Podcasts about tom40

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2023.02.03.527057v1?rss=1 Authors: Busto, J. V., Mathar, H., Steiert, C., Schneider, E. F., Straub, S. P., Ellenrieder, L., Song, J., Stiller, S. B., Lübbert, P., Guiard, B., den Brave, F., Schulte, U., Fakler, B., Becker, T., Wiedemann, N. Abstract: The majority of mitochondrial precursor proteins are imported through the Tom40 beta-barrel channel of the translocase of the outer membrane (TOM). The sorting and assembly machinery (SAM) is essential for beta-barrel membrane protein insertion into the outer membrane and thus required for the assembly of the TOM complex. Here we demonstrate that the alpha-helical outer membrane protein Mco6 forms a complex with the mitochondrial distribution and morphology protein Mdm10 as part of the SAM machinery. Moreover, Mco6 also interacts with the subunit Mim1 of the mitochondrial import complex (MIM), which is itself required for the biogenesis of alpha-helical outer membrane proteins. MCO6 and MDM10 display a negative genetic interaction and a MCO6-MDM10 yeast double mutant contains reduced levels of TOM complex. Cells lacking Mco6 affect the levels of Mdm10 and MIM-subunits associated with assembly defects of the TOM complex. Thus, this work reveals a role of the SAM-Mco6 complex for the biogenesis of the mitochondrial outer membrane. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info Podcast created by Paper Player, LLC

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2022.11.30.518502v1?rss=1 Authors: Needs, H. I., Henley, J., Collinson, I. Abstract: Protein import into mitochondria is an intricate and highly conserved process essential for organellar biogenesis, and maintenance of its structure and function. Defects in the import apparatus impact the assembly of the respiratory chain and ATP synthase complexes required for oxidative phosphorylation, compromising the ready supply of ATP to the cell. The consequences of reduced bioenergetic function are particularly severe for cells with high energetic demands such as neurons. However, relatively little is known about howdefectiveimportcontributestoneurodegeneration, or how neurotoxic proteins characteristic ofneurodegenerative diseases impact mitochondrial import efficiency. Here, we used HeLa cells to investigate how expressing high levels of Tau variants affect mitochondrial import activity, morphology, and function. We found that the variant associated with neurodegeneration (TauP301L) colocalises with mitochondria. TauP301L, but not wildtype Tau, interacts with TOM40, the protein-channel component of the outer membrane protein import complex. Interestingly, TauP301L expression had no discernible effect on overall mitochondrial import function, despite associating with TOM40 and altering mitochondrial morphology, suggesting that a rescue mechanism is at play. This rescue could be explained by the appearance of microtubule and actin containing tunnelling nanotubes (TNTs), used to recruit healthy mitochondria from neighbouring cells and/or dispose of mitochondria with aggregated Tau. Furthermore, in primary neuronal cultures TauP301L induces morphological changes that resemble a neurodegeneration like phenotype, and this is mirrored in cells where the import sites are blocked artificially. These results reveal an intriguing link between the production of aggregation prone protein variants, such as Tau, and the mitochondrial protein import machinery relevant to neurodegenerative disease. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info Podcast created by Paper Player, LLC

Alpha-synuclein (α-Syn) accumulation/aggregation and mitochondrial dysfunction play prominent roles in the pathology of Parkinson's disease. We have previously shown that postmortem human dopaminergic neurons from PD brains accumulate high levels of mitochondrial DNA (mtDNA) deletions. We now addressed the question, whether alterations in a component of the mitochondrial import machinery -TOM40- might contribute to the mitochondrial dysfunction and damage in PD. For this purpose, we studied levels of TOM40, mtDNA deletions, oxidative damage, energy production, and complexes of the respiratory chain in brain homogenates as well as in single neurons, using laser-capture-microdissection in transgenic mice overexpressing human wildtype α-Syn. Additionally, we used lentivirus-mediated stereotactic delivery of a component of this import machinery into mouse brain as a novel therapeutic strategy. We report here that TOM40 is significantly reduced in the brain of PD patients and in α-Syn transgenic mice. TOM40 deficits were associated with increased mtDNA deletions and oxidative DNA damage, and with decreased energy production and altered levels of complex I proteins in α-Syn transgenic mice. Lentiviral-mediated overexpression of Tom40 in α-Syn-transgenic mice brains ameliorated energy deficits as well as oxidative burden. Our results suggest that alterations in the mitochondrial protein transport machinery might contribute to mitochondrial impairment in α-Synucleinopathies.

Preface This study is focussed on the structural investigation of large molecular assemblies such as the 26S proteasome and the translocation machinery of the outer mitochondrial membrane. It is divided in two chapters and in both parts the structural and further functional analysis is based on X-ray crystallography. Chapter 1: Structural investigation of Rpn13, the multifunctional adaptor protein of the 26S proteasome The results in chapter 1 reveal that the multifunctional adaptor protein Rpn13 acts as a novel ubiquitin receptor of the 26S proteasome and deliver structural and biophysical details of its interaction with ubiquitin and with other proteasomal subunits. The crystal structure of the ubiquitin binding domain of Rpn13 reveals the molecular architecture of a Pleckstrin Homology (PH) domain and the NMR structure of the complex with ubiquitin shows a novel ubiquitin-binding mode. Additional NMR studies and domain mapping by truncation analysis provide further insights in the domain architecture of Rpn13 and the interaction with its partners Rpn2 and Uch37. Chapter 2: Crystallographic studies of the TOM core complex Chapter 2 presents the purification and crystallization of the mitochondrial protein translocase, the TOM core complex, from Neurospora crassa. Preliminary crystallographic data lead to the determination of space group and cell dimensions. This chapter also describes various experiments to improve the diffraction quality of the crystals and the co-crystallization of TOM core complex with specific monoclonal antibody fragments. Furthermore, expression and refolding of the main component Tom40 is raised as an alternative approach in structural investigation of the TOM complex.

The translocase of the outer mitochondrial membrane (TOM complex) is the general entry site for newly synthesized proteins into the organelle. The translocase is a multi-subunit complex composed of seven subunits: two receptor proteins, Tom70 and Tom20, and five components which form the core complex, Tom40, Tom22, Tom7, Tom6, and Tom5. In this thesis it is shown that Mim1 is required for the integration of the import receptor Tom20 into the outer membrane but not for its assembly into the TOM complex. Structural characteristics of Mim1 required for its function were studied in detail. Mim1 forms homooligomeric structures via its transmembrane segment which contains two helix-dimerization GXXXG/A motifs. The homooligomerization is a precondition for the function of Mim1 in mediating the integration of Tom20 into the mitochondrial outer membrane.

The mitochondrial outer membrane harbors different sub-classes of proteins that mediate numerous interactions between the mitochondrial metabolic and genetic system and the rest of the eukaryotic cell. Two classes of these proteins were investigated in this thesis. The first class, tail-anchored proteins, exposes a large domain to the cytosol and is anchored to the membrane by a single hydrophobic segment close to the C-terminus. This segment is usually flanked by positively–charged amino acids residues. In the first part of my study I could identify that the tail anchor domain fulfills four distinct functions: First, the tail anchor domain mediates the targeting to mitochondria in a process that probably requires the positive charges down stream the transmembrane segment. Second, the domain facilitates the insertion into the outer membrane. Third, the tail anchor domain is required for assembly of the proteins into the relevant complexes. Finally, it can stabilize such complexes. In the second part of my study I investigated the biogenesis of β-barrel proteins. These membrane proteins are unique for the outer membrane of mitochondria, chloroplast and gram-negative bacteria. Recently a complex which mediates the biogenesis of β-barrel proteins was identified and termed TOB (SAM) complex. At the beginning of this work, the TOB complex was known to consist of the peripheral associated membrane protein Mas37 and the essential membrane embedded component Tob55. Initially, we could identify Tob38 as a new component of the TOB complex. Tob38 is encoded by an essential gene and the protein associates with the TOB complex at the cytosolic side of mitochondria. It interacts with Mas37 and Tob55 and is associated with Tob55 even in the absence of Mas37. The Tob38–Tob55 core complex binds precursors of β-barrel proteins and facilitates their insertion into the outer membrane. The import of β-barrel precursors into Tob38-depleted mitochondria was demonstrated here to be dramatically reduced in comparison to wild type organelles. Notably, such an effect was not observed for other precursors of the outer membrane proteins and precursors distained to the various sub-mitochondrial compartments. Taken together, we conclude that Tob38 has a crucial function in the biogenesis of β-barrel proteins of mitochondria. Next, the import and the assembly pathways of Mas37 and Tob55 were analyzed in detail. Reduced insertion of the Tob55 precursor in the absence of Tom20 and Tom70 argues for initial recognition of the precursor of Tob55 by the import receptors. It is then transferred through the import channel formed by Tom40. Variants of the latter protein influenced the insertion of Tob55. Assembly of newly synthesized Tob55 into pre-existing TOB complexes, as analyzed by blue native gel electrophoresis, depended on pre-existing Tob55 and Tob38 but to a less extent on Mas37. In contrast, both the association of Mas37 precursor with mitochondria and its assembly into the TOB complex were not affected by mutation in the TOM complex. My results suggest that Mas37 assembled directly with the TOB core complex. Hence, the biogenesis of Mas37 represents a novel import pathway of mitochondrial proteins. Finally, the structure function relationships of Tob55 were investigated by combination of biochemical and genetic approaches. Tob55 exposes an N-terminal hydrophilic domain into the intermembrane space and is anchored in the outer membrane by its C-terminal β-barrel domain. Deletion of various lengths at the N-terminal domain did not affect the targeting of Tob55 precursor to mitochondria and its insertion into the outer membrane. Replacement of wild type Tob55 by these deletion variants resulted in reduced growth of cells. Mitochondria isolated from such cells contain reduced levels of β-barrel proteins and are impaired in their capacity to import newly synthesized β-barrel precursors. Finally, purified N-terminal domain of Tob55 was found to be able to bind β-barrel precursors in a specific manner. Taken together, these results demonstrate that the N-terminal domain of Tob55 has a function in recognizing precursors of β-barrel proteins. Furthermore, the receptor-like function of the N-terminal domain of Tob55 seems to have a role in coupling the translocation of β-barrel precursors across the TOM complex to their interaction with the TOB complex.

Die Translokase der mitochondrialen Außenmembran TOM-Komplex erkennt alle in Mitochondrien zu importierenden Proteine und vermittelt den Transfer in oder über die Membran. Der Mechanismus der Translokation ist allerdings bisher nur teilweise verstanden. Strukturelle Informationen über den TOM-Komplex können Fragen nach den Detailschritten beantworten helfen. Aus dem Schimmelpilz Neurospora crassa wurde der TOM-Komplex so aufgereinigt, dass Ausbeute und Reinheit strukturelle Untersuchungen mittels Proteinkristallographie ermöglichten. Kristalle des TOM-Komplexes wurden gewonnen und Beugungsexperimente durchgeführt. Die Auflösung der erhaltenen Kristalle des TOM-Komplexes war nicht ausreichend, um Aussagen über die Raumgruppe oder den strukturellen Aufbau des Komplexes treffen zu können. Deshalb wurde das Reinigungsverfahren weiter optimiert sowie eine Reihe von Mutanten des TOM-Komplexes untersucht. Bisher konnte jedoch keine Verbesserung der Beugungsdaten erreicht werden. Zu Beginn dieser Arbeit waren vier Untereinheiten des TOM-Core-Komplexes von N. crassa bekannt: Tom40, Tom22, Tom7 und Tom6. Im ansonsten vergleichbar aufgebauten TOM-Core-Komplex von S. cerevisiae war noch eine weitere Komponente Tom5 beschrieben worden. Daher wurde im Vorfeld der Kristallisationsexperimente die Zusammensetzung des N. crassa TOM-Komplexes massenspektrometrisch analysiert, wobei Tom5 als eine weitere Tom-Untereinheit in N. crassa identifiziert werden konnte. Aufgrund von Experimenten mit S. cerevisiae wurde eine Rolle des Tom5 im Proteinimport in Mitochondrien postuliert. Im Gegensatz hierzu hatte Tom5 in N. crassa keinen Einfluß auf den Proteinimport. Auch auf die Assemblierung des TOM-Komplexes und das Wachstum der Zellen wirkte sich eine Deletion von Tom5 in N. crassa nicht negativ aus. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen allerdings eine solche Funktion auch in Hefe als fraglich erscheinen. Vielmehr deuten die hier vorgelegten Befunde auf eine strukturelle Funktion von Tom5 bei der Stabilisierung des TOM-Komplexes hin. Um weitere neue Komponenten des Import- und Assemblierungsapparates der mitochondrialen Außenmembran zu finden, wurde eine massenspektrometrische Analyse der Proteine von isolierten Außenmembranvesikeln aus N. crassa durchgeführt. Hierbei wurde Mim1 als bisher unbekanntes Außenmembranprotein identifiziert. Mim1 liegt in einem 300 kDa-Komplex vor und es wurde eine essentielle Funktion von Mim1 bei der Assemblierung des TOM-Komplexes nachgewiesen.

Die mitochondriale Außenmembran beherbergt eine Vielzahl an Proteinen, die anhand ihrer Topologie in unterschiedliche Klassen eingeteilt werden können. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Biogenese von zwei Klassen untersucht. Die erste besitzt eine hydrophile cytosolische Domäne und ist über eine Transmembrandomäne im N-terminalen Bereich in der Membran verankert. Dieser N-terminale Bereich enthält die Signalsequenz dieser Proteine und dient gleichzeitig als Membrananker, weshalb er als Signal-Anker-Domäne bezeichnet wird. Zu dieser Proteinklasse gehören die beiden Rezeptorkomponenten des TOM-Komplexes, Tom20 und Tom70, und in S. cerevisiae das Protein OM45 mit bisher unbekannter Funktion. Zur Bestimmung der Bedeutung der Signal-Anker-Domäne für die Funktion des jeweiligen Proteins bzw. zur strukturellen und funktionellen Charakterisierung dieses Sequenzabschnittes wurde ein Komplementationsansatz benutzt. Damit konnte gezeigt werden, dass die Signal-Anker-Domänen mitochondrialer Außenmembranproteine funktionell austauschbar sind. Folglich spielen sie für die spezifische Funktion des Proteins nur eine untergeordnete Rolle, sind allerdings für den Transport zu den Mitochondrien und für die Verankerung in der Außenmembran von entscheidender Bedeutung. Des Weiteren konnte ich die strukturellen Elemente bestimmen, die zusammen mit der Ankerdomäne das topogene Signal bilden. Eine moderate Hydrophobizität der Transmembrandomäne scheint am wichtigsten zu sein, um diese Proteine zu Mitochondrien zu dirigieren. Eine positive Nettoladung in beiden flankierenden Regionen der Transmembrandomäne erhöht die Effizienz des Transports zu den Mitochondrien und die Membraneinbaurate, ist aber keine essenzielle strukturelle Eigenschaft dieses Signals. Zusätzlich zur Charakterisierung der Signal-Anker-Domänen wurde der Importmechanismus dieser Proteinklasse untersucht. Dieser ist gemäß unserer Ergebnisse nicht von den bekannten Importrezeptoren, Tom20 und Tom70, abhängig, benötigt aber sehr wohl die zentrale Tom-Komponente Tom40. Im Gegensatz zu Vorstufen von Proteinen interner mitochondrialer Kompartimente und von beta-Barrel-Proteinen der Außenmembran scheinen die Vorstufen von Proteinen mit einer Signal-Anker-Domäne nicht über den von Tom40 gebildeten Kanal importiert zu werden. Höchstwahrscheinlich werden diese Proteine durch andere Teile von Tom40 erkannt und anschließend an der Protein-Lipid-Interphase in die Membran eingebaut. Die zweite untersuchte Proteinklasse der mitochondrialen Außenmembran sind die beta-Barrel-Proteine, welche über mehrere antiparallele beta-Faltblätter in der Membran verankert sind. Diese Proteine sind neben Mitochondrien in der Außenmembran von Chloroplasten und gram-negativen Bakterien zu finden. Zu Beginn dieser Arbeit war wenig über die Biogenese mitochondrialer beta-Barrel-Proteine bekannt. Wir konnten zeigen, dass diese Proteinklasse über einen evolutionär konservierten Weg in Mitochondrien importiert wird. Beta-Barrel-Proteine werden zunächst mit Hilfe des TOM-Komplexes zur Intermembranraumseite transportiert. Von dort werden sie durch einen zweiten oligomeren Proteinkomplex, den TOB-Komplex, in die Außenmembran eingebaut. Als erste Tob-Komponente konnten wir das essenzielle Protein Tob55 identifizieren und charakterisieren. Es kann eine Pore in Lipidmembranen bilden und könnte folglich für die Insertion der beta-Barrel-Vorstufen in die Außenmembran verantwortlich sein. Mas37 wurde ebenfalls als Bestandteil dieses Komplexes beschrieben. Auf der Suche nach weiteren Komponenten konnte ich Tob38 mit Tob55 zusammen reinigen. Tob38 ist wie Tob55 essenziell für das Wachstum von Hefezellen und für die Funktion des TOB-Komplexes. Es ist auf der Oberfläche der mitochondrialen Außenmembran lokalisiert. Tob38 interagiert mit Mas37 und Tob55 und ist auch in Abwesenheit von Mas37 mit Tob55 assoziiert. Der Tob38-Tob55 Kernkomplex bindet Vorstufen von beta-Barrel-Proteinen und ermöglicht deren Einbau in die Außenmembran. Die Depletion von Tob38 führt zu stark verringerten Mengen an Tob55 und Mas37 und die verbleibenden Proteine bilden keinen Komplex mehr. Der Import von beta-Barrel-Vorstufenproteinen in Tob38-depletierte Mitochondrien ist stark beeinträchtigt, wohingegen andere Außenmembranproteine oder Proteine anderer mitochondrialer Subkompartimente mit gleicher Effizienz wie in Wildtyp-Organellen importiert werden. Demnach besitzt Tob38 eine äußerst wichtige und spezifische Funktion bei der Biogenese von mitochondrialen beta-Barrel-Proteinen. Es könnte für die Stabilität und Assemblierung des TOB-Komplexes notwendig sein oder an der Ausbildung einer transienten Assoziation zwischen dem TOM- und dem TOB-Komplex beteiligt sein und dabei den Transfer von Vorstufenproteinen erleichtern. Andererseits könnte Tob38 auch als Regulator der von Tob55 gebildeten Pore fungieren. Mim1 konnte im Rahmen dieser Arbeit als eine weitere am Import bzw. der Assemblierung des beta-Barrel-Proteins Tom40 beteiligte Komponente charakterisiert werden. Die Depletion von Mim1 führt zu stark verringerten Mengen an assembliertem TOM-Komplex und zur Akkumulation von Tom40 als niedermolekulare Spezies. Wie alle mitochondrialen beta-Barrel-Proteine werden die Vorstufen von Tom40 durch den TOB-Komplex in die Außenmembran eingebaut. Mim1 wird höchstwahrscheinlich nach diesem TOB-abhängigen Schritt benötigt. Aufgrund der starken Konservierung im Bereich des Transmembransegments von Mim1 beim Vergleich der Proteinsequenzen verschiedener Pilze könnte das Protein als eine Art Membran-Chaperon fungieren. Dabei könnte Mim1 notwendig sein, um nicht oder teilweise assembliertes Tom40 in einer kompetenten Form für die Assemblierung mit den kleinen Tom-Proteinen und mit Tom22 zu halten. Mim1 ist weder eine Komponente des TOM-Komplexes noch des TOB-Komplexes, sondern scheint vielmehr Bestandteil eines weiteren, bisher nicht charakterisierten Komplexes zu sein. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass Mim1 eine spezifische und unverzichtbare Rolle bei der Assemblierung des TOM-Komplexes spielt.

Im Rahmen dieser Arbeit konnte in Saccharomyces cerevisiae ein neuer Translokationsapparat der mitochondrialen Außenmembran identifiziert werden, der TOB-Komplex (topogenesis of mitochondrial outer membrane beta-barrel proteins). Dieser wird für den Import und die Insertion von mitochondrialen beta-Barrel-Proteinen, wie Porin und Tom40, benötigt. In Eukaryoten kommen beta-Barrel-Membranproteine nur in der Außenmembran von Mitochondrien und Chloroplasten vor; in Prokaryoten nur in der Außenmembran von Gram-negativen Bakterien. Die essenzielle Untereinheit des TOB-Komplexes ist Tob55, das in allen eukaryotischen Genomen präsent ist, aber auch in allen Gram-negativen Bakterien Homologe aufweist. Der TOB-Komplex weist eine molekulare Masse von 220-250 kDa auf und enthält neben Tob55 das nicht-essenzielle Protein Mas37. Dieses ist als peripheres Membranprotein auf der Außenseite der Außenmembran lokalisiert. Die Funktion von Mas37 ist unklar, eine stabilisierende Wirkung auf den TOB-Komplex erscheint möglich. Der TOB-Komplex enthält einen ionenleitenden Kanal. Elektronenmikroskopische Aufnahmen weisen zylindrische Partikel mit einem Durchmesser von 15 nm auf, die eine Kavität von 7-8 nm Durchmesser enthalten. Zusätzlich scheint diese eine zentrale Masse zu enthalten, die möglicherweise von der löslichen N-terminalen Domäne von Tob55 gebildet wird. Diese könnte eine Funktion bei der Regulation des Kanalzugangs ausüben. Tob55 wird von dem offenen Leserahmen YNL026w kodiert und ist ein integrales beta-Barrel-Außenmembranprotein. Die N-terminale Domäne ist im Intermembranraum lokalisiert, während der C-terminale Bereich die membranintegrierte beta-Barrel-Struktur ausbildet. Tob55 ist ein essenzielles Protein für S. cerevisiae und ist somit neben Tom40 das zweite essenzielle Außenmembranprotein. Depletion von Tob55 in vivo führt zum spezifischen Verlust der mitochondrialen beta-Barrel-Membranproteine Porin, Tom40 und Mdm10. Mdm10 konnte als neues mitochondriales beta-Barrel-Protein identifiziert werden. Außenmembranproteine die durch alpha-Helices verankert sind, waren bei der Depletion von Tob55 nicht beeinträchtigt. Tob55 ist für den Import der beta-Barrel-Membranproteine essenziell. Es interagiert mit frühen Importintermediaten der beta-Barrel-Vorstufen, nicht jedoch mit assemblierten beta-Barrel-Proteinen. Vor Interaktion mit Tob55 müssen die beta-Barrel-Vorstufen zuvor mittels des TOM-Komplexes die Außenmembran überqueren. Interaktion der TOM-assoziierten beta-Barrel-Vorstufen mit Tob55 ist für die vollständige Translokation über den TOM-Komplex notwendig. Ein lösliches Intermediat im Intermembranraum scheint nicht vorzukommen. Anschließend erfolgt die Tob55-vermittelte Insertion von der Innenseite der Außenmembran in die Lipidschicht. Ob der TOB-Komplex aktiv an der Faltung der beta-Barrel-Vorstufen in eine insertionskompetente Konformation beteiligt ist oder die Ausbildung der beta-Barrel-Struktur innerhalb der TOB-Kavität stattfindet, ist bisher nicht bekannt. Da Mitochondrien von einem endosymbiotischen bakteriellen Vorläufer abstammen, haben sich offenbar essenzielle Elemente des Biogeneseapparates von beta-Barrel-Membranproteinen während der Evolution erhalten.

The TOM complex, a multisubunit assembly in the mitochondrial outer membrane, mediates targeting and membrane translocation of virtually all nuclear-encoded mitochondrial preproteins analyzed so far. In the present study the mechanisms by which the TOM complex recognizes different precursor proteins and translocates them across the outer membrane were investigated. In a first part of study the isolated TOM complex was analyzed for its ability to interact with preproteins with N-terminal targeting signals. The TOM translocase was found to bind precursor proteins efficiently in a specific manner in the absence of chaperones and lipids in a bilayer structure. Following the initial binding, the presequence was transferred into the translocation pore in a step that required unfolding of the mature part of the preprotein. This translocation step was mediated also by protease-treated TOM holo complex that contains almost exclusively Tom40. The TOM core complex consisting of Tom40, Tom22, Tom5, Tom6 and Tom7 represents a molecular machine that can recognize and partially translocate mitochondrial precursor proteins. In a second part of study the interaction of BCS1 precursor with the TOM complex was investigated. BCS1 belongs to the group of proteins with internal, non-cleavable import signals. The information for import and intramitochondrial sorting of BCS1 was localized to the region consisting of amino acid residues 1-126. Three sequence elements were identified in this region: (i) a transmembrane domain (amino acid residues 45-68), (ii) a presequence-like helix (residues 69-83), and (iii) an import-auxiliary sequence (residues 84-126). The contribution of each of these elements to import was studied. The transmembrane domain was found not to be required for stable binding to the TOM complex. The Tom receptors (Tom70, Tom22 and Tom20), as determined by peptide scan analysis, had no affinity for peptides corresponding to the transmembrane domain. They did interact with the presequence-like helix, yet the highest binding was to the region covering residues 92-126. This latter region represents a novel type of signal with targeting and sorting function. It is recognized by all three known mitochondrial import receptors demonstrating their capacity to decode various targeting signals. The results of the present study suggest that the BCS1 precursor crosses the TOM complex as a loop structure. This is in contrast to preproteins with cleavable presequences which enter the TOM complex in a linear fashion with the N-terminal first. Once the precursor emerges from the TOM complex, all three structural elements are essential for the intramitochondrial sorting to the inner membrane.

Proteolytische Prozesse spielen eine wichtige Rolle während der Biogenese von Mitochondrien und bei der Qualitätskontrolle mitochondrialer Proteine. In der vorliegenden Arbeit wurde der Abbau von Proteinen in der Innen- und Außenmembran von Mitochondrien aus Saccharomyces cerevisiae untersucht. Ein erster Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit Mechanismen der Proteolyse in der mitochondrialen Innenmembran. Dazu wurde der Abbau einer mutanten Variante des polytopischen Membranproteins Oxa1 verfolgt. Es zeigte sich, dass die m-AAA-Protease den Abbau von Oxa1ts vermittelt, während keine Hinweise auf eine Beteiligung der i-AAAProtease erhalten wurden. In Abwesenheit der m-AAA-Protease wird Oxa1ts ebenfalls proteolytisch durch eine (oder mehrere) bislang nicht identifizierte Metallopeptidase(n) gespalten. Allerdings ist kein vollständiger Abbau von Oxa1ts durch diese Peptidase(n) zu beobachten. Vielmehr akkumulieren proteolytische Intermediate in den Mitochondrien. Nach den vorliegenden Untersuchungen kann die endoproteolytische Aktivität der Metallopeptidase(n) entweder eine Vorraussetzung für die Proteolyse durch die m-AAAProtease sein oder aber einen Bestandteil eines molekularen Ersatzsystems zum Abbau von mitochondrialen Innenmembranproteinen in Abwesenheit der m-AAAProtease darstellen. Während der Proteolyse durch AAA-Proteasen wird eine Dislokation von Membranproteinen beobachtet. Daher wurde eine mögliche Beteiligung von Translokationsporen der Innenmembran an Abbauvorgängen untersucht. Eine Rolle der TIM17/23-Translokase konnte ausgeschlossen werden. Des weiteren konnte auch für die OXA1-Pore keine essentielle Bedeutung für die Dislokation von Membranproteinen während der Proteolyse nachgewiesen werden. Eine Inaktivierung der Proteine Mba1 und Pnt1, die an Insertion von mitochondrialen Proteinen in die Innenmembran beteiligt sind, führte jedoch zu einer Beeinträchtigung von Abbauprozessen in der Innenmembran. Diese Befunde weisen auf eine Rezeptor- oder Chaperon-Funktion von Mba1 und Pnt1 während des Abbaus durch die AAA-Proteasen hin. In einem zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde genetisch und biochemisch nach Komponenten gesucht, die den Abbau von Proteinen der mitochondrialen Außenmembran vermitteln. Ein Fusionsprotein, HA-DHFRWT-Tom6, das eine lösliche entfaltete Domäne in das Cytoplasma exponiert und im TOM-Komplex assembliert ist, wurde als Modellsubstrat verwendet. Während in isolierten Mitochondrien kein Abbau stattfindet, unterliegt das Protein in vivo deutlicher Proteolyse. Dieser Prozess wurde als ATP-abhängig charakterisiert. Eine Beteiligung des vakuolären Proteolyse-Systems, der i-AAA-Protease sowie des Ubiquitin- Proteasom-Abbauweges konnte unter den verwendeten experimentellen Bedingungen ausgeschlossen werden. Zur Identifizierung von Komponenten, die an der Proteolyse von Außenmembranproteinen beteiligt sind, wurde eine genetische Durchmusterung durchgeführt. Eine temperatursensitive Mutante des essentiellen Außenmembranproteins Tom40, das unter nicht-permissiven Bedingungen rasch abgebaut wird, wurde verwendet, um nach stabilisierenden Mutanten zu suchen. Die identifizierten Mutanten unterdrückten zwar den Wachstumsdefekt, führten aber zu keiner Stabilisierung von Tom40ts, weshalb keine am Abbau beteiligten Komponenten identifiziert werden konnten. Allerdings wurde durch die Isolierung eines Suppressors ein Bereich innerhalb des Proteins Tom40 beschrieben, der für die Assemblierung von Tom40 in den TOM-Komplex essentiell ist.

Die Biogenese von Mitochondrien erfordert den Eintransport cytosolisch synthetisierter Vorstufenproteine über die mitochondriale Außenmembran. Der TOM-Komplex in der Außenmembran erkennt die in die Mitochondrien zu importierenden Vorstufenproteine, bindet sie, ermöglicht den Transfer von zumindest Teilen davon über die mitochondriale Außenmembran und die Integration von Membranproteinen in die Außenmembran. Auf der Grundlage bestehender Untersuchungen des TOM-Holo-Komplexes wurden in dieser Arbeit verschiedene Subkomplexe des TOM-Komplexes aus Neurospora crassa isoliert, biochemisch und biophysikalisch charakterisiert. Zudem wurde eine neue Komponente des TOM-Komplexes identifiziert: Tom5, eine kleine Komponente von etwa 5 kDa mit Sequenzhomologie zu Tom5 von Saccharomces cerevisiae. Der in dieser Arbeit isolierte TOM-Core-Komplex besteht aus den Protein-untereinheiten Tom40, Tom22, Tom7, Tom6 und Tom5; gegenüber dem TOM-Holo-Komplex fehlen ihm die Rezeptorkomponenten Tom70 und Tom20. Der TOM-Core-Komplex weist eine Molekülmasse von ca. 400 kDa und eine Stöchimetrie der Komponenten Tom40 : Tom22 : Tom7 : Tom6 von 8 : 4 : 2 : 1-2 auf. Er kann in vitro präsequenzabhängig bis zu 8 Vorstufen-proteine pro Komplex binden. Elektronenmikroskopische Bilder des TOM-Core- Komplexes zeigen eine symmetrische Doppelringstruktur mit zwei durchgehenden Poren von etwa 2,1 nm Durchmesser. Der TOM-Core-Komplex bildet in Übereinstimmung damit Kanäle mit zwei Leitfähigkeits-niveaus, die zwei Poren entsprechen. Die Bevorzugung von Kationen und die Eigenschaft, durch mitochondriale, positiv geladene Präpeptide selektiv und spezifisch inhibiert zu werden, belegen die Rolle des TOM-Core-Komplexes bei der Proteintranslokation. TOM-Core-Komplex, dessen hydrophile Domänen von Tom22 und den kleinen Toms durch limitierte Proteolyse weitgehend abgedaut wurden, zeigte in den durchgeführten Untersuchungen nahezu identische Binde-, Kanal- und Struktureigenschaften wie der unbehandelte Core-Komplex. Die Grundstruktur der Proteintranslokase der mitochondrialen Außenmembran Zusammenfassung - 132 - kann somit hinreichend durch Tom40 und die membrandurchspannenden Domänen von Tom22, Tom7, Tom6 und Tom5 stabil gebildet werden. Weiterführende Experimente mit isoliertem Tom40 bestätigten dies. So bildet isoliertes Tom40 oligomere Strukturen mit einer mittleren Molekülmasse von ca. 350 kDa. Tom40 zeigte sich in Transmissions-EM-Bildern überwiegend als Einlochpartikel. In Übereinstimmung hiermit weisen die vom Tom40- Komplex gebildeten Kanäle eine Leitfähigkeit von nur der Hälfte der Leitfähigkeit des TOM-Core-Komplexes mit zwei Poren auf. Ein kleiner Teil des isolierten Tom40 bildet Zweilochpartikel. Tom40 ist also in der Lage, die Grundstruktur des TOM-Komplexes zu bilden, wie sie für den TOM-Core-Komplex gefunden wurde. Infrarot- und Circulardichroismus-Spektren von isoliertem Tom40 führen zu dem Schluß, daß ein einzelnes Tom40-Protomer keinen Kanal mit β -Barrel-Struktur bilden kann, sondern daß dazu mehrere Tom40 zusammenwirken müssen.