Podcasts about tom core komplexes

Die Translokase der mitochondrialen Außenmembran TOM-Komplex erkennt alle in Mitochondrien zu importierenden Proteine und vermittelt den Transfer in oder über die Membran. Der Mechanismus der Translokation ist allerdings bisher nur teilweise verstanden. Strukturelle Informationen über den TOM-Komplex können Fragen nach den Detailschritten beantworten helfen. Aus dem Schimmelpilz Neurospora crassa wurde der TOM-Komplex so aufgereinigt, dass Ausbeute und Reinheit strukturelle Untersuchungen mittels Proteinkristallographie ermöglichten. Kristalle des TOM-Komplexes wurden gewonnen und Beugungsexperimente durchgeführt. Die Auflösung der erhaltenen Kristalle des TOM-Komplexes war nicht ausreichend, um Aussagen über die Raumgruppe oder den strukturellen Aufbau des Komplexes treffen zu können. Deshalb wurde das Reinigungsverfahren weiter optimiert sowie eine Reihe von Mutanten des TOM-Komplexes untersucht. Bisher konnte jedoch keine Verbesserung der Beugungsdaten erreicht werden. Zu Beginn dieser Arbeit waren vier Untereinheiten des TOM-Core-Komplexes von N. crassa bekannt: Tom40, Tom22, Tom7 und Tom6. Im ansonsten vergleichbar aufgebauten TOM-Core-Komplex von S. cerevisiae war noch eine weitere Komponente Tom5 beschrieben worden. Daher wurde im Vorfeld der Kristallisationsexperimente die Zusammensetzung des N. crassa TOM-Komplexes massenspektrometrisch analysiert, wobei Tom5 als eine weitere Tom-Untereinheit in N. crassa identifiziert werden konnte. Aufgrund von Experimenten mit S. cerevisiae wurde eine Rolle des Tom5 im Proteinimport in Mitochondrien postuliert. Im Gegensatz hierzu hatte Tom5 in N. crassa keinen Einfluß auf den Proteinimport. Auch auf die Assemblierung des TOM-Komplexes und das Wachstum der Zellen wirkte sich eine Deletion von Tom5 in N. crassa nicht negativ aus. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen allerdings eine solche Funktion auch in Hefe als fraglich erscheinen. Vielmehr deuten die hier vorgelegten Befunde auf eine strukturelle Funktion von Tom5 bei der Stabilisierung des TOM-Komplexes hin. Um weitere neue Komponenten des Import- und Assemblierungsapparates der mitochondrialen Außenmembran zu finden, wurde eine massenspektrometrische Analyse der Proteine von isolierten Außenmembranvesikeln aus N. crassa durchgeführt. Hierbei wurde Mim1 als bisher unbekanntes Außenmembranprotein identifiziert. Mim1 liegt in einem 300 kDa-Komplex vor und es wurde eine essentielle Funktion von Mim1 bei der Assemblierung des TOM-Komplexes nachgewiesen.

Die Proteintranslokase in der mitochondrialen Außenmembran (TOM-Komplex) ist verantwortlich für die Erkennung von mitochondrialen Präproteinen und deren Translokation über die mitochondriale Außenmembran. Das Ziel dieser Arbeit bestand in der Klonierung und Charakterisierung von bislang nicht identifizierten Komponenten des TOM-Komplexes in Neurospora crassa sowie in der Charakterisierung der Bindung von Präproteinen an den isolierten TOM-Komplex. Dabei wurden folgende Ergebnisse erzielt: Es wurden zwei bislang unbekannte, ca. 6 bzw. 7 kDa grosse Komponenten des Neurospora crassa TOM-Komplexes, Tom6 und Tom7, identifiziert. Deren Gene wurden mittels Durchmusterung einer cDNA-Phagenbibliothek sowie einer sortierten genomischen DNA-Bibliothek identifiziert und sequenziert. Das TOM6-Gen umfasst drei Exons und zwei Introns, während das TOM7-Gen vier Exons und drei Introns enthält. Die Aminosäuresequenzen von Neurospora crassa Tom6 und Tom7 weisen eine hohe Ähnlichkeit zu denen von Tom6 und Tom7 aus anderen Organismen auf. Dabei erstreckt sich der homologe Bereich bei Tom7 über die gesamte Aminosäuresequenz, während er bei Tom6 auf den carboxyterminalen Bereich beschränkt ist. Für beide Proteine wurde jeweils eine potentielle Transmembrandomäne an ihrem Carboxyterminus vorausgesagt. Sowohl Tom6, als auch Tom7 sind integrale Bestandteile des TOM-Core-Komplexes und befinden sich in engem Kontakt zu anderen Komponenten des TOM-Komplexes. Es konnte mit Hilfe von chemischen Quervernetzungsexperimenten gezeigt werden, daß sich Tom6 und Tom7 im TOM-Komplex von Neurospora crassa in direkter räumlicher Nähe zu Tom 40 befinden. Außerdem konnte ein direkter Kontakt zwischen Tom6 und Tom22 nachgewiesen werden, welcher durch Bindung des Präproteins pSu9-DHFR moduliert wird. Ein weiterer Schwerpunkt bei der Charakterisierung von Neurospora crassa Tom6 und Tom7 bestand in der Untersuchung des Imports dieser Proteine in Mitochondrien sowie deren Assemblierung in bereits bestehende TOM-Komplexe. Sowohl Tom6, als auch Tom7 konnten in vitro in Mitochondrien importiert werden und in bereits bestehende TOM-Komplexe assemblieren. Dabei benutzen sie teilweise den generellen Importweg von Präproteinen in Mitochondrien. Der Import von Tom6 umfasst zwei nicht miteinander gekoppelte Schritte. Zunächst findet eine vom Carboxyterminus vermittelte Interaktion mit Komponenten des TOM-Komplexes statt, es folgt die Assemblierung in den TOM-Komplex. Die Assemblierung von Tom6 in den TOM-Komplex setzt eine spezifische Interaktion des aminoterminal an die Transmembrandomäne angrenzenden Bereichs mit anderen TOM-Komponenten voraus. Daneben ist eine Interaktion der Transmembrandomäne von Tom6 mit dem aminoterminal an die Transmembrandomäne angrenzenden Bereich von Tom6 essentiell für die korrekte Assemblierung von Tom6 in den TOM-Komplex. Im Gegensatz zu anderen Außenmembranproteinen kommt bei Neurospora crassa Tom6 positiv geladenen Aminosäuren im an die Transmembrandomäne angrenzenden Bereich keine Bedeutung für den Import zu. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Arbeit bestand in der Untersuchung einiger Aspekte der Bindung des mit Fluoreszenzfarbstoff markierten Präproteins pSu9-DHFR an den isolierten TOM-Komplex unter Anwendung der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie. Die Bindung dieses Präproteins an den TOM-Komplex ist reversibel und wird spezifisch von der Präsequenz vermittelt. Die apparenten Bindungskonstanten betragen 1,3 nM für den TOM-Holokomplex sowie 3,4 nM für den TOM-Core-Komplex. Ein wichtiges Merkmal der Bindung von pSu9-DHFR an den TOM-Komplex sind elektrostatische Wechselwirkungen, da eine Erhöhung der Ionenstärke im Reaktionspuffer eine drastische Verminderung der Bindung zur Folge hatte. Des weiteren geht die Bindung von pSu9-DHFR an den TOM-Komplex einher mit der Entfaltung der DHFR. Eine Verhinderung der Entfaltung der DHFR durch Komplexierung mit Methotrexat führte zu einer stark verminderten Bindung von pSu9-DHFR an den TOM-Komplex.

Die Biogenese von Mitochondrien erfordert den Eintransport cytosolisch synthetisierter Vorstufenproteine über die mitochondriale Außenmembran. Der TOM-Komplex in der Außenmembran erkennt die in die Mitochondrien zu importierenden Vorstufenproteine, bindet sie, ermöglicht den Transfer von zumindest Teilen davon über die mitochondriale Außenmembran und die Integration von Membranproteinen in die Außenmembran. Auf der Grundlage bestehender Untersuchungen des TOM-Holo-Komplexes wurden in dieser Arbeit verschiedene Subkomplexe des TOM-Komplexes aus Neurospora crassa isoliert, biochemisch und biophysikalisch charakterisiert. Zudem wurde eine neue Komponente des TOM-Komplexes identifiziert: Tom5, eine kleine Komponente von etwa 5 kDa mit Sequenzhomologie zu Tom5 von Saccharomces cerevisiae. Der in dieser Arbeit isolierte TOM-Core-Komplex besteht aus den Protein-untereinheiten Tom40, Tom22, Tom7, Tom6 und Tom5; gegenüber dem TOM-Holo-Komplex fehlen ihm die Rezeptorkomponenten Tom70 und Tom20. Der TOM-Core-Komplex weist eine Molekülmasse von ca. 400 kDa und eine Stöchimetrie der Komponenten Tom40 : Tom22 : Tom7 : Tom6 von 8 : 4 : 2 : 1-2 auf. Er kann in vitro präsequenzabhängig bis zu 8 Vorstufen-proteine pro Komplex binden. Elektronenmikroskopische Bilder des TOM-Core- Komplexes zeigen eine symmetrische Doppelringstruktur mit zwei durchgehenden Poren von etwa 2,1 nm Durchmesser. Der TOM-Core-Komplex bildet in Übereinstimmung damit Kanäle mit zwei Leitfähigkeits-niveaus, die zwei Poren entsprechen. Die Bevorzugung von Kationen und die Eigenschaft, durch mitochondriale, positiv geladene Präpeptide selektiv und spezifisch inhibiert zu werden, belegen die Rolle des TOM-Core-Komplexes bei der Proteintranslokation. TOM-Core-Komplex, dessen hydrophile Domänen von Tom22 und den kleinen Toms durch limitierte Proteolyse weitgehend abgedaut wurden, zeigte in den durchgeführten Untersuchungen nahezu identische Binde-, Kanal- und Struktureigenschaften wie der unbehandelte Core-Komplex. Die Grundstruktur der Proteintranslokase der mitochondrialen Außenmembran Zusammenfassung - 132 - kann somit hinreichend durch Tom40 und die membrandurchspannenden Domänen von Tom22, Tom7, Tom6 und Tom5 stabil gebildet werden. Weiterführende Experimente mit isoliertem Tom40 bestätigten dies. So bildet isoliertes Tom40 oligomere Strukturen mit einer mittleren Molekülmasse von ca. 350 kDa. Tom40 zeigte sich in Transmissions-EM-Bildern überwiegend als Einlochpartikel. In Übereinstimmung hiermit weisen die vom Tom40- Komplex gebildeten Kanäle eine Leitfähigkeit von nur der Hälfte der Leitfähigkeit des TOM-Core-Komplexes mit zwei Poren auf. Ein kleiner Teil des isolierten Tom40 bildet Zweilochpartikel. Tom40 ist also in der Lage, die Grundstruktur des TOM-Komplexes zu bilden, wie sie für den TOM-Core-Komplex gefunden wurde. Infrarot- und Circulardichroismus-Spektren von isoliertem Tom40 führen zu dem Schluß, daß ein einzelnes Tom40-Protomer keinen Kanal mit β -Barrel-Struktur bilden kann, sondern daß dazu mehrere Tom40 zusammenwirken müssen.