Podcasts about virulenzfaktor

Zusammenfassung Die enteropathogenen Yersinia-Arten Y. enterocolitica und Y. pseudotuberculosis verursachen neben Enteritiden und Enterokolitiden auch extraintestinale Erkrankungen wie reaktive Arthritis oder Erythema nodosum. In ihrem Infektionsverlauf zeigen sich allerdings zwischen diesen beiden Arten Unterschiede. So erfolgt eine Dissemination von Y. pseudotuberculosis meist in Form einer mesenterialen Lymphadenitis, im Falle von Y. enterocolitica hingegen kommt es zusätzlich zum Befall und zur Schädigung der weiter proximal und distal gelegenen Darmabschnitte im Sinne einer Enterokolitis. Bislang ist nicht geklärt, wodurch diese Unterschiede im Infektionsverlauf bedingt sind. Das Virulenzplasmid der enteropathogenen Yersinien kodiert für verschiedene Virulenzfaktoren, unter anderem für das Yersinia-Adhäsin YadA. Zwischen den YadA-Varianten der beiden Yersinia-Spezies und ihrer Serovare finden sich Unterschiede in der Aminosäuresequenz, die als Ursache für Unterschiede im Bindungsverhalten der Bakterien an EZM-Proteine diskutiert werden. Da die Bindung an Wirtsgewebe einen entscheidenden Schritt in der Pathogenese einer bakteriellen Infektion darstellt, könnten diese Unterschiede in YadA verantwortlich für die unterschiedlichen Infektionsmuster sein. Um dies zu klären, wurden yadA-Varianten und -Hybride aus beiden Arten in Y. enterocolitica Serotyp O:8, Stamm WA-314 als definiertem Expressionsprototyp eingebracht. Die verschiedenen Varianten wurden hinsichtlich ihres Bindungsverhaltens an immobilisierte EZM-Proteine und ihr Adhärenz- und Invasionsverhalten an HeLa-Zellen untersucht. Hierbei fand sich eine signifikant stärkere Bindung von Mutanten mit einem YadAent an Kollagen I und Fibronektin. In der Adhärenz an HeLa-Zellen konnte dieser Unterschied nicht dargestellt werden, aber alle yadA-positiven Stämme zeigten eine stärkere Adhärenz als die yadA-negativen Kontroll-Mutante. Allerdings ließ sich kein Unterschied der Zellinvasivität in HeLa-Zellen verglichen mit der Negativkontrolle nachweisen. Außerdem wurden zum Vergleich yadA-Knock-out-Mutanten von zwei Y. pseudotuberculosis-Stämmen erstellt. Diese wurden gemeinsam mit ihren Wildtyp-Stämmen mit den o. g. genannten Y. enterocolitica WA-314-Mutanten im oralen Mausinfektionsmodell verglichen. Hierbei fand sich kein Unterschied in der Virulenz zwischen den yadA-positiven und yadA-negativen Y. pseudotuberculosis-Stämmen. Hingegen war die yadA-Deletions-Mutante von Y. enterocolitica WA-314 nicht mausvirulent im Gegensatz zu den yadA-positiven Y. enterocolitica WA-314-Mutanten. Zusammenfassung ___________________________________________________________________________ 118 Die Ergebnisse der histologischen Auswertung von Milz und Peyerschen Plaques weisen auf einen unterschiedlichen Infektionsverlaufs von Y. enterocolitica im Vergleich zu Y. pseudotuberculosis hin. Allerdings zeigte sich auch hier, dass Unterschiede im Infektionserlauf für Y. enterocolitica WA-314 im Mausmodell nicht von der exprimierten YadA-Variante abhängig sind. Es zeigte sich, dass das yadA-Gen von verschiedenen Yersinia-Spezies, Serotypen und Stämmen nach Übertragung auf Y. enterocolitica WA-314 im vergleichenden Mausinfektionsmodell keinen Virulenzunterschied deutlich machte. Zudem konnte die Kopfregion, unter Nutzung der homologen Sequenzen im Konnektor-Bereich, ohne Virulenzminderung ausgetauscht werden. Zudem zeigte sich in dieser Arbeit, in Einklang mit Erkenntnissen, wonach die Kopfregion die EZM-Bindung vermittelt, dass nach einem solchen Austausch das Bindungsverhalten an Kollagen I und Fibronektin durch die Kopfregion bestimmt wurde. Die Analyse der Adhärenz an HeLa-Zellen zeigte allerdings, dass eine stärkere Kollagen I- und Fibronektin-Bindung nicht mit einer stärkeren Zellbindung einhergeht und somit kein ausreichender Prediktor für die Zellbindungsfähigkeit ist. Die Auswertung der Mausinfektionsversuche bestätigen, dass YadA für die Virulenz von Y. enterocolitica entscheidend ist, wohingegen Y. pseudotuberculosis auch ohne YadA seine volle Mausvirulenz behält. YadA, das für Y. enterocolitica ein wichtiger Virulenzfaktor ist, kann unter gewissen Voraussetzungen, wie für Y. pestis nachgewiesen, auch nachteilhaft für das Überleben im Wirt sein. Für Y. pseudotuberculosis könnten andere Virulenzfaktoren eine wichtigere Rolle spielen als YadA.

E. coli O157-Stämme gelten als Prototyp der EHEC, die weltweit beim Menschen verschiedene, teils schwerwiegende Krankheitsbilder wie die hämorrhagische Colitis (HC) und das hämolytisch-urämische Syndrom (HUS) hervorrufen können. Die Produktion von Shigatoxinen, syn. Verotoxinen gilt als primärer Virulenzfaktor dieser Erregergruppe. Zum Reservoir der shigatoxinbildenden E. coli zählen insbesondere große und kleine Wiederkäuer. Mit dem Singlepath® E. coli O157 und dem Duopath® Verotoxins der Fa. Merck stehen zwei GLISA-Schnelltests zur Verfügung, deren Handhabung im Zusammenhang mit der vorliegenden Prävalenzstudie beurteilt wurde.

Die sekretorischen Aspartatproteinasen (SAP) von Candida albicans gelten als ein wichtiger Virulenzfaktor. Im Vaginalsekret bei Frauen mit chronisch rezidivierender Vulvovaginalcandidose (CRVVC) sollen diese Proteasen (SAP 1- 9) nachgewiesen werden. Hierfür wurden bei insgesamt 135 Patientinnen Vaginalabstriche abgenommen und sowohl mikrobiologisch (Pilzkultur) als auch molekularbiologisch (rT-PCR, PCR) untersucht. Für die molekularbiologischen Untersuchungen erfolgte zunächst eine RNA-Isolierung auf Basis der Guanidinisothiocyanat/Phenol-Methode, danach erfolgte die Synthese von cDNA, die DNA-Amplifikation mittels PCR und schließlich eine Gelelektrophorese. 95 Patientinnen mit typischem Beschwerdebild (Jucken, Brennen, Ausfluß)und mehr als 4 Infektionen pro Jahr wurden der Candidagruppe und 40 asymptomatische, jedoch mit Candida albicans kolonisierte Patientinnen der Kontrollgruppe zugeordnet. In der Candidagruppe konnte schließlich in 64 Fällen mittels rT-PCR und PCR eine Proteasensekretion nachgewiesen werden, wobei in sieben Fällen keine der Proteasen SAP 1-9 nachgewiesen werden konnte. Um sicherzustellen, dass es sich bei den amplifizierten Genabschnitten um eine Kopie der isolierten RNA (cDNA) und nicht um genomische DNA handelt, verwendeten wir eine interne Kontrolle (Abschnitt aus dem EFB-Gen). Je nach verwendeter DNA (cDNA / genomische DNA) ergibt sich ein unterschiedlich großes Amplifikationsprodukt. In dieser Arbeit konnte bei Frauen mit einer CRVVC im Vergleich zu einer asymptomatischen Kontrollgruppe eine signifikant höhere Expression dieser Enzyme nachgewiesen werden. Auch wurden SAP 1 und SAP 4 im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant häufiger gefunden. Allerdings konnte kein für eine CRVVC typisches Isoenzymmuster beobachtet werden. Die Tatsache, dass es in der Mehrzahl der untersuchten Proben zu einer Expression der Aspartatproteinasen kam, zeigt, dass diese Enzyme eine Bedeutung bei Entstehung bzw. Aufrechterhaltung einer CRVVC haben könnten.

Humanpathogene Yersinien nutzen ein Typ III-Sekretionssystem (TTSS), um Virulenzproteine in die Wirtzelle zu injizieren und so der angeborenen Immunantwort des Wirts zu entkommen. Die homologen Proteine YscM1 und YscM2 in Yersinia enterocolitica gelten als funktionell austauschbare negative Regulatoren des TTSS. Ziel dieser Arbeit war die nähere Charakterisie-rung der Funktion von YscM1 und YscM2. Mithilfe von Wechselwirkungsstudien wurde in Y. enterocolitica ein Interaktionspartner der beiden Proteine gefunden, der durch Mas-senspektrometrie als Phosphoenolpyruvatcarboxylase (PEPC) identifiziert wurde. Bei der PEPC handelt es sich um ein Stoffwechselenzym, das die Synthese von Oxalacetat aus Phosphoenol-pyruvat und CO2 katalysiert und somit der Aufrechterhaltung des Citratzyklus dient, da dieser neben der Energiegewinnung auch Bausteine für Aminosäuresynthesen liefert. YscM1 und YscM2 sowie deren Chaperon SycH und PEPC wurden rekombinant hergestellt und gereinigt. Mit den gereinigten Proteinen konnte die Bindung von PEPC an YscM1 und YscM2 bestätigt werden. Es konnte gezeigt werden, dass beide Proteine antagonistisch wirken. YscM1 drosselt die Enzymaktivität von PEPC, während YscM2 die Aktivität erhöht. Um einen Effekt von YscM1 und YscM2 auf die Enzymaktivität von PEPC in vivo zu untersuchen, wur-den beide Proteine in Y. enterocolitica überexprimiert. Die Wachstumsbedingungen wurden dabei so gewählt, dass die Yersinien auf die PEPC-Reaktion angewiesen waren. Bei Überpro-duktion von YscM1 kam das Wachstum der Yersinien dabei völlig zum Erliegen, während YscM2 das Wachstum stimulierte. Die hier beschriebene Funktion von YscM1 und YscM2 ließ sich als völlig neue Funktion gegenüber der bekannten regulatorischen Funktion abgrenzen. Mausinfektionsversuche zeigten für eine ppc- und eine yscM1-Mutante einen attenuierten Phä-notyp, während die yscM2-Mutante keine Unterschiede in der Pathogenität im Vergleich zum Wildtyp aufwies. Für pathogene Bakterien ist vielfach beschrieben, dass sich deren Stoffwechsel auf die Expres-sion von Virulenzfaktoren auswirkt. In dieser Arbeit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass ein Virulenzfaktor den Stoffwechsel eines bakteriellen Erregers moduliert. Vermutlich ist durch die Modulation der Enzymaktivität eine optimale Anpassung an die Ernährungssituation im Wirt möglich, da eine Balance zwischen Energiestoffwechsel und der Synthese von Viru-lenzfaktoren sichergestellt wird. Da die PEPC im Menschen nicht vorkommt, aber für viele pathogene Bakterien von großer Bedeutung sein dürfte, könnte die PEPC ein interessantes Angriffsziel für Antibiotika und die Wechselwirkung zwischen YscM1 und PEPC die Grundlage für deren Entwicklung darstellen.

Der opportunistisch humanpathogene Hefepilz Candida albicans gehört bei vielen gesunden Menschen zur mikrobiellen Schleimhautflora, kann jedoch bei abwehrgeschwächten Patienten oberflächliche Infektionskrankheiten sowie lebensbedrohliche Organmykosen verursachen. Obwohl der Immunstatus des Wirtes für eine Infektion mit diesem Erreger von entscheidender Bedeutung ist, trägt auch eine Reihe von Virulenzfaktoren, insbesondere die sekretorischen Aspartatproteasen (Saps), zur Pathogenität von C. albicans bei. Die angeborene Immunität ist in der Lage, derartige Pathogene schon beim Erstkontakt zu erkennen und zu bekämpfen. Haupteffektoren dieser schnellen, angeborenen Immunantwort sind Makrophagen und neutrophile Granulozyten. Mitglieder der Toll-Proteinfamilie, sogenannte Toll-like Rezeptoren (TLRs), wurden kürzlich als Rezeptoren auf diesen Immunzellen in Säugern identifiziert. Sie erkennen unterschiedliche Erreger anhand von in der Evolution hoch konservierten Strukturen, den Pathogen-assoziierten molekularen Mustern (PAMPs), was zur Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-кB und zur Freisetzung von Zytokinen führt. Sowohl TLR2 als auch TLR 4 wurden kürzlich für die Erkennung von C. albicans diskutiert. Zielsetzung dieser Arbeit war es, die Interaktion von Makrophagen mit C. albicans im Hinblick auf die Aktivierung von Toll-like Rezeptoren und die nukleäre Translokation von NF-кB zu untersuchen. Neben dem lebenden C. albicans-Isolat wurden zudem drei weitere Präparationen untersucht: Mit den Antimykotika (AM) Amphotericin B, Nystatin und Itraconazol vorbehandelte Keime, durch Hitze inaktivierte Keime sowie Sap-inaktivierte Keime. Die Zellstimulationsexperimente wurden mit murinen Wildtyp-Makrophagen, TLR2- bzw. TLR4- defizienten Einzelknockoutmutanten und mit TLR2/4-Doppelknockoutmutanten durchgeführt. Die TLR-vermittelte Aktivierung von NF-кB wurde mit Gelshifts (EMSA) nachgewiesen. Mit Western Blots wurden die intrazellulären Signaltransduktionswege untersucht. Der Hitze-inaktivierte Stamm bewirkte keine Translokation von NF-кB in Wildtyp-Makrophagen. Eine Inhibition der Saps bewirkte keine Abschwächung der NF-кB Induktion, so dass im Umkehrschluss dieser bedeutende Virulenzfaktor die TLR-vermittelte NF-кB Aktivierung nicht beeinflusst. Der lebende Stamm benutzte sowohl TLR2 als auch TLR4 für die Induktion von NF-кB. Nach Vorstimulation der Makrophagen mit Interferon-γ ließ sich jedoch eine klare TLR2-Abhängigkeit – unabhängig von TLR4 – in der Aktivierung von NF-кB und in der Induktion von TNF-α zeigen. In beiden Fällen wurden die Makrophagen erst ab einer Candida-Dichte von 106 Zellen pro 100 µl PBS stimuliert. Für den AM-vorbehandelten Stamm ergab sich eine deutliche TLR2-Abhängigkeit in der Regulation von NF-кB, welche durch die Präinkubation der Makrophagen mit IFN-γ nicht beeinflusst wurde. AM-vorbehandelte Keime konnten NF-кB in den Makrophagen erst ab einer Dichte von 107 Zellen pro 100 µl PBS aktivieren. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass lebende und AM-vorbehandelte Keime im Gegensatz zur Hitze-inaktivierten Präparation und zu den Saps relevante PAMP-Strukturen für eine TLR-vermittelte NF-кB Hochregulation besitzen. Die Beteiligung beider Rezeptoren, TLR2 und TLR4, belegt beim lebenden Stamm das Konzept, dass immunkompetente Zellen sich mehrerer TLRs bedienen, um die Immunantwort möglichst spezifisch und fein zu regulieren. Beim AM-vorbehandelten Stamm scheint den Antimykotika Amphotericin B, Nystatin und Itraconazol eine besondere Rolle zuzukommen, da diese die Integrität der Pilzmembran stören und somit TLR2-aktivierende PAMPs aus Zellwand und/oder Zytosol freisetzen. Neben dem direkten Effekt auf die Pilzmembran kommt es somit zusätzlich zu einer indirekten, TLR2 vermittelten Stimulation der Makrophagen. Untersuchungen der Signaltransduktion (Stimulation von Wildtyp-Makrophagen mit dem AM-vorbehandelten C. albicans-Isolat) ergaben eine vorübergehende, zeitlich eng begrenzte Induktion von NF-кB, die durch den Inhibitor IкB-α reguliert wird. Gleichzeitig wurden im zeitlichen Verlauf der Stimulation auch MAP Kinasen (ERK, p38, JNK) und c-Jun, eine Subeinheit des Transkriptionsfaktors AP-1, phosphoryliert. Diese simultane Aktivierung beider Transkriptionsfaktoren weist auf eine feinregulierte Immunantwort der Makrophagen gegenüber C. albicans hin und legt zudem einen Cross-Talk zwischen NF-кB und AP-1 nahe.