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Desmosomen sind spezialisierte Haftstrukturen, die die Stabilisierung des Zellverbundes gegenüber Zug- und Scherkräften gewährleisten. Dazu binden desmosomale Cadherine extrazellulär an Haftmoleküle benachbarter Zellen und sind intrazellulär unter anderem über Desmoplakin (DP) und Plakoglobin (PG) an Keratinfilamenten verankert. Insbesondere für das desmosomale Cadherin Desmoglein 3 (Dsg3), das sowohl innerhalb als auch außerhalb der Desmosomen vorkommt, wurde eine wichtige Bedeutung als Adhäsionsprotein in Keratinozyten nachgewiesen. Trotz ihrer Funktion, Widerstand gegen hohe mechanische Belastungen zu vermitteln, sind Desmosomen dynamische Strukturen, die einem stetigen Umbau unterliegen. Die Notwendigkeit einer genauen Regulierung des desmosomalen Auf- und Abbaus wird durch das Vorkommen zahlreicher vererbbarer und autoimmuner Erkrankungen unterstrichen. In der vorliegenden Arbeit wurden Mechanismen, die der geordneten Assemblierung der Desmosomen und der Disassemblierung nach Störung der desmosomalen Zell-Zell-Haftung unterliegen, untersucht. Im ersten Teil der vorliegenden Studien standen die Vorgänge der Desmosomenbildung in humanen Keratinozyten im Fokus. Adhärenskontakte und deren Zusammenwirken mit Actinfilamenten spielen eine wichtige Rolle in der Ausbildung der Desmosomen. Für die Actin-Bindeproteine Adducin und Cortactin wurde durch siRNA-Interferenzstudien eine essentielle Funktion für die Vermittlung der desmosomalen Zell-Zell-Haftung nachgewiesen. Die siRNA-induzierte Depletion von Adducin verursachte eine Reduktion der zytoskelettal-gebundenen Dsg3-Moleküle, was mit einer reduzierten Membranmobiltät korrelierte. Für Cortactin wurde eine direkte Interaktion mit Dsg3 mittels zweier unabhängiger molekularbiologischer Methoden nachgewiesen. Dies deutet auf eine direkte Rolle des Cortactins in der Regulierung der Desmosomen hin. Die siRNA-induzierte Depletion von E-Cadherin führte zum Verlust der membranständigen Lokalisation von Dsg3 und zu einer verminderten Verankerung der Dsg3-Moleküle innerhalb der zytoskelettalen Proteinfraktion. Es wurde ein Signalkomplex aus extradesmosomalen Dsg3, E-Cadherin und der Tyrosinkinase Src identifiziert, dessen Stabilität durch Src reguliert wurde. Hierbei wurden Dsg3 und E-Cadherin an Tyrosinresten durch Src phosphoryliert, deren Aktivität sowohl für die Inkorporation von Dsg3 in die Desmosomen als auch für die Reifung der Desmosomen zu stabilen Haftkontakten essentiell war. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden die Prozesse der desmosomalen Disassemblierung nach Inkubation mit Pemphigus vulgaris-Autoantikörpern (PV-IgG) analysiert.PV ist eine etablierte Modellerkrankung zur Untersuchung der Desmosomen-vermittelten Zelladhäsion in Keratinozyten. Die Bindung der gegen Dsg1 und Dsg3 gerichteten PV-IgGs induziert eine Reduktion der Dsg3-Proteinmengen und eine Aktivierung verschiedener Signalwege, u.a. von RhoA und PKC. Da diese Signalwege ebenfalls Adducin regulieren und PV-IgGs eine Umorganisierung des Actin-Zytoskeletts verursachen, die durch exogene Aktivierung von RhoA verhindert wird, wurde das Zusammenspiel von PV-IgGs, RhoA und Adducin untersucht. Die protektive Wirkung der RhoA-Aktivierung auf die Zell-Zell-Haftung und die Verteilung von Dsg3 nach Applikation der PV-IgGs war sowohl von der Expression als auch von der Phosphorylierung von Adducin an Serin726 abhängig. Interessanterweise verursachten PV-IgGs über den Ca2+-Einstrom und über PKC, unabhangig von RhoA, eine schnelle Phosphorylierung von Adducin an Serin726. Die durch den Ca2+-Einstrom- und PKC-vermittelte Phosphorylierung von Adducin könnte somit einen Rettungsmechanismus der Keratinozyten darstellen, der in Reaktion auf die PV-IgG-Bindung einsetzt und die desmosomale Assemblierung induziert. Ferner wurde die reduzierte Verankerung der Keratinfilamente an Desmosomen, ein weiteres Merkmal der PV-Pathogenese, mit der Aktivität von PKC korreliert. Keratinfilamente, die einer dynamischen Regulierung durch p38MAPK unterliegen, lösen sich in Reaktion auf PV-IgGs von den Desmosomen und akkumulieren perinukleär. Dieses Phänomen der Zytokeratin-Retraktion wurde durch Inkubation mit Tandempeptid (TP), das die Transinteraktion von Desmogleinen stärkt, verhindert. Zusammenfassend liefern die in dieser Arbeit gewonnenen Daten neue Erkenntnisse über die Mechanismen des desmosomalen Umsatzes. Adducin und E-Cadherin nehmen eine essentielle Rolle in der Ausbildung und Aufrechterhaltung der desmosomalen Haftstrukturen ein. Untersuchungen der pathogenen Effekte der PV-IgGs unterstreichen die hohe Relevanz eines intakten Actin- und Keratin-Stützgerüsts für die interzelluläre Haftung von Keratinozyten. Diese Befunde könnten in Zukunft auch von medizinischer Relevanz für die Therapie von Pemphigus-Patienten sein.

Adulte Weichgewebesarkome (engl. soft tissue sarcoma; STS) werden zu einer Gruppe seltener maligner und teilweise aggressiver Tumoren klassifiziert, die eine Tendenz zur Bildung von hämatogenen Fernmetastasen aufweisen. Die Kombination der Regionalen Hyperthermie mit einer Chemotherapie erwies sich in vorangegangenen Studien als eine vielversprechende Behandlungsoption beim lokalisierten Hochrisiko STS. Es wurde gezeigt, dass eine neoadjuvante Chemotherapie mit Regionaler Hyperthermie bei diesen Sarkomen das Tumoransprechen, das lokale progressionsfreie und das krankheitsfreie Überleben im Vergleich zu einer alleinigen Chemotherapie signifikant verbessert. Auf zellulärer Ebene induziert ein Hitzeschock (HS) bei klinisch relevanten Temperaturen (41,8°C/43°C) unter anderem eine temporäre Defizienz der Homologen Rekombinationsreparatur (HR), einem essentiellen Mechanismus für die fehlerfreie Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSB). Dies steht im Zusammenhang mit einer hitzeinduzierten proteosomalen Degradierung von BRCA2, einer unerlässlichen Komponente der HR. Trabectedin (Tr) ist eine antiproliferativ wirksame Substanz, die ursprünglich aus dem marinen Tunikat Ecteinascidia turbinata isoliert wurde. Die vielfältigen zytotoxischen Aktivitäten von Tr umfassen neben dem Interferieren mit der aktivierten Transkription und der Modulation der Tumor-Mikroumgebung hauptsächlich die Induktion von DSBs. Seit 2007 wird Tr in der Zweitlinientherapie zur Behandlung refraktärer STS, sowie bei Patienten eingesetzt, bei denen die Erstlinientherapie (Ifosfamid und/oder Doxorubicin) nicht angewendet werden kann. In Anbetracht der hitzeinduzierten Inaktivierung von BRCA2 und den DNA schädigenden Eigenschaften von Tr wurde in dieser Arbeit untersucht, ob und wie die Hyperthermie zu einer Wirkungsverstärkung der zytotoxischen Effekte von Tr beitragen kann. Tr bewirkt in vitro bei Zelllinien unterschiedlicher Sarkomentitäten (U2Os, SW872, SW982) eine dosisabhängige Reduktion des klonogenen Überlebens, das durch einen HS zusätzlich verstärkt wird. Die erhöhte antiproliferative Aktivität von Tr nach einem HS wird als thermale Chemosenitivierung definiert. Zudem konnte durch die Analyse der DNA-Verteilung bei U2Os und SW872 Zellen eine Intensivierung und Verlängerung der Tr-induzierten G2/M-Blockade nachgewiesen werden. Darüber hinaus wurden Zelllinien-spezifische Unterschiede bezüglich einer behandlungsinduzierten Apoptoseinduktion oder Senseszenzantwort identifiziert. SW872 Zellen weisen einen dosis- und temperaturabhängigen Anstieg des Anteiles apoptotischer Zellen auf, der mit einer starken Aktivierung der Effektorcaspasen 3 und 7 einhergeht. Dem entgegen gehen U2Os Zellen in eine ausgeprägte behandlungsinduzierte zelluläre Seneszenz über. Anhand der quantitativen Analyse Tr-induzierter H2AX Foci hat sich ein relevanter Anstieg an DSBs durch eine zusätzliche Hitzeexposition herausgestellt, der eine Beeinträchtigung der BRCA2-vermittelten vollständigen Assemblierung der DNA-Reparaturfoci vermuten lässt. Die Hypothese einer thermalen Chemosensitivierung gegenüber Tr durch eine hitzeinduzierte HR-Defizienz – insbesondere im Rahmen der hitzeinduzierten BRCA2 Degradierung – wurde zudem durch das Ausbleiben der hitzebedingten Verstärkung der Tr-induzierten Zytotoxizität bei BRCA2-defizienten Zellen bekräftigt. Darüber hinaus wurde durch Hochdurchsatzanalysen bestätigt, dass eine hitzevermittelte, erhöhte antiproliferative Aktivität von Tr nach einem Knockdown zahlreicher HR-spezifischer Komponenten ausbleibt. Durch Hochdurchsatzanalysen sowie durch anschließende Validierungsexperimente wurden Proteine identifiziert, die sich als relevant für weitere präklinische und klinische Untersuchungen herausgestellt haben. Die Proteine BRCA1, PARP1 und CHEK1 stellen dabei potentielle molekulare Marker für ein Tumoransprechen auf die Kombinationstherapie von Tr und Hyperthermie dar. Deren Inhibition erwies sich zudem als eine weitere Strategie, um die Effektivität der ursprünglichen Behandlung zusätzlich zu erhöhen. Darüber hinaus wurde die Funktion von FANCD2 als prädiktiver Marker und von ERCC1 als Resistenzmarker für das Therapieansprechen einer alleinigen Tr-Behandlung in vitro bestätigt. Die herausgearbeitete thermale Chemosensitivierung gegenüber Tr mit Hyperthermie durch die induzierte HR-Defizienz mittels passagerer BRCA2 Degradierung (induzierte synthetische Letalität) sowie die Identifizierung weiterer Proteine, deren medikamentöse Inhibition die Effektivität der Kombinationsbehandlung zusätzlich erhöhen könnte, eröffnen neue Möglichkeiten in der Therapie solider Tumoren.

Ein lebender Organismus ist unter anderem durch seine Fähigkeit zum präzisen Auf- und Zusammenbau höherer molekularer Strukturen charakterisiert, wobei die Faltung und Assemblierung von Proteinen eine bedeutende Rolle spielt. Die Proteinfaltung wird durch molekulare Chaperone unterstützt und optimiert, bis ein Protein seine native, biologisch funktionelle Struktur eingenommen hat. Durch exogene Einflüsse oder endogene Veränderungen eines Proteins, z.B. bei neurodegenerativen Erkrankungen wie M. Alzheimer, M. Parkinson oder Chorea Huntington, oder des gesamten Proteinnetzwerkes, kann Proteinfehlfaltung, Aggregation und die Ausbildung amyloider Strukturen, verbunden mit Zytotoxizität, auftreten. Die zur Fehlfaltung und Bildung ähnlicher amyloider Aggregate führenden strukturellen Determinanten der Zytotoxizität, verursacht durch Proteine unterschiedlicher Primärstruktur und Länge, sind nur unzureichend erforscht. Eine Hypothese besagt, dass lösliche intermediäre Oligomere der aggregierenden Proteine die toxische Spezies in einem wahrscheinlich multifunktionellen pathogenen Geschehen darstellen. Es gibt Hinweise, dass eine zusammenbrechende Proteostase verbunden mit einer zu geringeren Kapazität molekularer Chaperone zu den deletären Effekten führt. Auch ist nicht abschließend geklärt, ob und zu welchem Anteil die Toxizität durch Aggregation des Proteins und damit verbundener erhöhter Pathogenität bedingt ist, oder inwieweit durch einen Funktionsverlust des fehlgefalteten Proteins selbst. Um zytotoxische Effekte in humanen Zellen zu analysieren, wurden de novo generierte beta-Faltblattproteine untersucht, welche durch Aggregation in der Zelle keine Autofunktionsstörung auslösen sollten. Es wurde gezeigt, dass diese artifiziellen Proteine in HEK293T-Zellen amyloide Aggregate bildeten und zytotoxisch wirkten, im Vergleich zu de novo generierten alpha-helikalen Proteinen, welche löslich und homogen in der Zelle verteilt vorlagen und nahezu keine Zytotoxizität aufwiesen. Drei aus einer kombinatorischen Bibliothek ausgewählte de novo amyloide Proteine, beta4, beta17 und beta23, waren zytotoxisch mit der Gradierung beta4 < beta17 < beta23, sie induzierten Apoptose und veränderten die Zellmorphologie. Die Zytotoxizität korrelierte mit vorhandenen präfibrillären, intermediären Oligomeren. Die Proteine beeinträchtigten die Rückfaltung von GFP-Luciferase in gleicher Abstufung, ebenso eine Induktion der Stressantwort und die Proteinbiogenese. Die Aggregate colokalisierten mit GFP-Luciferase, jedoch nicht mit GFP. Eine massenspektrometrische Untersuchung der Interaktionspartner der drei de novo amyloiden Proteine in Kombination mit SILAC und Co-IP wies Interaktionen mit metastabilen Proteinen essentieller zellulärer Funktionen nach, dabei wurde Hsp110 als stark angereichertes Chaperon unter den Interaktoren identifiziert. Eine Überexpression von Hsp110 verminderte die Zytotoxizität der de novo Proteine beta4 und beta17, jedoch nicht beta23. Hsp110 war ebenfalls in der Lage, Aggregate teilweise zu solubilisieren und eine normalisierte Zellmorphologie wieder herzustellen. Um einen beta-Strang verkürzte oder verlängerte Mutanten der semitoxischen beta-Faltblattproteine beta4 und beta17 wiesen eine erhöhte Zytotoxizität auf, so dass wahrscheinlich generell beta-Faltblattproteine mit einer ungeraden Anzahl an beta-Strängen toxischer sind als ihre Derivate mit gerader Anzahl an beta-Strängen, da ungepaarte reaktive beta-Stränge vorliegen dürften. Zusammenfassend stellen die de novo beta-Faltblattproteine ein attraktives Modell dar, um aggregierende, amyloide Proteine ohne biologische Funktion in vivo zu untersuchen. Inkubation humaner Zellen mit dem Prolin-Analogon Azetidin-2-carbonsäure führte in Anwesenheit eines proteasomalen Inhibitors zur Verstärkung der Zytotoxizität, es entstanden amyloide Aggregate und präfibrilläre Intermediate, so dass die Hypothese der Verstärkung von Funktion und Pathogenität durch Aggregation in diesem System weiter untermauert wurde. Expression von Huntingtin mit expandierter PolyQ-Sequenz und einem angefügten hydrophoben CL1-Degron führte zu einer Erhöhung der Löslichkeit, zu verstärkter Inhibition des Ubiquitin-Proteasom-Systems und zu erhöhter Zytotoxitzität im Vergleich zu expandiertem Huntingtin ohne CL1-Degron. Die Zytotoxizität des mit Degron versehenen Huntingtins konnte mittels Überexpression von expandiertem Huntingtin ohne Degron durch Coaggregation verringert werden. Die Ergebnisse sprechen für die Hypothesen, dass präfibrilläre Intermediate die maßgeblichen zytotoxischen Spezies darstellen, während große Aggregate eine protektive Funktion einnehmen können. Eine Überexpression fehlfaltender Proteine kann in multifaktorieller Weise zur Interaktion mit essentiellen zellulären Proteinen führen und die Funktion metastabiler Proteine beeinträchtigen, was u.a. im Falle der de novo amyloiden Proteine zur Inhibition der Proteinbiogenese und der HSR führt. Akkumulation endogener fehlgefalteter Proteine durch proteasomale Inhibition legt den Mechanismus einer Verstärkung der Zytotoxizität durch amyloide, aggregierende Proteine per se nahe.

Die γ-Sekretase ist eine in essentieller Weise an der Produktion des Amyloid-β-Peptids beteiligte Aspartylprotease, welches durch proteolytische Spaltung des Amyloid-Vorläufer-Proteins (Amyloid Precursor Protein, APP) entsteht. Amyloid-β stellt die Hauptkomponente der amyloiden Plaques im Gehirn von Alzheimer-Patienten dar und spielt bei der Entstehung der Alzheimer-Demenz eine entscheidende Rolle. Die γ-Sekretase ist ein Proteinkomplex, für dessen Funktionalität die vier Komponenten Presenilin (PS), Nicastrin (Nct), Aph1 und Pen2 hinreichend und notwendig sind. Im endoplasmatischen Retikulum (ER) werden die einzelnen Untereinheiten vollständig assembliert, nach dem Austritt aus dem ER kommt es zur katalytischen Aktivierung des γ-Sekretase-Komplexes. Die Substratprozessierung durch den nun aktiven Komplex findet in endolysosomalen Kompartimenten und an der Plasmamembran statt. Nicht vollständig assemblierte Teilkomplexe und einzelne Komponenten werden im ER zurückgehalten und erreichen nicht die nachgeschalteten Kompartimente. Diese Beobachtungen legen nahe, dass eine mögliche Regulation der Aktivität des Enzyms eng mit der Regulation von Assemblierung und Transport des Komplexes verknüpft ist. Um mechanistisch zu erklären, weshalb ausschließlich der vollständig assemblierte Komplex in der Lage ist, das ER zu verlassen, wurde von der Arbeitsgruppe ein Modell vorgeschlagen, demzufolge die einzelnen nicht assemblierten Untereinheiten mittels Retentionssignalen im ER zurückgehalten werden, bis diese im Rahmen der Assemblierung durch die Bindung an andere Untereinheiten maskiert werden. In der vorliegenden Arbeit wird unter Verwendung von Reporterkonstrukten bzw. chimären Fusionsproteinen mittels konfokaler Mikroskopie und Proteinbiochemie gezeigt, dass nicht assembliertes Pen2 im ER zurückgehalten wird und dass diese Retention durch ein neuartiges Retentionssignal in der ersten Transmembrandomäne (TM1) vermittelt wird. Insbesondere ist ein konservierter Asparaginrest innerhalb dieser Sequenz für die Retention erforderlich. Auch wird mittels knock down- und rescue-Experimenten gezeigt, dass die Pen2-TM1 essentiell für die korrekte Assemblierung und enzymatische Aktivität der γ-Sekretase ist. Diese Arbeit bestätigt damit das vorgeschlagene Modell für die Transportregulation des γ-Sekretase-Komplexes bezüglich seiner Untereinheit Pen2 und gibt starke Anhaltspunkte dafür, dass dieser Mechanismus für eine korrekte Funktionalität des Komplexes erforderlich ist.

Etioplasten sind hochspezialisierte pflanzliche Organelle der Plastidenfamilie, die während der Skotomorphogenese von Pflanzen gebildet werden. Die Morphologie der Etioplasten unterscheidet sich grundlegend von Chloroplasten, die während der Photomorphogenese gebildet werden. Durch Belichtung von Pflanzen, die im Dunkeln angezogen worden sind, kommt es zur Induktion der Transformation von Etioplasten zu Chloroplasten. Die unmittelbar vor Induktion des biologischen Systems bestehende Zusammensetzung der Proteine und Proteinkomplexe des Etioplasten ist allerdings bislang kaum untersucht worden. Im Rahmen dieser Arbeit erfolgten mehrere spezifische Analysen von plastidären Subproteomen. Ausgewählte Subproteome der inneren Membranen von Etioplasten der Gerste wurden im Vergleich zum Proteom der Thylakoidmembran von Chloroplasten analysiert. Durch die Kombination verschiedener gelelektrophoretischer Trennmethoden für Einzelproteine und Proteinkomplexe mit massenspektrometrischen Analysemethoden gelangen sensitivste Nachweise niedrig konzentrierter Untereinheiten von Membranproteinkomplexen. Darüber hinaus gelangen der Nachweis niedermolekularer membranintegraler Proteine und die spezifische Charakterisierung von Einzelproteinen. Im ersten Teil der Arbeit wurden die N-Termini von NADPH:Protochlorophyllid-Oxidoreduktase (POR) A und B durch ein LC-MS basiertes Verfahren bestimmt. Es erfolgte die Entwicklung einer Methode zur selektiven Isolation N-terminaler Peptide mittels Höchstdruckflüssigkeitschromatographie (UPLC). Dazu wurden zwei chemische Reaktionsschritte auf Protein- und Peptidebene durchgeführt, wodurch das N-terminale Peptid nach einem tryptischen Verdau ausschließlich acetyliert vorlag und interne Peptide durch eine weitere Modifikation mit 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure abgetrennt wurden. Dadurch konnte gezeigt werden, dass die N-Termini von PORA und PORB homolog zueinander sind und eine vergleichbare Erkennungssequenz für die prozessierende(n) Protease(n) vorliegt. Das Transitpeptid von PORA ist somit deutlich kürzer, als bislang vermutet, wodurch neue Rückschlüsse bezüglich einer möglichen Bindestelle von Protochlorophyllid gezogen werden konnten, da eine von Reinbothe et al. 2008 beschriebene Bindestelle nicht im Bereich des Transitpeptids, sondern in Bereich der maturen PORA liegt. Bei PORB konnten neben einem dominierenden N-terminalen Peptid zwei weitere um jeweils ein Alanin verkürzte N-terminale Peptide mit geringerer Signalintensität nachgewiesen werden. Dies deutet auf eine unpräzise N-terminale Prozessierung hin. Im zweiten Teil der Arbeit gelang die bislang umfassendste massenspektrometrische Charakterisierung des NAD(P)H-Dehydrogenase-Komplexes aus einer C3-Pflanze. In Etioplasten konnten sechs plastidär kodierte und mindestens fünf kernkodierte Untereinheiten des NDH-Komplexes identifiziert werden. Dies gelang durch die Isolation des Komplexes mittels nativer PAGE als 1. Dimension und die anschließende Aufkonzentrierung der Untereinheiten in einer SDS-PAGE als konzentrierende 2. Dimension. Dadurch konnte gezeigt werden, dass der NDH-Komplex bereits in Etioplasten neben dem membranintegralen Subkomplex aus mindestens zwei löslichen Subkomplexen aufgebaut ist. Aufgrund dieser umfangreichen Assemblierung ist eine physiologische Funktion wahrscheinlich und erste Versuche zur NAD(P)H-Dehydrogenase Aktivität lieferten Hinweise auf eine mögliche enzymatische Aktivität. Im dritten Teil der Arbeit gelang in Etioplasten erstmals der Nachweis aller bekannten membranintegralen, niedermolekularen Untereinheiten von Photosystem II, nicht aber von Photosystem I. Die Untereinheiten von PSI konnten ausschließlich in Chloroplasten nachgewiesen werden. Von PSII konnten 13 niedermolekulare Untereinheiten mit jeweils einer Transmembrandomäne nachgewiesen werden. Diese Untereinheiten konnten im Gegensatz zu Chloroplasten nicht in höhermolekularen Komplexen, sondern ausschließlich nahe der Lauffront einer BN-PAGE im Bereich der freien Proteine nachgewiesen werden. Der Nachweis von PsbN war ausschließlich in Etioplasten möglich. Aus diesen Ergebnissen wurde geschlossen, dass ausschließlich nicht-chlorophyllbindende Untereinheiten von PSII in Etioplasten akkumuliert werden und die Anreicherung von chlorophyllbindenden Untereinheiten von PSI und PSII von der Anwesenheit von Chlorophyll abhängt. Darüber hinaus konnten die vier niedermolekularen, membranintegralen Untereinheiten des Cytochrom b6f-Komplexes in Etioplasten und in Chloroplasten sowohl in der monomeren, als auch dimeren Assemblierungsstufe nachgewiesen werden. Ermöglicht wurden diese Nachweise durch eine neu entwickelte Methode zur Extraktion von Proteinen aus einem Polyacrylamid-Gel mit organischen Lösungsmitteln und der anschließenden massenspektrometrischen Charakterisierung mittels offline ESI-MS.

Tue, 5 Aug 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9680/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9680/1/Kufer_Stefan.pdf Kufer, Stefan ddc:530, ddc:500, Fakultät fü

Die Synthese von Chlorophyll ist in Angiospermen ein streng lichtabhängiger Prozess. Keimlinge, welche im Dunkeln angezogen werden, bilden anstelle der (grünen) Chloroplasten (gelb-orange) Etioplasten. In diesen ist die Thylakoidmembran durch den parakristallinen Prolamellarkörper und einige Prothylakoidmembranen ersetzt. Auf Ebene der Proteine kann zwar bereits im Dunkeln die Translation aller plastidencodierten Chlorophyll-bindenden Proteine nachgewiesen werden, allerdings werden diese mit Ausnahme des D2-Proteins in Abwesenheit von Chlorophyll sofort wieder degradiert. Mit der Belichtung von etioliertem Gewebe setzen der Abbau des Prolamellarkörpers und die Bildung der Thylakoidmembranen ein. Diese Umstrukturierung des inneren Membransystems geht mit der Akkumulation und der Assemblierung der chlorophyll-bindenden Photosystemkomplexe einher. Der genaue Ablauf der de novo Assemblierung der Chlorophyll-bindenden Proteinkomplexe ist bisher nicht vollständig geklärt. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit die Biogenese von Pigment-bindenden Proteinkomplexen der Plastidenmembran während der Ergrünung untersucht. Dabei dienten im Dunkeln angezogene Keimlinge bzw. die daraus isolierten Etioplasten und deren Membranproteinkomplexe als Startpunkt. Zur Identifikation und Charakterisierung der Pigment-bindenden Komplexe wurden verschiedene Methoden (differentielle Gelelektrophorese für Membranproteine, farblose native Polyacrylamidelektrophorese in Kombination mit Absorptionsspektroskopie) weiterentwickelt. Durch die Kombination aller Techniken konnten verschiedene Aussagen zur Situation im Etioplasten und zum Ablauf der de novo Assemblierung während der Ergrünung getroffen werden. Der ATP-Synthase- und der Cytochrom b6f-Komplex liegen bereits im Etioplasten in der aus dem Chloroplasten bekannten hochmolekularen Assemblierungsstufe vor, wobei im dimeren Cytochrom b6f-Komplex im Etioplasten Protochlorophyll a anstelle von Chlorophyll a nachgewiesen werden kann. Somit ist der Cytochrom b6f-Komplex der einzige Chlorophyll-bindende Komplex, der bereits in der Abwesenheit von Chlorophyll unter Ersatz des Chlorophylls durch ein Chlorophyllderivat akkumulieren kann. Unmittelbar nach der Initiation der Chlorophyllbiosynthese ist der Großteil des de novo synthetisierten Chlorophylls in der Membran nicht mit Photosystemkomplexen assoziiert, sondern transient mit dem membranintegralen Lil (Light harvesting like) 3-Protein. Die Identifikation des Lil 3-Proteins als Chlorophyll-bindendes Protein weist erstmals auf eine mögliche Funktion dieses Proteins als temporärer Chlorophyllspeicher hin. Nach einer Stunde Belichtung können sowohl Photosystem I wie auch Photosystem II-Komplexe nachgewiesen werden, wohingegen erste LHC- Komplexe nach zweistündiger Belichtung zu detektieren sind. Während des Assemblierungsvorganges können für beide Photosysteme mehrere Assemblierungsintermediate nachgewiesen werden. Nach vierstündiger Belichtung hat die Assemblierung aller Thylakoidmembrankomplexe die komplexeste Assemblierungsstufe erreicht, welche aus dem Chloroplasten bekannt ist. Daher kann nach einer Belichtungszeit von vier Stunden die Biogenese der vier an der Lichtreaktion beteiligten Thylakoidmembrankomplexe von proteinbiochemischer Seite als abgeschlossen betrachtet werden.

Etwa 30% aller Gene codieren für Membranproteine (MP). Trotz ihrer hohen Relevanz, speziell im medizinischen Bereich, stellt die Analyse von MP aufgrund ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften ein häufiges Problem in der Proteinbiochemie dar. Diese Arbeit soll eine Einsicht in die Problematik geben sowie Lösungsansätze aufzeigen, um den Umgang mit diesen Polypeptiden zu vereinfachen. Ein geeignetes Modellsystem zum Studium der Eigenschaften membranintegraler Proteine und Peptide sowie zur Verbesserung der bestehenden Analysemethoden stellte die Thylakoidmembran der Plastide dar. Um das funktionelle Proteom der Thylakoidmembran zu definieren, wurden die Proteinkomplexe der Thylakoidmembran von Gerste (Hordeum vulgare) über hochauflösende 2D-Blue Native /SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) getrennt. Das Gelsystem erlaubte die Isolation der photosynthetisch aktiven Proteinkomplexe PSI/LHCI, PSII, LHCII, Cytochrom b6/f und ATPase in unterschiedlichen Assemblierungszuständen. Im Fokus der Untersuchungen stand die Charakterisierung der isolierten Subkomplexe von PSII. Die Identifikation der Komplexuntereinheiten erfolgte nach enzymatischem In-Gel Verdau und massenspektrometrischer Analyse der entstandenen Peptide (offline nanoESI-MSMS). MP > 10 kDa wurden ausschließlich über Peptide aus den löslichen Abschnitten identifiziert. Die Analyse der niedermolekularen Untereinheiten (< 10 kDa) wurde auf Ebene des Gesamtproteins nach Extraktion aus den Komplexbanden der BN-PAGE realisiert. Dabei konnten dem mono- und dimeren PSII-Subkomplex folgende niedermolekularen UEn zugeordnet werden: PsbE, PsbF, PsbI, PsbK, PsbL, PsbM, PsbTc und PsbX. Da kein Unterschied in der Zusammensetzung des mono- und dimeren PSII-Subkomplexes existierte, konnte eine Beteiligung einer der niedermolekularen UEn an der Ausbildung des dimeren PSII-Subkomplexes im Rahmen der Assemblierung nicht bestätigt werden. Die Lichtsammelproteine (LHCP) des LHCII wurden nach 2D BN/SDS-PAGE auf Ebene der Superkomplexe oder abgetrennt als Mono- und Trimerer LHCII-Subkomplex identifiziert, wobei das Trimer durch das Fehlen der minoren LHCP (CP29, CP26 und CP24) charakterisiert war. Die für Membranproteine der Thylakoide ungewöhnlich hydrophilen LHCP erhielten die benötigte Hydrophobizität zur Durchspannung der Membran über die Bindung von Pigmenten (Chlorophyll). Eine eindeutige Unterscheidung der Genprodukte von Lhcb1-3 war trotz extremer Sequenzhomologie über die Detektion eines charakteristischen Peptids im N-terminalen Bereich der maturen Sequenz möglich. In Gerste wurde somit jeweils eine Form von Lhcb2 und 3, sowie sechs Isoformen von Lhcb1 identifiziert. Um den In-Gel Verdau von Proteinen nach elektrophoretischer Trennung zu vereinfachen und zu standardisieren, wurde ein Reaktionsgefäß (OMX-S®) aus Polypropylen entwickelt. Im Zuge der Anpassung des konventionellen Protokolls zum In-Gel Verdau von Proteinen für OMX-S® wurde ein optimiertes Verdauprotokoll entwickelt, das ohne die Reaktionsschritte Entfärbung, Reduktion & Alkylierung der AS Cystein sowie eine multiple Extraktion zur Anreicherung der entstandenen Peptide auskommt. Die Erhöhung der Reaktionstemperatur auf 50°C und die Verkürzung der Diffusionsstrecke für die Protease erhöhten zudem die Effizienz des Verdaus und führten zu einer Reduktion der gesamten Prozesszeit von 6-24 h auf 1 h. Welche Auswirkung die Auslassung einzelner Reaktionsschritte auf die Peptidausbeute hatte, wurde nach differentieller Isotopenmarkierung der generierten Peptide mittels massenspektrometrischer Analyse quantifiziert. Da jeder Prozessierungsschritt eine potentielle Quelle für Verluste darstellte, waren die Peptidausbeuten im Vergleich zum konventionellen In-Gel Verdau äquivalent oder sogar besser. Unabhängig vom verwendeten Verfahren, fehlten die membranintegralen Peptide in den Spektren. Folglich wurde die Detektierbarkeit und Signalintensität von tryptischen Peptiden in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren untersucht. Dabei ergab sich eine direkte Korrelation zwischen der Proteinmenge einer Bande und der Anzahl, der nach Verdau detektierten Peptide. Die Untersuchungen an Peptiden aus löslichen und membranintegralen Proteinen ergaben, dass die Hauptursache für das Fehlen letzterer, nicht auf den Einfluss bestimmter AS auf die Ionisierbarkeit, die Sequenzlänge und/oder die Hydrophobizität zurückzuführen war. Entscheidend für die Abwesenheit der membranintegralen Peptide war vielmehr die schlechte Zugänglichkeit der Schnittstellen für die Protease, aufgrund unzureichender Denaturierung der Sekundärstruktur bzw. der Aggregation hydrophober Abschnitte im Rahmen der Probenaufarbeitung.

Für die Assemblierung des bakteriellen Flagellums müssen die externen Untereinheiten an ihren Bestimmungsort transportiert werden. Dies geschieht wie bei allen Gram-negativen Bakterien auch in Escherichia coli mit Hilfe des flagellären Typ III-Sekretionssystems (fTTSS). Dabei ist der flagelläre Exportapparat mit seinen cytoplasmatischen Komponenten FliH, FliI und FliJ von Bedeutung. Der Exportapparat ist im Basalkörper des Flagellums lokalisiert und liefert die Energie für den Export der Substrate, wie z. B. das Hakenkappenprotein FlgD und das Hakenprotein FlgE. Die Substrate benötigen ihrerseits ein Signal für die Erkennung durch den Exportapparat. Im Rahmen dieser Arbeit konnten Interaktionen zwischen den löslichen Komponenten FliH, FliI und FliJ des flagellären Typ III-Sekretionssystems von E. coli K12 festgestellt werden. Zudem wurden begonnene Arbeiten zur Lokalisation und Beschaffenheit einer Erkennungssequenz für den Exportapparat beim Substrat FlgD weitergeführt und auch das Substrat FlgE näher untersucht. Mit Hilfe der Affinitätschromatographie konnte ein Komplex, bestehend aus FliH, FliI und FliJ, aus dem Cytosol von E. coli BL21 (DE3) präpariert werden. Dafür wurden zuvor die Gene fliH, fliI und fliJ zusammen in den Vektor pASK-IBA 45 kloniert und dann exprimiert. Parameter für Interaktionen und Affinitäten zwischen zuvor einzeln präpariertem FliH, FliI und FliJ konnten mit Hilfe von isothermaler Titrationskalorimetrie (ITC) und Surface Plasmon Resonance (SPR) ermittelt werden. Unter Verwendung eines bereits etablierten Testsystems für das fTTSS in E. coli CC181-Mutanten konnte der Export der Hybridproteine FlgDPhoA bzw. FlgEPhoA untersucht werden. Dabei wurden von FlgD auch N- oder C-terminale Verkürzungen sowie auf Nukleotid- oder Aminosäureebene veränderte Sequenzen eingesetzt. Die Untersuchungen ergaben ein Signal für den Export des Hakenkappenproteins FlgD auf Proteinebene und nicht auf der Ebene der mRNA. Zudem konnte das Exportsignal auf die N terminalen 71 Aminosäuren von FlgD eingegrenzt und eine Bedeutung des möglichen zweiten Startcodons an Position 52 in flgD für den Export ausgeschlossen werden. FlgE wurde in seiner gesamten Länge vom fTTSS transportiert. Im Gegensatz zu FlgD führten jedoch alle C-terminalen Verkürzungen von FlgE zum Transportverlust.

Einfluss der F1FO-ATP Synthase-Oligomerisierung auf den bioener-getischen Zustand von Mitochondrien Eine wichtige Funktion der Mitochondrien besteht in der Bereitstellung von ATP, dessen Synthese durch die OXPHOS-Komplexe der Innenmembran bewerkstelligt wird. Zusätzlich besitzt die F1FO-ATP Synthase eine strukturgebende Aufgabe. Dazu bildet diese Oligomere aus, die für die Ausbildung von Cristaestrukturen essentiell sind. Insbesondere die oligomer-spezifischen Untereinheiten Su e und Su g sind dafür, nicht jedoch für die enzymatische Aktivität der F1FO-ATP Synthase, notwendig. Der Einfluss der F1FO-ATP Synthase Assemblierung auf den bioenergetischen Zustand von Mitochondrien wurde in dieser Arbeit untersucht. Teildeletionen der C-terminalen ‚coiled-coil’-Domänen von Su e weisen eine verringerte Stabilität der Oligomere auf. Diese Destabilisierung geht mit einer Reduktion des mitochondrialen Membranpotentials und der Wachstumsrate einher, ist jedoch für die Ausbildung von Cristaestrukturen hinreichend. Des Weiteren sind die enzymatischen Aktivitäten der Atmungskettenkomplexe, die Integrität der Innenmembran sowie die Verlustrate der mtDNA in diesen Mutanten nicht beeinträchtigt. Der beobachtete Phänotyp ist daher nicht auf Sekundäreffekte zurückzuführen. Diese Arbeit unterstützt ein Modell, nach dem die Assemblierung der F1FO-ATP Synthase zu Oligomeren für die räumliche Anordnung auch von anderen Proteinkomplexen in Form von Mikrodomänen für einen effizienten Substratumsatz während der oxidativen Phosphorylierung oder für deren Regulation notwendig ist. Somit hat die Stabilität der F1FO-ATP Synthase-Oligomere einen Einfluss auf die bioenergetische Leistungsfähigkeit von Mitochondrien. Charakterisierung der mitochondrialen Rhomboidprotease Pcp1 Das Dynamin-ähnliche mitochondriale Protein Mgm1 kommt in zwei Isoformen vor, die möglicherweise an der Ausbildung von Cristaestrukturen beteiligt sind. Die kurze Isoform, s-Mgm1, entsteht in Abhängigkeit von der hochkonservierten Intramembran-Rhomboidprotease Pcp1. Zur genaueren Aufklärung dieser Prozessierung wurde die Topologie und Biogenese von Pcp1 ermittelt. Pcp1 durchspannt die mitochondriale Innenmembran mit sieben Transmembrandomänen und besitzt eine Nin-Cout-Topologie. Untersuchungen zum Import von Pcp1 zeigen, dass dessen Import in die innere Membran von der TIM23-Translokase vermittelt und die mitochondriale Signalsequenz schrittweise durch die zwei Proteasen MPP und MIP entfernt wird. Außerdem wird möglicherweise die C-terminale Transmembrandomäne von Pcp1, entsprechend einem ‚Stop-Transfer’-Mechanismus, in der TIM23-Translokase arretiert und anschließend lateral in die Innenmembran inseriert. Alternativ wird Pcp1 zunächst vollständig in die Matrix importiert und anschließend über den konservativen Sortierungsweg in die Innenmembran inseriert. Die bisherigen Ergebnisse lassen eine Unterscheidung zwischen diesen beiden Möglichkeiten nicht zu. Aufgrund von Sequenzvergleichen verschiedener Rhomboidproteasen wurden wie in anderen Serinproteasen drei konservierte Aminosäurereste als mögliche katalytische Triade postuliert. Um dies zu untersuchen, wurden diese Aminosäurereste jeweils gegen Alanin ausgetauscht. Zwei dieser Punktmutationen, in Serin-256 oder Histidin-313, führen zur vollständigen Inaktivierung von Pcp1, während die Aminosäure Asparagin-202 für die Aktivität nur partiell notwendig ist. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass die mitochondriale Rhomboidprotease Pcp1 mit einer katalytischen Diade eine besondere Stellung unter den Serinproteasen einnimmt.

Die gamma-Sekretase ist ein Proteasekomplex, der aus vier Komponenten, Presenilin (PS), Nicastrin (NCT), APH-1 und PEN-2, besteht und der die intramembranöse Prozessierung verschiedener Typ I Transmembranproteine, einschliesslich des Alzheimer-assoziierten beta-Amyloid Vorläuferproteins, katalysiert. In der vorliegenden Arbeit wurden stabile PEN-2 RNAi-Knockdown Zellen (PEN-2KD) dazu verwendet, um Hinweise auf die Funktion von PEN-2 bei der Assemblierung und Reifung des gamma-Sekretasekomplexes, die Rolle von PEN-2 im aktiven Komplex und für die gamma-Sekretaseaktivität zu erhalten. Zusätzlich wurden, vor dem Hintergrund des PEN-2KD, RNAi-resistente PEN-2 Varianten analysiert, die in einer Struktur- /Funktionsanalyse auf ihre Fähigkeit hin untersucht wurden, den Defekt des PEN- 2KD aufzuheben, um damit funktionell wichtige Domänen im PEN-2 Protein zu identifizieren. Der Knockdown von PEN-2 war mit gestörter Reifung von NCT und blockierter PS Endoproteolyse assoziiert. PS akkumulierte als Vollängenprotein (PSholo), das durch Komplexbildung mit NCT und APH-1 stabilisiert wurde. In Abwesenheit von PEN-2 können PS, NCT und APH-1 zu einem trimeren Komplex assemblieren, PEN- 2 ist danach allerdings notwendig, um die Reifung des gamma-Sekretasekomplexes durch Initialisierung der PS Endoproteolyse einzuleiten. Interessanterweise bewirkte der Knockdown von PEN-2 auch in Endoproteolyse defizienten SwAPP/PS1 deltaExon9 Zellen einen Defekt in der Reifung von NCT. Dies schlägt eine generelle Rolle von PEN-2 bei der Reifung und für die Aktivität der gamma-Sekretase vor, die unabhängig von der PS Endoproteolyse ist. Die Defekte des PEN-2KD konnten effektiv durch RNAi-resistentes wt-PEN-2 revertiert werden. In der folgenden Struktur-/Funktionsanalyse erwies sich am N-Terminus mit einem Epitop-tag verlängertes PEN-2 als voll funktionell, wohingegen sowohl die Verlängerung des C-Terminus mit einem tag, als auch eine Trunkierung des C-Terminus (PEN-2 deltaC) defekte PEN-2 Varianten hervorrief. Diese konnten zwar die Akkumulation von PSholo, die mit dem Knockdown von PEN-2 assoziiert war ausgleichen, konnten aber weder normale Spiegel an PS-NTF und -CTF herstellen, noch für eine Reifung von NCT sorgen. PEN-2 deltaC war sehr instabil und wurde schnell vom Proteasom abgebaut, was mit der Unfähigkeit einen stabilen gamma-Sekretasekomplex zu bilden konsistent war. Zusätzlich verursachte die Expression von PEN-2 deltaC eine selektive Instabilität des PS-NTF/-CTF Heterodimers, das ebenfalls vom Proteasom abgebaut wurde, wohingegen NCT und APH-1 stabil blieben. Der C-Terminus von PEN-2 ist nicht für die Einleitung der PS Endoproteolyse notwendig. Danach wird er allerdings benötigt um die entstandenen PS Fragmente und PEN-2 selbst im Komplexzu stabilisieren. Um den PEN-2 C-Terminus genauer zu untersuchen, wurden unterschiedliche Deletionen und Mutationen mehrerer konservierter Aminosäuren, im PEN-2KD auf funktionelle Aktivität hin analysiert. Progressive Verkürzung des C-Terminus bewirkte einen zunehmenden Funktionsverlust. Dieser wurde auch bei einer internen Deletion oder der groben Verdopplung der Länge durch einen Epitop-tag beobachtet. Interessanterweise störte nur die kombinierte, nicht aber die einzelne Mutation der konservierten Aminosäuren D90, F94, P97 und G99 die Funktion von PEN-2. Alle funktionslosen Mutanten erlaubten zwar die PS Endoproteolyse, die PS Fragmente und PEN-2 selbst waren aber instabil und wurden durch das Proteasom abgebaut. Länge und gesamter Sequenzkontext des PEN-2 C-Terminus sind also, in der engen räumlichen Anordnung der Komplexpartner, für die Stabilisierung des PS-NTF/- CTF Heterodimers und von PEN-2 selbst im gamma-Sekretasekomplex notwendig. Die Interaktion der C-terminalen PEN-2 Mutanten mit den PS Fragmenten und den anderen beiden Komplexpartnern konnte allerdings unter Bedingungen, wo der proteasomale Abbau blockiert war, wiederhergestellt werden. Somit wurde ein Komplex aus allen vier essentiellen gamma-Sekretasekomponenten stabilisiert und isoliert, der zwar vollständig assembliert, aber noch nicht komplett gereift war. Dieser prämature Komplex zeigte noch keine gamma-Sekretaseaktivität, für welche sowohl die vollständige Assemblierung der Komponenten, als auch deren komplette Reifung essentiell sind. Zusammenfassend schlagen die vorliegenden Daten folgende Funktionen für PEN- 2 im gamma-Sekretasekomplex vor: PEN-2 wird für die Reifung des gamma-Sekretasekomplexes und die Einleitung der PS Endoproteolyse benötigt. Darüber hinaus stabilisiert PEN-2 die, durch die Endoproteolyse entstandenen PS Fragmente im Komplex. Für letztere Funktion ist ein in Länge und Gesamtsequenzkontext intakter C-Terminus wichtig, der allerdings für die Einleitung der PS Endoproteolyse nicht benötigt wird. Unabhängig von der Rolle bei der PS Endoproteolyse ist PEN-2 aber generell für die Reifung und Aktivität des gamma-Sekretasekomplexes wichtig.

Die Translokase der mitochondrialen Außenmembran TOM-Komplex erkennt alle in Mitochondrien zu importierenden Proteine und vermittelt den Transfer in oder über die Membran. Der Mechanismus der Translokation ist allerdings bisher nur teilweise verstanden. Strukturelle Informationen über den TOM-Komplex können Fragen nach den Detailschritten beantworten helfen. Aus dem Schimmelpilz Neurospora crassa wurde der TOM-Komplex so aufgereinigt, dass Ausbeute und Reinheit strukturelle Untersuchungen mittels Proteinkristallographie ermöglichten. Kristalle des TOM-Komplexes wurden gewonnen und Beugungsexperimente durchgeführt. Die Auflösung der erhaltenen Kristalle des TOM-Komplexes war nicht ausreichend, um Aussagen über die Raumgruppe oder den strukturellen Aufbau des Komplexes treffen zu können. Deshalb wurde das Reinigungsverfahren weiter optimiert sowie eine Reihe von Mutanten des TOM-Komplexes untersucht. Bisher konnte jedoch keine Verbesserung der Beugungsdaten erreicht werden. Zu Beginn dieser Arbeit waren vier Untereinheiten des TOM-Core-Komplexes von N. crassa bekannt: Tom40, Tom22, Tom7 und Tom6. Im ansonsten vergleichbar aufgebauten TOM-Core-Komplex von S. cerevisiae war noch eine weitere Komponente Tom5 beschrieben worden. Daher wurde im Vorfeld der Kristallisationsexperimente die Zusammensetzung des N. crassa TOM-Komplexes massenspektrometrisch analysiert, wobei Tom5 als eine weitere Tom-Untereinheit in N. crassa identifiziert werden konnte. Aufgrund von Experimenten mit S. cerevisiae wurde eine Rolle des Tom5 im Proteinimport in Mitochondrien postuliert. Im Gegensatz hierzu hatte Tom5 in N. crassa keinen Einfluß auf den Proteinimport. Auch auf die Assemblierung des TOM-Komplexes und das Wachstum der Zellen wirkte sich eine Deletion von Tom5 in N. crassa nicht negativ aus. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen allerdings eine solche Funktion auch in Hefe als fraglich erscheinen. Vielmehr deuten die hier vorgelegten Befunde auf eine strukturelle Funktion von Tom5 bei der Stabilisierung des TOM-Komplexes hin. Um weitere neue Komponenten des Import- und Assemblierungsapparates der mitochondrialen Außenmembran zu finden, wurde eine massenspektrometrische Analyse der Proteine von isolierten Außenmembranvesikeln aus N. crassa durchgeführt. Hierbei wurde Mim1 als bisher unbekanntes Außenmembranprotein identifiziert. Mim1 liegt in einem 300 kDa-Komplex vor und es wurde eine essentielle Funktion von Mim1 bei der Assemblierung des TOM-Komplexes nachgewiesen.

Die Inaktivierung des von Hippel-Lindau (VHL) Tumorsuppressors spielt eine Rolle in der Entstehung von verschiedenen gut- und bösartigen Tumoren mit hoher Gewebespezifität. Als substraterkennende Untereinheit des CBCVHL Ubiquitin Ligase Komplexes steuert VHL den sauerstoffabhängigen Abbau des Transkriptionsfaktors HIF1/2α. HIF1/2α aktiviert die Transkription einer Vielzahl von Faktoren, die für den Energiehaushalt der Zelle und die Blutgefäßneubildung von entscheidender Bedeutung sind. Die Akkumulation von HIF1/2α führt zu deren konstitutiver Expression und fördert somit das Wachstum von Tumoren durch eine verbesserte Nährstoffversorgung. Der sauerstoffabhängige Mechanismus der HIF-Erkennung wird durch die Aktivität einer neuen Familie von Prolylhydroxylasen reguliert, die möglicherweise ihrerseits eine Reihe von zellulären Substraten haben. Trotz der guten Korrelation zwischen bestimmten, den HIF-Abbau beeinflussenden VHL-Mutationen und dem Auftreten von verschiedenen Krankheitssubtypen sind noch nicht alle Phänotypen im Zusammenhang mit VHL erklärbar. Vor allem die Identifizierung neuer Substrate für den CBCVHL Komplex ist für ein umfassendes Verständnis der VHL-Krankheit von Interesse. In dieser Arbeit wurden unterschiedliche Methoden zur Identifizierung neuer Substrate von VHL angewendet. Durch Affinitätschromatographie mit einem rekombinanten Komplex aus VHL, Elongin B und Elongin C (VCB) konnte Daxx als neuer Interaktor von VHL identifiziert werden. Daxx bindet Elongin B/C-unabhängig an VHL, und seine Stabilität wird nicht durch VHL reguliert. Zudem bildet Daxx einen Komplex mit dem VHL-Substrat HIF1α. Dies weist auf eine mögliche Funktion von VHL neben seiner Rolle als Ubiquitin Ligase hin, z.B. in der Regulation von Daxx als transkriptionellem Repressor. In einem funktionalisierten „TwoHybrid“-Screen konnte der Mechanismus der HIF-Regulation in S. cerevisiae rekonstituiert werden. Dies ermöglichte die Identifizierung weiterer potentieller VHL-Substrate, unter anderem Diacylglycerol Kinase iota (DGKι). DGKι weist zwei Erkennungsmotive für Prolylhydroxylasen auf und wird in Gehirn und Retina exprimiert. In diesem Organen kommt es bei VHL-Patienten zur Entstehung von Hämangioblastomen. DGKι wird in vivo ubiquityliert und bindet sowohl an VHL, als auch an zwei der drei bekannten Prolylhydroxylasen. Mit Mutanten von DGKι konnte allerdings gezeigt werden, dass Bindung und Ubiquitylierung nicht über den gleichen Mechanismus erfolgen wie bei HIF1α. Möglicherweise spielen Ubiquitylierung und VHL-Bindung getrennte Rollen in unterschiedlichen zellulären Prozessen. Es wird zunehmend deutlicher, dass VHL nicht nur eine Komponente des CBCVHL Komplexes bildet, sondern weitere Funktionen in der Zelle erfüllt. VHL spielt eine Rolle in der Assemblierung der Fibronektinmatrix, der Regulation von Mikrotubulistabilität und –dynamik und der Transkriptionskontrolle. Eine weitere Charakterisierung des nicht-degradativen Einflusses von VHL auf die in dieser Arbeit beschriebenen Bindungspartner ist nötig, um die zelluläre Wirkungsweise von VHL vollständig zu verstehen.

Die mitochondriale Außenmembran beherbergt eine Vielzahl an Proteinen, die anhand ihrer Topologie in unterschiedliche Klassen eingeteilt werden können. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Biogenese von zwei Klassen untersucht. Die erste besitzt eine hydrophile cytosolische Domäne und ist über eine Transmembrandomäne im N-terminalen Bereich in der Membran verankert. Dieser N-terminale Bereich enthält die Signalsequenz dieser Proteine und dient gleichzeitig als Membrananker, weshalb er als Signal-Anker-Domäne bezeichnet wird. Zu dieser Proteinklasse gehören die beiden Rezeptorkomponenten des TOM-Komplexes, Tom20 und Tom70, und in S. cerevisiae das Protein OM45 mit bisher unbekannter Funktion. Zur Bestimmung der Bedeutung der Signal-Anker-Domäne für die Funktion des jeweiligen Proteins bzw. zur strukturellen und funktionellen Charakterisierung dieses Sequenzabschnittes wurde ein Komplementationsansatz benutzt. Damit konnte gezeigt werden, dass die Signal-Anker-Domänen mitochondrialer Außenmembranproteine funktionell austauschbar sind. Folglich spielen sie für die spezifische Funktion des Proteins nur eine untergeordnete Rolle, sind allerdings für den Transport zu den Mitochondrien und für die Verankerung in der Außenmembran von entscheidender Bedeutung. Des Weiteren konnte ich die strukturellen Elemente bestimmen, die zusammen mit der Ankerdomäne das topogene Signal bilden. Eine moderate Hydrophobizität der Transmembrandomäne scheint am wichtigsten zu sein, um diese Proteine zu Mitochondrien zu dirigieren. Eine positive Nettoladung in beiden flankierenden Regionen der Transmembrandomäne erhöht die Effizienz des Transports zu den Mitochondrien und die Membraneinbaurate, ist aber keine essenzielle strukturelle Eigenschaft dieses Signals. Zusätzlich zur Charakterisierung der Signal-Anker-Domänen wurde der Importmechanismus dieser Proteinklasse untersucht. Dieser ist gemäß unserer Ergebnisse nicht von den bekannten Importrezeptoren, Tom20 und Tom70, abhängig, benötigt aber sehr wohl die zentrale Tom-Komponente Tom40. Im Gegensatz zu Vorstufen von Proteinen interner mitochondrialer Kompartimente und von beta-Barrel-Proteinen der Außenmembran scheinen die Vorstufen von Proteinen mit einer Signal-Anker-Domäne nicht über den von Tom40 gebildeten Kanal importiert zu werden. Höchstwahrscheinlich werden diese Proteine durch andere Teile von Tom40 erkannt und anschließend an der Protein-Lipid-Interphase in die Membran eingebaut. Die zweite untersuchte Proteinklasse der mitochondrialen Außenmembran sind die beta-Barrel-Proteine, welche über mehrere antiparallele beta-Faltblätter in der Membran verankert sind. Diese Proteine sind neben Mitochondrien in der Außenmembran von Chloroplasten und gram-negativen Bakterien zu finden. Zu Beginn dieser Arbeit war wenig über die Biogenese mitochondrialer beta-Barrel-Proteine bekannt. Wir konnten zeigen, dass diese Proteinklasse über einen evolutionär konservierten Weg in Mitochondrien importiert wird. Beta-Barrel-Proteine werden zunächst mit Hilfe des TOM-Komplexes zur Intermembranraumseite transportiert. Von dort werden sie durch einen zweiten oligomeren Proteinkomplex, den TOB-Komplex, in die Außenmembran eingebaut. Als erste Tob-Komponente konnten wir das essenzielle Protein Tob55 identifizieren und charakterisieren. Es kann eine Pore in Lipidmembranen bilden und könnte folglich für die Insertion der beta-Barrel-Vorstufen in die Außenmembran verantwortlich sein. Mas37 wurde ebenfalls als Bestandteil dieses Komplexes beschrieben. Auf der Suche nach weiteren Komponenten konnte ich Tob38 mit Tob55 zusammen reinigen. Tob38 ist wie Tob55 essenziell für das Wachstum von Hefezellen und für die Funktion des TOB-Komplexes. Es ist auf der Oberfläche der mitochondrialen Außenmembran lokalisiert. Tob38 interagiert mit Mas37 und Tob55 und ist auch in Abwesenheit von Mas37 mit Tob55 assoziiert. Der Tob38-Tob55 Kernkomplex bindet Vorstufen von beta-Barrel-Proteinen und ermöglicht deren Einbau in die Außenmembran. Die Depletion von Tob38 führt zu stark verringerten Mengen an Tob55 und Mas37 und die verbleibenden Proteine bilden keinen Komplex mehr. Der Import von beta-Barrel-Vorstufenproteinen in Tob38-depletierte Mitochondrien ist stark beeinträchtigt, wohingegen andere Außenmembranproteine oder Proteine anderer mitochondrialer Subkompartimente mit gleicher Effizienz wie in Wildtyp-Organellen importiert werden. Demnach besitzt Tob38 eine äußerst wichtige und spezifische Funktion bei der Biogenese von mitochondrialen beta-Barrel-Proteinen. Es könnte für die Stabilität und Assemblierung des TOB-Komplexes notwendig sein oder an der Ausbildung einer transienten Assoziation zwischen dem TOM- und dem TOB-Komplex beteiligt sein und dabei den Transfer von Vorstufenproteinen erleichtern. Andererseits könnte Tob38 auch als Regulator der von Tob55 gebildeten Pore fungieren. Mim1 konnte im Rahmen dieser Arbeit als eine weitere am Import bzw. der Assemblierung des beta-Barrel-Proteins Tom40 beteiligte Komponente charakterisiert werden. Die Depletion von Mim1 führt zu stark verringerten Mengen an assembliertem TOM-Komplex und zur Akkumulation von Tom40 als niedermolekulare Spezies. Wie alle mitochondrialen beta-Barrel-Proteine werden die Vorstufen von Tom40 durch den TOB-Komplex in die Außenmembran eingebaut. Mim1 wird höchstwahrscheinlich nach diesem TOB-abhängigen Schritt benötigt. Aufgrund der starken Konservierung im Bereich des Transmembransegments von Mim1 beim Vergleich der Proteinsequenzen verschiedener Pilze könnte das Protein als eine Art Membran-Chaperon fungieren. Dabei könnte Mim1 notwendig sein, um nicht oder teilweise assembliertes Tom40 in einer kompetenten Form für die Assemblierung mit den kleinen Tom-Proteinen und mit Tom22 zu halten. Mim1 ist weder eine Komponente des TOM-Komplexes noch des TOB-Komplexes, sondern scheint vielmehr Bestandteil eines weiteren, bisher nicht charakterisierten Komplexes zu sein. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass Mim1 eine spezifische und unverzichtbare Rolle bei der Assemblierung des TOM-Komplexes spielt.

Agrobacterium tumefaciens ist ein Gram-negatives Bodenbakterium, das dikotyle Pflanzen infiziert. Mittels eines Typ IV Sekretionssystems werden dabei ein Teil der bakteriellen DNA (T-DNA), sowie die Virulenzproteine VirE2, VirE3, VirD2 und VirF in die pflanzliche Zelle transferiert. Das Typ IV Sekretionssystem von A. tumefaciens besteht aus den 12 Vir-Proteinen VirB1-VirB11 und VirD4, die zu einem die äußere und innere Membran durchspannenden Proteinkomplex und einem Pilus (T-Pilus) assemblieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Protein-Protein-Interaktionen im VirB/D4-Sekretionssystem von A. tumefaciens C58 analysiert, mit dem Ziel einer Aufklärung der Assemblierung von Transporterstruktur und T-Pilus. Ergebnisse: 1) Unter Verwendung des milden nicht-ionischen Detergenz n-Dodecyl-b-D-maltosid wurde eine potentielle Vorstufe der T-Pilus Assemblierung solubilisiert. In dem ca. 100 kDa großen Proteinkomplex wurden die Vir-Proteine VirB2, VirB3, VirB5, VirB6, VirB7, VirB8 und geringe Mengen VirB9 detektiert. Die T-Pilus Proteine VirB2, VirB5 und VirB7 zeigten bei Analyse mittels BN-PAGE und 2D-Gelelektrophorese eine Kofraktionierung. Unter Berücksichtigung bereits bekannter Fakten wurde ein Modell der T-Pilus Assemblierung wurde erstellt. 2) Ein 27 kDa großes, mit VirB5 interagierendes Protein wurde entdeckt und nach Aufreinigung und N-terminaler Sequenzierung als „trans-Zeatin produzierendes Protein“ (Tzs) identifiziert. Die Untersuchung der enzymatischen Aktivität von Tzs ergab eine Umsetzung von 4-Hydroxy-3-methyl-2-(E)-butenyldiphosphat (HMBPP) mit AMP zu Zeatinribosid-5´-monophosphat (ZMP), einem Phytohormon der Cytokinin-Klasse. HMBPP ist ein Zwischenprodukt des alternativen Isoprenoid-Biosynthese Weges (DXP-Weg) Gram-negativer Bakterien. 3) Eine Interaktion von VirB5 mit VirB5, sowie VirB5 mit VirE2 konnte gezeigt werden. Im Rahmen der Analysen wurde neben den Piluskomponenten VirB2, VirB5 und VirB7 auch VirB1 in isolierten T-Pili detektiert.

Wed, 3 Dec 2003 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/1624/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/1624/1/lutz_thomas.pdf Lutz, Thomas ddc:570, ddc:500,

Die kotranslationelle Dekodierung des Kodons UGA als Selenocystein erfolgt durch eine spezifische tRNA (tRNASec), die von Seryl-tRNA Synthetase mit Serin beladen und anschließend von Selenocystein Synthase (SelA) zu Selenocysteyl- tRNASec umgesetzt wird. Selenophosphat, das als Selendonor für diese Reaktion dient, wird von Selenophosphat Synthetase (SelD) aus Selenid und ATP generiert. Der anschließende Transfer der beladenen tRNA zum Ribosom erfolgt durch den spezialisierten Elongationsfaktor SelB, dessen N-terminale Region Homologie zu EF-Tu zeigt und wie dieses Guanosin-Nukleotide und tRNA bindet. Der C-terminale Teil interagiert zusätzlich mit einer als SECIS-Element bezeichneten mRNA- Sekundärstruktur, die in Bakterien unmittelbar auf das für Selenocystein kodierende UGA-Triplett folgt und für dessen Rekodierung als Sinnkodon verantwortlich ist. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit den Mechanismen, die der Interaktion von SelB mit seinen Liganden sowie der Regulation der Selenocystein- Biosynthese durch SelB zu Grunde liegen. Im Einzelnen wurden dabei folgende Resultate erhalten: 1) Die strikte Diskriminierung zwischen Seryl- und Selenocysteyl-tRNASec durch SelB ist essentiell für das Funktionieren des Selenocystein inkorporierenden Systems. Eine gerichtete Mutatagenese der Aminoacyl-Bindetasche von SelB zeigte, dass die Selektivität der tRNA-Bindung vermutlich nicht auf einer spezifischen Erkennung des Aminoacyl-Rests beruht. Nach Zufallsmutagenese konnten vier SelB-Varianten isoliert werden, die in vivo eine erhöhte Aktivität mit Seryl-tRNASec besitzen. Zwei der Mutationen waren in der G-Domäne von SelB lokalisiert, die anderen beiden in Domäne 4a. Die biochemische Charakterisierung der mutierten Proteine ergab noch keinen Hinweis auf eine erhöhte Affinität der SelB-Varianten für Seryl-tRNASec, so dass andere Mechanismen für die Erweiterung der Aminosäure-Spezifität verantwortlich sein müssen. 2) Die Interaktion von SelB mit seinen Liganden wurde mit Hilfe von biochemischen und biophysikalischen Methoden analysiert. Der Elongationsfaktor zeigt im Gegensatz zu vielen anderen G-Proteinen eine höhere Affinität für GTP (KD = 0,74 µM) als für GDP (KD = 13,4 µM),was zusammen mit der hohen Dissoziationsrate von GDP (kdis = 15 s-1) darauf hinweist, dass der Nukleotidaustausch ohne Katalyse durch einen Austauschfaktor erfolgt. Die Kinetiken der Interaktion mit Guanosin-Nukleotiden werden durch die Gegenwart eines SECIS-Elements nicht beeinflusst. Die Affinität von SelB zu einem fluoresceinmarkierten SECIS-Transkript liegt im nanomolaren Bereich (KD = 1,23 nM), wobei die Assoziations- und Dissoziationskinetiken sehr schnell sind und durch die Gegenwart von Guanosin-Nukleotiden nicht verändert werden. In Gegenwart von Selenocysteyl-tRNASec wurde jedoch eine signifikante Verringerung der Dissoziationsgeschwindigkeit beobachtet, die zu einer Stabilisierung der Bindung führt und eine Interaktion zwischen der SECIS- und tRNA-Bindetasche nahelegt. Diese intramolekulare Wechselwirkung wurde durch Charakterisierung der isolierten mRNA-Bindedomäne von SelB bestätigt. Die Gleichgewichtslage der einzelnen Reaktionen führt zu einer gerichteten Bildung eines Komplexes aus SelB, GTP, Selenocysteyl-tRNASec und dem SECIS-Element, der durch seine hohe Stabilität auf der mRNA fixiert wird und gleichzeitig eine Konformation annimmt, die seine Interaktion mit dem Ribosom zulässt. 3) In der 5´-untranslatierten Region der selAB-mRNA wurde eine Sekundärstruktur identifiziert, die Ähnlichkeit mit dem SECIS-Element aufweist und mit der SelB spezifisch und mit hoher Affinität interagiert. Die Stabilität des Komplexes zwischen SelB und dem SECIS-ähnlichen Element erhöht sich in Gegenwart von Selenocysteyl-tRNASec. Eine Analyse der sel-Genexpression ergab, dass die Synthese von SelA und in geringerem Ausmaß SelB in genetischen Hintergründen, die eine Assemblierung des quaternären Komplexes aus SelB, GTP, Selenocysteyl- tRNASec und dem SECIS-ähnlichen Element erlauben, reprimiert ist. Mutationen in sel- Genen führen dagegen zu einer erhöhten intrazellulären Konzentration dieser Proteine. Mit Hilfe von Reportergen-Fusionen wurde gezeigt, dass die Repression der selA-Expression direkt von der Bildung eines quaternären Komplexes am SECIS-ähnlichen Element abhängig ist. Da diese keinen Einfluss auf die Transkription hat und nur zu einer schwachen Verringerung der mRNA-Menge führt, wurde gefolgert, dass das SECIS-ähnliche Element eine Regulation der Translationsinitiation am selA-Gen in Abhängigkeit vom Selenstatus der Zelle ermöglicht.

Im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit steht die Funktion der Untereinheit e (Sue) der mitochondrialen F1FO-ATP Synthase von Saccharomyces cerevisi-ae. Anhand der Resultate der durchgeführten Experimente wurden folgende Schlussfolgerungen gezogen: (1) Sue ist der Lage, ein Sue-Homodimeres zu bilden. Das Protein spielt eine zentrale Rolle bei der Assemblierung der F1FO-ATP Synthase zu einem stabilen Dimer. Sue-Disruptanten bilden entsprechend kein stabiles ATP Synthase-Dimeres aus. Die C-terminalen 36 Aminosäurereste von Sue, die gegenüber Untereinheiten e aus Säugerzellen zusätzlich vorhanden sind, sind für die Dimerisierung von Sue und der F1FO-ATP Synthase ohne Bedeutung. (2) Zwischen den Untereinheiten e und k, die beide im FO-Sektor der ATP Synthase lokalisiert sind, besteht eine enge räumliche Beziehung. Für die In-teraktion von Sue mit Suk ist der Bereich von Sue, der anderen Untereinheiten e aus Säugerzellen ähnelt, ausreichend. (3) Im Hefegenom wurde ein der Sequenz von Suk nahe verwandtes Le-seraster gefunden. Die Sequenzähnlichkeit auf Aminosäureebene beträgt 45%. Ein entsprechendes hypothetisches Protein wurde als Suk hom bezeichnet. Eine Deletion dieser Sequenz allein oder gemeinsam mit dem Gen für Suk blieb ohne Auswirkungen auf die oxidative Phosphorylierung, die Assemblie-rung der F1FO-ATP Synthase und die Expression von Untereinheiten des FO-Sektors der F1FO-ATP Synthase. (4) Die Dimerisierung der F1FO-ATP Synthase und somit auch die Funkti-on von Sue als Dimerisierungsfaktor erwies sich als essentiell für die Funkti-on weiterer Komponenten der Atmungskette: der Cytochrom c-Oxidase und des Cytochrom bc1-Komplexes. Die Assemblierung der ATP Synthase wirkt sich auf die Aktivitäten der beiden Komponenten des Cytochrom bc1-COX-Suprakomplexes aus. Sie beeinflusst auch deren Assemblierung in den Supra-komplex beziehungsweise seine Stabilität. Die Anwesenheit der Region von Sue, die anderen Untereinheiten e aus Säugetierzellen ähnelt, reicht für die Bildung des Cytochrom bc1-COX-Suprakomplexes aus. Das Dimer der ATPase Synthase ist demzufolge in den Suprakomplex einge-bunden. Allerdings hat der Assemblierungszustand des Cytochrom bc1-COX-Suprakomplexes keinerlei Auswirkungen auf die Assemblierung der ATP Synthase. Dies deutet auf einen hierarchisch ablaufenden Prozeß der Bildung eines Suprakomplexes aus Cytochrom bc1-Komplex, Cytochrom c-Oxidase und F1FO-ATP Synthase hin. Die ATP Synthase nutzt zur Bildung von ATP den elektrochemischen Gra-dienten über die innere Mitochondrienmembran, an dessen Aufbau der Cy-tochrom bc1-Komplex und die Cytochrom c-Oxidase beteiligt sind. Eine Ein-bindung dieser Enzyme in einen Suprakomplex würde eine koordinierte Re-gulation der oxidativen Phosphorylierung ermöglichen. (5) Zwischen der Untereinheit Sue der F1FO-ATP Synthase und der Unter-einheit Cox2 der Cytochrom c-Oxidase konnte eine enge räumliche Bezie-hung nachgewiesen werden. Diese ist von der Funktionalität der F1FO-ATP Synthase abhängig. Anhand der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit konnte somit folgende Erklä-rung für die Funktion der Untereinheit e der mitochondrialen F1FO-ATP Synthase gefunden werden: Sue dient als Dimerisierungsfaktor der F1FO-ATP Synthase. Die Dimerisie-rung von Sue und damit die Dimerisierung der ATP Synthase ist essentiell für die Stabilisierung des Cytochrom bc1-COX-Suprakomplexes und die Funkti-on seiner Komponenten.

Proteolytische Prozesse spielen eine wichtige Rolle während der Biogenese von Mitochondrien und bei der Qualitätskontrolle mitochondrialer Proteine. In der vorliegenden Arbeit wurde der Abbau von Proteinen in der Innen- und Außenmembran von Mitochondrien aus Saccharomyces cerevisiae untersucht. Ein erster Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit Mechanismen der Proteolyse in der mitochondrialen Innenmembran. Dazu wurde der Abbau einer mutanten Variante des polytopischen Membranproteins Oxa1 verfolgt. Es zeigte sich, dass die m-AAA-Protease den Abbau von Oxa1ts vermittelt, während keine Hinweise auf eine Beteiligung der i-AAAProtease erhalten wurden. In Abwesenheit der m-AAA-Protease wird Oxa1ts ebenfalls proteolytisch durch eine (oder mehrere) bislang nicht identifizierte Metallopeptidase(n) gespalten. Allerdings ist kein vollständiger Abbau von Oxa1ts durch diese Peptidase(n) zu beobachten. Vielmehr akkumulieren proteolytische Intermediate in den Mitochondrien. Nach den vorliegenden Untersuchungen kann die endoproteolytische Aktivität der Metallopeptidase(n) entweder eine Vorraussetzung für die Proteolyse durch die m-AAAProtease sein oder aber einen Bestandteil eines molekularen Ersatzsystems zum Abbau von mitochondrialen Innenmembranproteinen in Abwesenheit der m-AAAProtease darstellen. Während der Proteolyse durch AAA-Proteasen wird eine Dislokation von Membranproteinen beobachtet. Daher wurde eine mögliche Beteiligung von Translokationsporen der Innenmembran an Abbauvorgängen untersucht. Eine Rolle der TIM17/23-Translokase konnte ausgeschlossen werden. Des weiteren konnte auch für die OXA1-Pore keine essentielle Bedeutung für die Dislokation von Membranproteinen während der Proteolyse nachgewiesen werden. Eine Inaktivierung der Proteine Mba1 und Pnt1, die an Insertion von mitochondrialen Proteinen in die Innenmembran beteiligt sind, führte jedoch zu einer Beeinträchtigung von Abbauprozessen in der Innenmembran. Diese Befunde weisen auf eine Rezeptor- oder Chaperon-Funktion von Mba1 und Pnt1 während des Abbaus durch die AAA-Proteasen hin. In einem zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde genetisch und biochemisch nach Komponenten gesucht, die den Abbau von Proteinen der mitochondrialen Außenmembran vermitteln. Ein Fusionsprotein, HA-DHFRWT-Tom6, das eine lösliche entfaltete Domäne in das Cytoplasma exponiert und im TOM-Komplex assembliert ist, wurde als Modellsubstrat verwendet. Während in isolierten Mitochondrien kein Abbau stattfindet, unterliegt das Protein in vivo deutlicher Proteolyse. Dieser Prozess wurde als ATP-abhängig charakterisiert. Eine Beteiligung des vakuolären Proteolyse-Systems, der i-AAA-Protease sowie des Ubiquitin- Proteasom-Abbauweges konnte unter den verwendeten experimentellen Bedingungen ausgeschlossen werden. Zur Identifizierung von Komponenten, die an der Proteolyse von Außenmembranproteinen beteiligt sind, wurde eine genetische Durchmusterung durchgeführt. Eine temperatursensitive Mutante des essentiellen Außenmembranproteins Tom40, das unter nicht-permissiven Bedingungen rasch abgebaut wird, wurde verwendet, um nach stabilisierenden Mutanten zu suchen. Die identifizierten Mutanten unterdrückten zwar den Wachstumsdefekt, führten aber zu keiner Stabilisierung von Tom40ts, weshalb keine am Abbau beteiligten Komponenten identifiziert werden konnten. Allerdings wurde durch die Isolierung eines Suppressors ein Bereich innerhalb des Proteins Tom40 beschrieben, der für die Assemblierung von Tom40 in den TOM-Komplex essentiell ist.

Die Proteintranslokase in der mitochondrialen Außenmembran (TOM-Komplex) ist verantwortlich für die Erkennung von mitochondrialen Präproteinen und deren Translokation über die mitochondriale Außenmembran. Das Ziel dieser Arbeit bestand in der Klonierung und Charakterisierung von bislang nicht identifizierten Komponenten des TOM-Komplexes in Neurospora crassa sowie in der Charakterisierung der Bindung von Präproteinen an den isolierten TOM-Komplex. Dabei wurden folgende Ergebnisse erzielt: Es wurden zwei bislang unbekannte, ca. 6 bzw. 7 kDa grosse Komponenten des Neurospora crassa TOM-Komplexes, Tom6 und Tom7, identifiziert. Deren Gene wurden mittels Durchmusterung einer cDNA-Phagenbibliothek sowie einer sortierten genomischen DNA-Bibliothek identifiziert und sequenziert. Das TOM6-Gen umfasst drei Exons und zwei Introns, während das TOM7-Gen vier Exons und drei Introns enthält. Die Aminosäuresequenzen von Neurospora crassa Tom6 und Tom7 weisen eine hohe Ähnlichkeit zu denen von Tom6 und Tom7 aus anderen Organismen auf. Dabei erstreckt sich der homologe Bereich bei Tom7 über die gesamte Aminosäuresequenz, während er bei Tom6 auf den carboxyterminalen Bereich beschränkt ist. Für beide Proteine wurde jeweils eine potentielle Transmembrandomäne an ihrem Carboxyterminus vorausgesagt. Sowohl Tom6, als auch Tom7 sind integrale Bestandteile des TOM-Core-Komplexes und befinden sich in engem Kontakt zu anderen Komponenten des TOM-Komplexes. Es konnte mit Hilfe von chemischen Quervernetzungsexperimenten gezeigt werden, daß sich Tom6 und Tom7 im TOM-Komplex von Neurospora crassa in direkter räumlicher Nähe zu Tom 40 befinden. Außerdem konnte ein direkter Kontakt zwischen Tom6 und Tom22 nachgewiesen werden, welcher durch Bindung des Präproteins pSu9-DHFR moduliert wird. Ein weiterer Schwerpunkt bei der Charakterisierung von Neurospora crassa Tom6 und Tom7 bestand in der Untersuchung des Imports dieser Proteine in Mitochondrien sowie deren Assemblierung in bereits bestehende TOM-Komplexe. Sowohl Tom6, als auch Tom7 konnten in vitro in Mitochondrien importiert werden und in bereits bestehende TOM-Komplexe assemblieren. Dabei benutzen sie teilweise den generellen Importweg von Präproteinen in Mitochondrien. Der Import von Tom6 umfasst zwei nicht miteinander gekoppelte Schritte. Zunächst findet eine vom Carboxyterminus vermittelte Interaktion mit Komponenten des TOM-Komplexes statt, es folgt die Assemblierung in den TOM-Komplex. Die Assemblierung von Tom6 in den TOM-Komplex setzt eine spezifische Interaktion des aminoterminal an die Transmembrandomäne angrenzenden Bereichs mit anderen TOM-Komponenten voraus. Daneben ist eine Interaktion der Transmembrandomäne von Tom6 mit dem aminoterminal an die Transmembrandomäne angrenzenden Bereich von Tom6 essentiell für die korrekte Assemblierung von Tom6 in den TOM-Komplex. Im Gegensatz zu anderen Außenmembranproteinen kommt bei Neurospora crassa Tom6 positiv geladenen Aminosäuren im an die Transmembrandomäne angrenzenden Bereich keine Bedeutung für den Import zu. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Arbeit bestand in der Untersuchung einiger Aspekte der Bindung des mit Fluoreszenzfarbstoff markierten Präproteins pSu9-DHFR an den isolierten TOM-Komplex unter Anwendung der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie. Die Bindung dieses Präproteins an den TOM-Komplex ist reversibel und wird spezifisch von der Präsequenz vermittelt. Die apparenten Bindungskonstanten betragen 1,3 nM für den TOM-Holokomplex sowie 3,4 nM für den TOM-Core-Komplex. Ein wichtiges Merkmal der Bindung von pSu9-DHFR an den TOM-Komplex sind elektrostatische Wechselwirkungen, da eine Erhöhung der Ionenstärke im Reaktionspuffer eine drastische Verminderung der Bindung zur Folge hatte. Des weiteren geht die Bindung von pSu9-DHFR an den TOM-Komplex einher mit der Entfaltung der DHFR. Eine Verhinderung der Entfaltung der DHFR durch Komplexierung mit Methotrexat führte zu einer stark verminderten Bindung von pSu9-DHFR an den TOM-Komplex.