Podcasts about exons

(00:32):Before we jump in, would each of you share a little bit about your background and yourselves? (01:18):Dr. Marcou. could you provide us with an overview of what the WESDX test is? (01:50):Marissa, would you help explain why this test is important? (03:10):In your experience who would benefit from WESDX,(05:12):How does a provider order A WES DX and secondarily what type of samples are accepted?(06:24):What types of variants are detected by the test? (07:47):There are a lot of exome tests available. What are some other unique features that set WESDX apart? (09:52):Last question, could you summarize the benefits of doing WESDX at Mayo?

Please join first author Cecilia Bahit and Associate Editor Graeme Hankey as they discuss the article "Predictors of Development of Atrial Fibrillation in Patients With Embolic Stroke Of Undetermined Source: An Analysis of the RE-SPECT ESUS Trial." Dr. Carolyn Lam: Welcome to Circulation on the Run, your weekly podcast summary and backstage pass to the journal and its editors. We're your co-hosts. I'm Dr. Carolyn Lam, Associate Editor from the National Heart Center, and Duke; National University of Singapore. Dr. Greg Hundley: And I'm Dr. Greg Hundley, Associate Editor and Director of the Pauley Heart Center at VCU Health in Richmond, Virginia. Well, Carolyn, this week's feature, we're going to analyze the RE-SPECT ESUS trial. What does that pertain to? Well, you're going to have to wait and find out, but it relates to atrial fibrillation and embolic stroke. But before we get to that, how about we grab a cup of coffee and go through some of the other articles in the issue? Would you like to go first? Dr. Carolyn Lam: I sure would. Greg, we know that Chronic kidney disease is associated with adverse outcomes among patients with established cardiovascular disease or diabetes. The question is: What are the effects of Icosapent Ethyl across the range of kidney function in patients with established cardiovascular disease or diabetes from the REDUCE-IT trial? Dr. Greg Hundley: Ah, Carolyn, can you remind us what was the REDUCE-IT trial? What did it encompass there? Dr. Carolyn Lam: The REDUCE-IT trial was a multicenter double-blind, placebo-controlled trial that randomized statin treated patients with elevated triglycerides, who had cardiovascular disease or diabetes, and one additional risk factor, two treatment with icosapent ethyl at 4g daily versus placebo. After a median follow up period of 4.9 years, the study drug demonstrated a 25% relative risk reduction in the primary composite endpoint of cardiovascular death, myocardial infarction, stroke, coronary revascularization, or unstable angina. Dr. Greg Hundley: Ah, great summary of the original paper, but now this is sort of a follow-up paper. What did this paper research? Dr. Carolyn Lam: Well first, remember they focused on renal function and the median baseline GFR was 75 ml/min with a range of 17 to 123 mL/min/1.73 m2. Treatment with Icosapent Ethyl led to consistent reduction in both primary and secondary composite endpoints across the baseline GFR categories. Patients with the GFR >60 treated with Icosapent Ethyl had the largest absolute, but similar relative risk reduction for the primary composite endpoint. And while patients with GFR >60 treated with Icosapent Ethyl had the highest numerical rates of atrial fibrillation of flutter and serious bleeding. The hazard ratios for atrial fibrillation flutter and serious bleeding were similar across GFR categories. In summary Icosapent Ethyl reduced cardiovascular events among patients with elevated triglycerides in a well-controlled LDL on statin therapy across a wide range of baseline renal function. Dr. Greg Hundley: Oh, Carolyn. Beautiful presentation. That presentation was so good that I know you are ready for a quiz. We haven't had Carolyn's quiz in a week, so we've got to get right back to that. Dr. Carolyn Lam: No, we don't (laughs). Dr. Greg Hundley: Can you describe the primary sequelae of Hutchinson-Gilford progeria syndrome? Dr. Carolyn Lam: Oh wow. Okay. So this is the syndrome where there's premature aging, there's a lot of vascular stiffening, calcification. I'm going to guess some sort of atherosclerotic consequence (laughs). Dr. Greg Hundley: Very nicely done Carolyn. Oh my goodness. I need to get you to take my ABIM recertification- Dr. Carolyn Lam: (laughing) Dr. Greg Hundley: Beautifully done. So Carolyn, this paper comes to us from Dr. Vicente Andrés from Centro Nacional De Investigaciones Cardiovasculares Carlos III, and Hutchinson-Gilford progeria syndrome is a rare disorder characterized, just like you said, Carolyn by premature aging and death, mainly due to myocardial infarction, stroke or heart failure. The disease is provoked by progerin, a variant of lamin A expressed in most differentiated cells. Carolyn, these patients look healthy at birth and symptoms typically emerge in the first or second year of life. In assessing the reversibility of progerin induced damage, and the relative contribution of specific cell types is critical to determining the potential benefits of late treatment and to developing new therapies. Dr. Carolyn Lam: Wow, you've really, really piqued my interest. So what did these investigators do and what did they find? Dr. Greg Hundley: Oh Carolyn, very clever design. So the authors use CRISPR-Cas9 technology to generate mice engineers to ubiquitously express progerin while lacking lain A and allowing progestin suppression in lain A restoration in a time and cell type specific manner upon CRE recombinase activation. They characterize the phenotype of these engineered mice and cross them with CRE transgenic lines to assess the effects of suppressing progestin and restoring lain A ubiquitously at different disease stages, as well as specifically in vascular smooth muscle cells and cardiomyocytes. So Carolyn, what did they find? Well, number one, like Hutchinson-Milford progenia syndrome patients, their engineered mice appeared healthy at birth, and progressively developed Hutchinson-Milford progenia syndrome symptoms, including failure to thrive, Lipodystrophy, vascular smooth muscle cell loss, vascular fibrosis, electric cardiographic anomalies and early death. Their median lifespan was 15 months versus 26 months in the wild types. Dr. Greg Hundley: Second, ubiquitous progestin suppression in lain A restoration significantly extended lifespan, when induced in six month old, mildly symptomatic mice, and even in severely ill animals aged 13 months, although the benefit was much more pronounced upon the early intervention. And then finally, Carolyn remarkably major vascular alterations were prevented and lifespan normalized in engineered Hutchinson-Milford progenia syndrome mice when progestin suppression and lain A restoration were restricted to: just Vascular smooth muscle cells and Cardiomyocytes. Dr. Carolyn Lam: Wow, just fascinating, but, okay. What is the clinical take home message? Dr. Greg Hundley: Right, Carolyn. So these authors findings suggest that it is never too late to treat Hutchinson-Milford progenia syndrome, although the benefit is much more pronounced when progestin is targeted early in mice with mild symptoms. Also, restricting its suppression to Vascular smooth muscle cells in Cardiomyocytes is sufficient to prevent Vascular disease and normalize lifespan in mice, and therefore these data suggest that strategies to treat Hutchinson-Milford progenia syndrome through gene therapy or RNA therapy should consider targeting Vascular smooth muscle cells and Cardiomyocytes. Dr. Carolyn Lam: Oh wow. Very, very cool. Well, my next paper is a basic science paper that's significant for both its methods and its results. Dr. Greg Hundley: Oh wow, Carolyn, I can't wait. So tell us about this novel methodology. Dr. Carolyn Lam: Well, this paper is from Dr. Chang from Westlake University in Hangzhou, China, and colleagues who use a gene editing approach to efficiently institute Exon Skipping without introducing DNA double-strand breaks. So harnessing a fusion of a nuclease defective Case protein, and a cytidine deaminase, which is, we're going to abbreviate it as Targeted AID-induced mutagenesis (TAM) or base editor three (BE3), their approach precisely edited conserved guanines at splice sites, thus abrogating Exon recognition resulting in a programmable skipping of the targeted Exons. Isn't that neat? Dr. Greg Hundley: Yeah, it really is sophisticated Carolyn, wow. So what did they do using these methods? Dr. Carolyn Lam: A novel mirroring model of Duchenne muscular dystrophy was generated, which recapitulated many cardiac defects observed in the human form of the disease, including dilated cardiomyopathy, reduced left ventricular function and extensive cardiac fibrosis. Using this model, they examined the feasibility of using a cytidine base editor to install Exon Skipping and rescue the dystrophic cardiomyopathy in vivo. A single dose administration of an Adenovirus 9EtAm, instituted over 50% targeted Exon Skipping in the Chengdu muscular dystrophy transcripts and restored up to 90% dystrophin in the heart. And as a result, early ventricular remodeling was prevented and cardiac and skeletal muscle function were improved, leading to an increased lifespan of the mice. Despite gradual decline of the Adenovirus vector and base editor expression, the dystrophin restoration and pathophysiological rescue of muscular dystrophy lasted for at least a year. And so this technique really has the potential to be applied to monogenic human diseases, to modulate Exon Skipping or inclusion. Isn't that cool? Dr. Greg Hundley: Absolutely, Carolyn. Beautifully explained. Dr. Carolyn Lam: Well, let me end by sharing what else is in today's issue. There's a Perspective piece by Dr. Alexander on “Chest Pain Redux: Updated and Patient Centered.” There is an In Depth paper by Dr. Kroemer on NAD plus metabolism in cardiac health, aging and disease. And there's a Research Letter by Dr. Shepherd on sudden death in female athletes, with insights from a large regional registry in the United Kingdom. Dr. Greg Hundley: Very good, Carolyn. What a great issue. Now, how about we get to that feature discussion? Dr. Carolyn Lam: Let's go, Greg. Dr. Greg Hundley: Welcome listeners to our feature discussion today on this November 30th. And we have with us Dr. Cecilia Bahit from Rosario, Argentina and our own associate editor, Dr. Graeme Hankey from Perth, Australia to talk to us about a paper pertaining to Atrial Fibrillation. Welcome to you both, and Cecilia, we'll start with you. Could you describe for us a little bit of the background information that went into formulating your study, and then what hypothesis did you want to address? Dr. Cecilia Bahit: Thank you for the invitation. So we all know that embolic stroke of undetermined source, which is called ESUS isn't just a subset of cryptogenic stroke, and is associated with stroke recurrence about 3-6% per year. And on the other hand, we know that continuous cardiac monitoring in this patient population shows that atrial fibrillation can be detected between 10% at six months or 30% at three years. So the underlying atrial fibrillation may be a mechanism for the recurrent thromboembolic stroke in this patient population. So we know that prior studies have identified some predictors of atrial fibrillation in these patients. And if we are able to identify which patients could benefit from cardiac monitoring and have a higher yield to detect atrial fibrillation, we could do a better job at treating them. So, that was our idea behind the paper. So using the RE-SPECT ESUS trial, which was a trial that included patient with ESUS stroke and were randomized to the bigger trend versus Aspirin, we look at predictors of atrial fibrillation unassociated regarding stroke. Dr. Greg Hundley: Very nice. And so, now was this a sub-study here and maybe define for us a little bit, your study design and specific study population. Dr. Cecilia Bahit: So this was a secondary analysis of a randomized clinical trial that as mentioned it was not a sub-study, it was a secondary analysis. We thought all along to do it because of the interest of the clinical question. We look at the total patient population was 5,390 patients. And we looked at those patients who developed atrial fibrillation during the 19 months of follow-up. And it was 7.5%, 403 patients developed atrial fibrillation. Dr. Greg Hundley: Very good. And what were your results? Dr. Cecilia Bahit: So, as I mentioned, we saw that 7.5% of our patient population developed atrial fibrillation during the follow-up. And we know those patients were older, were like, have higher morbidities, and we assessed, we did an one variable analysis and then a multi-variable analysis, trying to identify predictors for atrial fibrillation. And for our model, we identified different predictors, older age, hypertension, lack of diabetes, and higher body mass index, were independent predictors of atrial fibrillation. So the patients who have atrial fibrillation have a higher recurrence of stroke, it was 7.2 versus four, compared to those that did not have atrial fibrillation. Dr. Cecilia Bahit: So I think there's an important part, that 20% of the patient population of the overall trial, this is a little more than a thousand patients, had NT-prob measure at baseline. And when we included this biomarker into the model, only older age and NT-prob were independent predictors of atrial fibrillation. In addition, even though this was not the objective of this analysis, we look at the treatment effect of the bigger trend. And even though we saw that there was a statistical benefit of the bigger trend versus Aspirin in the higher group of these in our score, the overall treatment effect was not there. So we couldn't assess the fact that the bigger trend was better compared to Aspirin in patient with atrial fibrillation, but of course the numbers were very small. Dr. Greg Hundley: Very good. Thank you so much for that wonderful description. And Graeae, now we'll turn to you as associate editor for us at Circulation, and also the editorialist on this particular paper. What caught your attention about this particular study and the results from the many papers that really come across your desk. Dr. Graeme Hankey: Thank you, Greg. And congratulations to Cecilia and her RE-SPECT ESUS colleagues. I mean, this is a landmark study, the RE-SPECT ESUS study, and just to go back, embolic stroke of undetermined source is really common. About one in four ischemic strokes, we don't know the cause of, and it's one of the major subtypes of cryptogenic stroke is an embolic ischemic stroke in which the source could have come from the heart or the aortic arch or the carotids. And we're not really sure. And we think that some of these patients have occult atrial fibrillation, but we can't pick it up at the time. So one way is to try and monitor them with prolonged ECG monitoring. And another way is to actually treat them with anticoagulation because we know that, that's more effective in people with cardio embolic stroke. And so RE-SPECT ESUS and NAVIGATE ESUS used the latter strategy and said, let's see if treating people with ESUS with anticoagulation is more effective than antiplatelet therapy. Dr. Graeme Hankey: And both studies were not significant in terms of showing that Dabigatran or Parovarian for NAVIGATE ESUS was more effective than antiplatelet therapy. So we're left now with this default that all patients with ESUS just get Aspirin, but we have a hunch that some of them actually have cardiogenic embolism and are being undertreated with Aspirin and need anticoagulation. So it's a heterogeneous entity, but we're treating it homogeneously with a sort of weak antiplatelet. So we want to try and find out who's going to get AF or who's already got it that is occult. And this study is a really great and prospective study with 5,000 patients as Cecilia said, who of whom 7% did develop AF just through annual ECG reporting and just with symptom reporting. And that's probably an under report. You know, if they'd had monitoring, they probably would've found about 20 or 30% would've developed AF during that time of 19 months follow up. Dr. Graeme Hankey: And it's the first study to really then show that not just the AF people had a higher stroke rate, but in that group who they predicted to be at high risk of AF with older age and the NT-prob, that the high risk group had a significant reduction with Dabigatran versus Aspirin in that high risk group. It's just, when you look for hetero homogeneity or heterogeneity across the risk groups, it wasn't quite significant. And that might be because it's not significant or it might be that study was underpowered to look at those three, across those three risk subgroups. And also it might be a bit confounded because of it, the patients weren't randomized according to their risk status for AF, they were just randomized, whether they had ESUS, so it's further excited us that there might be a subgroup who needs anticoagulation. And that's why the ARCADIA trial is ongoing now, looking at where the people with ESUS who have high risk of AF benefit from a apixaban versus aspirin. Dr. Greg Hundley: Very nice. And so, with these results that we have here, maybe come back to Cecilia, what do you think would be the next series of studies that needs to be performed in this area of research? Dr. Cecilia Bahit: Well, there's one side that's ongoing as Dr. Hankie mentioned, but I think we should be able to identify which patients have a higher risk of atrial fibrillation and those patients who use cardiac monitoring for long term to identify atrial fibrillation and to treat properly. So I think that would be key in this area. Dr. Greg Hundley: Very nice. And Graeae, what are your thoughts? Dr. Graeme Hankey: Yes. Well, one way is to have our ESUS patients have prolonged ECG monitoring by implantable loop recorders, for example, and then those who develop AF randomizing them to anticoagulation versus antiplatelet therapy. Although if they declare themselves with AF they're usually just go straight onto anticoagulation therapy. So the burning question is, in these people with ESUS who haven't declared themselves as AF, but have predictors of AF like those shown in RESPECT ESUS, like older age, high blood pressure, high BMI ,prob, and perhaps echo features, like left atrial size or ECG features like lots of premature atrial contractions or P wave of abnormalities. Dr. Graeme Hankey: Are these, the subgroups or even LV dysfunction, are these subgroups who need to be more specifically targeted in a randomized trial rather than the whole group of ESUS. And also with longer follow up. NAVIGATE ESUS stopped after 11 months. The bigger RESPECT ESUS stopped after a median follow up of 16 months and the curves were diverging. Maybe with five years follow up, a lot of these people would've developed AF and would've benefited from longer term anticoagulation, but the trials were stopped early, because there wasn't a signal of benefit and there was an early risk of bleeding with anticoagulation. Dr. Greg Hundley: Very good. Well listeners, this has been a really interesting study and we want to thank Cecilia and Graeme for sharing results of the RESPECT ESUS study, highlighting that, in patients with embolic stroke of undetermined source, atrial fibrillation occurs and is a possible source of this stroke, and then also older age, and elevation of NT-prob can be associated with development of atrial fibrillation, subsequent to that stroke event. Dr. Greg Hundley: Well listeners, we want to wish you a great week. And on behalf of Carolyn and myself, look forward to catching you next week on The Run. This program is copyright of the American Heart Association, 2021. The opinions expressed by speakers in this podcast are their own and not necessarily those of the editors or of the American Heart Association. For more visit ahajournals.org.

Hereditäre Myopathien, insbesondere Gliedergürteldystrophien, sind häufig mit einer begleitenden Kardiomyopathie assoziiert. Bei 15 der 27 bisher bekannten und molekulargenetisch analysierten Gliedergürteldystrophien konnte eine begleitende kardiale Komponente in unterschiedlicher Ausprägung gefunden werden. Dagegen wurde bislang nur unzureichend untersucht, wie häufig Patienten, die primär an einer hereditären Kardiomyopathie leiden, auch eine Skelettmuskelbeteiligung aufweisen, beispielsweise wie oft Patienten mit einer hypertrophen bzw. obstruktiven Kardiomyopathie (HCM oder HOCM) auch eine Gliedergürtelschwäche zeigen. Bei einer Familie mit einer bekannten familiären Kardiomyopathie konnte eine autosomal-dominante Mutation im MYBPC3-Gen gesichert werden. Mutationen in diesem Gen gehören zu den häufigsten genetischen Ursachen einer HCM. Einige schwerer betroffene Familienmitglieder litten zusätzlich an einer Gliedergürteldystrophie. Eine Gesamtexom-Analyse mittels Next-Generation-Sequencing lieferte Hinweise auf Varianten in möglichen weiteren Kandidatengenen, die die Schwere des Phänotyps erklären könnte. Alternativ wurde die Hypothese überprüft, ob Mutationen im MYBPC3-Gen neben ihrer bekannten Rolle als Ursache von Kardiomyopathien auch an der Entstehung von Gliedergürtelmuskelschwäche beteiligt sein könnten. Ein repräsentatives Patientenkollektiv wurde sowohl von neurologischer als auch von kardiologischer Seite ausgewählt, um eine klinische Kombination der Erkrankungen teilweise bestätigt zu finden. In einem kleinen Kollektiv von sieben Patienten mit einer hereditären hypertrophen (obstruktiven) Kardiomyopathie und verschiedenen Mutation im MYBPC3-Gen wurde bei drei Patienten eine bisher nicht diagnostizierte leichtgradige Muskelschwäche bestätigt, was die Möglichkeit einer Assoziation eines Gliedergürtelphänotyps und einer hereditären hypertrophen (obstruktiven) Kardiomyopathie mit Mutationen im MYBPC3-Gen nahelegte. Um zu überprüfen, ob MYBPC3-Genvarianten eine bisher übersehene Ursache erblicher Skelettmuskelerkrankungen sind, wurde ein Kollektiv von 59 Patienten mit dem klinischen Phänotyp einer Gliedergürteldystrophie, einem dystrophen Bild in der Muskelhistologie und positiver Familienanamnese ausgewählt, mit bislang aber negativer genetischer Testung in einer Reihe von bekannten LGMD-Genen. Eine molekulargenetische Analyse aller kodierenden Exons des MYBPC3-Gens lieferte jedoch keine pathogene Sequenzvariante. Auch bei einer anderen erblichen Myopathie, die als GNE-Myopathie oder hereditäre Einschlusskörpermyopathie bezeichnet wird, da sie durch Mutationen im GNE-Gen bedingt ist und muskelbioptisch charakteristische Einschlusskörper aufweist, ist neben der Skelettmuskelerkrankung auch eine kardiale Beteiligung beschrieben worden, die zwar selten auftritt, aber zu infausten Prognosen führen kann. Die GNE-Myopathie wird autosomal-rezessiv vererbt und präsentiert sich klinisch mit einer distal betonten und im weiteren Verlauf nach proximal fortschreitender Muskelschwäche, die eine typische Aussparung des M. quadriceps femoris zeigt. In der vorliegenden Arbeit wurde das GNE-Gen bei 20 klinisch ausführlich charakterisierten Patienten molekulargenetisch analysiert, mit dem Ziel, das bisher beschriebene Spektrum an bekannten Mutationen zu erweitern. Bei zwei Patienten konnten bereits publizierte Mutationen gefunden werden, wovon eine auch mit einem kardialen Phänotyp assoziiert wird. Die zusätzlich durchgeführte Proteinexpressions- und Lokalisationsdiagnostik von GNE in der Zelle mittels Western-Blot und Immunfluoreszenzmikroskopie sollte Aufschluss über die genaue Lokalisation und Funktion von GNE erbringen, um die Pathogenesemechanismen genauer zu verstehen und dadurch zielgerichtet therapeutische Strategien entwickeln zu können. Eine Einschlusskörpermyopathie findet sich ebenfalls bei der sehr seltenen hereditären IBMPFD, bei der es sich um einen Symptomenkomplex aus Einschlusskörpermyopathie (inclusion body myopathy, IBM), frontotemporaler Demenz und M. Paget des Knochens handelt, der durch Mutationen im VCP-Gen bedingt ist. Bei der IBMPFD wurden bislang weltweit 19 verschiedene Mutationen in 38 Familien gefunden. Die Erkrankung kann sich häufig auch klinisch oligosymptomatisch manifestieren, d. h. nur mit einer Myopathie. In einem Patientenkollektiv mit passendem Phänotyp ohne Nachweis einer Mutation im VCP-Gen, wurde die Analyse eines neuen, vielversprechenden Kandidatengens etabliert. Das HDAC6-Gen kodiert für ein gleichnamiges Protein, das durch die Interaktion mit VCP beim Abbau fehlgefalteter Proteine identifiziert wurde und an der Aggresombildung beteiligt ist. Somit wurden Patienten mit einem IBM- oder IBMPFD-Phänotyp und negativer genetischer Testung im VCP-Gen einer HDAC6-Genanalyse unterzogen. Eine pathogene Sequenzvariante ließ sich dabei jedoch nicht detektieren. Künftig werden neue Technologien wie die Gesamtexom-Sequenzierung die aufwändige Kandidatengenanalyse ablösen, um bei neuromuskulären Erkrankungen Mutationen in neuen oder bekannten Genen zu identifizieren, die wesentliche Erkenntnisse zur Genotyp-Phänotyp-Korrelation liefern.

Fragestellung: Das PFAPA-Syndrom ist ein erworbenes periodisches Fiebersyndrom (PFS). Das Akronym PFAPA ist zusammengesetzt aus den Leitsymptomen des Krankheitsbildes: Periodisches Fieber, Aphthöse Stomatitis, Pharyngitis und Adenitis. Da es sich aufgrund der unspezifischen Symptomatik und unbekannter Pathogenese um eine Ausschlussdiagnose handelt, stellen sich folgende Fragen: Finden sich bei Patienten mit der klinischen Diagnose PFAPA Mutationen in Genen für bekannte hereditäre PFS und gibt es Überschneidungen mit deren Krankheitsbildern? Methodik: Von Patienten mit der Verdachtsdiagnose PFAPA wurden die demographischen, klinischen und therapiebezogenen Daten sowie die Laborbefunde retrospektiv aus den Akten und einem Patientenfragebogen erhoben. Die molekulargenetische Untersuchung der Gene TNFRSF1A (TNF-Rezeptor-assoziiertes periodisches Syndrom TRAPS; Exons 2-7), MEFV (Familiäres Mittelmeerfieber FMF; Exons 2 und 10), MVK (Mevalonatkinasedefizienz, Hyper-IgD-Syndrom HIDS; Exons 6, 9 und 11) und CIAS1 (Cryopyrin-assoziierte periodische Syndrome CAPS; Exon 3) wurde mittels PCR und Sequenzierung genomischer DNA durchgeführt. Ergebnisse: Untersucht wurden 71 Kinder (51 Jungen (71,8 %), 20 Mädchen (28,2 %)) im Alter von drei bis 17 Jahren (Mittelwert 8,6 Jahre) mit Krankheitsbeginn vor dem fünften Lebensjahr. Bei 55 (77,5 %) der 71 Patienten konnte durch die genetische Untersuchung ein hereditäres PFS ausgeschlossen und so die klinische Verdachtsdiagnose PFAPA-Syndrom bekräftigt werden. Neben den o.g. Kardinalsymptomen traten Schüttelfrost, Kopfschmerzen, Hauterscheinungen, gastrointestinale und muskuloskelettale Symptome auf. Die Entzündungsparameter waren im Fieberschub signifikant erhöht. 16 Patienten (22,5 %) erwiesen sich als Träger von Mutationen, die mit hereditären PFS assoziiert sind. Bei sieben Kindern (9,9 %) wurden Mutationen im TNFRSF1A-Gen gefunden, bei je fünf Kindern (je 7,0 %) Mutationen in den MEFV- und MVK-Genen und bei einem Jungen (1,4 %) eine CIAS1-Mutation. Unter diesen Alterationsträgern waren ein Mädchen mit sowohl einer TNFRSF1A- als auch einer MVK-Mutation und ein Junge mit einer MEFV- und einer TNFRSF1A-Mutation. Zudem wurde eine bisher in der Literatur nicht beschriebene TNFRSF1A-Mutation gefunden. Schlussfolgerung: Der Anteil Mutations-positiver Patienten von 22,5 % rechtfertigt bei Kindern mit klinischem Verdacht auf ein PFAPA-Syndrom die molekulargenetische Untersuchung als einen unverzichtbaren Bestandteil der Diagnostik. Denn nur die adäquate und frühzeitige Therapie eines sonst möglicherweise nicht erkannten und behandelbaren hereditären PFS erhöht die Lebensqualität und bewahrt den Patienten vor diesbezüglich assoziierten Spätschäden wie einer Amyloidose.

Die autosomal dominante Optikusatrophie ist mit Mutationen in dem Gen OPA1 assoziiert. OPA1 kodiert eine konservierte mitochondriale Dynamin-ähnliche GTPase. Das Ortholog von OPA1 in S. cerevisiae ist Mgm1. Mgm1 liegt im Intermembranraum der Mitochondrien assoziiert mit der Innenmembran in zwei Proteinisoformen vor: der langen (l-Mgm1) und der kurzen Isoform (s-Mgm1). Beide Isoformen sind für den Erhalt der mitochondrialen Morphologie und der mitochondrialen DNA erforderlich. l-Mgm1 wird von der mitochondrialen Rhomboidprotease Pcp1 durch limitierte N-terminale Proteolyse in s-Mgm1 umgesetzt. OPA1 ist ebenfalls für den Erhalt normaler mitochondrialer Morphologie in Säugetierzellen erforderlich. Zusätzlich reguliert es die Freisetzung von Cytochrom c während der Apoptose. Insgesamt acht Transkriptionsvarianten von OPA1 sind bekannt, die durch alternatives Spleißen der N-terminal gelegenen Exons 4, 4b und 5b entstehen. Auf Proteinebene ließen sich bis zu fünf OPA1-Proteinisoformen unterschiedlicher Größe voneinander abgrenzen. Die Proteinisoformen liegen zum einen Teil membranverankert in der Innenmembran und zum anderen Teil peripher mit der Innenmembran assoziiert im Intermembranraum der Mitochondrien vor. Die vorliegende Dissertation beschäftigt sich mit der Biogenese der verschiedenen OPA1-Proteinisoformen. Hierzu wurden OPA1-Transkriptionsvarianten in Hefe heterolog exprimiert. OPA1 wird in Hefe ähnlich wie in Säugetierzellen prozessiert. Die Prozessierung erfolgt N-terminal, an mehreren Stellen und schrittweise. Die menschliche mitochondriale Rhomboidprotease PARL kann Pcp1 in der Hefe voll komplementieren, aber weder Pcp1 noch PARL prozessieren OPA1. In PARL-/--Mauszellen wird OPA1 normal prozessiert. In der Hefe ist die Prozessierung von OPA1 von den Untereinheiten Yta10 und Yta12 der mitochondrialen AAA-Protease der Matrix (m-AAA-Protease) abhängig. Durch Expression der Untereinheiten der menschlichen m-AAA-Protease, Paraplegin und AFG3L2, lässt sich die Prozessierung von OPA1 in yta10yta12 rekonstituieren. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Biogenese von Mgm1/OPA1 nicht vollständig von der Hefe bis zu Säugetieren konserviert ist. Der Austausch der prozessierenden Protease könnte in Verbindung mit einem Mechanismus zur Qualitätssicherung der Mitochondrien in Metazoa stehen.

Die Untersuchung genetischer Prädispositionsfaktoren in der Ätiologie der chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (CED) führte zur Identifikation von zahlreichen so genannten Suszeptibilitätsgenen, die eine Rolle in der Pathophysiologie der CED spielen könnten. Im Jahre 2001 wurde das so genannte NOD2-/CARD15-Gen in der perizentrischen Region des Chromosoms 16 identifiziert. Drei Hauptmutationen in diesem 12 Exons umfassenden Gen konnten mit einem Morbus Crohn (MC) assoziiert werden (c.2104C>T (p.R702W) in Exon 4, c.2722G>C (p.G908R) in Exon 8 und c.3020insC (p.1007fs) in Exon 11). Ist ein Allel durch eine dieser Mutationen verändert, so ist im Vergleich zur Normalbevölkerung das relative Risiko, an einem Morbus Crohn zu erkranken, ungefähr dreimal so hoch. Im Falle einer Veränderung beider CARD15-Allele steigt das Erkrankungsrisiko sogar um das 30 bis 40fache. Weiterhin konnte in klinischen Studien gezeigt werden, dass diese CARD15-Mutationen mit einer rascheren Progression der Erkrankung und mit einem penetrierenden und stenosierenden Verlauf assoziiert sind. Ziel der im Rahmen dieser Doktorarbeit durchgeführten Studien war es, die genetischen Analysen für den Kliniker nutzbar zu machen und die Bedeutung der Genotypisierung in der klinischen Diagnostik und Therapieplanung genauer zu definieren. Ein weiteres Hauptinteresse war die Identifizierung genetisch determinierter Subpopulationen von CED-Patienten, die ein homogenes Krankheitsbild aufweisen. Da sich in verschiedenen Studien zeigte, dass gerade homozygote und zusammengesetzt heterozygote Merkmalsträger von CARD15-Mutationen unter einer besonders schweren CED leiden, sollte eine effektive und auch in der täglichen Routine leicht anwendbare Detektionsstrategie entwickelt werden, um solche Patienten einfach identifizieren zu können. Durch die Untersuchung der drei Hauptmutationen des CARD15-Gens (p.R702W, p.G908R und p.1007fs) bei 445 CED-Patienten und eine anschließend durchgeführte Genotyp-Phänotyp-Korrelation konnte solch eine Population von Hochrisiko-Patienten identifiziert werden, die für die Insertionsmutation p.1007fs homozygot war. Dabei handelt es sich um die größte je in der Literatur veröffentlichte Subkohorte von MC-Patienten (n = 19) mit diesem Genotyp, die durch ein sehr homogenes Krankheitsbild charakterisiert war. Alle Betroffenen litten unter einem progressiv verlaufenden Morbus Crohn mit der häufigen Notwendigkeit einer operativen Intervention, und sie mußten mit Immunsuppressiva behandelt werden, um eine Remission der Erkrankung zu erreichen. In einer weiteren Studie wurde eine zweite Subgruppe von CED-Patienten identifiziert, die ebenfalls unter einer raschen Progression der Erkrankung litt. Es handelte sich dabei um zusammengesetzt heterozygote Merkmalsträger, deren zweite, seltenere Mutation durch eine limitierte DNA-Sequenzanalyse der Exons 4, 5, 6, 8 und 11 des CARD15-Gens detektiert werden konnte. Durch diese Detektionsstrategie war es theoretisch möglich, bis zu 96,6 % der bis dahin beschriebenen mutierten Allele effektiv zu identifizieren. Von den acht neuen CARD15-Varianten spielt die Mehrheit wahrscheinlich eine Rolle in der Pathophysiologie der CED. Im Rahmen einer ebenfalls am Universitätsklinikum München-Grosshadern durchgeführten prospektiven doppelblinden Studie sollte anschließend anhand des Phänotyps der CED-Patienten der assoziierte Genotyp vorhergesagt werden. Hierbei konnte die Insertionsmutation p.1007fs als Vorhersagewert für einen stenosierenden Verlauf des Morbus Crohn im terminalen Ileum identifiziert werden. Trotz kontroverser Diskussionen über den wirklichen Nutzen und die Konsequenzen der Kenntnis des CARD15-Mutationsstatus eines CED-Patienten im klinischen Alltag, d. h. für die Diagnostik und eventuell für die weitere Therapieplanung, scheint bei Betrachtung der Ergebnisse der im Rahmen dieser Doktorarbeit durchgeführten Studien eine Genotypisierung von CED-Patienten durchaus sinnvoll zu sein. Angesichts der Häufigkeiten und der Lokalisation der CARD15-Mutationen ist sicherlich eine initiale Fokussierung auf die drei Hauptmutationen des CARD15-Gens (p.R702W, p.G908R und p.1007fs) zum Beispiel mittels RLFP-Analysen sinnvoll. Eine Untersuchung weiterer Regionen des CARD15-Gens durch Sequenzierung der DNA ist vorzugsweise bei Patienten angebracht, die sich bereits in jungen Jahren mit einem schweren Krankheitsbild präsentieren. Insgesamt können nur etwa 20 % der genetischen Prädisposition für einen Morbus Crohn durch CARD15-Mutationen erklärt werden, wobei zwischen 35 und 45 % der MC-Patienten Träger von CARD15-Mutationen sind. Demzufolge müssen Veränderungen in weiteren Suszeptibilitätsgenen für die genetische Prädisposition verantwortlich sein. Seit der Erstbeschreibung des CARD15-Gens wurden dementsprechend weitere Gene bzw. Genveränderungen beschrieben, die ebenfalls eine Rolle in der Entstehung einer CED spielen könnten. DLG5, SCL22A4 und SLC22A5, Gene der HLA-Region, CARD4 und TLR4 sind solche potentiellen Suszeptibilitätsgene.

Nab2 ist in Melanomen und Melanomzelllinien im Vergleich zu Melanozyten und benignen Nävi stark überexprimiert. Durch Stimulation mit Wachstumsfaktoren oder Phorbolester kann Nab2 außerdem in allen Geweben und Zelllinien transient induziert werden. Die Expressionskinetik folgt dabei der eines delayed early response-Gens. Das Nab2-Protein ist ein transkriptioneller Korepressor der für die Wachstums- und Differenzierungsregulation wichtigen Zinkfinger-Transkriptionsfaktoren Egr1, Egr2 und Egr3. Das sind immediate early response-Gene, die durch die selben Stimuli induziert werden wie Nab2. Nach Stimulation wird die Expression von Egr deswegen grundsätzlich von einem Anstieg der Nab2-Expression gefolgt. Nab2 ist deswegen wahrscheinlich der wichtigste Repressor der Egr-Aktivität und verhindert eine übermäßige Stimulation von Egr-Zielgenen. Ziel dieser Arbeit war es, die regulatorischen DNS-Abschnitte des Nab2-Gens zu isolieren und genau zu charakterisieren. Am Nab2-Promotor sollten dann die Ursachen für die Überexpression im Melanom untersucht und der Mechanismus der Nab2-Induktion nach Stimulation identifiziert werden. Dazu wurde die genomische Nab2-DNS in einer humanen DNS-Bibliothek durch DNS-Hybridisierung identifiziert und daraus isoliert. So konnte ein 7.391 bp langes DNS-Fragment kloniert werden, das 1.845 bp der 5´-untranslatierten Region sowie die gesamte, aus 7 Exons aufgebaute proteinkodierende Nab2-Sequenz enthält. Durch in silico Analysen der 5´-untranslatierten Region konnten eine putative Promotorregion von Position -705 bis -82 (+1 = Adenin des Startkodons), eine CpG Insel von Position -876 bis +82 aber keine klassischen Kernpromotorelemente wie eine TATA-Box oder ein Inr-Element identifiziert werden. Der Nab2-Promotor gehört deshalb zur Klasse der TATA- und Inr-losen CpG-Insel-Promotoren. Durch eine Kombination aus EST- und cDNS-Kartierungen sowie Primerextensionsversuchen konnte ein sehr großes Transkriptionsstartareal identifiziert werden, das sich von Position -366 bis -96 erstreckt. Um funktionelle Studien mit der 5´-untranslatierten Nab2-Region durchzuführen wurden 17 verschiedene 5´-verkürzte Abschnitte daraus in Luziferase-Reportervektoren kloniert und deren transkriptionelle Aktivität in verschiedenen Zelllinien untersucht. Für das Erreichen der maximalen Promotoraktivität (ca. dem 400fachen der Aktivität des Leervektors) war der Sequenzabschnitt stromabwärts von Position -679 ausreichend. Ab Position -58 war dann keine Promotoraktivität mehr detektierbar. Der Nab2-Promotor erstreckt sich also von Position -679 bis -58. Der Kernpromotor konnte aufgrund der Lokalisation der Transkriptionsstartpunkte (-366 bis -96) und des 3´-Endes des Promotors (-58) zwischen Position -366 und -58 eingegrenzt werden. Die sehr hohe Aktivität des gesamten Nab2-Promotors wird durch die aktivierende Region von Position -679 bis -263 hervorgerufen. Durch diesen DNS-Abschnitt steigt die Aktivität vom 15- bis 30fachen auf das ca. 400fache der Aktivität des Leervektors. In dieser positiven regulatorischen Region konnten 10 putative Sp1-Bindestellen identifiziert werden, die mit hoher Wahrscheinlichkeit zu dem Aktivitätszuwachs beitragen. Um die Ursache der Überexpression von Nab2 in Melanomzelllinien zu Untersuchen, wurde die Aktivität der Nab2-Reporterkonstrukte in Melanomzelllinien, die Nab2 überexprimieren, und in Karzinomzelllinien, die nur wenig Nab2 exprimieren, verglichen. Die Reporterkonstukte zeigten jedoch in Melanom- und Karzinomzelllinien ungefähr die gleiche Aktivität. Die Ursache für die Überexpression in Melanomzelllininen konnte durch diese Versuche nicht identifiziert werden. Schließlich wurde die Aktivität der Reporterkonstrukte in unstimulierten und PMA stimulierten Zellen verglichen. Durch die PMA-Stimulation stieg die Aktivität des Nab2-Promotors auf das ca. 3fache der Basalaktivität an. Die gesteigerte Nab2-Expression nach Stimulation wird demnach auf der Transkriptionsebene reguliert. Anhand der Verkürzungskonstrukte konnte ein 19 bp langer DNS-Abschnitt zwischen Position -232 und -213 identifiziert werden, der diesen Anstieg der Promotoraktivität nach Stimulation hervorruft. In diesem Abschnitt liegen je eine Egr1- und Sp1-Bindestelle, die sich teilweise überlappen. Bei Kotransfektion eines Egr1-Expressionsvektors mit den Nab2-Reporterkonstrukten konnte ein Aktivitätsanstieg vergleichbarer Größenordnung wie durch PMA-Stimulation beobachtet werden. Wurde die Egr1-Bindestelle an Position -222 durch Mutation inaktiviert, so nahm die Induzierbarkeit des Nab2-Promotors durch PMA um 35-50% und durch Egr1-Kotransfektion um 64-73% ab. Diese Daten zeigen, dass Egr1 alleine in der Lage ist, den Nab2-Promotor maximal zu aktivieren und dass dieser Effekt vorwiegend über die Egr1-Bindestelle an Position -222 vermittelt wird. Weil der Promotor aber nach der Inaktivierung der Egr1-Bindestelle an Position -222 noch durch PMA und durch Egr1-Kotransfektion aktivierbar ist, sind weitere Egr1-Bindestellen und womöglich noch andere Transkriptionsfaktoren an der Aktivierung beteiligt. Diese Daten zeigen, dass der Transkriptionsfaktor Egr1 seinen eigenen Korepressor Nab2 induziert. Funktionell liegt also ein negativer Rückkoppelungs-Mechanismus vor, der eine überschießende Egr1-Aktivität verhindert.

Das kolorektale Karzinom ist die zweithäufigste Todesursache durch maligne Tumoren in den Industrienationen, verantwortlich für mehr als 10 % aller Krebstoten, mit zunehmender Inzidenz. Eine Heilung verspricht nur die chirurgische Intervention im Frühstadium, die Prognose in fortgeschrittenen Krankheitsstadien ist meist schlecht. Die Entdeckung der genetischen Veränderungen während der Tumorgenese kolorektaler Tumoren lässt hoffen, dass eine Früherkennung dieser ernsten Erkrankung über den Nachweis bestimmter Genmutationen im Stuhl oder der Kolonlavageflüssigkeit möglich ist. Die dabei am häufigsten auftretenden Mutationen betreffen das p53-Tumorsuppressorgen. Ziel dieser Arbeit war die Optimierung einer Methode zum Nachweis von p53 Mutationen in Kolonlavageproben. Mit Hilfe einer „Single Strand Conformation Polymorphism“ – Analyse war ein einfaches Screening der Exons 5-8 des p53-Gens möglich. Für die Etablierung dieser SSCP-Analyse und als positiv Kontrolle dienten die Zelllinien SW480, HaCat, Kle-1B, Hec-1B, Hut 78 und BT-20. Alle Mutationen der Zelllinien ließen sich in der optimierten SSCP-Analyse zweifelsfrei nachweisen. Dabei konnte bezüglich der Sensitivität dieser Methode gezeigt werden, dass ein Anteil von ≥ 20 % mutierter DNA in der Wildtyp-DNA nötig ist, um die Mutation nachzuweisen. Bei 37 Patienten mit kolorektalem Karzinom und einem Patienten mit einem 3 cm großen kolorektalen Adenom wurde eine Koloskopie durchgeführt. Die Tumoren wurden histopathologisch klassifiziert und die Lavageflüssigkeit zur weiteren Analyse gesammelt. Nach der Extraktion der DNA aus den Lavageproben folgten PCR und Reinigung der Amplifikate. Sowohl die Extraktion der DNA als auch die Amplifikation konnte in allen Fällen problemlos durchgeführt werden. P53 Mutationen konnten mit Hilfe der SSCP-Analyse bei 8 (22 %) der Karzinompatienten und bei dem Adenompatienten (100 %) detektiert werden. Es zeigte sich keine Korrelation zwischen dem Tumorstadium und dem Mutationsnachweis. Weiter zeigte sich keine Korrelation zwischen zusätzlich zu den Karzinomen vorhandenen Adenomen und dem Mutationsnachweis. Mit der hier verwendeten Methode ist ein Nachweis von p53 Mutationen in Kolonlavageproben möglich. Es konnten Mutationen sowohl in einem prämalignen Stadium als auch bei kleinen, auf Mukosa und Submukosa beschränkten, Karzinomen nachgewiesen werden. Der Mutationsnachweis gelang bei Tumoren aus allen Kolonabschnitten. Dennoch ist die Sensitivität der hier vorgestellten Methode zum gegenwärtigen Zeitpunkt nicht ausreichend. Weitere Studien werden benötigt, um die Sensitivität beispielsweise durch DNA-Anreicherungsmethoden zu erhöhen.

Die Grundlage für die Entstehung von Tumoren bildet der Erwerb genetischer Veränderungen, wobei neben Mutationen wie Chromosomeninstabilitäten, Insertionen, Deletionen oder Basenmutationen auch epigenetische Vorgänge von Bedeutung sind. Hierzu zählt die veränderte Methylierung von DNA in neoplastisch transformierten Zellen, die bei einigen Genen in deren transkriptionellen Inaktivierung resultiert. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten Kolon- und Magenkarzinome auf bestehende Methylierungsdefekte in zwei Genen untersucht werden. Im ersten Teil wurde ein in die Mismatch-Reparatur involviertes Gen, das hMLH1-Gen, untersucht. Gastrointestinale Karzinome wurden hierbei hinsichtlich eines Zusammenhangs zwischen ihrer Mikrosatelliten- instabilität und einer möglichen Methylierung von Cytosinbasen im hMLH1-Promotor analysiert. Hierfür kam die Bisulfitmethode zur Anwendung, bei der die Umwandlung von unmethylierten Cytosinbasen zu Uracil erfolgt und die damit die Grundlage für die anschließende methylierungssensitive PCR bildet. Insgesamt ließ sich die Mikrosatelliten- instabilität bei sieben von neun untersuchten Karzinomproben auf Methylierung der proximalen Promotorsequenz zurückführen. Der Methylierungsstatus der beiden übrigen mikrosatelliteninstabilen Tumoren konnte nicht eindeutig bestimmt werden, obwohl die Vollständigkeit der Bisulfitmodifikation über den Nachweis des maternalen Methylierungsmusters des Exons 1 von SNRPN bestätigt wurde. Überdies konnte eine Deletion dieser Sequenz mittels Überprüfung der unbehandelten DNA ausgeschlossen werden. Gegenstand des zweiten Teils dieser Arbeit war die Untersuchung des CD95-Gens, eines Mitglieds der Tumor- Nekrose-Faktor-Rezeptor-Familie (sog. Todesrezeptoren), das eine entscheidende Rolle bei der ungestörten Apoptose von Zellen spielt. Grundlage hierfür waren die Ergebnisse von Peli et al., 1999, denen zufolge die CD95-Expression in mehreren etablierten Säugetierzellinien durch onkogenes Ras (H-Ras) herunterreguliert wird, wodurch sich eine Resistenz der Zellen für CD95L-induzierte Apoptose entwickelt. Hinweise aus den genannten Untersuchungen, die Inaktivierung von CD95 sei möglicherweise durch Methylierung des Promotors verursacht, sollte in der vorliegenden Arbeit anhand von gastrointestinalen Karzinomen näher analysiert werden. Hierzu wurde der Methylierungsstatus von Promotor, Exon 1 und Intron-Enhancer des CD95-Gens von 17 Tumorproben mit Ras-Mutationen (KRAS2-Mutation in Kodon 12) mittels methylierungssensitiver Restriktionsenzyme, nachfolgendem Southernblot und Hybridisierung ermittelt. Bei 16 Tumoren erbrachte die Restriktionsanalyse für Sma I ein Restriktionsmuster, das eine Methylierung der Cytosine der CCCGGG-Motive im genannten Bereich ausschließt. Die nicht geschnittene Sma I-Sequenz in einer Tumor-DNA (Position 143901) wurde auch für die Normal-DNA nachgewiesen und erwies sich als RFLP. Ein aufgrund dieses Ergebnisses postulierter Polymorphismus innerhalb einer Sma I- Schnittstelle konnte durch Sequenzierung der isolierten Sequenz aus dem entsprechenden Tumor verifiziert werden. Möglicherweise ist die Entstehung dieses Polymorphismus zwar die Folge einer ehemaligen Methylierung des Cytosins in der Konstellation CpG; allerdings konnte nachgewiesen werden, daß der entsprechende Nukleotidaustausch nicht im Rahmen der Karzinogenese erfolgt war, da die DNA aus PBL des gleichen Patienten die identische Sequenz aufwies. Insgesamt wurde somit für keinen der untersuchten Tumoren eine Abschaltung der CD95-Expression aufgrund einer Methylierung des Gens durch aktiviertes, onkogenes Ras festgestellt.

Unzureichende Möglichkeiten in Diagnose und Behandlung von epithelialen Ovartumoren führen zu einer niedrigen Überlebensrate der Patientinnen. Die molekularen Zusammenhänge, die der Progression dieser Krankheit zugrunde liegen, sind noch weitgehend unbekannt und erschweren Verbesserungen in der Früherkennung und Therapie. In der vorliegenden Arbeit wurden mit Hilfe der Affymetrix Genchip-Technologie die Genexpressionsprofile von elf Ovartumor-Zelllinien mit denen von zwei IOSE-Zelllinien, die aus normalen Epithelzellen des Ovars etabliert wurden, verglichen. So sollten Gene identifiziert werden, welche die Tumorzellen von den normalen Zellen unterscheiden und eventuell als diagnostischer Marker oder als Zielgen für therapeutische Zwecke dienen können. Mit besonderem Augenmerk auf Transmembran- bzw. sezernierte Proteine wurden zunächst 21 bzw. sieben Gene in den beiden Gruppen identifiziert, deren Überexpression in Karzinomen des Ovars zum ersten Mal ermittelt wurde. Die Ergebnisse der Affymetrix-Analyse wurden mittels RT-PCR in sieben ausgewählten Genen bestätigt. Die Expressionsanalysen von drei ausgewählten Genen, NMU, JAG2 und L1CAM, wurden auf Ovartumor-Gewebeproben ausgeweitet und eine mögliche Rolle in der Tumorgenese des Ovarkarzinoms diskutiert. Da für L1CAM spezifische Antikörper zur Verfügung standen, konnte gezeigt werden, dass die Abundanz der L1CAM-mRNA mit der Protein-Abundanz korrelierte und die Lokalisierung in der Zelle wie erwartet in der Plasmamembran erfolgte. Die Expression von L1CAM konnte immunhistochemisch in Paraffinschnitten von Ovarkarzinomen nachgewiesen werden. Zu einem geringeren Prozentsatz konnte das Zelladhäsionsmolekül auch in Borderline-Tumoren, die in der Regel durch eine gute Prognose gekennzeichnet sind, und Fibromen identifiziert werden. In malignen Ovartumoren nicht epithelialer Herkunft konnte keine L1CAM-Expression festgestellt werden. Zeitgleich wurde die Überexpression von L1CAM in Ovarkarzinomen beschrieben und das Molekül als prognostischer Marker in Karzinomen des Ovars, Uterus und des Endometriums identifiziert. Durch funktionelle Analysen sollte die Funktion von L1CAM in Ovartumorzellen untersucht werden. Bei der Klonierung von L1CAM wurde festgestellt, dass aus den verwendeten Ovartumor-Zelllinien nur eine Isoform des Gens isoliert werden konnte, in der die Exons 2 und 27 deletiert sind. In stabilen L1CAMΔ2,27-Transfektanten konnte gezeigt werden, das die Expression dieser Isoform zu erhöhter Adhäsion an Laminin im Vergleich zu Vektor-Transfektanten führt. Die Invasionsfähigkeit der Transfektanten wurde durch die ektopische L1CAMΔ2,27-Expression nicht verändert. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit unter der Verwendung der Genchip-Technologie die zwei potenziellen Markergene NMU und JAG2 identifiziert, die in weiteren Analysen auf ihre Bedeutung in Ovarkarzinomen untersucht werden müssen. L1CAM wurde in immunhistochemischen Studien als Marker identifiziert, dessen prognostischer Wert in Zukunft die Diagnose und Therapie dieser aggressiven Erkrankung verbessern könnte. Zudem bieten die vielfältigen Funktionen von L1CAM Möglichkeiten bei der therapeutischen Intervention durch monoklonale Antikörper, die durch die Expression einer Spleißvariante in Ovartumorzellen spezifiziert werden könnte.

In der vorliegenden Arbeit wurde ein Deletionsscreening mittels qunatitativer Multiplex-PCR am Beispiel des APC-Gens etabliert, mit dem Deletionen ganzer Exons detektiert werden können. Die Gendosis einzelner Exons wird dabei durch Vergleich der Produktmengen der Exons untereinander und mit einem Kontrollexon eines anderen Gens ermittelt. Bei sechs der zwölf untersuchten DNA-Proben (Blut und Gewebe) konnten Deletionen eines oder mehrerer Exons nachgewiesen werden.

Summary CADASIL (cerebral autosomal arteriopathy with subcortical infarcts and eukoencephalopathy) is a autosomal dominant disease,which lead among other things to migraen headache and early stroke. Shortly before beginning of this work Notch3 was identified as responsible gene. Notch3 coded for a large transmembranereceptor with 34 extracellularly located,epidermal growth factor (EGF) similar domains. In this work 70 related families (70 index patients and 13 relatives) with bioptisch secured diagnosis in substantial two Exons (3 and 4) were examined, since within this range the mutations accumulate. By sequencing of Exon 3 and Exon 4 mutations in 70 % of the cases were identified. Three types of mutations were found: Point mutations ((n = 50), Dinukleotid mutation (n = 1) and Deletionen (n= 2). In addition numerous Polymorphismen was identified (n =43). Seven of the mutated nucleotides mutations arose frequently, whereby transitions of cytosine to thymine occure. All mutations including the Deletionen led either to an acquisition or a loss of a Cystein. Therefore it is to be accepted obviously that the change of a Cystein in a EGF similar domain of Notch3 represents the crucial mutation mechanical which is responsible for CADASIL. With the Polymorphismen no changes of the Cystein arose. Genotyp/Phaenotyp correlations could not be proven. This stands in the agreement with the uniformity of the mutations. Due to the results of this work an improvement in the procedure results for the existing diagnostics. Scinbiopsie and MRT photographs can be supplemented by the sequencing of Exon 3 and 4. Thus 2/3 of the mutations are already discovered. If no mutations are found there, still the remaining 22 Exons of the extracellular domain can be sequenzed, whereby here first on Exon 6 (and 12) the emphasis should be put. This procedure is used meanwhile as standard technique for the diagnostics. In this work as the further supplementing diagnostic method the analysis with mutation-specific restriction enzymes was developed. Under consultation of the theoretically computed restriction enzymes of the 7 most frequent mutations one receives 52% (amount of = 37) of the mutations with 70 index patients (74% of the found mutations). In families, in which a mutation already admits is, further family members with this method let themselves be examined faster and more economically, than by sequencing. In this work it could be shown that forecasts of mutation effects make the development of protein models possible on the protein structure. As possible working hypothesis a Conformationchange ore a Surfacechange can be accepted, the one effect on the connection partner be had can and possibly the function affected. An incorrect dismantling of the Notch3 of receptor leads to the fact that truncated receptor fragments collect in the Media of the vessels in the proximity of osmiophilen deposits. Because of the stereotyped mutations with those frequently so-called CpG (modulators of the Epigenetic)is present further possible mutations can be predicted.

IL-12, ein heterodimeres Zytokin bestehend aus IL-12p40 und IL-12p35, wird hauptsächlich von Zellen des angeborenen Immunsystems als Antwort auf intrazelluläre Pathogene gebildet und induziert eine TH1 vermittelte Immun- reaktion. Hühner IL-12p40 wurde in einer EST-Datenbank identifziert und vollständig kloniert. Der Vergleich des Hühner IL-12p40 Gens mit verschiedenen Säugerhomologen ergab Aminosäureidentitäten von 39,7% bis 43,5%. In der Hühnergenomsequenz wurde das IL-12p40 Gen auf Chromosom 13 lokalisiert, es ist 4898bp lang und besteht aus fünf Exons und vier Introns. Der korrespondierende offene Leserahmen besteht aus 945bp und kodiert für ein 315 Aminosäuren langes Protein. ChIL-12p40 wurde sowohl in prokaryotischen als auch in einem eukaryotischen System exprimiert und unter denaturierenden bzw. nativen Bedingungen aufgereinigt. Mit Hilfe des aus E. coli gewonnen ChIL-12p40 wurde ein polyklonales Kaninchen-a-ChIL-12p40 Antiserum entwickelt, das sowohl ChIL-12p40 aus prokaryotischem Expressionssystem als auch aus dem eukaryotischen Schneider SL-3-System erkennt und im Westernblot ChIL-12p40-Mengen bis zu 7,5ng detektiert. Die Klonierung der Hühner IL-12p35 Kette mit Hilfe von PCR mit Oligonukleotiden, spezifsch für hochkonservierte Regionen in Säugerhomologen, war nicht erfolgreich. Erst nach der Veröffentlichung der Hühnergenomsequenz konnte das Hühner IL-12p35 Gen auf Chromosom 9 identifziert wer- den. Die genomische Sequenz ist 1797bp lang und besteht aus fünf Exons und vier Introns. Die kodierende Region ist 615bp lang und kodiert für ein 205 Aminosäuren langes Protein, das 26,8% bis 31,2% Identität zum Säuger aufweist. Die Gene für Hühner IL-12p40 und IL-12p35 wurden durch einen Linker hintereinander kloniert und als IL-12p40/p35 -"Flexi-IL-12" exprimiert. Zur Analyse der Expression von IL-12p40 wurde RT-PCR auf cDNA Proben durchgeführt, die von verschiedenen Zelllinien, Geweben sowie stimulierten und unstimulierten Zellen stammten. IL-12p40 Signale wurden in HD-11-, RP9-, 2D8-, T16G5-, JJ1G9-, OU2-, CEC32-Zellen und mit IL-2 stimulierten Milzleukozyten detektiert. Zur weiteren Kontrolle wurde auch IFNg und IL-18 per PCR nachgewiesen. In einem in vitro Zellsystem wurde nachgewiesen, dass das rekombinant hergestellte Hühner IL-12p40 konzentrationsabhängig Milzzellen zur Sekretion von IFNg stimuliert.

5.1 Analysis and characterization of the mouse Hic2 gene Like Hic1 and γFBP (chicken), Hic2 cDNA coded five Krüppel-type C2H2 zinc finger domain. Through the sequencing and comparation with different protein sequences from the homolog proteins from different species (HIC1, Hic1, HIC2, γFBP, and Hypothetical protein), Hic2 protein shares more than 80% homology with HIC1 through the BTB/POZ and zinc finger domains, and both proteins have identical GLDLSKK/R motifs. A new part of Hic2 gene coding, exon two, and new exon one deduced full-length Hic2 protein contains 601 amino acids. Hic2 gene has two Exons (240 and 1842 bp), with one Intron (2182 bp). The location of the gene is mouse chromosome 16 (B1, UniGene Cluster Mm.103787 Mus musculus). The human gene HIC2 maps to chromosome 22q11.2, and is a homolog of the HIC1 candidate tumor suppressor gene located at 17p 13.3. (Deltour et al. 2001). Upstream from the TATA box MatInspector predicted different transcription binding sites. Between them Wilms Tumor Suppressor and p53 are most interesting transcription sites for the Hic2 gene. That’s why the Hic2 promoter activity was checked. A 1.2 kb promoter fragment of Hic2 has been characterized in a gene reporter assay system. The peak activity of the Hic2 promoter is associated with the total fragment, the next higher activity is in the fragment which included Wilms Tumor Suppressor and p53 transcription sites. The expression of the mouse Hic2 was investigated by in situ hybridisations (ISHs) of whole mount embryos and paraffin sections. Hic2 expression was detected in restricted territories of the brain, sinus centralis, olfactory bulb, canallis centralis medullae spinalis, embryonic ectoderm (neuroepithelium of neural tube), and small intestine. Because of its expression in the central nervous system, and mapping position of its human homolog HIC2, Hic2 could be involved in some syndromes. Patients with a 22q11 deletion have disrupted brain development which may involve abnormal neural crest cell migration, (Van Amelsvoort et al., 2001). It is now recognized that the 22q11.2 deletion syndrome encompasses the phenotypes previously described as DiGeorge syndrome (DGS) and velocardiofacial syndrome (Shprintzen syndrome),(Thomas and Graham 1997).

Die kongenitalen myasthenen Syndrome (CMS) bilden klinisch und pathogenetisch eine heterogene Gruppe von relativ seltenen hereditären Erkrankungen des Kindesalters. Sie werden durch unterschiedliche genetische Defekte im Bereich der neuromuskulären Endplatte verursacht und manifestieren sich mit variabler Symptomatik, bei der eine belastungs- und tageszeitabhängige Muskelschwäche das herausragende Kennzeichen ist. Man unterscheidet synaptische, prä- und postsynaptische CMS-Formen. Während der letzten Jahre hat sich gezeigt, dass die postsynaptischen Störungen bei weitem überwiegen, vor allem solche, bei denen die Mutationen in den Untereinheiten des Azetylcholinrezeptor (AChR) liegen. Dabei haben sich vor allem Mutationen im Gen, das für die Epsilon (e) -Untereinheit des AChR kodiert, als besonders häufig erwiesen. Der Hauptschwerpunkt dieser Arbeit lag deshalb auf der genauen Untersuchung des Gens kodierend für die e-Untereinheit bei unseren CMS-Patienten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden 86 CMS-Patienten aus 71 nicht-verwandten Familien mit Hilfe eines Fragebogens rekrutiert und anschließend molekulargenetisch untersucht. Unter den 71 CMS-Familien waren 21 Familien, die aus Deutschland stammten, und 50 Familien nicht-deutscher Abstammung. Alle Patienten zeigten typische CMS-Symptome. Die zwölf Exons des Gens der e-Untereinheit des AChR einschließlich der Spleiß-Donor- und Spleiß-Akzeptor-Sequenzen sowie die Promotorregion wurden sequenziert. Bei 40 der 86 CMS-Patienten wurden unterschiedliche Frameshift-Mutationen entdeckt, die zu einer verminderten Expression des AChR führen. Die Frameshift-Mutation e1267delG wurde bei 33 Patienten aus 26 nicht-verwandten Familien entdeckt. Alle e1267delG-Patienten stammen aus der Volksgruppe der Roma oder kommen aus südosteuropäischen Ländern. Die Mutation e1267delG wurde bei 58% (26/45) der CMS-Familien, die nicht-deutscher Abstammung sind, gefunden im Vergleich zu 0% (0/26) der Familien mit deutscher Abstammung. Bei sechs CMS-Patienten zeigten sich Spleiß-Mutationen, deren Pathogenität aus Muskel-RNA bewiesen wurde. Bei zwei Patienten konnten Promotormutationen nachgewiesen werden, die ebenfalls zu einer beeinträchtigten AChR-Expression führen. Bei sechs Patienten fanden sich Missense-Mutationen, die nicht vorbeschrieben sind und deren pathophysiologische Konsequenzen noch geklärt werden müssen. Bei 36 CMS-Patienten aus unserer 86 CMS-Patienten umfassenden Population konnten keine Mutationen im Gen der e-Untereinheit des AChR gefunden werden. Mutationen anderer Gene könnten verantwortlich sein für CMS bei diesen Patienten. Die Mutations-suche in diesen Genen könnte, zumindest in geeigneten Familien mit mehreren betroffenen und nicht betroffenen Mitgliedern, mittels begrenzter Kopplungsanalyse durch Ausschluss oder nähere Eingrenzung einzelner Genloci vereinfacht werden. Wir finden bei Patienten mit Mutationen im e-Gen des AChR häufiger eine Ptose, eine Ophthalmoparese, ein als generalisiertes oder als bulbär und fazial beschriebenes Krankheitsbild, ein Dekrement, einen gutartigen Verlauf, sowie eine Krankheits-manifestion vor Vollendung des zweiten Lebensjahres. Krisenhafte Verschlechterungen findet man dagegen häufiger bei CMS-Patienten, die keine Mutationen im e-Gen haben. Mutationen im CHAT-Gen könnten dafür verantwortlich sein. Da CMS durch verschiedene strukturelle oder funktionelle Abnormalitäten an der Synapse bedingt sind, ist eine präzise elektrophysiologische und/oder genetische Klassifikation der CMS wichtig für Patienten. Genetische Beratung und pränatale Diagnostik können nur durchgeführt werden, wenn eine exakte Diagnostik auf molekularer Ebene verfügbar ist. Außerdem hat die exakte Klassifizierung kongenitaler myasthener Syndrome für die betroffenen Patienten große Bedeutung, da sich daraus unterschiedliche Konsequenzen hinsichtlich Prognose, Vererbbarkeit und Behandlungs-möglichkeiten ergeben. Die Analyse ursächlicher genetischer Defekte wird die Grundlage für eine sichere und verlässliche Einordnung von CMS bilden und möglicherweise die bisher erforderlichen invasiven Verfahren ablösen. Darüber hinaus sind durch die genaue Kenntnis des ursächlichen Defektes und der patho-physiologischen Zusammenhänge in Zukunft auch neue Therapiemöglichkeiten für CMS-Patienten zu erwarten.

Bei der kongenitalen stationären Nachtblindheit (CSNB) handelt es sich um eine klinisch und genetisch heterogene Erkrankung, die durch eine seit Geburt vorhandene nichtprogres-sive Nachtblindheit und verminderte Sehschärfe gekennzeichnet ist. Bei der x–gekoppelten Form (xlCSNB) sind zudem ein Nystagmus sowie Strabismus bei normalem Augenhinter-grund beschrieben. Aus elektrophysiologischer und psychophysischer Sicht lassen sich da-bei zwei Varianten unterscheiden. Eine Form, bei der keine Stäbchenfunktion mehr nachweisbar ist (CSNB1, komplette CSNB) sowie eine Form, bei der noch eine Reststäb-chenfunktion erhalten ist (CSNB2, inkomplette CSNB). Der Genort für die inkomplette Form war vor Beginn dieser Arbeit zwischen die Marker DXS722 und DXS255 auf Xp11.23 gekoppelt worden. Im Rahmen eines Projektes von Arbeitsgruppen aus München und Jena konnten in dieser Region zahlreiche neue Gene identifiziert werden, u. a. das CACNA1F-Gen. CACNA1F liegt auf den Cosmiden PO37 und MO111 und besteht aus 48 Exons mit einer codierenden Sequenz von 5901 Nukleotiden. Diese codieren für ein Protein von 1966 Aminsäuren Länge und einem Molekulargewicht von 219,5 kDa. Mit der Northern-Blot Hybridisierung ließ sich ausschließlich in retinalem Gewebe eine Bande nachweisen. Ver-gleichende Sequenzanalysen bestätigten die Annahme, dass CACNA1F für eine neue a 1-Untereinheit eines transvers-tubulären, spannungsabhängigen, Dihydropyridin-sensitiven Ca 2+ -Kanals vom L-Typ codiert. Aufgrund dieser Homologien und im Hinblick auf die Tatsache, dass als Pathogenese der CSNB2 eine fehlerhafte Neurotransmission vermutet wurde, wurde CACNA1F als Kandidatengen für CSNB2 in Betracht gezogen. Ziel dieser Arbeit war es, der Frage nachzugehen, ob es sich bei CACNA1F um das bei CSNB2 mutierte Krankheitsgen handelt und ob sich die vermutete genetische Heterogeni-tät von CSNB1 und CSNB2 eindeutig bestätigen lässt. Zudem sollte untersucht werden, ob es sich bei CSNB2 und der ÅIED-verwandten Form, einer Augenerkrankung, die ausge-prägte klinische und elektrophysiologische Gemeinsamkeiten mit CSNB2 aufweist, um al-lelische Erkrankungen handelt. Die Identifizierung des CACNA1F-Gens erlaubt es zudem, weitere retinale Störungen, die in dieselbe Region kartiert wurden, spezifisch auf Mutatio-nen in diesem Gen zu untersuchen, um eine Allelität auszuschließen bzw. zu bestätigen

Die Proteintranslokase in der mitochondrialen Außenmembran (TOM-Komplex) ist verantwortlich für die Erkennung von mitochondrialen Präproteinen und deren Translokation über die mitochondriale Außenmembran. Das Ziel dieser Arbeit bestand in der Klonierung und Charakterisierung von bislang nicht identifizierten Komponenten des TOM-Komplexes in Neurospora crassa sowie in der Charakterisierung der Bindung von Präproteinen an den isolierten TOM-Komplex. Dabei wurden folgende Ergebnisse erzielt: Es wurden zwei bislang unbekannte, ca. 6 bzw. 7 kDa grosse Komponenten des Neurospora crassa TOM-Komplexes, Tom6 und Tom7, identifiziert. Deren Gene wurden mittels Durchmusterung einer cDNA-Phagenbibliothek sowie einer sortierten genomischen DNA-Bibliothek identifiziert und sequenziert. Das TOM6-Gen umfasst drei Exons und zwei Introns, während das TOM7-Gen vier Exons und drei Introns enthält. Die Aminosäuresequenzen von Neurospora crassa Tom6 und Tom7 weisen eine hohe Ähnlichkeit zu denen von Tom6 und Tom7 aus anderen Organismen auf. Dabei erstreckt sich der homologe Bereich bei Tom7 über die gesamte Aminosäuresequenz, während er bei Tom6 auf den carboxyterminalen Bereich beschränkt ist. Für beide Proteine wurde jeweils eine potentielle Transmembrandomäne an ihrem Carboxyterminus vorausgesagt. Sowohl Tom6, als auch Tom7 sind integrale Bestandteile des TOM-Core-Komplexes und befinden sich in engem Kontakt zu anderen Komponenten des TOM-Komplexes. Es konnte mit Hilfe von chemischen Quervernetzungsexperimenten gezeigt werden, daß sich Tom6 und Tom7 im TOM-Komplex von Neurospora crassa in direkter räumlicher Nähe zu Tom 40 befinden. Außerdem konnte ein direkter Kontakt zwischen Tom6 und Tom22 nachgewiesen werden, welcher durch Bindung des Präproteins pSu9-DHFR moduliert wird. Ein weiterer Schwerpunkt bei der Charakterisierung von Neurospora crassa Tom6 und Tom7 bestand in der Untersuchung des Imports dieser Proteine in Mitochondrien sowie deren Assemblierung in bereits bestehende TOM-Komplexe. Sowohl Tom6, als auch Tom7 konnten in vitro in Mitochondrien importiert werden und in bereits bestehende TOM-Komplexe assemblieren. Dabei benutzen sie teilweise den generellen Importweg von Präproteinen in Mitochondrien. Der Import von Tom6 umfasst zwei nicht miteinander gekoppelte Schritte. Zunächst findet eine vom Carboxyterminus vermittelte Interaktion mit Komponenten des TOM-Komplexes statt, es folgt die Assemblierung in den TOM-Komplex. Die Assemblierung von Tom6 in den TOM-Komplex setzt eine spezifische Interaktion des aminoterminal an die Transmembrandomäne angrenzenden Bereichs mit anderen TOM-Komponenten voraus. Daneben ist eine Interaktion der Transmembrandomäne von Tom6 mit dem aminoterminal an die Transmembrandomäne angrenzenden Bereich von Tom6 essentiell für die korrekte Assemblierung von Tom6 in den TOM-Komplex. Im Gegensatz zu anderen Außenmembranproteinen kommt bei Neurospora crassa Tom6 positiv geladenen Aminosäuren im an die Transmembrandomäne angrenzenden Bereich keine Bedeutung für den Import zu. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Arbeit bestand in der Untersuchung einiger Aspekte der Bindung des mit Fluoreszenzfarbstoff markierten Präproteins pSu9-DHFR an den isolierten TOM-Komplex unter Anwendung der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie. Die Bindung dieses Präproteins an den TOM-Komplex ist reversibel und wird spezifisch von der Präsequenz vermittelt. Die apparenten Bindungskonstanten betragen 1,3 nM für den TOM-Holokomplex sowie 3,4 nM für den TOM-Core-Komplex. Ein wichtiges Merkmal der Bindung von pSu9-DHFR an den TOM-Komplex sind elektrostatische Wechselwirkungen, da eine Erhöhung der Ionenstärke im Reaktionspuffer eine drastische Verminderung der Bindung zur Folge hatte. Des weiteren geht die Bindung von pSu9-DHFR an den TOM-Komplex einher mit der Entfaltung der DHFR. Eine Verhinderung der Entfaltung der DHFR durch Komplexierung mit Methotrexat führte zu einer stark verminderten Bindung von pSu9-DHFR an den TOM-Komplex.

Plasma-Kallikrein (PK) ist eine Serinprotease, die als inaktives Zymogen Plasma- Prokallikrein (PPK) in der Leber gebildet und in den Blutstrom sezerniert wird. Dort erfolgt die Konvertierung zum aktiven Enzym im Kontaktphasen-System der Blutgerinnung. Neben der Funktion im Kontakt-System spielt diese Protease sowohl in der Fibrinolyse als auch im Kallikrein-Kinin-System eine zentrale Rolle. Neuere Arbeiten haben gezeigt, dass PPKmRNA auch außerhalb der Leber exprimiert wird. Daraus ist zu schließen, dass dort ebenfalls PPK-Protein gebildet wird und dass diesem extrahepatischen, gewebeständigen PPK bzw. PK spezielle lokale Funktionen zukommen. Dieser Befund bildet die Grundlage dieser Dissertation. Mit dem langfristigen Ziel die physiologische und pathophysiologische Rolle des extrahepatisch gebildeten PPK aufzuklären, sollte in dieser Arbeit zunächst mittels einer quantitativen PCR-Technik (TaqMan) untersucht werden, in welchem Umfang PPK-mRNA und die mRNAs der übrigen Komponenten des Kontaktphasen-Systems in humanen Zellen bzw. Geweben exprimiert werden. Aufgrund dieser Ergebnisse sollte im zweiten Teil der Arbeit untersucht werden, ob bzw. inwieweit das PPK-Gen gewebespezifisch reguliert werden kann. Hierzu sollten die regulatorisch bedeutsamen Regionen des PPK-Gens charakterisiert werden. Mittels der TaqMan-Technologie konnte die PPK-mRNA-Expression in allen untersuchten humanen Geweben quantifiziert werden. In neun Geweben liegt die mRNA-Expression im Vergleich zur Leber zwischen 1 % und 68 % und in sechs Geweben zwischen 0,1 % und 1 %. Diese Ergebnisse sprechen für eine ubiquitäre, aber teils sehr unterschiedliche Expression der PPK-mRNA in humanen Geweben. Die mRNAs von hochmolekularem Kininogen (HK), niedermolekularem Kininogen (LK), Faktor XI (FXI) und Faktor XII (FXII) werden dagegen nur in wenigen Geweben exprimiert. Die Transkripte von HK, LK und FXI findet man außerhalb der Leber nur noch in Nierengewebe in signifikanter Menge, während FXII-mRNA nahezu ausschließlich in der Leber synthetisiert wird. Ein gemeinsames Merkmal aller Transkripte ist, dass sie in Lebergewebe am stärksten expimiert werden. Zellstimulationsversuche mit HepG2-Zellen ergaben, dass die PPK-mRNA-Synthese mittels Lipopolysacchariden (LPS) kurzfristig induziert werden kann, was für eine wesentliche Funktion von PPK bzw. PK bei Entzündungsreaktionen spricht. Im Gegensatz hierzu bewirkt Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) eine Herabregulation der PPK-Transkription. Untersuchungen zur Stabilität der mRNAs von PPK und dem Haushaltsgen GAPDH mit den Transkriptionsinhibitoren Actinomycin D, α-Amanitin und DRB zeigten, dass die mRNAAbbaurate in HepG2-Zellen vom jeweils eingesetzten Transkriptionsinhibitor abhängt. Bei allen Transkriptionsinhibitoren wurde das PPK-Transkript im Vergleich zu GAPDH deutlich schneller (Faktor 3-5) abgebaut. Dies weist darauf hin, dass die PPK-mRNA-Spiegel in den Zellen durch ständige Neusynthese aufrechterhalten werden, um eine kontinuierliche Produktion von PPK zu gewährleisten. Mittels der RLM-RACE Methode wurden in Leber-, Pankreas-, Nieren- und Testisgewebe die PPK-Transkriptionsstartpunkte (TS) identifiziert. Während in der Leber und im Pankreas nur TSs in Exon 1 des PPK-Gens benutzt werden, findet man in Nieren- und Testisgewebe TSs sowohl in der upstream-Region als auch in Intron 1. Weiterhin wurden in Nierengewebe drei am 5´-Ende verkürzte PPK-Transkripte detektiert, die aufgrund dieser Deletion keine Signalpeptid- Sequenz enthalten und dadurch eine intrazelluläre Lokalisation der entsprechenden PPK-Isoform bedingen. Die Consensussequenz-Analyse für die Transkriptionsinitiation zeigt, dass jedem experimentell ermittelten Transkriptionsstart eine TATA-Box oder/und ein Initiator-Element assoziiert ist. Außerdem konnte durch die RLM-RACE-Analysen die Existenz eines weiteren untranslatierten Exons im 5´-Bereich des PPK-Gens ausgeschlossen werden. Unter Anwendung der Genome Walker Technik wurde die Promotorregion (P-1729) stromaufwärts von Exon 1 kloniert und mittels Reportergen-Studien analysiert. In HepG2-Zellen zeigt dieses Gensegment eindeutig transkriptionsaktivierende Kapazität. Durch die Generierung von neun Verkürzungsvarianten konnten der Core-Promotor (-158 bis +22), Enhancerbereiche (-1675 bis -1494) und Silencerregionen (-1304 bis -674) charakterisiert werden. Die Transkriptionsfaktoren-Analyse ergab, dass bei der Regulation durch die P-1729 Region neben ubiquitär exprimierten auch streng gewebespezifische Transkriptionsfaktoren eine zentrale Rolle spielen. Reportergen-Untersuchungen des Intron-1-Bereichs in HEK 293-Zellen zeigten, dass auch diese Region des PPK-Gens transkriptionsaktivierende Kapazität besitzt. Ebenso zeigt aber auch der P-1729 Bereich in HEK 293-Zellen Promotoraktivität. Somit können innerhalb eines Zelltyps beide Promotorbereiche funktionell aktiv sein, wodurch eine alternative Regulation der PPK-Transkription ermöglicht wird.

Unter Annahme einer möglichen Funktionsstörung des Androgenrezeptors bei der amyotrophen Lateralsklerose (ALS) wurde die repetitive CAG-Trinukleotidsequenz seines ersten Exons bei 12 Patienten untersucht, da eine abnorme Verlängerung dieses Genabschnitts zur ALS-ähnlichen bulbospinalen Neuronopathie führt. Nach den Ergebnissen kommt dieser Typ vom Androgenrezeptordefekt in der Pathogenese der ALS nicht in Frage: alle Patienten zeigten eine Normalbefund.

In murine cytomegalovirus, abundant immediate-early transcription originates from 0.769 to 0.815 map units of the genome. This region contains the immediate-early gene (gene ieI) which encodes pp89, a phosphoprotein active in transcriptional regulation. In this paper we report on the precise location, structural organization, and sequence of gene ieI. The predominant ieI transcript, a 2.75-kilobase mRNA, is generated by splicing and composed of four exons. The precise termini of the 2.75-kilobase mRNA and the positions of the exons were determined by nuclease digestion experiments with either 5' or 3' end-labeled DNA fragments or in vitro transcribed cRNA probes. Exons of 300, 111, 191, and 1,703 nucleotides are separated by introns of 825, 95, and 122 nucleotides. The first AUG is located in the second exon of 111 nucleotides, and a single open reading frame of 1,785 nucleotides predicts a protein of 595 amino acids with a calculated molecular weight of 66,713. The N-terminal region of the protein contains sequences similar to a consensus sequence of histone 2B proteins. The regulatory function of pp89 and the role of this protein as an immunodominant antigen are discussed in relation to the amino acid sequence.

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