Podcasts about phosphatmangel

Die vorliegende Arbeit diente der funktionellen Charakterisierung der Zwei-Komponenten Systeme (ZKS) des halophilen Archaeons Halobacterium salinarum. Von der Existenz mehrerer Histidinkinasen (HK) und Antwortregulatoren (RR) neben dem Chemotaxis-ZKS CheA/CheY weiss man nur aufgrund der Sequenzierung des Genoms. Folglich fehlten bislang funktionelle Beschreibungen dieser Proteine. Die vorgelegte Dissertation begann, diesen Mangel zu beheben. Den Laborversuchen war eine bioinformatische Bestandsaufnahme vorgeschaltet, welche die Sensordomänen der HK, die Effektordomänen der RR und die konservierten ZKS-Domänen beider Proteinklassen nach greifbaren Anhaltspunkten durchforstete. Diese Rasterfahndung vermochte jedoch nur bescheidene Hinweise auf die Funktionen und Wechselwirkungen der HK und RR zu erbringen. Die praktischen Arbeiten zur funktionellen Charakterisierung der halobakteriellen ZKS basierten auf zwei unterschiedlichen Strategien. Der erste Ansatz bestand in dem Versuch einer Funktionszuordnung über die Applikation eines Phosphatmangels, dem alle bislang daraufhin untersuchten Prokaryoten durch eine exklusiv ZKS gesteuerte, differentielle Genexpression entgegenwirken. Im zweiten Ansatz wurde mit OE3855R eine der wenigen HK, deren Primärsequenz einen Hinweis auf die Proteinfunktion lieferte, eingehend biochemisch analysiert. Für die Phosphatmangelversuche musste zunächst geprüft werden, bei welchem Nährstoffangebot H. salinarum in eine Unterversorgung gerät. Den Experimenten zufolge limitiert ein Phosphatgehalt von weniger als 0,5mM im Medium die finale Wachstumsdichte. Die mangelhafte Phosphatversorgung induziert das Gen aph, was zu einer verstärkten Produktion und Sekretion des Enzyms Alkalische Phosphatase führt. Mikroarray-Analysen und RT-qPCR-Experimente deckten auf, dass das halobakterielle Pho-Regulon mehrere ABC-Transportsysteme und verschiedene sekretierte Enzyme umfasst. Über die somit stark verbesserten Phosphataufnahmefähigkeiten hinaus ändert sich die Transkription einer Vielzahl weiterer Gene, wobei es sich wahrscheinlich um sekundäre Effekte handelt. Während der Hungerphase verbraucht H. salinarum drei Viertel seines intrazellulären Phosphatspeichers. Die massive Abnahme des Phosphatvorrats ist nicht nur die Folge der Mangelversorgung, sondern gleichzeitig verantwortlich für die Induktion des Pho-Regulons. Das zuständige Regulatorprotein wurde bislang nicht enttarnt. Durch Konstruktion mehrerer Deletionsstämme konnten klassische ZKS als Signaltransduktoren überraschenderweise ausgeschlossen werden. Die Induktion von Proteinen mit Homologien zu DNA bindenden Bereichen von Transkriptionsfaktoren und zu dem regulatorischen Mediatorprotein PhoU deutet auf einen alternativen Regelkreis hin. Dieser wäre exklusiv für Archaea, da solche PhoU-Chimären ausschließlich in archaealen Genomen zu finden sind. Von der Anpassung des Proteininventars abgesehen orientieren H. salinarum-Zellen ihre Bewegungen an einem Phosphatgradienten. Diese Chemotaxis wird durch Phosphatmangel induziert und durch das Zwei-Komponenten System CheA-CheY vermittelt. Erstmals in einem Archaeon gezeigt, wird die Phosphattaxis von H. salinarum ausschließlich von anorganischem Phosphat ausgelöst. Laut Primärsequenzanalyse besitzt die Histidinkinase OE3855R eine Häm bindende PAS-Domäne (PAS3855) und könnte daher einen Sauerstoffsensor darstellen. Eine heterologe Expression von PAS3855 sollte dieser Hypothese Substanz verleihen. Das exprimierte Polypeptid enthielt geringe Mengen eines Kofaktors, der mittels Absorptionsspektroskopie und LC-MS-Analyse als Häm des Typs B identifiziert wurde. Auf Basis dieses Wissens erfolgte die Rekonstitution der Domäne mit HämB, was die Bildung eines Tetramers induzierte. Die spektroskopische Analyse entlarvte große Ähnlichkeiten zwischen den elektronischen Zuständen der zentralen Häm-Eisenionen von PAS3855 und dem Häm bindenden Redoxsensorprotein Dos aus E. coli. Da die Reduktion von FeIII- zu FeII-PAS3855 die Oligomerisierung der Domäne von einem Tetramer zu einem Dimer veränderte, lag eine redoxabhängige Signalfunktion der Histidinkinase OE3855R nahe. Die Deletion des kodierenden Gens führte zu keinem erkennbaren Phänotyp, weshalb zum gegenwärtigen Zeitpunkt keine Aussage getroffen werden kann, ob diese HK in vivo tatsächlich als Redox- oder auch Sauerstoffsensor fungiert.

Nach der Aufklärung der Basenabfolge des Genoms von Saccharomyces cerevisiae ist die Funktion der 30.000-40.000 Gene und insbesondere das Zusammenspiel der Regulation der einzelnen Gene ein zentrales Thema der Molekularbiologie. Die DNA eukaryonter Zellen liegt durch Bindungen an Histon-Proteine im Zellkern als Chromatin vor. Die Chromatinstruktur dient nicht nur der Komprimierung der DNA auf engstem Raume, sondern hat auch starke Auswirkungen auf die Funktion der DNA. So müssen Gene bei ihrer Aktivierung durch Veränderung ihrer Chromatinstruktur, die bis zur Ablösung der Histone führen kann, den für die Transkription benötigten Enzymen und Faktoren erst zugänglich gemacht werden. Das PHO5-Gen der Hefe Saccharomyces cerevisiae stellt ein sehr gut untersuchtes Modell dar, bei dem Veränderungen der Chromatinstruktur genau untersucht und mit dem funktionellen Zustand des Gens korreliert worden sind. PHO5 kodiert für eine saure Phosphatase, die bei Verbrauch der Phosphatreserven der Zelle in den periplasmatischen Raum sezerniert wird, um aus dort eventuell vorhandenen organischen Phosphatverbindungen Phosphat zu gewinnen. Ist im Medium genügend Phosphat vorhanden, ist PHO5 reprimiert. In diesem Zustand ist die Chromatinstruktur des PHO5-Promotors durch vier dicht aufeinander folgende Nukleosomen gekennzeichnet, wodurch der Promotor Enzymen und regulatorischen Proteinen allgemein schlecht zugänglich ist. Nur zwischen dem zweiten und dem dritten Nukleosom ist die dichte Anordnung der Nukleosomen durch einen etwa 70 bp langen gut zugänglichen Bereich unterbrochen. In dieser sogenannten hypersensitiven Region bindet bei Phosphatmangel der aktivierende Transkriptionsfaktor Pho4 gemeinsam mit dem Faktor Pho2 an ein UAS-Element und induziert die PHO5-Expression. Dabei lösen sich die vier Nukleosomen vom DNA-Strang ab. Sin4 ist ein Transkriptionsfaktor der Hefe Saccharomyces cerevisiae, der auf mehrere Promotoren zumeist reprimierenden Einfluss ausübt. Ausgangspunkt der hier vorliegenden Arbeit war der Befund, dass in Abwesenheit von Sin4 die Gegenwart der prokaryontischen lacZ Sequenz stromaufwärts des PHO5-Promotors zu einer Derepression des PHO5-Gens führt, und zwar in Gegenwart von Phosphat, also unter eigentlich reprimierenden Bedingungen. Dieser Effekt wurde ursprünglich bei der Verwendung der kodierenden Sequenz von lacZ als dem PHO5-Promotor nachgeschalteten Reporter-Gen in sin4-Hefezellen entdeckt. Eine Frage der hier vorliegenden Arbeit galt der Ursache der Derepression von PHO5 durch die lacZ kodierenden DNA-Sequenz. Dazu interessierte uns, ob die Derepression ein spezielles Phänomen der lacZ-Sequenz ist oder ob es sich hierbei eher um eine allgemeine Eigenschaft von DNA-Fragmenten handelt. Außerdem interessierte uns, ob die Herkunft der DNA aus prokaryonten oder eukaryonten Zellen eine Rolle spielen könnte. Dazu wurde jeweils eine große Anzahl zufällig ausgewählter DNA-Fragmente einer Länge zwischen 900bp und 1200bp aus den Genomen der Hefe Saccharomyces cerevisiae und der Bakterien Escherichia coli und Micrococcus lysodeikticus an entsprechender Stelle vor den PHO5-Promotor integriert. Die so konstruierten Plasmide wurden in einen Hefestamm transformiert, in dem das SIN4-Gen zerstört worden war. Insgesamt wurden 400 Klone mit integrierten Hefe-DNA-Fragmenten, 300 Klone mit integrierten M. lysodeikticus-DNA-Fragmenten und 14 Klone mit integrierten E. coli-DNA-Fragmenten untersucht. Die Bestimmung der Phosphatase-Aktivitäten der einzelnen Klone ergab für fast alle Plasmide mit integrierten E. coli- und M. lysodeikticus-DNA-Fragmenten eine erhöhte Aktivität trotz phosphatreichen Mediums. Im Gegensatz dazu zeigten die wenigsten Plasmide mit integrierten Hefe-DNA-Fragmenten eine Erhöhung der PHO5-Expression unter denselben Bedingungen. Von den insgesamt 400 getesteten Plasmiden wiesen nur neun eine gesteigerte PHO5-Expression auf. In allen Fällen, also für alle E. coli-, M. lysodeikticus- und Hefe-DNA-Fragmente, wurde nur in Abwesenheit von Sin4 eine erhöhte Phosphatase-Aktivität gemessen. Bei seiner Anwesenheit wurden in phosphatreichem Medium nie gesteigerte Aktivitäten beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass die hier beobachtete Derepression typischerweise eine Eigenschaft prokaryonter DNA ist. Nur ein Bruchteil der eukaryonten DNA-Fragmente aus dem Hefe-Genom führt zu einer Derepression der Promotoraktivität, während dies nahezu alle prokaryonten DNA-Fragmente aus Escherichia coli- bzw. Micrococcus lysodeikticus tun. Um die neun Hefe-DNA-Fragmente, die zu einer Aktivierung des PHO5-Promotors führten, auf eventuelle Besonderheiten zu untersuchen, wurden ihre DNA-Sequenzen bestimmt und analysiert. Außerdem wurden noch zwei E. coli-DNA-Fragmente sequenziert, die zu keiner gesteigerten PHO5-Expression geführt haben. Diese sehr eindeutigen Ergebnisse werfen Fragen nach dem zugrunde liegenden Mechanismus auf. Eventuelle DNA-Methylierungen oder kryptische Promotoren schieden als Erklärung des Phänomens aus. Unterschiede des G-C-Gehalts der einzelnen DNA-Fragmente könnten besonders für die prokaryonte DNA teilweise eine Erklärung liefern. Die beiden prokaryonten Genome haben mit 51% bzw.72% einen wesentlich höheren G-C-Gehalt als das Hefegenom mit 38%. Besonders die beiden E. coli-DNA-Fragmente, die zu keiner gesteigerten PHO5-Expression führten, besitzen einen wesentlich geringeren G-C-Gehalt als der Durchschnitt des gesamten E. coli-Genoms (44,7% bzw. 38,0% im Vergleich zu 51%). Eukaryonte DNA besitzt in ihrer Sequenz im Gegensatz zu der aus Prokaryonten eine gewisse Periodizität, die sich etwa alle 10,5bp wiederholt und die Ausbildung von Nukleosomen erleichtert. Das Fehlen dieser Periodizität in prokaryonter DNA könnte sich ebenfalls auswirken, z.B. über eine labile Chromatinstruktur, die sich auch auf den benachbarten PHO5-Promotor auswirkt und dadurch eine Dereprimierung von PHO5 in sin4-Zellen auslöst. Die Dereprimierung des PHO5-Promotors durch die wenigen Hefe-DNA-Fragmente trotz reprimierender Bedingungen könnten aufgrund anderer Mechanismen zustande zu kommen. Die neun Hefe-DNA-Fragmente, die zu einer Aktivierung des PHO5-Promotors führten, zeigten auch keinen vom Hefegenom abweichenden G-C-Gehalt. Es ist auffällig, dass alle 9 DNA-Fragmente intergenische Bereiche enthalten. In diesen Bereichen gibt es oft regulatorische Elemente, die häufig in hypersensitiven Regionen gefunden werden. Hypersensitive Regionen sind nicht in Nukleosomen gepackt und könnten dadurch auch die umgebene Chromatinstruktur beeinflussen. Unabhängig von den mechanistischen Überlegungen zeigen diese Untersuchungen, dass die Aktivität eines Promotors von der Umgebung beeinflusst werden kann und dass daher der Einsatz von heterologen Reportergenen mit Vorsicht betrachtet werden muss.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Wechselwirkung zwischen Transkriptionsfaktoren und Elementen der Chromatinstruktur bei der Regulation zweier Promotoren des Phosphatase-systems der Hefe Saccharomyces cerevisiae untersucht. Als Modellsystem wurden die Promotoren der Gene PHO5 und PHO8 gewählt, die für eine saure bzw. eine alkalische Phosphatase kodieren und durch Phosphatmangel induziert werden. Während der Induktion findet eine charakteristische Chromatin-Umordnung am Promotor statt, die sich bei PHO5 über einen Bereich von vier Nukleosomen ausdehnt, bei PHO8 jedoch signifikant geringer ist. Für die transkriptionelle Aktivierung sind insbesondere zwei Transkriptionsfaktoren nötig: das bHLH-Protein Pho4 und das Homöodomänenprotein Pho2. Der PHO5-Promotor besitzt zwei Pho4-Bindestellen, die den regulatorischen Elementen UASp1 und UASp2 entsprechen. Während UASp1 in einem hypersensitiven Bereich zwischen den Nukleosomen liegt, ist UASp2 intranukleosomal lokalisiert. Mutagenese einer der beiden Bindestellen führte zu einer zehnfachen Abnahme der Promotoraktivität, während Mutagenese beider Stellen die Induzierbarkeit des Promotors völlig aufhob. Um die Bedeutung der Lokalisation der UAS-Elemente im Chromatin zu analysieren, wurde ein Operator für den a2-Repressorkomplex oberhalb des PHO5-Promotors eingebaut. Dieser Repressorkomplex bildet im Kontext bestimmter Promotoren eine zum a2-Operator benachbarte repressive Chromatinstruktur mit basenpaargenauer Nukleosomenposition aus. Im PHO5-Promotor führte der Einbau dieses Operators zur Repression der Promotoraktivität und einer leicht verminderten Chromatinzugänglichkeit. Demnach kann der a2-Operator transkriptionshemmende Strukturen initiieren, wobei die Repression durch verstärkte Chromatinkondenation und möglicherweise durch die Rekrutierung von reprimierenden Mediatorproteinen des RNA-PolymeraseII-Holoenzyms vermittelt wird. Durch Deletionen von Bereichen zwischen dem a2-Operator und den UAS-Elementen konnten Nukleosomen wie das Nukleosom -2 zwar stabilisiert, aber nicht gezielt verschoben werden. Rekonstitutionsexperimente mit einem 180 Bp-DNA-Fragment, das den Bereich des Nukleosoms -2 enthielt, zeigten zwar einen gewissen Beitrag der Sequenz zur Histon-DNA-Bindung, dieser allein kann jedoch keinesfalls die Positionierung erklären, vielmehr scheinen Wechselwirkungen der Histone mit anderen Chromatinkomponenten entscheidenden Anteil zu haben. Zusammenfassung E -144-Der Mechanismus der Chromatin-Umordnung am PHO5-Promotor durch die Transkriptions-faktoren Pho4 und Pho2 wurde zunächst durch in vitro Experimente unter Verwendung von rekombinantem Pho2-Protein analysiert. Es konnten mehrere Pho2-Bindestellen verschie-dener Affinität im PHO5-Promotor gefunden werden. Eine der hochaffinen Pho2-Binde-stellen überlappt größtenteils mit der Pho4-Bindestelle UASp1. Die kooperative DNA-Bindung der beiden Proteine an ihre überlappenden Bindestellen resultierte in einem hochaffinen ternären Komplex. Auch am UASp2-Element, bei dem zwei Pho2-Bindestellen eine Pho4-Bindestelle flankieren, findet eine kooperative Bindung von Pho2 und Pho4 an die DNA statt. Durch Mutation der mittels in vitro-Footprints entdeckten Pho2-Bindestellen konnte gezeigt werden, daß diese zur Promotoraktivität beitragen. Sie sind nicht nur wichtig, um Pho2 an den Promotor zu rekrutieren, sondern ermöglichen auch die kooperative DNA-Bindung mit Pho4 über direkte Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen Pho2 und Pho4. Eine Pho2-Interaktionsdomäne von Pho4 ist essentiell für die Aktivierung des PHO5-Promotors, wie durch Deletionsanalyse demonstriert wurde. Die kooperative DNA-Bindung dieser Faktoren scheint demnach sehr wichtig für die Transkriptionsregulation des PHO5-Gens zu sein. Getrennte Untersuchungen von UASp1 und UASp2 in einem CYC1-Promotor-Kontext zeigen einen eindrucksvollen Unterschied zwischen den zwei UAS-Elementen und verdeutlichen die duale Rolle von Pho2 in der Aktivierung des PHO5-Promotors. Es ist in entscheidender Weise für die Rekrutierung von Pho4 zur UASp1-Stelle nötig und verstärkt darüber hinaus das Pho4-Aktivierungspotential, während es an der UASp2-Stelle eher nur das Pho4-Aktivierungspotential erhöht. Trotz der koordinierten Regulation beider Promotoren ist der PHO8- fast 10mal schwächer als der PHO5-Promotor. Von den beiden Pho4-Bindestellen am PHO8-Promotor, welche früher in vitro bestimmt worden waren, ist nur eine in vivo funktional. Der Austausch des inaktiven PHO8-UASp1-Elements durch das UASp1-Element des PHO5-Promotors erhöht das Ausmaß der Chromatinöffnung im Bereich der Nukleosomen -3 und -2 und ergibt einen zweifachen Anstieg der Promotoraktivität. Im Gegensatz dazu verhindert der Austausch der hochaffinen UASp2-Stelle durch die entsprechende UASp2-Stelle von PHO5 die Chromatin-umordnung und Promotoraktivierung, obwohl eine effiziente Bindung von Pho4 an dieser Stelle besteht. Diese Daten zeigen, daß eine quantitative Bindung von Pho4 an ein UAS-Element ohne irgendeine Chromatin-Umordnung und Promotoraktivierung möglich ist. Die Deletion der Promotorregion, die normalerweise von den Nukleosomen -3 und -2 bedeckt wird, ergibt einen zweifachen Anstieg der Promotoraktivität, was die repressive Rolle dieser Zusammenfassung -145-Nukleosomen anzeigt. Die gute Korrelation zwischen Promotoraktivität und Ausmaß der Chromatin-Umordnung impliziert, daß für das Ausmaß der PHO8-Induktion im Vergleich zu PHO5 die Qualität der Histon-DNA-Wechselwirkung eine Rolle spielt, da auch bei Einführung des PHO5-UASp1-Elements in den PHO8-Promotor keine vollständige Chromatinöffnung beobachtet wird. Obwohl Pho4 in Pho2-unabhängiger Weise am PHO8-Promotor bindet und Chromatin remoduliert, ist Pho2 dennoch an der Promotoraktivität durch Erhöhen des Aktivierungspotentials von Pho4 beteiligt, ähnlich wie am UASp2-Element des PHO5-Promotors. Die Ergebnisse dieser Arbeit haben die Rolle des Homöoproteins Pho2 bei der Induktion des PHO5- und PHO8-Promotors aufgeklärt und unterstreichen die enorme Bedeutung des kooperativen Bindens der Transkriptionsfaktoren Pho4 und Pho2. Zum anderen haben sie das Wechselspiel zwischen Transkriptionsfaktoren und der Chromatinstruktur am Beispiel dieser Promotoren besser definiert.