Podcasts about proteolyse

Vielversprechende Therapieansätze für die Alzheimer Erkrankung basieren auf der Amyloid-Hypothese und beinhalten die Inhibition der β-Sekretase BACE1 und des γ-Sekretase-Komplexes sowie die Aktivierung der α-Sekretase ADAM10. Für die Einschätzung und Minimierung von Nebenwirkungsprofilen ist die Kenntnis weiterer Substrate dieser Sekretasen essentiell. Als ein solches Substrat wurde Typ I Neuregulin1-β (Typ I NRG1-β), ein Mitglied der EGF-Familie von Wachstumsfaktoren, vermutet. In der vorliegenden Arbeit konnte in vitro gezeigt werden, dass Typ I NRG1-β ein Substrat für den γ-Sekretase-Komplex darstellt. Nach erfolgtem Shedding von Typ I NRG1-β katalysiert der γ-Sekretase-Komplex die intramembranäre Proteolyse durch einen Schnitt innerhalb der Transmembrandomäne. Ferner konnte in vitro gezeigt werden, dass BACE1 das Shedding der Isoformen Typ I NRG1-β1 und Typ I NRG1-β4 katalysiert, wobei die β1-Isoform das bevorzugte Substrat von BACE1 darstellt. Typ I NRG1-β2 wird dagegen nicht oder nur in sehr geringem Ausmaß durch BACE1 prozessiert. Für die β1-Isoform wurde die BACE1-Schnittstelle innerhalb der juxtamembranären Region zwischen der Aminosäure-Position Glu236-Phe237 und Met238-Glu239 (EF-ME) von humanem Typ I NRG1-β1 charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass diese Schnittstelle spezifisch für BACE1 ist und dass keine weiteren BACE1-Schnittstellen innerhalb der juxtamembranären Region von Typ I NRG1-β1 existieren. Neben BACE1 wird das Shedding der β1-Isoform durch α-Sekretasen katalysiert, wobei das Shedding der β1-Isoform hauptsächlich durch ADAM10 erfolgt. Im Gegensatz zur β1-Isoform werden die Isoformen β2 und β4 nicht durch ADAM10 geschnitten. Für die β2-Isoform konnte jedoch ein Shedding durch andere α-Sekretasen in vitro nachgewiesen werden. Die vorliegenden Ergebnisse ermöglichen allerdings keine Aussage dazu, um welche spezifischen α-Sekretasen es sich handelt. Für α-Sekretasen wird kontrovers eine fehlende Schnittstellen-Sequenzspezifität diskutiert. Vermutlich sind für die Substraterkennung neben einer spezifischen Schnittstellensequenz weitere Faktoren von Bedeutung. So konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Länge der juxtamembranären Region von Typ I NRG1-β einen entscheidenden Einfluss auf das Shedding durch α-Sekretasen hat. Dabei stellen die Isoformen mit einer kürzeren juxtamembranären Region das bevorzugte Substrat für α-Sekretasen dar. Diese Arbeit zeigt, dass Typ I NRG1-β ein Substrat von allen drei Sekretasen ist, die vielversprechende Therapieansatzpunkte in der Alzheimertherapie darstellen. Durch die Beeinflussung der Aktivität dieser Sekretasen wird somit auch die Proteolyse von Typ NRG1-β beeinflusst und damit letztendlich auch die physiologischen Funktionen von Typ NRG1-β. Im Hinblick auf daraus resultierende Nebenwirkungen ist es daher essentiell, die physiologische Bedeutung der Sekretasen ADAM10, BACE1 und des γ-Sekretase-Komplexes bezüglich der Funktionen von Typ NRG1-β weiter zu analysieren.

Die Alzheimer-Krankheit (AD), die häufigste Form der Demenz, manifestiert sich klinisch meist ab dem 65. Lebensjahr mit langsam progredienten Gedächtnis-, Orientierungs- und Aufmerksamkeitsstörungen. Neuropathologische Korrelate sind die Amyloid-Plaques, die hauptsächlich aus extrazellulären Aggregaten des β-Amyloid-Proteins (Aβ) zusammengesetzt sind, und intrazelluläre neurofibrilläre Bündel, die aus Aggregaten des mikrotubulus-assoziierten Proteins Tau bestehen. Der „Auslöser“ der Alzheimer-Krankheit ist das β-Amyloid-Protein (Amyloid-Kaskaden-Hypothese), welches durch proteolytische Prozessierung von βAPP (β-Amyloid-Vorläufer-Protein) entsteht. Dies geschieht, indem zuerst BACE-1 (β-site APP cleaving enzyme 1) und anschließend der γ-Sekretase-Komplex βAPP schneiden. Menschen mit Down-Syndrom (DS), welches die häufigste autosomale Chromosomenaberration darstellt, entwickeln bereits ab einem Alter von 40 Jahren die typischen neuropathologischen Kennzeichen der Alzheimer-Krankheit und zeigen mit einem Durchschnittsalter von 56 Jahren die klinischen Symptome der Demenz. Die Gründe für das frühe Auftreten der Amyloid-Plaques sind noch nicht vollständig geklärt. Das Gen für βAPP befindet sich auf dem Chromosom 21, welches im DS dreifach vorhanden ist, und wird daher mit der frühen Plaque-Pathologie im Down-Syndrom in Zusammenhang gebracht. BACE-1 konnte durch Überexpressions- und Knock-out-Experimente eindeutig als alleinige β-Sekretase identifiziert werden. In Gehirnen von Alzheimer-Demenz-Patienten konnten im Vergleich zu Kontrollgehirnen erhöhte BACE-1-Proteinmengen und BACE-1-Aktivitäten nachgewiesen werden. Es war deshalb interessant zu untersuchen, ob auch im Gehirn von Down-Syndrom-Patienten die BACE-1-Proteinexpression erhöht ist. Durch eine Hochregulation von BACE-1 im Down-Syndrom könnte vermehrt βAPP prozessiert und somit Aβ gebildet werden. Daher war es das Ziel der vorliegenden Arbeit die Expression von BACE-1 in Gehirnen (Temporal- und Frontallappen) von DS-Patienten im Vergleich zu Kontrollgehirnen zu analysieren. In der Western-Blot-Analyse der Gewebeproben konnte gezeigt werden, dass die BACE-1-Proteinmengen im Down-Syndrom im Vergleich zu den Kontrollen (K) 1,4-fach erhöht waren. Die Proteinexpressionen von βAPP zeigten sich im DS im Vergleich zu den Kontrollen 1,4-fach erhöht. Diese Ergebnisse erzielten keine Signifikanz, zeigten aber deutliche Trends im Expressionsverhalten. Dies könnte auf die Anzahl der untersuchten Gehirne (Temporal- und Frontallappen je 3 DS, 4 AD und 5 K), Qualitätsmängel der Gehirnproben oder einer ungleichen Verteilung der Proteinexpression im Gewebe zurückzuführen sein. Es ist daher notwendig mehr Gehirne zu untersuchen. Zudem wäre es interessant in Gehirnschnitten das Verteilungsmuster der BACE-1-Expression im DS genauer zu studieren. Die Ergebnisse deuten jedoch auf eine Hochregulation von BACE-1 im DS-Gehirn und somit auf eine Beteiligung der Protease an der Plaquepathologie des Down-Syndroms hin. BACE-1 scheint also sowohl in der Pathogenese der Alzheimer-Demenz als auch in der des Down-Syndroms eine zentrale Rolle einzunehmen. Daher ist es sehr interessant die Regulation von BACE-1 weiter zu analysieren. Da in p25-überexprimierenden Mäusen erhöhte BACE-1-Proteinexpressionen gezeigt werden konnten, vermutete man eine Beteiligung von p25 an der Regulation der β-Sekretase. p25, das im Gehirn der AD-Patienten vermehrt gebildet wird und aus der Proteolyse von p35 entsteht, bindet und aktiviert die Kinase cdk5. cdk5 phosphoryliert unter anderem das Tau-Protein und wird daher mit der Bildung der neurofibrillären Bündel in Zusammenhang gebracht. Durch die Hochregulation von BACE-1 könnte p25 in der Pathogenese der Alzheimer-Erkrankung eine neue Bedeutung zugeschrieben werden. Zur Analyse der p25 induzierten Veränderungen in den Neuronen wurden humane Neuroblastomazellen mit einem induzierbaren p25-Expressionsvektor, Sp25-Zellen, verwendet. In diesen p25-überexprimierenden Zellen konnten sowohl in der Western-Blot-Analyse als auch in der BACE-1-Aktivitätsmessung erhöhte BACE-1-Proteinexpressionen bzw. BACE-1-Aktivitäten gezeigt werden. Die Northern-Blot-Analyse der Sp25-Zellen ergab erhöhte BACE-1-mRNA-Spiegel, die sich jedoch in einer für endogene BACE-1-mRNA untypische Größe detektieren ließen. p35, das membrangebundene Vorläufer-Protein von p25, war indes nicht in der Lage die BACE-1-Proteinexpression in humanen Neuroblastomazellen zu erhöhen. Die Ergebnisse der Sp25-Zellen konnten in p25-überexprimierenden murinen Neuroblastomazellen, Np25-Zellen, nicht reproduziert werden. Daher ist es notwendig, den p25-induzierten BACE-1-Regulationsmechanismus auf seine Reproduzierbarkeit, z.B. in weiteren In-vivo-Modellen, zu überprüfen.

Cathepsine sind lysosomale Cysteinproteasen, die neben der allgemeinen Proteindegradation in Lysosomen auch spezifische Funktionen ausüben, die eine limitierte Proteolyse erfordern. Zudem werden Cathepsine sezerniert, weshalb man sie auch im Extrazellulärraum findet, wo sie ebenfalls an verschiedenen biologischen Vorgängen, wie etwa der Zellmigration/Invasion, teilnehmen. Über Cathepsin X, einen relativ neu entdeckten Vertreter dieser Proteinklasse, war zu Beginn der Promotionsarbeit noch wenig bekannt. Die Struktur und das Aktivitätsprofil konnten zwar bereits gelöst werden, über mögliche (patho-)physiologische Funktionen gab es jedoch noch keine Erkenntnisse. Das Hauptziel meiner Untersuchungen war daher, mittels geeigneter Methoden nähere Aufschlüsse über die Rolle von Cathepsin X oder seiner Proform innerhalb und außerhalb der Zelle zu erlangen. Dies sollte vorwiegend durch die Analyse der Expression und Sekretion dieser Protease, sowie durch das Auffinden von Interaktionspartnern erfolgen. Wie sich in Vorversuchen zeigte, wird Cathepsin X in humanen Leukozyten unterschiedlich stark exprimiert. Da eine hohe Expression insbesondere in Monozyten vorlag, wurde für weitere Analysen das Zellmodell THP-1 eingesetzt, das auch für die Differenzierung zu Makrophagen-ähnlichen Zellen durch Stimulation mit Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) oder all-trans Retinsäure (ATRA) verwendet werden kann. Interessanterweise zeigten diese Agenzien unterschiedliche Auswirkungen auf die Expression und Sekretion von Cathepsin X. So wurde mit PMA eine starke intra- und extrazelluläre Erhöhung der Protease verzeichnet, während mit ATRA das Gegenteil der Fall war. Da eine differenzielle Expression von Cathepsin X in Leukozyten auf eine mögliche Funktion in der Entzündungsantwort hindeutet, schien eine Untersuchung der Wirkung von proinflammatorischen Zytokinen und extrazellulären Matrix (EZM)-Proteinen sinnvoll, weil diese Faktoren ebenfalls die Sekretion von Proteasen beeinflussen können. Die untersuchten Zytokine hatten allerdings keinen Effekt auf die Sekretion von Cathepsin X aus THP-1-Zellen, wohingegen mit dem EZM-Protein Vitronektin eine Verdopplung der Cathepsin-X-Konzentration im Medium beobachtet wurde. In diesem Kontext konnte nachgewiesen werden, dass Vitronektin durch die Interaktion mit dem Zelloberflächenrezeptor Integrin avb3 den Sekretionsapparat der Zelle beeinflusst, wobei offensichtlich das Sequenzmotiv Arginin-Glyzin-Aspartat (RGD), welches in Vitronektin enthalten ist, für diesen Vorgang entscheidend ist. Neben Cathepsin X wurde auch für die Cathepsine B und L eine erhöhte Freisetzung nach Inkubation mit Vitronektin gemessen, was zeigt, dass dieser durch das EZM-Protein ausgelöste Mechanismus nicht auf Cathepsin X beschränkt ist. Umgekehrt ließ sich in einem weiteren Zellmodell (HUVEC) durch den Einsatz von „small-interfering RNA“ (siRNA) die Expression von Cathepsin X erniedrigen, was zu einer verminderten Migration der HUVEC in einem Invasionsversuch führte. Dies deutet auf eine Funktion von Cathepsin X in der Zellmotilität hin. Weil Cathepsin X, ähnlich wie Vitronektin, ein exponiertes RGD-Motiv in seiner Proregion aufweist, sollte nun eine mögliche Interaktion mit Integrinen untersucht werden. Tatsächlich ließ sich eine RGD-abhängige Interaktion von Procathepsin X mit dem Integrin avb3 zeigen. Somit werden in dieser Arbeit zwei wesentliche neue Aspekte in der Regulation der Sekretion und seiner Beteiligung an Migrationsvorgängen gezeigt, wobei die Interaktion von Procathepsin X mit dem Integrin avb3 eine besondere Rolle zu spielen scheint. Ob diese beiden Vorgänge miteinander gekoppelt sind, konnte mit den bisherigen Ergebnissen noch nicht bewiesen werden. Insgesamt deuten die Ergebnisse jedoch darauf hin, dass extrazelluläres (Pro)Cathepsin X neben seiner Rolle als Protease auch nicht-proteolytische Funktionen, beispielsweise als Ligand bestimmter Zelloberflächenstrukturen ausüben kann. Dieser Aspekt könnte im Hinblick auf eine therapeutische Inhibition von Angiogenese und Metastasierung von Tumorzellen durch Antikörper gegen Cathepsin X und/oder Integrine von großem Nutzen sein.

Die autosomal dominante Optikusatrophie ist mit Mutationen in dem Gen OPA1 assoziiert. OPA1 kodiert eine konservierte mitochondriale Dynamin-ähnliche GTPase. Das Ortholog von OPA1 in S. cerevisiae ist Mgm1. Mgm1 liegt im Intermembranraum der Mitochondrien assoziiert mit der Innenmembran in zwei Proteinisoformen vor: der langen (l-Mgm1) und der kurzen Isoform (s-Mgm1). Beide Isoformen sind für den Erhalt der mitochondrialen Morphologie und der mitochondrialen DNA erforderlich. l-Mgm1 wird von der mitochondrialen Rhomboidprotease Pcp1 durch limitierte N-terminale Proteolyse in s-Mgm1 umgesetzt. OPA1 ist ebenfalls für den Erhalt normaler mitochondrialer Morphologie in Säugetierzellen erforderlich. Zusätzlich reguliert es die Freisetzung von Cytochrom c während der Apoptose. Insgesamt acht Transkriptionsvarianten von OPA1 sind bekannt, die durch alternatives Spleißen der N-terminal gelegenen Exons 4, 4b und 5b entstehen. Auf Proteinebene ließen sich bis zu fünf OPA1-Proteinisoformen unterschiedlicher Größe voneinander abgrenzen. Die Proteinisoformen liegen zum einen Teil membranverankert in der Innenmembran und zum anderen Teil peripher mit der Innenmembran assoziiert im Intermembranraum der Mitochondrien vor. Die vorliegende Dissertation beschäftigt sich mit der Biogenese der verschiedenen OPA1-Proteinisoformen. Hierzu wurden OPA1-Transkriptionsvarianten in Hefe heterolog exprimiert. OPA1 wird in Hefe ähnlich wie in Säugetierzellen prozessiert. Die Prozessierung erfolgt N-terminal, an mehreren Stellen und schrittweise. Die menschliche mitochondriale Rhomboidprotease PARL kann Pcp1 in der Hefe voll komplementieren, aber weder Pcp1 noch PARL prozessieren OPA1. In PARL-/--Mauszellen wird OPA1 normal prozessiert. In der Hefe ist die Prozessierung von OPA1 von den Untereinheiten Yta10 und Yta12 der mitochondrialen AAA-Protease der Matrix (m-AAA-Protease) abhängig. Durch Expression der Untereinheiten der menschlichen m-AAA-Protease, Paraplegin und AFG3L2, lässt sich die Prozessierung von OPA1 in yta10yta12 rekonstituieren. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Biogenese von Mgm1/OPA1 nicht vollständig von der Hefe bis zu Säugetieren konserviert ist. Der Austausch der prozessierenden Protease könnte in Verbindung mit einem Mechanismus zur Qualitätssicherung der Mitochondrien in Metazoa stehen.

Die Familie der Sorting Nexine (SNX) umfasst 33 bekannte Mitglieder, jedoch ist der Funktionsmechanismus vieler Sorting Nexine bislang nicht aufgeklärt. Auf der Suche neuer Modulatoren der βAPP-Proteolyse konnte im Rahmen eines Expressionsklonierungs-Screens (Schobel et al., 2006) ein bislang nicht beschriebenes Protein, Sorting Nexin 33 (SNX33), als Aktivator der βAPP-Proteolyse identifiziert werden. SNX33 ist ein phosphoryliertes Protein, das ubiquitär exprimiert wird und zudem eine hohe Homologie zu den Proteinen SNX9 und SNX18 aufweist. SNX33 ist im Zytosol lokalisiert, kann jedoch auch Membran-assoziiert vorliegen. Es konnte gezeigt werden, dass Überexpression von SNX33 zu einer Inhibition Dynamin-abhängiger Endozytose und in Folge dessen zu einer etwa 50% -igen Reduktion der βAPP-Endozytose führt. Die von SNX33 induzierte Endozytosehemmung wird durch die SH3-Domäne des Proteins vermittelt. Im Rahmen dieser Doktorarbeit durchgeführte Koimmunpräzipitationsstudien zeigten, dass SNX33 mittels seiner SH3-Domäne mit Dynamin interagiert und auf diese Weise möglicherweise dessen Funktion moduliert. In Übereinstimmung mit den durchgeführten Zellkultur-Experimenten führte eine Überexpression von SNX33 im Modellorganismus Caenorhabditis elegans ebenfalls zu einem Dynamin-Funktionsverlust. Da SNX33 Expression zu einer generellen Inhibition Dynamin-abhängiger Endozytose führt, handelt es sich dabei nicht um einen spezifischen βAPP-Modulator. Konsequenz einer reduzierten βAPP-Internalisierung ist eine starke Zunahme der neurotrophen sAPPα-Bildung sowie - je nach verwendeter Zelllinie - ein leichter Anstieg bzw. eine geringe Reduktion der pathogenen sAPPβ-Generierung. Es konnte gezeigt werden, dass Überexpression der homologen Proteine SNX9 und SNX18 ebenfalls zu einer Zunahme der βAPP-Spaltung führt. Es handelt sich also um einen Effekt, der von der ganzen Sorting Nexin-Subgruppe (SNX33/SNX9/SNX18) vermittelt wird. Diese Beobachtung legt die Vermutung nahe, dass diese Funktion innerhalb dieser Subgruppe konserviert ist. Transfektion von SNX1 führte zu keiner Änderung der βAPP-Proteolyse, was bedeutet, dass dieser Effekt nicht von der gesamten Sorting Nexin-Familie vermittelt wird. Interessanterweise ist die Spaltung von βAPP besonders sensitiv bezüglich einer veränderten Endozytose-Rate, da die Proteolyse der Transmembranproteine L-Selektin und des Tumornekrosisfaktor-Rezeptors 2 (TNFR2) unter SNX33 Überexpressionsbedingungen nicht signifikant verändert war. Ein siRNA-vermittelter Knock-Down von SNX33 führte zu keiner generellen Endozytoseinhibition in HEK293 Zellen, es konnte keine veränderte βAPP-Endozytoserate beobachtet werden. Die Bildung von sAPPα- und sAPPβ war in Folge dessen unverändert. Auch ein lst-4/SNX33-Knock-Down in C. elegans führte überraschenderweise zu keiner Inhibition der Dynamin-Funktion, äußerte sich jedoch in einer Fehlfunktion der Insulin-Signaltransduktion. SNX33-Knock-Down in humanen Zellen brachte keine nachweisbare Beeinträchtigung des Insulinsignalweges mit sich, jedoch besteht die Möglichkeit, dass die Homologen SNX9 und SNX18 einen Verlust von SNX33 kompensieren können. Dabei gilt zu beachten, dass eine Funktionsübernahme durch homologe Proteine in C. elegans nicht möglich ist, da dieser Organismus nur ein einziges homologes Protein der SNX33/SNX9/SNX18-Subgruppe besitzt. Im Rahmen dieser Doktorarbeit präsentierten sowie diskutierten Daten zeigen, dass SNX33 in unterschiedliche zellulärer Prozesse involviert ist. SNX33 ist ein neu identifizierter Modulator der Zelle, der für zentrale Signalwege und Vorgänge, wie zum Beispiel der Insulinrezeptor-Signaltransduktion und Endozytose, von Bedeutung ist. Im Gegensatz zum Modellorganismus C. elegans kann im humanen Zellkultursystem ein durch siRNA induzierter Funktionsverlust von SNX33 durch die homologen Proteine SNX9 und SNX18 kompensiert werden.

Plasminogen wird durch verschiedene Proteasen proteolytisch gespalten. Zu den Enzymen, von denen bekannt ist, daß sie Plasminogen an definierten Peptidbindungen prozessieren können, gehören Elastase aus polymorphnukleären Neutrophilen (PMN) und Metallo-Elastase aus Makrophagen. Ein Spaltprodukt ist Miniplasminogen, das die proteolytische Domäne und den Kringel 5 umfaßt. Die Spaltstelle bei Val441 ist charakterisiert und ein Sandwich-ELISA gegen die Neodeterminante ist etabliert. Das dabei entstehende Counterpart besteht aus den Kringeln1-4. Es wird Angiostatin genannt, weil es hemmend auf die Neubildung von Gefäßen wirkt. Im Rahmen dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob Miniplasminogen unter pathologischen Bedingungen wie Sepsis, Peritonitis und Tumorerkrankungen auftritt, um daraus einerseits den Einfluß der Elastase abzuleiten und Einblicke in die pathophysiologischen Abläufe bei Entzündung und Tu-morgeschehen unter Betrachtung der Plasminogenspaltprodukte in Korre-lation zu anderen Parametern zu gewinnen. In Vorversuchen konnte gezeigt werden, daß unter dem Einfluß von aktivierten polymorph-nukleären Neutrophilen Miniplasminogen aus Plas-minogen generiert wird. Von den potentiell an der Proteolyse beteiligten En-zymen konnte in vitro nur bei dem Einsatz von PMN-Elastase Mini-plasminogen nachgewiesen werden, nicht jedoch von MMP-2, -8 und -9. In Untersuchungen zur Stabilität von Miniplasminogen unter verschiedenen Blutabnahmebedingungen waren Citrat-Proben den anderen Systemen (EDTAPlasma, Serum) überlegen. In Proben von gesunden Probanden konnte in keinem Fall Miniplasminogen über der Nachweisgrenze des ELISAs gemessen werden.Es wurden Proben aus klinischen Studien zu Sepsis, Peritonitis und Mammakarzinom ausgewählt, die auf Grund einer hohen PMN-Elastase-Konzentration ein Entstehen von Miniplasminogen erwarten lassen konnten. Ein Ausscheiden von Miniplasminogen über die Niere konnte durch Messungen im Urin ausgeschlossen werden. In Citratplasma-Proben von Peritonitispatienten war kein Miniplasminogen nachweisbar, in Peritonitisexsudaten desselben Patientenkollektivs waren Miniplasminogenwerte bis 90 ng/ml meßbar. Es zeigte sich allerdings keine Korrelation zu anderen Parametern (Elastase-Konzentration, Plasminogenkonzentration). Signifikante Unterschiede der Miniplasminogenkonzentrationen konnten zwischen den Mittelwerten der Proben der Patientengruppe, bei der therapeutisch Fresh-Frozen-Plasma intraabdominell appliziert wurde, und der Kontrollgruppe, sowie zwischen den Gruppen mit und ohne Tumorerkrankung nachgewiesen werden. Bei der Evaluierung von Serumproben aus einem Mammakarzinom-Kollektiv wurden Werte bis 52 ng/ml gemessen. Eine Korrelation mit anderen Parametern oder signifikante Unterschiede in den verschiedenen Subgruppen konnten auch hier nicht gezeigt werden. Ein Zusammenhang zwischen der proteolytischen Kapazität in den Exsudaten und der MPlg-Entstehung ließ sich nicht zweifelsfrei beweisen. MPlg ist daher – im Gegensatz zu dem Elastase-spezifischen Spaltprodukt des Fibrinogens (FEP) (Gippner-Steppert, 1991) - als ein spezifisches Spaltprodukt des Plg nicht für den indirekten Nachweis der proteolytischen Aktivität der PMNElastase geeignet. Erfolgversprechend könnten ggf. immunhistochemische Untersuchungen von Tumormaterial in Hinblick auf das lokale Entstehen von Miniplasminogen sein.

Proteolytische Prozesse spielen eine wichtige Rolle während der Biogenese von Mitochondrien und bei der Qualitätskontrolle mitochondrialer Proteine. In der vorliegenden Arbeit wurde der Abbau von Proteinen in der Innen- und Außenmembran von Mitochondrien aus Saccharomyces cerevisiae untersucht. Ein erster Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit Mechanismen der Proteolyse in der mitochondrialen Innenmembran. Dazu wurde der Abbau einer mutanten Variante des polytopischen Membranproteins Oxa1 verfolgt. Es zeigte sich, dass die m-AAA-Protease den Abbau von Oxa1ts vermittelt, während keine Hinweise auf eine Beteiligung der i-AAAProtease erhalten wurden. In Abwesenheit der m-AAA-Protease wird Oxa1ts ebenfalls proteolytisch durch eine (oder mehrere) bislang nicht identifizierte Metallopeptidase(n) gespalten. Allerdings ist kein vollständiger Abbau von Oxa1ts durch diese Peptidase(n) zu beobachten. Vielmehr akkumulieren proteolytische Intermediate in den Mitochondrien. Nach den vorliegenden Untersuchungen kann die endoproteolytische Aktivität der Metallopeptidase(n) entweder eine Vorraussetzung für die Proteolyse durch die m-AAAProtease sein oder aber einen Bestandteil eines molekularen Ersatzsystems zum Abbau von mitochondrialen Innenmembranproteinen in Abwesenheit der m-AAAProtease darstellen. Während der Proteolyse durch AAA-Proteasen wird eine Dislokation von Membranproteinen beobachtet. Daher wurde eine mögliche Beteiligung von Translokationsporen der Innenmembran an Abbauvorgängen untersucht. Eine Rolle der TIM17/23-Translokase konnte ausgeschlossen werden. Des weiteren konnte auch für die OXA1-Pore keine essentielle Bedeutung für die Dislokation von Membranproteinen während der Proteolyse nachgewiesen werden. Eine Inaktivierung der Proteine Mba1 und Pnt1, die an Insertion von mitochondrialen Proteinen in die Innenmembran beteiligt sind, führte jedoch zu einer Beeinträchtigung von Abbauprozessen in der Innenmembran. Diese Befunde weisen auf eine Rezeptor- oder Chaperon-Funktion von Mba1 und Pnt1 während des Abbaus durch die AAA-Proteasen hin. In einem zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde genetisch und biochemisch nach Komponenten gesucht, die den Abbau von Proteinen der mitochondrialen Außenmembran vermitteln. Ein Fusionsprotein, HA-DHFRWT-Tom6, das eine lösliche entfaltete Domäne in das Cytoplasma exponiert und im TOM-Komplex assembliert ist, wurde als Modellsubstrat verwendet. Während in isolierten Mitochondrien kein Abbau stattfindet, unterliegt das Protein in vivo deutlicher Proteolyse. Dieser Prozess wurde als ATP-abhängig charakterisiert. Eine Beteiligung des vakuolären Proteolyse-Systems, der i-AAA-Protease sowie des Ubiquitin- Proteasom-Abbauweges konnte unter den verwendeten experimentellen Bedingungen ausgeschlossen werden. Zur Identifizierung von Komponenten, die an der Proteolyse von Außenmembranproteinen beteiligt sind, wurde eine genetische Durchmusterung durchgeführt. Eine temperatursensitive Mutante des essentiellen Außenmembranproteins Tom40, das unter nicht-permissiven Bedingungen rasch abgebaut wird, wurde verwendet, um nach stabilisierenden Mutanten zu suchen. Die identifizierten Mutanten unterdrückten zwar den Wachstumsdefekt, führten aber zu keiner Stabilisierung von Tom40ts, weshalb keine am Abbau beteiligten Komponenten identifiziert werden konnten. Allerdings wurde durch die Isolierung eines Suppressors ein Bereich innerhalb des Proteins Tom40 beschrieben, der für die Assemblierung von Tom40 in den TOM-Komplex essentiell ist.

Die Biogenese von Mitochondrien erfordert den Eintransport cytosolisch synthetisierter Vorstufenproteine über die mitochondriale Außenmembran. Der TOM-Komplex in der Außenmembran erkennt die in die Mitochondrien zu importierenden Vorstufenproteine, bindet sie, ermöglicht den Transfer von zumindest Teilen davon über die mitochondriale Außenmembran und die Integration von Membranproteinen in die Außenmembran. Auf der Grundlage bestehender Untersuchungen des TOM-Holo-Komplexes wurden in dieser Arbeit verschiedene Subkomplexe des TOM-Komplexes aus Neurospora crassa isoliert, biochemisch und biophysikalisch charakterisiert. Zudem wurde eine neue Komponente des TOM-Komplexes identifiziert: Tom5, eine kleine Komponente von etwa 5 kDa mit Sequenzhomologie zu Tom5 von Saccharomces cerevisiae. Der in dieser Arbeit isolierte TOM-Core-Komplex besteht aus den Protein-untereinheiten Tom40, Tom22, Tom7, Tom6 und Tom5; gegenüber dem TOM-Holo-Komplex fehlen ihm die Rezeptorkomponenten Tom70 und Tom20. Der TOM-Core-Komplex weist eine Molekülmasse von ca. 400 kDa und eine Stöchimetrie der Komponenten Tom40 : Tom22 : Tom7 : Tom6 von 8 : 4 : 2 : 1-2 auf. Er kann in vitro präsequenzabhängig bis zu 8 Vorstufen-proteine pro Komplex binden. Elektronenmikroskopische Bilder des TOM-Core- Komplexes zeigen eine symmetrische Doppelringstruktur mit zwei durchgehenden Poren von etwa 2,1 nm Durchmesser. Der TOM-Core-Komplex bildet in Übereinstimmung damit Kanäle mit zwei Leitfähigkeits-niveaus, die zwei Poren entsprechen. Die Bevorzugung von Kationen und die Eigenschaft, durch mitochondriale, positiv geladene Präpeptide selektiv und spezifisch inhibiert zu werden, belegen die Rolle des TOM-Core-Komplexes bei der Proteintranslokation. TOM-Core-Komplex, dessen hydrophile Domänen von Tom22 und den kleinen Toms durch limitierte Proteolyse weitgehend abgedaut wurden, zeigte in den durchgeführten Untersuchungen nahezu identische Binde-, Kanal- und Struktureigenschaften wie der unbehandelte Core-Komplex. Die Grundstruktur der Proteintranslokase der mitochondrialen Außenmembran Zusammenfassung - 132 - kann somit hinreichend durch Tom40 und die membrandurchspannenden Domänen von Tom22, Tom7, Tom6 und Tom5 stabil gebildet werden. Weiterführende Experimente mit isoliertem Tom40 bestätigten dies. So bildet isoliertes Tom40 oligomere Strukturen mit einer mittleren Molekülmasse von ca. 350 kDa. Tom40 zeigte sich in Transmissions-EM-Bildern überwiegend als Einlochpartikel. In Übereinstimmung hiermit weisen die vom Tom40- Komplex gebildeten Kanäle eine Leitfähigkeit von nur der Hälfte der Leitfähigkeit des TOM-Core-Komplexes mit zwei Poren auf. Ein kleiner Teil des isolierten Tom40 bildet Zweilochpartikel. Tom40 ist also in der Lage, die Grundstruktur des TOM-Komplexes zu bilden, wie sie für den TOM-Core-Komplex gefunden wurde. Infrarot- und Circulardichroismus-Spektren von isoliertem Tom40 führen zu dem Schluß, daß ein einzelnes Tom40-Protomer keinen Kanal mit β -Barrel-Struktur bilden kann, sondern daß dazu mehrere Tom40 zusammenwirken müssen.

Wed, 1 Jan 1986 12:00:00 +0100 https://epub.ub.uni-muenchen.de/9300/1/9300.pdf Fritz, Hans; Kortmann, H.; Dittmer, H.; Duswald, Karl-Heimo; Jochum, Marianne

Tue, 1 Jan 1985 12:00:00 +0100 https://epub.ub.uni-muenchen.de/9232/1/9232.pdf Fritz, Hans; Jochum, Marianne

Sun, 1 Jan 1984 12:00:00 +0100 https://epub.ub.uni-muenchen.de/9221/1/9221.pdf Kortmann, H.; Dittmer, H.; Duswald, Karl-Heimo; Jochum, Marianne; Fritz, Hans