Podcasts about yersinia spezies

Bisherige Testformate zum Nachweis von Antikörpern gegen enteropathogene Yersinia spp. bei Schweinen konnten lediglich eine Aussage darüber treffen, ob eine Infektion stattgefunden hat, jedoch nicht darüber, welcher der beiden Erreger, Y. enterocolitica bzw. Y. pseudotuberculosis, die Infektion verursachte. Ziel der Arbeit war daher die Entwicklung eines Immunoassays auf Basis der Beadtechnologie, der Serum und Fleischtropfsaft (FTS) von Schlachtschweinen sowohl als positiv bzw. negativ klassifizieren kann, als auch gezielt zwischen Y. enterocolitica und Y. pseudotuberculosis differenziert. 551 Serum- sowie 368 Fleischtropfsaftproben wurden mit dem im Rahmen der Arbeit entwickelten recomBead Yersinia pig Assay (Firma Mikrogen, Neuried, Deutschland), der die rekombinant hergestellten Antigene YopD, YopE, YopH, YopM, YopN, MyfA, PsaA und VAG-A enthält, gegen einen Referenztest, den PIGTYPE® YOPSCREEN ELISA (QIAGEN Leipzig GmbH, Leipzig, Deutschland) auf IgG Antikörper gegen Yersinien getestet. Verglichen mit dem ELISA zeigte der Beadassay im Serum eine Sensitivität von 98,3% und eine Spezifität von 98,4 %. Für FTS lagen Sensitivität und Spezifität bei 93,6 % bzw. 99,0 %. Von 307 im Beadtest positiv getesteten Seren konnten 180 Seren einem Erreger zugeordnet werden; das entspricht einem Prozentsatz von 58,6 %. Dabei handelte es sich um 179 Y. enterocolitica positive Seren sowie ein Y. pseudotuberculosis positives Serum. Beim FTS wurden 164 als positiv getestet, von denen 85 dem Erreger Y. enterocolitica zugeordnet werden konnten, das entspricht einer Differenzierungsquote von 51,8 %. Kein FTS wurde als Y. pseudotuberculosis positiv differenziert. Dies ist die erste Evaluierung eines Testsystems zum Nachweis von Antikörpern gegenüber beiden enteropathogenen Yersinia-Spezies sowie der Fähigkeit einer gleichzeitigen Erregerdifferenzierung. Der entwickelte Beadassay eignet sich zum Nachweis von Antikörpern aus Blut- und Fleischtropfsaftproben von Hausschweinen.

Zusammenfassung Die enteropathogenen Yersinia-Arten Y. enterocolitica und Y. pseudotuberculosis verursachen neben Enteritiden und Enterokolitiden auch extraintestinale Erkrankungen wie reaktive Arthritis oder Erythema nodosum. In ihrem Infektionsverlauf zeigen sich allerdings zwischen diesen beiden Arten Unterschiede. So erfolgt eine Dissemination von Y. pseudotuberculosis meist in Form einer mesenterialen Lymphadenitis, im Falle von Y. enterocolitica hingegen kommt es zusätzlich zum Befall und zur Schädigung der weiter proximal und distal gelegenen Darmabschnitte im Sinne einer Enterokolitis. Bislang ist nicht geklärt, wodurch diese Unterschiede im Infektionsverlauf bedingt sind. Das Virulenzplasmid der enteropathogenen Yersinien kodiert für verschiedene Virulenzfaktoren, unter anderem für das Yersinia-Adhäsin YadA. Zwischen den YadA-Varianten der beiden Yersinia-Spezies und ihrer Serovare finden sich Unterschiede in der Aminosäuresequenz, die als Ursache für Unterschiede im Bindungsverhalten der Bakterien an EZM-Proteine diskutiert werden. Da die Bindung an Wirtsgewebe einen entscheidenden Schritt in der Pathogenese einer bakteriellen Infektion darstellt, könnten diese Unterschiede in YadA verantwortlich für die unterschiedlichen Infektionsmuster sein. Um dies zu klären, wurden yadA-Varianten und -Hybride aus beiden Arten in Y. enterocolitica Serotyp O:8, Stamm WA-314 als definiertem Expressionsprototyp eingebracht. Die verschiedenen Varianten wurden hinsichtlich ihres Bindungsverhaltens an immobilisierte EZM-Proteine und ihr Adhärenz- und Invasionsverhalten an HeLa-Zellen untersucht. Hierbei fand sich eine signifikant stärkere Bindung von Mutanten mit einem YadAent an Kollagen I und Fibronektin. In der Adhärenz an HeLa-Zellen konnte dieser Unterschied nicht dargestellt werden, aber alle yadA-positiven Stämme zeigten eine stärkere Adhärenz als die yadA-negativen Kontroll-Mutante. Allerdings ließ sich kein Unterschied der Zellinvasivität in HeLa-Zellen verglichen mit der Negativkontrolle nachweisen. Außerdem wurden zum Vergleich yadA-Knock-out-Mutanten von zwei Y. pseudotuberculosis-Stämmen erstellt. Diese wurden gemeinsam mit ihren Wildtyp-Stämmen mit den o. g. genannten Y. enterocolitica WA-314-Mutanten im oralen Mausinfektionsmodell verglichen. Hierbei fand sich kein Unterschied in der Virulenz zwischen den yadA-positiven und yadA-negativen Y. pseudotuberculosis-Stämmen. Hingegen war die yadA-Deletions-Mutante von Y. enterocolitica WA-314 nicht mausvirulent im Gegensatz zu den yadA-positiven Y. enterocolitica WA-314-Mutanten. Zusammenfassung ___________________________________________________________________________ 118 Die Ergebnisse der histologischen Auswertung von Milz und Peyerschen Plaques weisen auf einen unterschiedlichen Infektionsverlaufs von Y. enterocolitica im Vergleich zu Y. pseudotuberculosis hin. Allerdings zeigte sich auch hier, dass Unterschiede im Infektionserlauf für Y. enterocolitica WA-314 im Mausmodell nicht von der exprimierten YadA-Variante abhängig sind. Es zeigte sich, dass das yadA-Gen von verschiedenen Yersinia-Spezies, Serotypen und Stämmen nach Übertragung auf Y. enterocolitica WA-314 im vergleichenden Mausinfektionsmodell keinen Virulenzunterschied deutlich machte. Zudem konnte die Kopfregion, unter Nutzung der homologen Sequenzen im Konnektor-Bereich, ohne Virulenzminderung ausgetauscht werden. Zudem zeigte sich in dieser Arbeit, in Einklang mit Erkenntnissen, wonach die Kopfregion die EZM-Bindung vermittelt, dass nach einem solchen Austausch das Bindungsverhalten an Kollagen I und Fibronektin durch die Kopfregion bestimmt wurde. Die Analyse der Adhärenz an HeLa-Zellen zeigte allerdings, dass eine stärkere Kollagen I- und Fibronektin-Bindung nicht mit einer stärkeren Zellbindung einhergeht und somit kein ausreichender Prediktor für die Zellbindungsfähigkeit ist. Die Auswertung der Mausinfektionsversuche bestätigen, dass YadA für die Virulenz von Y. enterocolitica entscheidend ist, wohingegen Y. pseudotuberculosis auch ohne YadA seine volle Mausvirulenz behält. YadA, das für Y. enterocolitica ein wichtiger Virulenzfaktor ist, kann unter gewissen Voraussetzungen, wie für Y. pestis nachgewiesen, auch nachteilhaft für das Überleben im Wirt sein. Für Y. pseudotuberculosis könnten andere Virulenzfaktoren eine wichtigere Rolle spielen als YadA.

Die enterpathogenen Yersinia-Spezies unterlaufen die primären Abwehrmechanismen des Wirtes durch Einflußnahme auf Signaltransduktionskaskaden. Diese Subversion wird von einem 70 kDa Virulenzplasmid vermittelt, welches für ein Typ III Sekretion/Translokationsssystem und einige Virulenzfaktoren, sogenannte Yops (Yersinia outer proteins) kodiert. Die sechs bisher bekannten Effektor-Yops gelangen über das Sekretionssystem ins Zytoplasma von Makrophagen und Granulozyten, was in diesen zu einer Inhibition von Phagozytose, oxidative burst und Zytokinfreisetzung sowie zur Induktion der Apoptose führt. Ziel dieser Arbeit war es, die zellulären Angriffsproteine der Effektor-Yops YopM und YopO zu identifizieren. Als Methode diente das Yeast Two- Hybrid System. Es stellte sich heraus, dass YopM für diese Methode aufgrund seiner transskriptionsaktivierenden Eigenschaft nicht verwendbar ist. Dies und die Beobachtung, dass YopM in den Zellkern lokalisiert wird (77) deuten darauf hin, dass YopM möglicherweise als Transkriptionsfaktor in der Wirtszelle wirken könnte. Für YopO erbrachte die Two-Hybrid Untersuchung 31 positiv interagierende Klone, die als Rac1 (17 Klone, davon 4 unabhängige), Snk i.p. (11 Klone, davon 6 unabhängige) und Mus musculus spindlin (3 Klone) identifiziert werden konnten. Rac1 gehört zur Familie der Rho-GTPasen zu denen u.a. auch die Proteine RhoA und Cdc42 gehören. Diese kleinen G-Proteine sind in komplexer und in noch unvollkommen verstandener Weise an der Regulation vielfältiger Zellfunktionen beteiligt. Es konnte gezeigt werden, dass YopO neben Rac1 auch mit RhoA, nicht jedoch mit Cdc42 im Yeast Two-Hybrid System interagiert. Für YpkA, dem zu YopO homologen Protein aus Y. pseudotuberculosis zeigte sich das gleiche Interaktionsverhalten. Durch Koimmunopräzipitation konnten die Ergebnisse der Yeast Two-Hybrid Untersuchung mit einer zweiten, unabhängigen Methode bestätigt werden. Aus dem Zellysat von mit Yersinien infizierten humanen COS-Zellen, ließen sich RhoA und Rac1, nicht aber Cdc42 mit Hilfe von Anti-YpkA-Antikörpern koimmunopräzipitieren. In dieser Arbeit konnte mit zwei unabhängigen Methoden eine bis dahin unbekannte Affinität zwischen YpkA/YopO mit RhoA und Rac1 gezeigt werden. Es kann somit davon ausgegangen werden, dass RhoA und Rac1 die intrazellulären Angriffspunkte der Effektor- Yops YpkA bzw. YopO darstellen.