally coming down to Australia and performing there. Hopefully a lot of people show up and maybe we can open up a new market and do some more shows in Australia."Other than a full night of Accept music, we press UDO on what fans can expect from the shows."We try to make a good mix up with all the classic accept songs," he smiled. "We play songs from I'm A Rebel, Restless & Wild, Balls To The Wall, Metal Heart, Russian Roulette so it will be a hit parade (laughs). A lot of people ask me why I'm not coming under UDO but maybe the next time. Promotors have been asking for me to come and play only Accept songs because people want to hear the original voice and for me it's not a problem to do. I did a three year tour with Dirkschneider through Europe and that was only playing Accept songs. It's a good thing. I can make UDO and I can make Dirkschneider with Accept songs. In the end it's always what the people want."In the full interview, UDO tells why it has taken so long for him to perform Accept music to Australian audiences, having Baltes in the band and how that helps with the Accept set, the early days of Accept and riding the wave of heavy metal, leaving the band and what changed to make him return, burying the hatchet, at what point he knew Accept were going to be a force in metal, what he considers Accept has contributed to music and more.

Premis ARC, des de Lleida. Avui es lliuren els Premis ARC de l'Associaci

Everyone in business studies is talking about digital transformation or digitalisation. Yes, both developments are directly or indirectly affecting all areas of an organisation, not to mention the fact that it also change our life and society as a whole. But how important is this aspect to social work and human service organisations? – This new episode explores this question and discusses, first and foremost, what digital leadership includes, secondly, how it is relevant for social work institutions, and, thirdly, how social work managers can adapt to this ever-changing situation.References:Arnold, M. (2021). Leading Digital Change and the Management of Hybridity in Social Work Organizations. In F. Özsungur (Ed.), Handbook of Research on Policies, Protocols, and Practices for Social Work in the Digital World (pp. 55-73). Hershey, PA: IGI Global. https://doi.org/10.4018/978-1-7998-7772-1.ch004Rost, K., Hölzle, K., & Gemünden, H. G. (2007). Promotors or champions? Pros and cons of role specialisation for economic process. Schmalenbach Business Review, 59(4), 340-363. https://doi.org/10.5167/uzh-68489Sheninger, E. (2019). Digital Leadership: Changing Paradigms for Changing Times. Thousand Oaks: Corwin Press.For more information, visit my blog: profmanagement.de Thank you for listening. If you liked this episode, please leave a review on the iTunes / Apple Podcasts website. If you've got any thoughts on this episode, or if you've got an idea about new podcast topics or questions you'd like us to discuss, send an audio file or voice note to hi@profmanagement.de. For any non-audio comments, drop a tweet or DM to @profmanagement on Twitter or Instagram, please.

In this week's Power of One we go back to your submitted questions. This time we discuss the difference between Advocators, Promotors and Creators.

In This Episode 186 We Have Special Guest Recording Artists "UA THE DUO” Who Tells Us How They Became Huge Music Artists, Promotors, Content Creators and how to make it your passion/purpose/living! Follow & Support “UA THE DUO” Instagram @uatheduo_ @wally_ua @slowmo_ua & YouTube: UA The DUOFollow & Support Me @Venmo- @Ariel-Castillo-4PayPal- Paypal.me/arielentTIKTOK- @Arielent.comAriel Castillo SoundcloudInstagram- https://www.instagram.com/arielentpod/Website- Arielent.com

Welcome back, its St Patty Day week so if your drunk hopefully you stumble across are podcast and become a fan. What a fight between Michael Conlan vs Leigh Wood, it was a type of fight that gives you that old school feel for boxing. so hopefully you get a chance to check it out and we dive into a lot more. so, grab a drink and enjoy.

This is Part 1 of 3 Part Series:When it comes to running a business, a craft show is a great way to get sales. Yet finding the right one can be a bit overwhelming especially if your just starting out. I find there are three (3) types of craft shows: Small Craft shows (lower fee); Medium craft shows (mid-range fee); Large craft shows (upper-level fee). The prices of craft shows do vary and sometimes a good craft show can be found in the oddest places. In this episode, I will be talking about the small craft shows and the inventory needed to get the sale and grow your customer base. Remember that every product is different so decide what product is your best seller and get it noticed. If no best selling products, that's fine...as I talk about that too. 

Tot a punt per als Premis ARC. Un any m

De man achter de microfoon vandaag is ruim 25 jaar werkzaam als Radiopromotor in Hilversum. Promotors, in vakjargon ook wel pluggers genoemd, zijn van een zeldzaam ras.  Dit exemplaar is een muziekfreak van de bovenste plank en doet zijn job met een ongekende passie. Meer dan twee decennia het volhouden in de “radio jungle” zegt iets over deze promotor, namelijk 'het is een toppertje'! Arjan van Elk, Radiopromotor bij Universal Music, neemt ons mee in de wondere wereld van radiopromotie. Zie het privacybeleid op https://art19.com/privacy en de privacyverklaring van Californië op https://art19.com/privacy#do-not-sell-my-info.

It's WrestleMania Weekend and HSP is officially back on the HSP Network! The guys are sitting down with Kevin Nasta, President of D365 Promotions in Part Two of our very special interview which details Kevin's journey to being a full-time wrestling & entertainment vendor/promoter. Jeff & Bryan will discuss with Kevin about how the pandemic has affected the wrestling business, not just in the Metropolitan area but nationally as well. We'll delve into the unwritten rules of this very cutthroat business, as well as break some news on a recent WWE Hall of Famer that will be coming to the East Coast exclusively for d365 Promotions. Plus, we'll rundown some names on the very infamous list of Nasta and much more! HSP is back and the best is yet to come.Follow us on our social media- @highspotpodcastDownload & Subscribe- bit.ly/2zvRb9Ayoutube.com/highspotpodcasthighspotpodcast.com

Thema: Alkohol Als Vorbereitung auf diese Folge: Wissenswertes zum Reinheitsgebot Als Reinheitsgebot wird seit dem 20. Jahrhundert die Vorstellung bezeichnet, dass Bier nur aus Hopfen, Malz, Hefe und Wasser hergestellt werden soll. Die erste Erwähnung der Bezeichnung „Reinheitsgebot“ ist in einem Sitzungsprotokoll des bayerischen Landtags vom 4. März 1918 belegt. Der Abgeordnete und zugleich Leiter der Buchstelle bei der Akademie für Landwirtschaft und Brauerei Weihenstephan Hans Rauch hob bereits damals eine Vorschrift von 1516 als Tradition hervor. Laut dem Leiter des Bayerischen Hauptstaatsarchivs Erich Stahleder wurde der Vorschrift mit der neuen Bezeichnung „Reinheitsgebot“ bewusst eine neue Aufgabe übertragen, „die des Promotors in einer zunehmend von der Werbung abhängigen Branche“. Die Bezeichnung setzte sich jedoch erst allmählich durch, außerhalb Bayerns erst während des Streits um das sogenannte „Süßbier“ in den 1950er-Jahren. Sowohl bayerische als auch außerbayerische Zeitungen berichteten häufig sehr emotional über eine Reihe von gerichtlichen Auseinandersetzungen aufgrund steigender Importe zuckerhaltiger Biere aus anderen Bundesländern nach Bayern. In Bayern war der Zusatz von Zucker bei der Herstellung von Bier nicht zugelassen. Hier noch ein Geheimnis: Dieses Wissen braucht Ihr für die Folge gar nicht. Aber schön, dass wir Euch wieder ein bisschen klüger machen durften.

Dr. Charles Dean Presents... THE BRIDGE - WHAT DO IT TAKE? So you want to be a recording artist? On Luv Radio Network

It's WrestleMania Weekend and HSP is officially back on the HSP Network! The guys are sitting down with Kevin Nasta, President of D365 Promotions in Part One of our very special interview which details Kevin's journey to being a full-time wrestling & entertainment vendor/promoter. Jeff & Bryan will discuss with Kevin about how the pandemic has affected the wrestling business, not just in the Metropolitan area but nationally as well. We'll delve into the unwritten rules of this very cutthroat business, as well as break some news on a recent WWE Hall of Famer that will be coming to the East Coast exclusively for d365 Promotions. Plus, we'll rundown some names on the very infamous list of Nasta and much more! HSP is back and the best is yet to come.Follow us on our social media- @highspotpodcastDownload & Subscribe- bit.ly/2zvRb9Ayoutube.com/highspotpodcasthighspotpodcast.com

Lisa Mikkelsen, Head of Global Human Capital at Flourish Ventures talks about her experience working in a unique role of working with investors, founders and portfolio companies. We also explore the topics of the role of Human Capital professional in startups and helping founders creating a safe space

In the Front of the house there is a Back of House and we're talking with them today! Promotors, ticketing, Festival Directors and more. Working tirelessly to make sure we have an event to show up to. Back of House is a weekly publication that will Drop News and information into your inbox every Tuesday Morning that is all about live events. This week we talk about all things live events past present and future to see what we might be able to expect in the coming months. You can reach Back of House at hey@bohlive.com Get connected with Back of House! bohlive.com GigReady is always at GigReady@gigrent.com #gigready #backofhouse #eventprof #liveevents

La Generalitat adjudica la redacció del projecte de la millora de la integració urbana de la línia de FGC Lleida-la Pobla al seu pas per Balaguer per un valor de 79.000 euros La majoria de ciutadans de Balaguer compleixen amb el confinament nocturn. També el sector de la restauració compleix tot i que des de la Paeria s’ha fet algun avís en algun establiment per saltar-se les restriccions La Paeria de Balaguer presentarà el proper 25 de novembre, coincidint amb el Dia contra les violències envers les dones, la Diagnosi sobre violències sexuals i sexistes en espais festiu i d’oci amb el corresponent pla d’actuació Aquest dimarts s’ha fet una nova crida de voluntaris pel gran recapte d’aliments a Balaguer. Actualment, el Gran Recapte compta amb 80 voluntaris però l’objectiu és arribar als 120 Continua el descens dels principals indicadors de risc de Covid-19 a Balaguer i comarca de la Noguera. També ho fa a la regió de Lleida, tot i que no baixa el nombre d’hospitalitzats. A nivell de Catalunya, augmenten els pacients a l’UCI. El Govern prepara un pla per reobrir activitats a partir del 23 de novembre per trams que tindran una periodicitat de quinze dies. Restauració al 30% i esport a l’aire lliure i cultura al 50%, primera fase de l’esborrany de pla de desescalada. En la segona de les quatre etapes, el confinament de cap de setmana seria comarcal i els gimnasos podrien reobrir PIMEComerç demana al Govern una desescalada urgent pels sectors més afectats pels tancaments Primera reunió de la Comissió d’Usuaris i Promotors de la línia Lleida-La Pobla d’FGC. La Comissó neix amb l’objectiu de treballar propostes per a la millora del servei de mobilitat en el corredor i reforçar els vincles amb els grups d’interès per conèixer de primera mà les necessitats de mobilitat del territori La Diputació de Lleida aprovarà la creació de l’oficina de supervisió de projectes en el ple de dijous. La Llei de contractes estableix que projectes iguals o superiors a 500.000 euros han d’estar supervisats per aquest ens L’Agència de Residus de Catalunya obre una nova línia d’ajuts per als ens locals per a la retirada d’amiant Interior alerta de l’increment de les estafes per internet mentre el total de delictes cau per les mesures anticovid. Sàmper diu que sortir els dijous de cap de setmana ara és una “conducta generalitzada” però no s’ampliarà el confinament El proper dimecres 18 de novembre tindrà lloc la 2a edició de Crafts NOW, un espai de trobada, coneixement i debat adreçat a professionals i estudiants del sector de l’artesania Josep Vallverdú estrena ‘Pa de forment’, un nou poemari publicat per Pagès Editors. Concert de la fira a Àger, amb Guillem Roma i Marta Roma el 6 de desembre. El guitarrista d’Os de Balaguer Josep-Manel Vega portarà al Molí de Tartareu la música que ha estat tocant per tot el món durant els darrers dos anys, en un esdeveniment en plena natura que tindrà lloc el dia 5 de juny de l’estiu vinent.Descarregar àudio (33:56 min / 16 MB)

En temps de confinament, ha nascut l’Associació de Promotors d’Esdeveniments Esportius de Catalunya amb el suport d’una trentena d’empreses i que engloba prop de 1.500 treballadors i treballadores. Parlem amb un dels seus impulsors i nou president, Pere Tutusaus. Fem notícies destacades amb els millors atletes catalans del 2019, el protocol de la FEEC i Kilian Jornet. Programa presentat per José Luis Rodríguez Beltrán i al control tècnic Francesc Rodés.

“If you have Promotors in the workplace with high morale, you're golden. They can't help but be influential. What we tell our promotors is ‘you have a superpower. Use it for good, not evil.' ” Welcome back! In the third installment of this behavior styles series, Ethan and Mike breakdown the wants, needs and expectations of the second of four styles: Promotors. Given that Mike is a Promoter himself, he takes the lead on this episode (in Promoter-like fashion). Promoters take the lead (see?), jump on new opportunities, get s*** done, help us not get stuck in old patterns and bring a sense of fun to the workplace. These are the kind of people who will be influential…no matter what. That means if you have a Promotor with high morale, that morale will be contagious throughout the workplace. But it's a double-edged sword. If they aren't careful, they may end up infecting the workplace with negativity. This episode will help Promoters understand the type of incredible characteristics they bring to the table and how to optimize them, and what some of their growth opportunities might be. Additionally, it will help those who work with Promoters to understand what these folks need to be successful and feel motivated in the workplace. Enjoy! Have topics you'd like for the Nash team to tackle? Drop us an email with your questions and they'll take a stab at it! Contact@nashconsulting.com Text the word “LEADING” to 66866 to be added to Nash Consulting's monthly newsletter. Just practical management skills and tips. And just once a month. Pinky swear. For more information on Nash Consulting, visit their website at www.nashconsulting.com

This week’s Misfit Entrepreneur is Chris Krimitsos. For many, Chris needs no introduction as the founder of the Podfest Multimedia expo, the world’s premier conference for all things podcasting and new media. Chris is also the founder of the Tampa Bay Business Owners organization, CK Media Productions, and is a speaker and consultant. But, more than anything Chris is a master at creating and facilitating successful events. He’s has facilitated over 2000 successful events and recently started a podcast focused on helping people learn the secrets to creating and putting on great events. It’s called the Conference Cashflow Podcast. I’ve had the opportunity to spend some time with Chris and I am amazed how our philosophies and principles are so similar – so there is a lot we can talk on today, but I want to focus first on what you can learn from Chris about how to put on a great, successful event. www.Podfest.us www.chriskrimitsos.com Chris grew up in New York and had a lot of inspiration from his uncles. They came as immigrants with nothing in their pockets. They worked hard, got into the restaurant industry, and were very successful. He would learn from them and started his first business at 13 years old selling candy. He was serial entrepreneur ever since. He moved to Florida in the mid 2000’s and invested in real estate. He was fortunate to have exited before the crash. Chris then got into production and produced two live TV shows. After some success, he started a group known as the Tampa Bay Business Owners. After growing it substantially, he sold it. He then started Podfest and is now its 6th year. Why should people consider doing events as part of their business strategy? There is something about today’s day and age that life events can do that things like social media cannot. Coming together with people of the same interests is something people crave. It is also a great way to drive business and create income. Putting on over 2000 events – what would you say are the critical elements someone needs to have to create successful event? You need an audience that is hungry for the information. You must be very specific about you are teaching and the topic of the event. If you can’t describe in 4-5 bullet points what they will walk away with, the there is an issue. The best speakers are not always professional ones, but great subject matter experts. Make sure to have early bird pricing and then raise your rate as you get closer to the event. Never set up more chairs than you have tickets sold. At the 10 min mark, Chris gives two case study examples on how to pick speakers and find the right ones. Make sure you speaker is relatable to your audience. You cannot have a disconnect with your audience and your speaker. You always want to have someone that is a step ahead of your audience, but not 4-5 steps ahead. Talk to us about the size event, what do people need to know? Starting out smaller is good and “big” when you are starting out is 20 or so people. You can do meetups 1x a month and then once a year do a larger event of 100 or more. Look what is happening in the local area, see if there is a need that is being underserved, and then create your event to serve it. You have to watch your expenses closely. Don’t go “free.” At minimum, have a contribution amount of $10 or so and make it optional. You want to have value on what you are doing. You can then graduate to fee based. Once you establish a following, then you can do larger events at $50 to $100 to attend and so on. How do you promote and get people to come to an event? For local events, the simplest way is to make sure you have the city name in your title of your event. There are 3 very simple ways to get traffic: Setup a Meetup Page which you can invite people to. Sell your tickets on Evenbrite and use their marketing expertise. Setup a Facebook event page and spend $50-100 targeting people in the local area. Best secrets to make an event memorable? People show up for the education, but they come back for the collaboration. Make sure to leave room and breaks for people to connect and collaborate. Create an experience. For local Meetups, 1x a month is a good cadence with special workshops that are a premium. Are there any big “don’ts” for events? Be very careful not to overpay with hotels and watch your food and beverage minimums If you can get the room for the value of the room and not do food and beverage, if you don’t need it. Make sure the hotel is right for your needs. Smaller hotels will charge just for the room and it will cost a couple of hundred dollars for the day If someone would like to speak at an event, what should they do? A lot of promotors these days that work with millennials don’t want to be approached by a representative – they want to be contacted by the speaker themselves. Promotors are doing the best they can to fulfill their audience needs, so make sure you know what the audience is looking for. If you do get selected – make sure your presentation is beautiful and clear with more pictures, so people can see it and understand it. Make sure you give the audience what they are looking for, not just what you want to share. What are your feelings on the current state of podcasting and what does the future hold over the next few years? Podcasting has really just started growing. 30% of the US is using podcasting, but are not “powerusers.” A lot more money is coming into the space to advertise and fund content. We will see growth like we haven’t seen before… Any specific things people should watch and follow in podcasting? Podcasting is on demand audio that is searchable through the internet. It can be SEO and content rich. You can use podcasts for some many things – ways to market your business, fill a need, focus on a very small niche. Don’t look at it as an interview show, look at it as searchable content. What are some critical habits that you believe all entrepreneurs should practice in today’s world? Being present in the moment. Using time effectively – focus and not waste it. Be very conscious to remove all time-wasting distractions from your work life that you can. What is your best advice for an entrepreneur starting out? Design a future that is worth living into. Spend time visualizing that future. Make sure your why is big enough that the how become irrelevant. At the 33 min mark, Chris talks about how to manifest your future and your why… Burn your “why” into your brain by visualizing what it is you are going to live into. What you intently focus on will become reality. Visualize while in motion if you can. Your why centers around the reason you are doing what you do – know what achieving your success looks like and how you celebrate it. This is really celebrating your why. If your why is strong – you will break through any issues with the how. Where do you want to go? What does it look like? Taste like? Smell like? Sound like? Etc. Go that deep…   Best Quote: "Design a future that is worth living into..."   Chris's Misfit 3: 1. Keep your feet on the ground and your eyes on the stars 2. Make sure you have a future that is worth living into 3. Monitor your self-talk and how you are programming your brain

Thu, 5 Dec 2013 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/17795/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/17795/1/Feldmann_Carolin.pdf Feldmann, Carolin

Der Transfer von Genen ist eine unverzichtbare Methode für die Erforschung von Genfunktionen in vivo, für die gezielte Expression von Proteinen oder RNA-Molekülen, sowie für die Entwicklung von Gentherapien z.B. gegen Krebserkrankungen oder genetische Defekte. Gerade unter gentherapeutischen Gesichtspunkten sind virale Gentransfervektoren von Interesse, mit deren Hilfe beispielsweise fehlende bzw. eingeschränkte Genfunktionen wiederhergestellt werden können. Ebenso vorstellbar ist der Einsatz viraler Vektoren für Immunisierungen, die z.B. zur Auslösung tumorspezifischer zellulärer Immunantworten führen. Wünschenswert ist in diesem Zusammenhang besonders eine zellspezifische Expression von Transgenen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden deshalb lentivirale Vektoren entwickelt, mit deren Hilfe eine konstitutive Genexpression in B-Zellen ermöglicht wurde. Die Beschränkung der Genexpression auf B-Zellen wurde durch die Wahl eines entsprechenden zellspezifischen Promotors gewährleistet. Lentivirale Vektoren haben sich in jüngster Zeit zu interessanten Werkzeugen für die Gentherapie sowie zu vielversprechenden Vakzinkandidaten entwickelt. Mit Hilfe dieser Gentransfervektoren können zahlreiche verschiedene Zelltypen, darunter auch hämatopoetische Zellen einschließlich der Immunzellen, in vitro und in vivo transduziert werden, wobei die Spezifität der Antigenexpression auf der Wahl eines entsprechenden Promotors beruht. Als Transgene wurden das verbesserte grün-fluoreszierende Protein eGFP (enhanced green fluorescent protein; im Folgenden als „GFP“ bezeichnet) und das Hühnerei-Albumin (im Folgenden als „OVA“ bezeichnet) exprimiert. Anhand umfangreicher Analysen der GFP-Expression in Knochenmarkschimären konnte die B-Zellspezifität der generierten Vektoren überprüft werden. Desweiteren wurden die lentiviralen Vektoren auch systemisch (intravenös) angewandt. Hier konnte gezeigt werden, dass die Spezifität der Genexpression mit dieser Applikationsroute erhalten bleibt, wohingegen die Expressionsstärke im Vergleich zu den Chimären erheblich zurückgeht. Funktionelle Studien mit B-zellspezifischen, OVA-kodierenden lentiviralen Vektoren konnten jedoch belegen, dass die Expressionsstärke nach systemischer Anwendung noch ausreichend war, um eine OVA-spezifische zelluläre Immunität zu stimulieren. Damit erwies sich das System auch hinsichtlich möglicher therapeutischer Anwendungen, z.B. als Vakzine, als funktionell. Eine humorale Antikörperantwort gegen virale Hüllproteine bzw. gegen OVA konnte nicht nachgewiesen werden. Zusammenfassend belegen diese Daten, dass die systemische Anwendung B-zellspezifischer lentiviraler Vektoren möglich ist und einen interessanten Ansatz zur Generierung neuer Vakzine bieten kann. Denkbar wäre beispielsweise eine Anwendung bei der Unterstützung therapeutischer Vakzinierungen. Ein weiterer interessanter Aspekt in diesem Zusammenhang ist die Rolle der B-Zelle als antigenpräsentierende Zelle, die mit Hilfe einer temporären Kontrolle der Genexpression genauer untersucht werden könnte. Aus diesem Grunde wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit auch ein induzierbares gammaretrovirales Genexpressionssystem entwickelt, um ein gezieltes An- und Abschalten der Genexpression in B-Zellen zu erreichen. Die Beschränkung auf B-Zellen wurde hier ebenfalls durch die Wahl eines entsprechenden zellspezifischen Promotors gewährleistet. Detaillierte in vivo-Analysen des Expressionssystems in Knochenmarkschimären zeigten jedoch, dass es einerseits nach Induktion nur zu einer schwachen Transgenexpression kam und es andererseits eine unerwünschte Hintergrundexpression sowohl in B-Zellen als auch in Nicht-B-Zellen gab. Aus diesen Gründen musste von der Anwendung dieses Systems für geplante Studien zur Rolle der Genexpression während verschiedener Stadien der B-Zellentwicklung abgesehen werden.

Embryonale Stammzellen stellen aufgrund ihrer Fähigkeit, in vitro in verschiedene Subtypen von Kardiomyozyten zu differenzieren, eine vielversprechende Quelle für eine spezifische Zellersatztherapie ischämischer Herzerkrankungen dar. Ein wesentliches Hindernis, das große therapeutische Potenzial embryonaler Stammzellen für klinische Zelltransplantationen zu nutzen, besteht darin, dass es bisher kein geeignetes Verfahren gibt, den gewünschten Zelltyp zu isolieren. Die Applikation hochaufgereinigter definierter Subpopulationen ist jedoch Voraussetzung, um optimale funktionelle Effekte zu erzielen und andererseits eine potenzielle intramyokardiale Teratomformation aus mittransplantierten undifferenzierten ES-Zellen zu vermeiden. Die Verwendung Zelltyp-spezifischer Promotoren zur Expression eines transgenen Oberflächenmarkers könnte die zellschonende und nicht immunogene Aufreinigung eines gewünschten aus ES-Zellen gewonnenen Zelltyps mit hoher Ausbeute ermöglichen und damit eine wichtige Basis für künftige Zelltransplantationen liefern. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Protokoll etabliert, um mittels der magnetischen Zellsortierung (MACS), dem gegenwärtigen Goldstandard einer zellschonenden und effizienten Zellseparation, stabil transfizierte murine embryonale Stammzellen aufzureinigen. Für MACS wurden ES-Zellen markiert, die ein intrazellulär trunkiertes CD4-Oberflächenprotein (∆CD4) unter der Kontrolle des konstitutiv aktiven PGK-Promotors stabil exprimierten. Um die markierten Zellen in vivo fluoreszenzmikroskopisch detektieren zu können, erfolgte in einem Parallelansatz eine Fusion des ∆CD4 mit einem intrazellulären EGFP-Teil (∆CD4EGFP). Die Funktionalität dieses Fusionsproteins wurde ebenso gezeigt wie dessen Eignung für die MACS-Aufreinigung, mit welcher Reinheiten von über 97% erzielt wurden. Die Expression des ∆CD4-Moleküls ohne EGFP-Anteil führte nach MACS zu über 98% positiven vitalen Zellen. Dabei waren die jeweils erzielten Reinheiten unabhängig von dem Differenzierungszustand der Zellen und der initialen Frequenz positiver Zellen (0,6% bis 16%). Die Vitalität der aufgereinigten Zellen nach dem MACS-Prozess wurde dadurch belegt, dass diese in der Lage waren, zu reaggregieren und normale „Embryoid Bodies“ auszubilden, die Marker aller drei embryonaler Keimblätter exprimierten. Parallel zur Etablierung der MACS-Methode wurde der kardial spezifische humane 2,75kb Nkx2.5-Promotor über die Expression des in vivo-Markers EGFP in murinen embryonalen Stammzellen untersucht. Die fluoreszenzmikroskopischen und durchflusszytometrischen Ergebnisse korrelierten mit dem erwarteten embryonalen Aktivitätsprofil des Nkx2.5-Promotors. RT-PCR-Analysen früher kardialer Marker zeigten, dass der hNkx2.5-Promotor Zellen markiert, deren Expressionsmuster dem früher kardial determinierter Zellen entspricht. Der 2,75 kb lange hNkx2.5-Promotor bietet damit einen vielversprechenden Ansatz, kardiale Vorläuferzellen innerhalb des heterogenen Zellspektrums sich differenzierender ES-Zellen zu identifizieren. Ein Transfer auf das in dieser Arbeit etablierte MACS-System könnte die effiziente, zellschonende und nicht immunogene Aufreinigung kardialer Vorläuferzellen aus humanen ES-Zellen ermöglichen. Dieser Ansatz könnte die Therapie ischämischer Herzmuskelerkrankungen mit embryonalen Stammzellen der klinischen Anwendung einen entscheidenden Schritt näher bringen.

Das epitheliale Zelladhäsionsmolekül EpCAM ist in der Tumorentstehung von Plattenepithelkarzinomen über- oder de novo exprimiert. Zudem korreliert die EpCAM-Expression in Tumorzellen positiv mit Proliferation und Entdifferenzierung. Es wurde in Vorarbeiten ein 1100 bp epcam-Promotorfragment kloniert, das spezifisch in EpCAM-positiven Zellen transkriptionell aktiv ist und durch TNFα in der Promotoraktivität reprimiert wird. In meiner Arbeit untersuchte ich, ob das 1100 bp epcam-Promotorfragment zur gezielten heterologen Genexpression geeignet ist. Zu diesem Zweck wurden drei Proteine ausgewählt: Grünes Fluoreszenz Protein (GFP), TNF receptor associated death domain Protein (TRADD) und Herpes Simplex Virus 1 Thymidinkinase (HSV1-TK). GFP diente der Visualisierung der Promotoraktivität im Fluoreszenzmikroskop. TRADD sollte die Apoptose in EpCAM-positiven Tumorzellen induzieren. Mit Hilfe der spezifischen Expression der HSV1-TK in EpCAM-positiven Zellen sollten Tumorzellen für Ganciclovir sensitiviert werden. Eine Therapie mit Ganciclovir sollte das Absterben der Tumorzellen bewirken. Die heterologe Genexpression wurde an einem zellulären Modellsystem von EpCAM-positiven und EpCAM-negativen HEK293 Zellen getestet. Dabei zeigten EpCAM-positive Zellen eine deutliche GFP-Expression, während EpCAM-negative Zellen sporadisch eine minimale Fluoreszenzintensität aufwiesen. Die EpCAM-spezifische Expression von GFP konnte im Immunoblot bestätigt werden. Um den Zusammenhang zwischen EpCAM- und GFP-Expression zu veranschaulichen, wurden die Ergebnisse der durchflusszytometrischen Messungen der EpCAM-Oberflächenexpression mit der GFP-Fluoreszenz verglichen. Damit konnte im zellulären Modellsystem von EpCAM-positiven und EpCAM-negativen HEK293 Zellen gezeigt werden, dass die epacm-Promotoraktivität zu einer heterologen Genexpression von GFP führt. Das zelluläre Modellsystem von EpCAM-positiven und EpCAM-negativen HEK293 Zellen wurde auf die Expression weiterer funktioneller Gene untersucht. Für das Funktionsgen TRADD konnte dabei weder eine EpCAM-spezifische heterologe Genexpression in der RT-PCR noch im Immunoblot nachgewiesen werden. In beiden Untersuchungen führten die Positivkontrollen zu einem Nachweis von TRADD. Da TRADD über komplexe Signalwege zur Bildung von TNFα führen kann, findet möglicherweise eine Inaktivierung des epcam-Promotors durch TNFα statt. Die heterologe Genexpression von HSV1-TK unter der Kontrolle des epcam-Promotors konnte im zellulären Modellsystem in der RT-PCR nachgewiesen und auf die EpCAM-positive Tumorzelllinie SKBR3 übertragen werden. Durch die Genexpression von HSV1-TK wurden EpCAM-positive HEK293 Transfektanten sensitiv gegenüber einer Behandlung mit Ganciclovir und zeigten eine deutlich reduzierte metabolische Aktivität im MTT-Ansatz bei Ganciclovirgabe. Dabei gewonnene Erkenntnisse wurden an der EpCAM-positiven Tumorzellinie SKBR3 bestätigt. Zusammengefasst konnte gezeigt werde, dass die heterologe Genexpression von HSV1-TK unter der Kontrolle des epcam-Promotors zu Ganciclovirsensitivität in EpCAM-positiven Zellen führte, jedoch nicht in EpCAM-negativen Zellen. Somit ist es denkbar, das 1100 bp epcam-Promotorfragment für die therapeutische Genexpression letaler Gene zur Elimination EpCAM-positiver Tumorzellen zu verwenden.

Nab2 ist in Melanomen und Melanomzelllinien im Vergleich zu Melanozyten und benignen Nävi stark überexprimiert. Durch Stimulation mit Wachstumsfaktoren oder Phorbolester kann Nab2 außerdem in allen Geweben und Zelllinien transient induziert werden. Die Expressionskinetik folgt dabei der eines delayed early response-Gens. Das Nab2-Protein ist ein transkriptioneller Korepressor der für die Wachstums- und Differenzierungsregulation wichtigen Zinkfinger-Transkriptionsfaktoren Egr1, Egr2 und Egr3. Das sind immediate early response-Gene, die durch die selben Stimuli induziert werden wie Nab2. Nach Stimulation wird die Expression von Egr deswegen grundsätzlich von einem Anstieg der Nab2-Expression gefolgt. Nab2 ist deswegen wahrscheinlich der wichtigste Repressor der Egr-Aktivität und verhindert eine übermäßige Stimulation von Egr-Zielgenen. Ziel dieser Arbeit war es, die regulatorischen DNS-Abschnitte des Nab2-Gens zu isolieren und genau zu charakterisieren. Am Nab2-Promotor sollten dann die Ursachen für die Überexpression im Melanom untersucht und der Mechanismus der Nab2-Induktion nach Stimulation identifiziert werden. Dazu wurde die genomische Nab2-DNS in einer humanen DNS-Bibliothek durch DNS-Hybridisierung identifiziert und daraus isoliert. So konnte ein 7.391 bp langes DNS-Fragment kloniert werden, das 1.845 bp der 5´-untranslatierten Region sowie die gesamte, aus 7 Exons aufgebaute proteinkodierende Nab2-Sequenz enthält. Durch in silico Analysen der 5´-untranslatierten Region konnten eine putative Promotorregion von Position -705 bis -82 (+1 = Adenin des Startkodons), eine CpG Insel von Position -876 bis +82 aber keine klassischen Kernpromotorelemente wie eine TATA-Box oder ein Inr-Element identifiziert werden. Der Nab2-Promotor gehört deshalb zur Klasse der TATA- und Inr-losen CpG-Insel-Promotoren. Durch eine Kombination aus EST- und cDNS-Kartierungen sowie Primerextensionsversuchen konnte ein sehr großes Transkriptionsstartareal identifiziert werden, das sich von Position -366 bis -96 erstreckt. Um funktionelle Studien mit der 5´-untranslatierten Nab2-Region durchzuführen wurden 17 verschiedene 5´-verkürzte Abschnitte daraus in Luziferase-Reportervektoren kloniert und deren transkriptionelle Aktivität in verschiedenen Zelllinien untersucht. Für das Erreichen der maximalen Promotoraktivität (ca. dem 400fachen der Aktivität des Leervektors) war der Sequenzabschnitt stromabwärts von Position -679 ausreichend. Ab Position -58 war dann keine Promotoraktivität mehr detektierbar. Der Nab2-Promotor erstreckt sich also von Position -679 bis -58. Der Kernpromotor konnte aufgrund der Lokalisation der Transkriptionsstartpunkte (-366 bis -96) und des 3´-Endes des Promotors (-58) zwischen Position -366 und -58 eingegrenzt werden. Die sehr hohe Aktivität des gesamten Nab2-Promotors wird durch die aktivierende Region von Position -679 bis -263 hervorgerufen. Durch diesen DNS-Abschnitt steigt die Aktivität vom 15- bis 30fachen auf das ca. 400fache der Aktivität des Leervektors. In dieser positiven regulatorischen Region konnten 10 putative Sp1-Bindestellen identifiziert werden, die mit hoher Wahrscheinlichkeit zu dem Aktivitätszuwachs beitragen. Um die Ursache der Überexpression von Nab2 in Melanomzelllinien zu Untersuchen, wurde die Aktivität der Nab2-Reporterkonstrukte in Melanomzelllinien, die Nab2 überexprimieren, und in Karzinomzelllinien, die nur wenig Nab2 exprimieren, verglichen. Die Reporterkonstukte zeigten jedoch in Melanom- und Karzinomzelllinien ungefähr die gleiche Aktivität. Die Ursache für die Überexpression in Melanomzelllininen konnte durch diese Versuche nicht identifiziert werden. Schließlich wurde die Aktivität der Reporterkonstrukte in unstimulierten und PMA stimulierten Zellen verglichen. Durch die PMA-Stimulation stieg die Aktivität des Nab2-Promotors auf das ca. 3fache der Basalaktivität an. Die gesteigerte Nab2-Expression nach Stimulation wird demnach auf der Transkriptionsebene reguliert. Anhand der Verkürzungskonstrukte konnte ein 19 bp langer DNS-Abschnitt zwischen Position -232 und -213 identifiziert werden, der diesen Anstieg der Promotoraktivität nach Stimulation hervorruft. In diesem Abschnitt liegen je eine Egr1- und Sp1-Bindestelle, die sich teilweise überlappen. Bei Kotransfektion eines Egr1-Expressionsvektors mit den Nab2-Reporterkonstrukten konnte ein Aktivitätsanstieg vergleichbarer Größenordnung wie durch PMA-Stimulation beobachtet werden. Wurde die Egr1-Bindestelle an Position -222 durch Mutation inaktiviert, so nahm die Induzierbarkeit des Nab2-Promotors durch PMA um 35-50% und durch Egr1-Kotransfektion um 64-73% ab. Diese Daten zeigen, dass Egr1 alleine in der Lage ist, den Nab2-Promotor maximal zu aktivieren und dass dieser Effekt vorwiegend über die Egr1-Bindestelle an Position -222 vermittelt wird. Weil der Promotor aber nach der Inaktivierung der Egr1-Bindestelle an Position -222 noch durch PMA und durch Egr1-Kotransfektion aktivierbar ist, sind weitere Egr1-Bindestellen und womöglich noch andere Transkriptionsfaktoren an der Aktivierung beteiligt. Diese Daten zeigen, dass der Transkriptionsfaktor Egr1 seinen eigenen Korepressor Nab2 induziert. Funktionell liegt also ein negativer Rückkoppelungs-Mechanismus vor, der eine überschießende Egr1-Aktivität verhindert.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Tyrosinphosphatase hVH-5 nach Genveränderungen untersucht. Als Mitglied der Familie der dual-spezifischen Phosphatasen ist hVH-5 (homologue of vaccinia virus H1 phosphatase gene clone 5) an der Signaltransduktion der Zelle durch Dephosphorylierung von stress-aktivierter Proteinkinase (SAPK) und p38 beteiligt. Aufgrund seiner Rolle als potentielles Tumorsuppressorgen können Genveränderungen oder Fehlregulationen von hVH-5 zur Entstehung von Tumoren beitragen. Wie bereits bekannt ist, zählt die Lokalisation dieses Gens auf Chromosom 11p15.5 zu häufig beobachteten Loss Of Heterozygosity (LOH)-Regionen bei Krebserkrankungen, u.a auch bei Brustkrebs. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Expressionsanalyse der hVH-5 Phosphatase in Normalgewebe und Brustkrebszelllinien durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass hVH-5 nicht nur, wie schon bekannt, in humanem Gehirn, Herz und Skelettmuskel transkribiert wird, sondern eine Trankription darüber hinaus auch noch in 10 weiteren humanen Geweben sowie in allen untersuchten Brustkrebszelllinien nachgewiesen werden konnte. Um ein zeitsparendes und effektives Mutationsscreening zu ermöglichen, wurde eine neue Methode, Conformation Sensitive Gel Electrophoresis (CSGE), etabliert. Dadurch konnte bereits im ersten Exon dieser Phosphatase eine Heteroduplexbildung als Hinweis auf eine Genveränderung sichtbar gemacht werden. Mittels Sequenzierungs- sowie Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus-Analyse konnte die exakte Nukleotidsequenz bestimmt werden. Es wurde festgestellt, dass es sich hierbei um eine bisher unbekannte Gensequenz eines prozessierten Pseudogens der hVH-5 Phosphatase handelt. Prozessierte Pseudogene sind dadurch definiert, dass sie typischerweise durch einen Verlust des Promotors transkriptionell inaktiv sind. Eine Datenbankrecherche (Sanger Center) ermöglichte die Lokalisation des Pseudogens auf Chromosom 10q22.2. Phylogenetische Analysen führten zu dem Ergebnis, dass das Gen vor ca. 6,8 Mio. Jahren entstanden sein müsste. Es konnte gezeigt werden, dass das in dieser Arbeit beschriebene Pseudogen von hVH-5 (ψhVH-5) entgegen der Definition eines Pseudogens in gesunden menschlichen Geweben transkribiert wird. Diese Tatsache deutet auf eine evtl. funktionelle Bedeutung dieses Gens hin. Weiterhin konnte ein möglicher Zusammenhang zwischen der Transkription des Pseudogens und der Entstehung von Brustkrebs nicht ausgeschlossen werden, da dieses in drei von 14 untersuchten Brustkrebszelllinien nicht transkribiert wird. Aus der Übersetzung der Nukleinsäuresequenz von ψhVH-5 in Aminosäuren resultierte ein Peptid von 8.8 kDa, welches sich stark vom hVH-5 Wildtyp unterscheidet und keinerlei funktionelle Domänen aufweist. Es konnte weder ein Nachweis des transient überexprimierten Proteins noch eines in vivo translatierten Proteins erbracht werden. Die Akkumulation der zahlreichen Mutationen im Pseudogen verglichen mit dem Wildtyp deutet stark darauf hin, dass dieses Gen in der Evolutionsgeschichte aufgrund fehlender funktioneller Bedeutung zumindest zeitweise keinem Selektionsdruck unterlag oder aber sich zu einem selbständigen Gen mit noch unbekannter Funktion weiterentwickelte. In der vorliegenden Arbeit konnten Hinweise dafür gebracht werden, dass ψhVH-5 sich möglicherweise derart entwickelt hat, um durch andere Regulationsmechanismen, beispielsweise solche, die für nicht-kodierende RNAs bekannt sind, mit dem Wildtypgen der hVH-5 Phosphatase zu interagieren.

Alopecia areata ist die häufigste Form krankheitsbedingter Verminderung der Haardichte. Anhand von 97 Patienten wurden Patientenvariablen in Abhängigkeit des Typs der Alopecia areata untersucht. Eine Abhängigkeit der Typen Alopecia areata universalis und totalis besteht von einer positiven Familienanamnese und Nagelwachstumsstörungen. Ferner besteht ein Trend, daß der Universalis-Typ und der Totalis-Typ mit einem niedrigeren Erkrankungsalter einhergehen. Es besteht keine Abhängigkeit von Vorliegen von anamnestischer Spontanremission, anderen Autoimmunerkrankungen und Erkrankungen aus dem atopischen Formenkreis sowie Erkrankungsdauer. Die topische Immuntherapie mit Diphenylcyclopropenon gilt als derzeit wirkungsvollster Therapieansatz. 86 Patienten wurden abschließend damit therapiert. Ein Halbseitenerfolg, als unabdingbare Voraussetzung zur Unterscheidung von Spontanremission und Behandlungserfolg, stellte sich bei 55 Patienten (64%) ein. Vollständiges Wiederwachstum erzielten 43 Patienten (50,0%). Die mittlere Zeitdauer bis zum Erreichen des Vollseiteneffekts betrug 47,1 Wochen, zum Erreichen eines Halbseiteneffekts waren 20,7 Wochen nötig. Therapieerfolg ist wahrscheinlicher bei dem Multilocularis-Typ und dem Ophiasis-Typ, unwahrscheinlicher dagegen bei dem Universalis-Typ und dem Totalis-Typ. Ein Therapieerfolg ist weiterhin wahrscheinlicher, je kürzer die Erkrankungsdauer und je höher das Erkrankungsalter ist. Der Behandlungserfolg ist dagegen unabhängig von positiver Familienanamnese, anamnestischer Spontanremission, assoziierten Autoimmunerkrankungen und Erkrankungen aus dem atopischen Formenkreis sowie Nagelwachstumsstörungen. Die Alopecia areata wird über eine T-zelluläre Immunreaktion moduliert, in deren Verlauf Zytokine eine wesentliche Rolle spielen. Ein Einzelnukleotid-Polymorphismus an Position -174 bp der humanen IL-6-Promotor-Region wurde beschrieben, resultierend aus einer Substitution von Guanin zu Cytosin. Es zeigte sich eine Abhängigkeit des Universalis-Typs der Alopecia areata vom Genotyp CC, während der Multilokularis Typ abhängig von dem Genotyp GG war. Weitere Patienten müssen untersucht werden, damit diese Abhängigkeit als uneingeschränkt gilt. Die Abhängigkeit der Alopecia areata von diesem Gen-Polymorphismus ist erstmals beschrieben worden.

Die Grundlage für die Entstehung von Tumoren bildet der Erwerb genetischer Veränderungen, wobei neben Mutationen wie Chromosomeninstabilitäten, Insertionen, Deletionen oder Basenmutationen auch epigenetische Vorgänge von Bedeutung sind. Hierzu zählt die veränderte Methylierung von DNA in neoplastisch transformierten Zellen, die bei einigen Genen in deren transkriptionellen Inaktivierung resultiert. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten Kolon- und Magenkarzinome auf bestehende Methylierungsdefekte in zwei Genen untersucht werden. Im ersten Teil wurde ein in die Mismatch-Reparatur involviertes Gen, das hMLH1-Gen, untersucht. Gastrointestinale Karzinome wurden hierbei hinsichtlich eines Zusammenhangs zwischen ihrer Mikrosatelliten- instabilität und einer möglichen Methylierung von Cytosinbasen im hMLH1-Promotor analysiert. Hierfür kam die Bisulfitmethode zur Anwendung, bei der die Umwandlung von unmethylierten Cytosinbasen zu Uracil erfolgt und die damit die Grundlage für die anschließende methylierungssensitive PCR bildet. Insgesamt ließ sich die Mikrosatelliten- instabilität bei sieben von neun untersuchten Karzinomproben auf Methylierung der proximalen Promotorsequenz zurückführen. Der Methylierungsstatus der beiden übrigen mikrosatelliteninstabilen Tumoren konnte nicht eindeutig bestimmt werden, obwohl die Vollständigkeit der Bisulfitmodifikation über den Nachweis des maternalen Methylierungsmusters des Exons 1 von SNRPN bestätigt wurde. Überdies konnte eine Deletion dieser Sequenz mittels Überprüfung der unbehandelten DNA ausgeschlossen werden. Gegenstand des zweiten Teils dieser Arbeit war die Untersuchung des CD95-Gens, eines Mitglieds der Tumor- Nekrose-Faktor-Rezeptor-Familie (sog. Todesrezeptoren), das eine entscheidende Rolle bei der ungestörten Apoptose von Zellen spielt. Grundlage hierfür waren die Ergebnisse von Peli et al., 1999, denen zufolge die CD95-Expression in mehreren etablierten Säugetierzellinien durch onkogenes Ras (H-Ras) herunterreguliert wird, wodurch sich eine Resistenz der Zellen für CD95L-induzierte Apoptose entwickelt. Hinweise aus den genannten Untersuchungen, die Inaktivierung von CD95 sei möglicherweise durch Methylierung des Promotors verursacht, sollte in der vorliegenden Arbeit anhand von gastrointestinalen Karzinomen näher analysiert werden. Hierzu wurde der Methylierungsstatus von Promotor, Exon 1 und Intron-Enhancer des CD95-Gens von 17 Tumorproben mit Ras-Mutationen (KRAS2-Mutation in Kodon 12) mittels methylierungssensitiver Restriktionsenzyme, nachfolgendem Southernblot und Hybridisierung ermittelt. Bei 16 Tumoren erbrachte die Restriktionsanalyse für Sma I ein Restriktionsmuster, das eine Methylierung der Cytosine der CCCGGG-Motive im genannten Bereich ausschließt. Die nicht geschnittene Sma I-Sequenz in einer Tumor-DNA (Position 143901) wurde auch für die Normal-DNA nachgewiesen und erwies sich als RFLP. Ein aufgrund dieses Ergebnisses postulierter Polymorphismus innerhalb einer Sma I- Schnittstelle konnte durch Sequenzierung der isolierten Sequenz aus dem entsprechenden Tumor verifiziert werden. Möglicherweise ist die Entstehung dieses Polymorphismus zwar die Folge einer ehemaligen Methylierung des Cytosins in der Konstellation CpG; allerdings konnte nachgewiesen werden, daß der entsprechende Nukleotidaustausch nicht im Rahmen der Karzinogenese erfolgt war, da die DNA aus PBL des gleichen Patienten die identische Sequenz aufwies. Insgesamt wurde somit für keinen der untersuchten Tumoren eine Abschaltung der CD95-Expression aufgrund einer Methylierung des Gens durch aktiviertes, onkogenes Ras festgestellt.

In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal der Einfluss des potentiellen Tumorsuppressors Pdcd4 auf das invasionsassoziierte Urokinase-Rezeptorgen(uPAR), sowie auf den Invasionsvorgang selbst, untersucht. In verschiedenen gastrointestinalen Karzinomzelllinien wurde eine gegenläufige Expression von uPAR und Pdcd4-mRNA und -Protein nachgewiesen. In Reportergen-Assays unter Verwendung von Wildtyp- und mutiertem uPAR-Promotor zeigte sich nach gleichzeitiger Transfektion von Pdcd4 eine dosisabhängige Suppression der uPARPromotoraktivität. Ferner wurden verschiedene cis-Elemente innerhalb des Promotors als potentielle Mediatoren dieser Regulation identifiziert. Bei diesen handelt es sich potentiell um die Region -402/-350bp mit mutmaßlichen Bindestellen für Sp-1, GATA-1, NF-1 und einem PEA3/ets Element an Position -245 bp. Zusätzlich konnte durch eine Mutation der kombinierten Bindungstelle für Sp-1 und Sp-3 an Position -152/-135bp, die über Pdcd4 ermittelte Suppression der Promotoraktivität aufgehoben werden. In Gelshiftanalysen zeigte sich neben einer verminderten Bindung von Transkriptionsfaktoren der GATA- und Sp-Familie innerhalb der Region -402/-350bp insbesondere eine Erhöhung der Bindung von Sp-3 an Promotorregion - 152/-135bp. Dies impliziert neben den oben genannten Mediatoren, dass Pdcd4 durch Induktion der Bindung von Sp-3 an dieses Element den uPAR-Promotor supprimiert. Darüber hinaus konnte durch die Expression von Pdcd4 die Invasionsfähigkeit der Kolonkarzinomzellinie HCT-116 in vivo reduziert werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass Pdcd4 die Promotoraktivität von uPAR über verschiedene cis-aktive Elemente des Promotors supprimiert und belegen erstmals die Regulation eines invasionsassoziierten Gens durch den potentiellen Tumorsuppressor Pdcd4. Ferner wird erstmals Sp-3 als Mediator der Pdcd4 vermittelten Genexpression vorgeschlagen. Daneben postulieren die Invasionsdaten auch eine Funktion von Pdcd4 als potentiellen Suppressor von Teilschritten der Metastasierungskaskade. Zusätzlich konnte in dieser Arbeit ein neues quantitatives CAM-Modell etabliert werden, das die Invasion und Intravasation von Tumorzellen in vivo spezifisch im Hühnerei-Modell untersucht. Das Protokoll unterscheidet sich von den bisher publizierten Arbeiten durch die Verwendung einer spezifischen TaqMan®-Probe in Zusammenfassung 116 Kombination mit Primern, die spezifisch humane Alu-Sequenzen der YB8-Unterfamilie nachweisen. Durch diese Modifikationen wurde eine höhere Sensitivität der quantitativen Alu-PCR erreicht. Zusätzlich eröffnet die Spezifität der hier entwickelten Primer über den CAM-Assay hinaus die Möglichkeit, humane Zellen und Mikrometastasen auch in murinen in vivo Modellen wie SCID- oder Nacktmäusen nachzuweisen.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Fragen zur Wechselbeziehung von Struktur und Funktion von Transkriptionsaktivatoren am PHO5-Promotor in Saccharomyces cerevisiae bearbeitet. Im ersten Teil der Arbeit wurden zwei Deletionsmutanten des Transkriptionsfaktors Pho4 hergestellt und charakterisiert. Dazu wurden aus der PHO4-Sequenz mit Hilfe einer PCR-gestützten Methode jeweils die für die Aminosäuren 97 bis 106 sowie 101 bis 110 kodierenden Sequenzen entfernt. Mit Hilfe von geeigneten Expressionsvektoren wurden beide Deletionsmutanten in S. cerevisiae exprimiert. Das Ausmaß der Transkriptionsaktivierung durch die Konstrukte wurde durch Messung der Aktivität der saueren Phosphatase bestimmt. Beide Mutanten bewirkten eine deutliche Aktivierung der Transkription am PHO5-Promotor. Daraus kann geschlossen werden, dass die hier deletierten Abschnitte von PHO4 keinen wesentlichen Anteil an der Transkriptionsaktivierung durch Pho4 haben. Zwischenzeitlich wurde der Nachweis einer minimalen transkriptionsaktivierenden Domäne von Pho4 publiziert. Die minimale transaktivierende Domäne besteht aus den Aminosäuren 79 bis 99. Dieser Abschnitt ist notwendig und ausreichend für die Öffnung der Chromatinstruktur des Promotors und die Aktivierung der Transkription. Die hier beschriebene Herstellung und Charakterisierung der Deletionsmutanten von PHO4 leistete einen wesentlichen Beitrag zur Eingrenzung der transaktivierenden Domäne von Pho4. Der zweite Teil der Arbeit befasste sich mit der Wirkung des als GAGA-Faktor (GAF) bezeichneten Transkriptionsfaktors aus Drosophila melanogaster am PHO5-Promotor von S. cerevisiae. Dazu wurden chimäre Konstrukte aus dem GAF und der DNA-bindende Domäne des Transkriptionsaktivators Pho4 hergestellt. Zudem wurden auch Fusionskonstrukte mit jeweils nur einer Hälfte des GAF und der DNA-bindende Domäne des Pho4 erzeugt. Diese Konstrukte wurden in S. cerevisiae exprimiert. Hier zeigte sich, dass die Verbindung aus dem gesamten GAF und der DNA-bindenden Domäne von Pho4, vermutlich aufgrund eines gestörten intrazellulären Transports oder aufgrund einer Instabilität des Proteins, keine Aktivität aufwies. Dagegen waren die Konstrukte, welche jeweils nur eine Hälfte des GAF enthielten, in der Lage, eine Öffnung der Chromatinstruktur und eine Aktivierung der Transkription am PHO5-Promotor zu bewirken.Um zu untersuchen, welche Veränderungen die chimären Konstrukte durch ihr Angreifen am PHO5-Promotor an der Chromatinstruktur des Promotors verursachen, wurden spezielle experimentelle Verfahren angewendet. Diese nutzen die unterschiedliche Zugänglichkeit der DNA für Enzyme bei geöffneter oder geschlossener Chromatinstruktur. Die Untersuchungen zeigten eine gleichartige Öffnung der Chromatinstruktur am PHO5-Promotor durch beide Konstrukte. Die gleichartige Öffnung der Chromatinstruktur korrelierte dabei nicht mit dem unterschiedlichen Umfang der Transkriptionsaktivierung von PHO5. Aufgrund der fehlenden Korrelation von Chromatinöffnung und Transkriptionsaktivierung stehen diese Ergebnisse im deutlichen Widerspruch zu der von vielen Autoren vertretenen Hypothese, der GAF würde die Transkription indirekt, nur durch die Öffnung repressiver Chromatinstrukturen aktivieren (Derepression). Vielmehr weisen diese Ergebnisse darauf hin, das der GAF auch als klassischer Transaktivator eine direkte Aktivierung der Transkription bewirken kann. Die Aktivierung der Transkription durch beide Hälften des GAF in den chimären Konstrukten war ein überraschendes Ergebnis. Es zeigt, dass GAF neben der glutaminreichen Domäne eine weitere Domäne enthält, die in vivo eine Aktivierung der Transkription bewirken kann. Diese Erkenntnis ist grundsätzlich neu und in der Literatur bisher nicht beschrieben worden.

Nach der Aufklärung der Basenabfolge des Genoms von Saccharomyces cerevisiae ist die Funktion der 30.000-40.000 Gene und insbesondere das Zusammenspiel der Regulation der einzelnen Gene ein zentrales Thema der Molekularbiologie. Die DNA eukaryonter Zellen liegt durch Bindungen an Histon-Proteine im Zellkern als Chromatin vor. Die Chromatinstruktur dient nicht nur der Komprimierung der DNA auf engstem Raume, sondern hat auch starke Auswirkungen auf die Funktion der DNA. So müssen Gene bei ihrer Aktivierung durch Veränderung ihrer Chromatinstruktur, die bis zur Ablösung der Histone führen kann, den für die Transkription benötigten Enzymen und Faktoren erst zugänglich gemacht werden. Das PHO5-Gen der Hefe Saccharomyces cerevisiae stellt ein sehr gut untersuchtes Modell dar, bei dem Veränderungen der Chromatinstruktur genau untersucht und mit dem funktionellen Zustand des Gens korreliert worden sind. PHO5 kodiert für eine saure Phosphatase, die bei Verbrauch der Phosphatreserven der Zelle in den periplasmatischen Raum sezerniert wird, um aus dort eventuell vorhandenen organischen Phosphatverbindungen Phosphat zu gewinnen. Ist im Medium genügend Phosphat vorhanden, ist PHO5 reprimiert. In diesem Zustand ist die Chromatinstruktur des PHO5-Promotors durch vier dicht aufeinander folgende Nukleosomen gekennzeichnet, wodurch der Promotor Enzymen und regulatorischen Proteinen allgemein schlecht zugänglich ist. Nur zwischen dem zweiten und dem dritten Nukleosom ist die dichte Anordnung der Nukleosomen durch einen etwa 70 bp langen gut zugänglichen Bereich unterbrochen. In dieser sogenannten hypersensitiven Region bindet bei Phosphatmangel der aktivierende Transkriptionsfaktor Pho4 gemeinsam mit dem Faktor Pho2 an ein UAS-Element und induziert die PHO5-Expression. Dabei lösen sich die vier Nukleosomen vom DNA-Strang ab. Sin4 ist ein Transkriptionsfaktor der Hefe Saccharomyces cerevisiae, der auf mehrere Promotoren zumeist reprimierenden Einfluss ausübt. Ausgangspunkt der hier vorliegenden Arbeit war der Befund, dass in Abwesenheit von Sin4 die Gegenwart der prokaryontischen lacZ Sequenz stromaufwärts des PHO5-Promotors zu einer Derepression des PHO5-Gens führt, und zwar in Gegenwart von Phosphat, also unter eigentlich reprimierenden Bedingungen. Dieser Effekt wurde ursprünglich bei der Verwendung der kodierenden Sequenz von lacZ als dem PHO5-Promotor nachgeschalteten Reporter-Gen in sin4-Hefezellen entdeckt. Eine Frage der hier vorliegenden Arbeit galt der Ursache der Derepression von PHO5 durch die lacZ kodierenden DNA-Sequenz. Dazu interessierte uns, ob die Derepression ein spezielles Phänomen der lacZ-Sequenz ist oder ob es sich hierbei eher um eine allgemeine Eigenschaft von DNA-Fragmenten handelt. Außerdem interessierte uns, ob die Herkunft der DNA aus prokaryonten oder eukaryonten Zellen eine Rolle spielen könnte. Dazu wurde jeweils eine große Anzahl zufällig ausgewählter DNA-Fragmente einer Länge zwischen 900bp und 1200bp aus den Genomen der Hefe Saccharomyces cerevisiae und der Bakterien Escherichia coli und Micrococcus lysodeikticus an entsprechender Stelle vor den PHO5-Promotor integriert. Die so konstruierten Plasmide wurden in einen Hefestamm transformiert, in dem das SIN4-Gen zerstört worden war. Insgesamt wurden 400 Klone mit integrierten Hefe-DNA-Fragmenten, 300 Klone mit integrierten M. lysodeikticus-DNA-Fragmenten und 14 Klone mit integrierten E. coli-DNA-Fragmenten untersucht. Die Bestimmung der Phosphatase-Aktivitäten der einzelnen Klone ergab für fast alle Plasmide mit integrierten E. coli- und M. lysodeikticus-DNA-Fragmenten eine erhöhte Aktivität trotz phosphatreichen Mediums. Im Gegensatz dazu zeigten die wenigsten Plasmide mit integrierten Hefe-DNA-Fragmenten eine Erhöhung der PHO5-Expression unter denselben Bedingungen. Von den insgesamt 400 getesteten Plasmiden wiesen nur neun eine gesteigerte PHO5-Expression auf. In allen Fällen, also für alle E. coli-, M. lysodeikticus- und Hefe-DNA-Fragmente, wurde nur in Abwesenheit von Sin4 eine erhöhte Phosphatase-Aktivität gemessen. Bei seiner Anwesenheit wurden in phosphatreichem Medium nie gesteigerte Aktivitäten beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass die hier beobachtete Derepression typischerweise eine Eigenschaft prokaryonter DNA ist. Nur ein Bruchteil der eukaryonten DNA-Fragmente aus dem Hefe-Genom führt zu einer Derepression der Promotoraktivität, während dies nahezu alle prokaryonten DNA-Fragmente aus Escherichia coli- bzw. Micrococcus lysodeikticus tun. Um die neun Hefe-DNA-Fragmente, die zu einer Aktivierung des PHO5-Promotors führten, auf eventuelle Besonderheiten zu untersuchen, wurden ihre DNA-Sequenzen bestimmt und analysiert. Außerdem wurden noch zwei E. coli-DNA-Fragmente sequenziert, die zu keiner gesteigerten PHO5-Expression geführt haben. Diese sehr eindeutigen Ergebnisse werfen Fragen nach dem zugrunde liegenden Mechanismus auf. Eventuelle DNA-Methylierungen oder kryptische Promotoren schieden als Erklärung des Phänomens aus. Unterschiede des G-C-Gehalts der einzelnen DNA-Fragmente könnten besonders für die prokaryonte DNA teilweise eine Erklärung liefern. Die beiden prokaryonten Genome haben mit 51% bzw.72% einen wesentlich höheren G-C-Gehalt als das Hefegenom mit 38%. Besonders die beiden E. coli-DNA-Fragmente, die zu keiner gesteigerten PHO5-Expression führten, besitzen einen wesentlich geringeren G-C-Gehalt als der Durchschnitt des gesamten E. coli-Genoms (44,7% bzw. 38,0% im Vergleich zu 51%). Eukaryonte DNA besitzt in ihrer Sequenz im Gegensatz zu der aus Prokaryonten eine gewisse Periodizität, die sich etwa alle 10,5bp wiederholt und die Ausbildung von Nukleosomen erleichtert. Das Fehlen dieser Periodizität in prokaryonter DNA könnte sich ebenfalls auswirken, z.B. über eine labile Chromatinstruktur, die sich auch auf den benachbarten PHO5-Promotor auswirkt und dadurch eine Dereprimierung von PHO5 in sin4-Zellen auslöst. Die Dereprimierung des PHO5-Promotors durch die wenigen Hefe-DNA-Fragmente trotz reprimierender Bedingungen könnten aufgrund anderer Mechanismen zustande zu kommen. Die neun Hefe-DNA-Fragmente, die zu einer Aktivierung des PHO5-Promotors führten, zeigten auch keinen vom Hefegenom abweichenden G-C-Gehalt. Es ist auffällig, dass alle 9 DNA-Fragmente intergenische Bereiche enthalten. In diesen Bereichen gibt es oft regulatorische Elemente, die häufig in hypersensitiven Regionen gefunden werden. Hypersensitive Regionen sind nicht in Nukleosomen gepackt und könnten dadurch auch die umgebene Chromatinstruktur beeinflussen. Unabhängig von den mechanistischen Überlegungen zeigen diese Untersuchungen, dass die Aktivität eines Promotors von der Umgebung beeinflusst werden kann und dass daher der Einsatz von heterologen Reportergenen mit Vorsicht betrachtet werden muss.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Wechselwirkung zwischen Transkriptionsfaktoren und Elementen der Chromatinstruktur bei der Regulation zweier Promotoren des Phosphatase-systems der Hefe Saccharomyces cerevisiae untersucht. Als Modellsystem wurden die Promotoren der Gene PHO5 und PHO8 gewählt, die für eine saure bzw. eine alkalische Phosphatase kodieren und durch Phosphatmangel induziert werden. Während der Induktion findet eine charakteristische Chromatin-Umordnung am Promotor statt, die sich bei PHO5 über einen Bereich von vier Nukleosomen ausdehnt, bei PHO8 jedoch signifikant geringer ist. Für die transkriptionelle Aktivierung sind insbesondere zwei Transkriptionsfaktoren nötig: das bHLH-Protein Pho4 und das Homöodomänenprotein Pho2. Der PHO5-Promotor besitzt zwei Pho4-Bindestellen, die den regulatorischen Elementen UASp1 und UASp2 entsprechen. Während UASp1 in einem hypersensitiven Bereich zwischen den Nukleosomen liegt, ist UASp2 intranukleosomal lokalisiert. Mutagenese einer der beiden Bindestellen führte zu einer zehnfachen Abnahme der Promotoraktivität, während Mutagenese beider Stellen die Induzierbarkeit des Promotors völlig aufhob. Um die Bedeutung der Lokalisation der UAS-Elemente im Chromatin zu analysieren, wurde ein Operator für den a2-Repressorkomplex oberhalb des PHO5-Promotors eingebaut. Dieser Repressorkomplex bildet im Kontext bestimmter Promotoren eine zum a2-Operator benachbarte repressive Chromatinstruktur mit basenpaargenauer Nukleosomenposition aus. Im PHO5-Promotor führte der Einbau dieses Operators zur Repression der Promotoraktivität und einer leicht verminderten Chromatinzugänglichkeit. Demnach kann der a2-Operator transkriptionshemmende Strukturen initiieren, wobei die Repression durch verstärkte Chromatinkondenation und möglicherweise durch die Rekrutierung von reprimierenden Mediatorproteinen des RNA-PolymeraseII-Holoenzyms vermittelt wird. Durch Deletionen von Bereichen zwischen dem a2-Operator und den UAS-Elementen konnten Nukleosomen wie das Nukleosom -2 zwar stabilisiert, aber nicht gezielt verschoben werden. Rekonstitutionsexperimente mit einem 180 Bp-DNA-Fragment, das den Bereich des Nukleosoms -2 enthielt, zeigten zwar einen gewissen Beitrag der Sequenz zur Histon-DNA-Bindung, dieser allein kann jedoch keinesfalls die Positionierung erklären, vielmehr scheinen Wechselwirkungen der Histone mit anderen Chromatinkomponenten entscheidenden Anteil zu haben. Zusammenfassung E -144-Der Mechanismus der Chromatin-Umordnung am PHO5-Promotor durch die Transkriptions-faktoren Pho4 und Pho2 wurde zunächst durch in vitro Experimente unter Verwendung von rekombinantem Pho2-Protein analysiert. Es konnten mehrere Pho2-Bindestellen verschie-dener Affinität im PHO5-Promotor gefunden werden. Eine der hochaffinen Pho2-Binde-stellen überlappt größtenteils mit der Pho4-Bindestelle UASp1. Die kooperative DNA-Bindung der beiden Proteine an ihre überlappenden Bindestellen resultierte in einem hochaffinen ternären Komplex. Auch am UASp2-Element, bei dem zwei Pho2-Bindestellen eine Pho4-Bindestelle flankieren, findet eine kooperative Bindung von Pho2 und Pho4 an die DNA statt. Durch Mutation der mittels in vitro-Footprints entdeckten Pho2-Bindestellen konnte gezeigt werden, daß diese zur Promotoraktivität beitragen. Sie sind nicht nur wichtig, um Pho2 an den Promotor zu rekrutieren, sondern ermöglichen auch die kooperative DNA-Bindung mit Pho4 über direkte Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen Pho2 und Pho4. Eine Pho2-Interaktionsdomäne von Pho4 ist essentiell für die Aktivierung des PHO5-Promotors, wie durch Deletionsanalyse demonstriert wurde. Die kooperative DNA-Bindung dieser Faktoren scheint demnach sehr wichtig für die Transkriptionsregulation des PHO5-Gens zu sein. Getrennte Untersuchungen von UASp1 und UASp2 in einem CYC1-Promotor-Kontext zeigen einen eindrucksvollen Unterschied zwischen den zwei UAS-Elementen und verdeutlichen die duale Rolle von Pho2 in der Aktivierung des PHO5-Promotors. Es ist in entscheidender Weise für die Rekrutierung von Pho4 zur UASp1-Stelle nötig und verstärkt darüber hinaus das Pho4-Aktivierungspotential, während es an der UASp2-Stelle eher nur das Pho4-Aktivierungspotential erhöht. Trotz der koordinierten Regulation beider Promotoren ist der PHO8- fast 10mal schwächer als der PHO5-Promotor. Von den beiden Pho4-Bindestellen am PHO8-Promotor, welche früher in vitro bestimmt worden waren, ist nur eine in vivo funktional. Der Austausch des inaktiven PHO8-UASp1-Elements durch das UASp1-Element des PHO5-Promotors erhöht das Ausmaß der Chromatinöffnung im Bereich der Nukleosomen -3 und -2 und ergibt einen zweifachen Anstieg der Promotoraktivität. Im Gegensatz dazu verhindert der Austausch der hochaffinen UASp2-Stelle durch die entsprechende UASp2-Stelle von PHO5 die Chromatin-umordnung und Promotoraktivierung, obwohl eine effiziente Bindung von Pho4 an dieser Stelle besteht. Diese Daten zeigen, daß eine quantitative Bindung von Pho4 an ein UAS-Element ohne irgendeine Chromatin-Umordnung und Promotoraktivierung möglich ist. Die Deletion der Promotorregion, die normalerweise von den Nukleosomen -3 und -2 bedeckt wird, ergibt einen zweifachen Anstieg der Promotoraktivität, was die repressive Rolle dieser Zusammenfassung -145-Nukleosomen anzeigt. Die gute Korrelation zwischen Promotoraktivität und Ausmaß der Chromatin-Umordnung impliziert, daß für das Ausmaß der PHO8-Induktion im Vergleich zu PHO5 die Qualität der Histon-DNA-Wechselwirkung eine Rolle spielt, da auch bei Einführung des PHO5-UASp1-Elements in den PHO8-Promotor keine vollständige Chromatinöffnung beobachtet wird. Obwohl Pho4 in Pho2-unabhängiger Weise am PHO8-Promotor bindet und Chromatin remoduliert, ist Pho2 dennoch an der Promotoraktivität durch Erhöhen des Aktivierungspotentials von Pho4 beteiligt, ähnlich wie am UASp2-Element des PHO5-Promotors. Die Ergebnisse dieser Arbeit haben die Rolle des Homöoproteins Pho2 bei der Induktion des PHO5- und PHO8-Promotors aufgeklärt und unterstreichen die enorme Bedeutung des kooperativen Bindens der Transkriptionsfaktoren Pho4 und Pho2. Zum anderen haben sie das Wechselspiel zwischen Transkriptionsfaktoren und der Chromatinstruktur am Beispiel dieser Promotoren besser definiert.

Die Aktivierung naiver Lymphozyten bezeichnet einen komplexen, immunmodulatorischen Prozeß, in dessen Verlauf mitotisch inaktive B- und T-Zellen als Folge des Kontakts mit Antigen in den Zellzyklus eintreten, proliferieren und anschließend zu spezifischen Effektorzellen oder zu langlebigen Gedächtniszellen differenzieren. Die klonale Expansion von Lymphozyten ist somit einerseits bedeutsam für die Förderung der akuten Immunantwort, andererseits ist sie auch Voraussetzung für die Etablierung von dauerhafter, adaptiver Immunität, deren zelluläre Grundlage die lymphozytären Gedächtniszellen darstellen. Auf wiederholte Antigen-Exposition reagieren Lymphozyten mit unmittelbarer und effizienter Aktivierung der Effektorfunktionen, beispielsweise der Produktion von Antikörpern durch BZellen oder der zytotoxischen bzw. immunmodulatorischen Aktivität von T-Zellen. Die Spezifität der Antigen-Erkennung wird in Lymphozyten durch hypervariable Antigenrezeptoren gewährleistet, deren Stimulation ein komplexes Netzwerk von Signaltransduktionsprozessen im Zellinneren initiiert. In T-Lymphozyten des Helfertyps resultieren diese Signalkaskaden unter anderem in der transkriptionellen Induktion des IL-2 Promotors. Das Signal des Antigenrezeptors wird jedoch moduliert durch die Aktivität von Corezeptoren, im Falle von T-Helferzellen beispielsweise unter Beteiligung des CD4-Moleküls. CD4 bindet an konstante Bereiche der antigenpräsentierenden MHC-II-Moleküle und stabilisiert so deren Interaktion mit dem T-Zell-Antigenrezeptor (TCR). Detaillierte Untersuchungen zu den Mechanismen der Koordination und Integration von Signalen des T-Zell-Antigenrezeptors mit denen des CD4-Moleküls bildeten das übergeordnete Thema der vorliegenden Arbeit. Sowohl der T-Zell-Antigenrezeptor als auch CD4 gehören zu einer Klasse von Rezeptoren, deren zytoplasmatische Anteile an Proteintyrosinkinasen (PTKs) koppeln. CD4 interagiert konstitutiv und nahezu stöchiometrisch mit der src-ähnlichen Kinase p56lck, welche während der Induktion von T-Zell Aktivierung eng mit der TCR-assoziierten Syk-ähnlichen Kinase ZAP-70 zu kooperieren vermag. Die Verknüpfung beider Kinasen mit den nachgeschalteten Signaltransduktionskaskaden erfolgt durch die Phosphorylierung spezifischer Substrate, welche zu Beginn dieser Untersuchungen noch größtenteils unbekannt waren. Zwei unabhängige experimentelle Ansätze sollten eine Identifikation potentieller in vivo Substrate der Tyrosinkinase ZAP-70 ermöglichen. Aufgrund von Befunden mit transmembran exprimierten Kinase-Fusionsproteine konnten mehrere Phosphoproteine als wahrscheinliche Substrate von ZAP-70 bestätigt werden, die zur selben Zeit von anderen Autoren als solche diskutiert wurden. Die zweite, parallel verfolgte experimentelle Strategie zielte auf die Charakterisierung einer konstitutiv-aktiven Variante von ZAP-70, deren Expression in TZellen zu einer Entkopplung von stimulierenden Signalen und somit zur Phosphorylierung spezifisch nachgeschalteter Substrate führen sollte. Tatsächlich konnte - durch Substitution carboxyterminaler Tyrosinreste von ZAP-70 - eine funktionell konstitutiv-aktive Mutante generiert und deren Substrate in vivo analysiert werden. Dieser Ansatz resultierte in der Charakterisierung einer bislang unvermuteten, positiv-regulatorischen Rückkopplungsschleife zwischen ZAP-70 und der ζ-Untereinheit des T-Zell-Antigenrezeptors. Dieser Rückkopplungsmechanismus könnte bedeutsam sein für die Amplifikation von Signalen des T– Zell Rezeptors. Dem Carboxyterminus von ZAP-70 würde somit entscheidendes Potential zur Modulation von T-Zell Aktivierung zukommen. Ein zweiter Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der funktionellen Charakterisierung des bislang unbekannten Proteins ACP33, welches im Vorfeld als ein potentieller Interaktionspartner der zytoplasmatischen Domäne von CD4 identifiziert worden war. Verschiedene Befunde hatten zuvor darauf schließen lassen, daß - neben p56lck - alternative intrazelluläre Liganden von CD4 existieren könnten. Mittels der Two-Hybrid Methodik konnte daraufhin die cDNA des ACP33 Proteins kloniert und zudem dessen Bindungsspezifität analysiert werden. ACP33 besitzt offenbar eine peptidbindende Domäne, welche spezifisch eine Kombination zweier hydrophober, nicht-aromatischer Aminosäurereste am Carboxyterminus von Peptiden erkennt. In der zytoplasmatischen Domäne von humanem CD4 und der aller bekannter CD4-Orthologe ist ein derartiges Interaktionsmotiv konserviert. Copräzipitationsexperimente und Mutationsanalysen bestätigten, daß C-terminale Deletionen von CD4 einen Verlust der Interaktion mit ACP33 zur Folge haben. Derselbe Effekt resultierte überraschenderweise auch aus der Substitution des Serinrestes 109 in ACP33, wodurch eine zu Hydrolasen homologe Region des ACP33 Proteins als neuartige peptidbindende Domäne identifiziert werden konnte. Funktionelle Analysen der carboxyterminalen CD4-Deletionsmutanten identifizierte das Interaktionsmotiv mit ACP33 als eine inhibitorische Determinante der antigenabhängigen T-Zell Aktivierung. ACP33 könnte demnach als eine negativ-regulatorische Komponente des Signalnetzwerkes einen bedeutenden Beitrag zur Modulation von TZell Aktivierung leisten. Zusammengenommen verdeutlichen die Resultate beider Teilprojekte, daß Regulation von T-Zell Aktivierung als ein integrativer Prozeß aus stimulatorischen und inhibitorischen Signalen anzusehen ist. Detailliertere Analysen zur Koordination dieser gegensätzlichen Signale sollte in Zukunft wesentlich zu einem besseren Verständnis von T-Zell Aktivierungsprozessen beitragen.