Podcasts about phagozytose

Welche Rolle spielt Vitamin C in demGefüge aus Leukozyten, Lymphozyten, T- und B- Zellen, dendritischen Zellen, Immunglobulinen und anderen. Erste Anwendungen von Vitamin C als antivirale Therapie gehen auf den Arzt Frederick R. Klenner zurück, der in den frühen 1940 iger Jahren bereits Vitamin C dafür einsetze. Heute wissen wir, dass immunkompetente Zellen (Lymphozyten, Neutrophile und Monozyten) mit 1 bis 4 mMol eine Vitamin-C-Konzentration aufweisen, die etwa 10- bis 100-fach über den Vitamin-C-Plasmaspiegeln im Blut liegt. Dies allein weist schon auf die immunologische Funktion von Vitamin C hin, wie es auch in der DAZ von 08/2011 zu lesen war. Der Arzt Harald Krebs zeigt in seinen Werk „Vitamin-C-Hochdosistherapie: Leitfaden für die therapeutische Praxis“, wie die einzelnen Komponenten des Immunsystems von Vitamin C profitieren. Der günstige Einfluss von Vitamin C auf die Immunmodulation des menschlichen Organismus ist vielfach nachgewiesen. Zusammenfassend kann man bemerken, dass Vitamin C, also Ascorbinsäure, eine Steigerung der Abwehrmechanismen durch Einflussnahme auf die Phagozytosefähigkeit der Leukozyten und durch Anregung der körpereigenen Interferonsynthese bewirkt.

Der SLE ist eine Autoimmunerkrankung aus der Gruppe der Kollagenosen, in deren Verlauf es durch einen Toleranzverlust zu einer fälschlichen Antwort des Immunsystems auf körpereigene Strukturen kommt. Das lange Pentraxin PTX3 ist ein inflammatorisches Akut-Phase-Protein und hat zahlreiche Funktionen im angeborenen Immunsystem. Um den Einfluss von PTX3 auf den SLE zu untersuchen, wurden B6lpr Mäuse verwendet, welche unter einem mit dem SLE vergleichbaren milden Autoimmunsyndrom leiden. In diese Mäuse wurde eine Ptx3-Defizienz eingekreuzt. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass PTX3 die systemische Autoimmunität entscheidend beeinflusst: Entweder führt PTX3 zu einer Aggravation der Klinik durch seine proinflammatorische Wirkung oder PTX3 hemmt die Krankheitsintensität über seine Steigerung der Phagozytose sowie die Hemmung der Selectin-P vermittelten Leukozyteninfiltration. Überraschenderweise beeinflusste das Fehlen von PTX3 die systemische Autoimmunität in B6lpr Mäusen kaum. So waren die Autoantikörper-produzierenden Plasmazellen sowie die Autoantikörper zwischen beiden Genotypen kaum verändert. Lediglich die Anzahl an „autoreaktiven“ CD4 und CD8 doppelnegativen T-Lymphozyten war in den Ptx3-defizienten B6lpr Mäusen signifikant erhöht. Es konnte gezeigt werden, dass PTX3 eine rasche Clearance apoptotischer T-Zellen intraperitoneal fördert und dass dies einen entscheidenden Beitrag für den Verlust der Immuntoleranz darstellen könnte. Umgekehrt könnte der Anstieg der „autoreaktiven“ T-Zellen durch die verschlechterte Clearance apoptotischer Zellen bedingt sein. Der Mangel an PTX3 zeigte auf Organ-spezifischer Ebene eine entscheidende Rolle bei der Ausprägung des SLE. Während die Lupusnephritis in den Mäusen unverändert blieb zeigte sich eine signifikant verstärkte Lungenschädigung in den Ptx3 knockout-Tieren. Ursächlich hierfür könnte die Anbindung von PTX3 an Selectin-P sein, durch die eine über dieses Adhäsionsmolekül vermittelte Leukozyteninfiltration an den Ort der Entzündung limitiert wird. Somit stellt PTX3 ein negativer Rückkopplungsmechanismus bei Entzündungen dar, da PTX3 vermehrt bei Inflammation gebildet wird, gleichzeitig aber die Leukozytenrekrutierung limitiert und somit das Ausmaß der entzündlich infiltrativ bedingten Lungenschädigung eindämmt. Defekte des Ptx3-Gens könnten ein genetischer Risikofaktor für die SLE bedingte Ausprägung von Lungenschädigungen des Menschen darstellen und so eine Behandlung mit rekombinanten PTX3 oder anderen PTX3-Agonisten eine mögliche spezifische Behandlungsstrategie darstellen.

Eine Glomerulonephritis kann durch eine virale Infektion verschlechtert werden, sie kann aber auch erst durch diese entstehen. Die Erkennung der viralen Bestandteile erfolgt über Pathogenerkennungsrezeptoren, wie beispielweise Toll-like Rezeptoren und RIG-like Rezeptoren. Die Hypothese der vorliegenden experimentellen Arbeit war, dass die nierenspezifischen Podozyten Pathogenerkennungsrezeptoren besitzen, die pathogen-assoziierte molekulare Muster erkennen und daraus Zytokine und antivirale Typ-I Interferone produzieren. Hierbei könnten Podozyten zu der Entstehung bzw. Veschlechterung einer virusassoziierten Glomerulonephritis beitragen. Murine Podozyten exprimieren, mit Ausnahme des Toll-like Rezeptors 8, alle bis dato bekannten Toll-like Rezeptoren (TLR-1 bis -11) in verschiedener Ausprägung. Sie exprimieren außerdem die zytosolische Rezeptoren RIG-1, MDA-5, DAI sowie deren Adaptermolekül IPS-1. Die Aktivierung dieser Rezeptoren verursacht die Produktion von Zytokinen und Typ-I Interferonen. Um die intrazelluläre Aufnahme der Nukleinsäuren zu gewährleisten, wurden diese mit kationischen Lipiden komplexiert. Dieser Vorgang wurde durch Cytochalasin D, Chlorpromazin und Methyl-β-Cyclodextrin unterbrochen. Daraufhin ergeben sich die Phagozytose, die Clathrin-abhängige Endozytose und die Caveolae-vermittelte Endozytose als mögliche Transportmechanismen. Das Adaptorprotein MyD88 zeigte bei Podozyten keine Bedeutung für die Nukleinsäureaufnahme in die Zelle zu besitzen. Die Stimulation von Podozyten mit Typ-I Interferonen veranlasste die Produktion von großen Mengen an Interleukin-6 und führte zu einer starken Expression von Pathogenerkennungsrezeptoren sowie proinflammatorischen Zytokinen auf Transkriptionsebene. Eine autokrin-parakrine Aktivierung der Podozyten durch ausgeschüttete Typ-I Interferone konnten wir ausschließen. Weder die Durchlässigkeit für Albumin noch die Viabilität der Zellen wurde durch die Aktivierung von Pathogenerkennungsrezeptoren beeinflusst. Eine Funktionseinschränkung der Podozyten nach Stimulation der TLRs oder RLRs im Sinne eines direkten Einflusses auf die Permeabilität oder die Fußfortsatzzahl fand sich nicht, jedoch zeigten Podozyten eine vermehrte Zytokinproduktion, was zur glomerulären Entzündung bei viraler Glomerulonephritis beitragen könnte.

Formine spielen eine wichtige Bedeutung bei der Regulierung polarisierter Aktin-gesteuerter Prozesse. Dies betrifft beispielsweise die Zellmigration, den Vesikeltransport, die Morphogenese und die Zytokinese (Faix und Grosse 2006). In früheren Arbeiten konnte nachgewiesen werden, dass das Protein Formin-like 1 (FMNL1) in Zellen von Patienten mit chronischer lymphatischer Leukämie (CLL), anderen Leukämien und Lymphomen und in Zelllinien, die von soliden Tumoren stammen, überexprimiert wird. Im gesunden Gewebe wird es fast ausschließlich in hämatopoetischen Zellen exprimiert. Diese selektive Expression macht FMNL1 zu einem attraktiven Ziel für neuartige Immuntherapien bei malignen und entzündlichen Erkrankungen (Krackhardt, Witzens et al. 2002; Schuster, Busch et al. 2007). In Vorarbeiten der Gruppe wurde ein allorestringierter T-Zellklon mit einem definierten T-Zellrezeptor identifiziert, der ein Peptid von FMNL1 erkennt und eine starke Antitumor-Aktivität gegen Lymphom- und Nierenzellkarzinom-Zelllinien, Epstein-Barr-Virus (EBV)-transformierte B-Zellen und von CLL-Zellen zeigt (Schuster, Busch et al. 2007). Allerdings sind die Funktion und Regulation von FMNL1 – beide wichtig für die Validierung dieses Proteins als Antigen – noch nicht gut untersucht. Frühere Arbeiten haben eine Beteiligung von FMNL1 bei der Neuausrichtung des MTOC (Mikrotubulin-organisierendes Zentrum) in Richtung der immunologischen Synapse und zusätzlich bei der Zytotoxizität von T-Zellen beschrieben (Gomez, Kumar et al gezeigt. 2007). Darüber hinaus wurde gezeigt, dass das murine FRL, das zu 85% homolog zum menschlichen FMNL1 ist, an der Zelladhäsion und Motilität von Makrophagen sowie an der Fc-Rezeptor-vermittelten Phagozytose beteiligt ist (Yayoshi-Yamamoto, et al Taniuchi hat. 2000; Seth, Otomo et al. 2006). Das Ziel dieses Projekts war es, die Funktion von FMNL1 für die weitere Validierung dieses Proteins als mögliche Zielscheibe für neue Anti-Tumor-Therapien zu untersuchen. Wir haben eine neue Spleißvariante (FMNL1) identifiziert, die am C-terminalen Ende ein residuelles Intron aufweist, welches einen Einfluss auf die Diaphanous-autoinhibierende-Domäne (DAD) hat. Im Gegensatz zu anderen FMNL1-Spleißvarianten, die eine zytoplasmatischen Lokalisierung aufweisen, zeigt diese Speißvariante eine kortikale und membranständige Lokalisation in verschiedenen Zelllinien. Eine FMNL1 Mutante, bei der die DAD-Domäne fehlt (FMNL1ΔDAD), weist eine ähnliche Lokalisierung auf. Das weist darauf hin, dass es bei FMNL1 zu einer Deregulierung der Autoinhibition kommt, die zu einer konstitutiv aktiven Form von FMNL1 führt, die möglicherweise bei der zellulären Transformation eine Rolle spielen könnte. FMNL1 und FMNL1ΔDAD können eine polarisierte, nicht mit einer Apoptose-assoziierten Blasenbildung an der Membran hervorrufen, die von Myosin, Aktin undTubulin abhängig ist, aber unabhängig von Src und ROCK zu sein scheint. Wir haben außerdem nachgewiesen, dass FMNL1 als myristoyliertes Protein vorliegt und konnten zeigen, dass die N-terminale Myristoylierung wichtig für die Regulierung der Funktion von FMNL1 ist, indem sie eine schnelle und reversible Membran-Lokalisierung ermöglicht. Des Weiteren haben wir gezeigt, dass FMNL1, das auch am kontraktilen Ring und Kortex von FMNL1-transfizierten mitotischen Zellen lokalsiert ist, die Zellproliferation moderat verstärkt. Eine gemeinsame Lokalisierung von menschlichem endogenem FMNL1 und -Tubulin am Kortex und den mitotischenden Spindeln von sich teilenden T-Zellen weist ebenfalls auf eine Rolle von FMNL1 in der Mitose und dem Zellwachstum hin. Überexpression von FMNL1 konnte eine höhere Konzentration von intrazellulärem freiem Calcium nach Zell-Stimulation induzieren, was auf eine Beteiligung von FMNL1 am Calcium-Signalweg deutet. Unsere Ergebnisse eröffnen neue Einblicke in die Regulation und Funktion von FMNL1 und zeigen dessen Beteiligung an unterschiedlichen Polarisierungsprozessen. Die Identifizierung von Interaktionspartnern von FMNL1 in verschiedenen hämatopoetischen Zellen sowie die weitere funktionelle Charakterisierung der Spleißvarianten wird von besonderer Bedeutung sein, und möglicherweise zur Entwicklung einer spezifischen therapeutischen Beinflussung maligner und entzündlicher Erkrankungen beitragen.

Thu, 15 Oct 2009 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/10798/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/10798/1/Hosse_Judith.pdf Hosse, Judith

Die Kontrolle von selbstreaktiven T-Zellen durch Toleranzmechanismen ist ein wichtiger Bestandteil des Immunsystems zur Vermeidung von Autoimmunkrankheiten. Man vermutet, dass Kreuzpräsentation von körpereigenen Ag in Abwesenheit einer Entzündung einen Mechanismus darstellen könnte, periphere CD8+ T-Zell-Toleranz zu induzieren. Durch Kreuzpräsentation werden von Dendritischen Zellen (DC) Antigene (Ag), die nicht von DC selbst exprimiert werden (exogene Ag), im Kontext von MHC Klasse I an CD8+ T Zellen präsentiert. Apoptotisches Material, welches von eigenen Geweben stammt, könnte dabei als Quelle für Selbstantigene dienen. Man hat kürzlich die Wichtigkeit der kleinen Rho-GTPase Rac1 für die Phagozytose apoptotischen Materials entdeckt. Um die Rolle von Kreuzpräsentation in der peripheren Toleranzinduktion durch DC in vivo zu untersuchen, wurde eine transgene Maus konstruiert, in der Rac1 DC-spezifisch inhibiert ist (CD11c-Rac1(N17) Tg+). Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde diese Mauslinie zunächst näher charakterisiert. Es wurde gezeigt, dass die CD11c-Rac1(N17) Tg+ Maus einen Defekt in der Kreuzpräsentation von löslichem Protein aufzeigt. Dabei war der Effekt unabhängig von der Art der Ag-Aufnahme. Die Präsentation endogener Ag in Form von Viren oder die Präsentation löslicher Peptide war indes normal. Durch Verwendung von OVA-Alexa Fluor 647 und DQ-OVA konnte festgestellt werden, dass in transgenen DC die Menge aufgenommenen OVA-Proteins reduziert und die Menge prozessierten OVA-Proteins normal bis leicht reduziert ist. Kerksiek et al. zeigten außerdem eine verminderte Phagozytose von zellassoziierten Ag durch transgene DC. Es ist insgesamt anzunehmen, dass eine verminderte Kreuzpräsentation zumindest zum Teil auf einem Defekt in der Ag-Aufnahme beruht, evtl. auch auf einen Defekt im Prozessierungsablauf. Eine reduzierte Ag-Präsentation von löslichen Ag durch transgene DC an CD4+ T-Zellen konnte ausgeschlossen werden. Diese Ergebnisse zeigen zusammenfassend, dass die CD11c-Rac1(N17) Tg+ Maus ein geeignetes Werkzeug darstellt, um die Rolle von Kreuzpräsentation in vivo zu studieren. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde weiterhin gezeigt, dass Kreuzpräsentation ein wichtiger Prozess ist, um periphere Toleranz zu induzieren und aufrechtzuerhalten. In einem Mausmodell für autoimmunen Diabetes (Rip-mOVA), löste die verminderte Kreuzpräsentation von membrangebundenem Ovalbumin (mOVA) im Pankreas Diabetes aus. Es wurde zwar weniger Proliferation der OT-I T-Zellen in doppeltransgenen Mäusen (Rac/Rip) als in Rip-mOVA Mäusen beobachtet, diese noch vorhandenen OT-I Zellen waren jedoch wegen verminderter Kreuztoleranz nicht anerg, wie es in Rip-mOVA Mäusen zu sehen war. Das führte nach Immunisierung mit HSV-OVA schließlich zur Zerstörung der -Inselzellen und damit zur Auslösung von Diabetes. Versuche, in denen T-Zellen von CD11c-Rac1(N17) Tg+ Mäusen in Rezipienten mit Thy1.1 Hintergrund transferiert wurden, deuten auch darauf hin, dass in CD11c-Rac1(N17) Tg+ Mäusen die Ausübung peripherer Toleranz inhibiert ist. Es sollte weiterhin gezeigt werden, ob die potentiell autoreaktiven CD8+ T-Zellen der transgenen Mauslinie ausreichen, um Autoimmunität in Form einer Transplantat-gegen-Empfänger Krankheit (GVHD) auszulösen. In Abwesenheit von CD4+ T-Zellen blieben (auch) die (Kontroll-) Versuchstiere gesund. Dieses Ergebnis spricht dafür, dass eine effektive Kreuzpräsentation auf die CD4+ T-Zell Hilfe angewiesen ist. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, wie essentiell die ständige Kreuzpräsentation von exogenen Selbstantigenen für die Kontrolle von Autoimmunreaktionen ist.

Aspergillus fumigatus ist ein opportunistischer Krankheitserreger, der ubiquitär in der Umwelt vorhanden ist. Die schwerwiegende Krankheit, die er verursacht, ist die invasive Aspergillose, welche nur bei immungeschwächten Patienten auftritt und bis heute nur sehr schwierig zu diagnostizieren und zu heilen ist. Die Sporen von A. fumigatus können aufgrund ihrer geringen Größe bis in die Alveolen der Lunge gelangen. Dort bilden Makrophagen die erste Verteidigungslinie, indem sie die Sporen phagozytieren. Die Phagozytose ist Bestandteil der angeborenen Immunantwort und ein initialer Schritt bei der Bekämpfung von A. fumigatus-Sporen durch Makrophagen. Das Verstehen dieses Prozesses gewinnt durch die stetige Zunahme der Patienten mit invasiver Aspergillose immer größere Bedeutung und ist Gegenstand intensivster Forschung. Im Rahmen dieser Dissertation wurden die Interaktionen von murinen und humanen Makrophagen mit A. fumigatus-Sporen untersucht. Die Fragestellung wurde aus zwei unterschiedlichen Perspektiven betrachtet. Zum einen wurde die Oberfläche der A. fumigatus-Sporen analysiert; zum anderen wurden die Interaktionen von A. fumigatus mit phagozytierenden Zellen erforscht. Um die Phagozytose von A. fumigatus-Sporen in murinen und humanen Zellen genauer charakterisieren zu können, wurde in dieser Arbeit der so genannte „Biotin-Calcofluor Staining Assay“ (BCS-Assay) entwickelt. Mit Hilfe dieser Methode war es möglich, zwischen extra- und intrazellulären Sporen zu unterscheiden, ohne auf die Anwesenheit von Antikörpern angewiesen zu sein. Mit Hilfe von diversen Inhibitoren konnte der Mechanismus der Phagozytose genauer untersucht werden. So konnte gezeigt werden, dass die Aufnahme von A. fumigatus-Sporen ein Aktin-abhängiger Prozess ist und dass Makrophagen für die Phagozytose die Aktivierung der Phosphoinositid 3 Phosphat-Kinasen und von Tyrosin-Kinasen benötigen, insbesondere diejenigen der scr Familie. Butanedion Monoxim, ein Inhibitor der Myosinmotor-Aktivität, blockierte ebenfalls effizient die Sporenaufnahme. Die weiteren Untersuchungen der Phagozytoseprozesse von A. fumigatus-Sporen erfolgten u.a. mit Hilfe von Fluoreszenz- und elektronenmikroskopischer Aufnahmen. In der Immunfluoreszenz ließen sich Tyrosin-phosphorylierte Proteine in den Aufnahmestrukturen detektieren, und elektronenmikroskopische Aufnahmen infizierter Makrophagen zeigten so gennante „Ruffle“-Strukturen. Diese Tatsache deutet darauf hin, dass A. fumigatus-Sporen durch einen „Trigger“-ähnlichen Mechanismus aufgenommen werden. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurden die Rezeptoren der Phagozytose von A. fumigatus-Sporen charakterisiert. Die Ergebnisse von Meier und ihren Kollegen zeigten bereits, dass die Erkennung von A. fumigatus durch Makrophagen mittels Toll-like Rezeptor 2 und TLR4 erfolgt. In der vorliegenden Arbeit wurde nun auch der Frage nachgegangen, welche Rolle TLR2 und TLR4 bei der Phagozytose von A. fumigatus-Sporen spielen. Hierzu wurden aus den Mausstämmen C3H/HeN (WT), C3H/HeJ (TLR4-), C3H/HeN TLR2-/- (TLR2-) und C3H/HeJ TLR2-/- (TLR2-/4-) murine Peritonealmakrophagen mittels Peritoneallavage entnommen, mit A. fumigatus-Sporen infiziert und mit Hilfe des BCS-Assays ausgewertet. Es konnte gezeigt werden, dass Toll-like Rezeptor 2 und nicht Toll-like Rezeptor 4 für eine effiziente Phagozytose benötigt wird. Dieses Ergebnis ließ sich wiederum mit Hilfe eines anti TLR2-Antikörpers bestätigen, da dieser auch die Phagozytose von A. fumigatus-Sporen, aber nicht von Kontrollbeads blockieren konnte. Des Weiteren wurde untersucht, ob der von Brown und seinen Mitarbeitern entdeckte Dectin-1 Rezeptor ein potentieller Phagozytoserezeptor von A. fumigatus-Sporen ist (Brown et al., 2001). Es konnte gezeigt werden, dass Laminarin, ein lösliches ß 1-3 Glucan, die Phagozytose von A. fumigatus-Sporen durch Makrophagen blockierte. Außerdem ließ sich mit einem anti-Dectin-1 Antikörper die Phagozytose von A. fumigatus-Sporen in Makrophagen hemmen. Zudem ließ sich Dectin-1 mit diesem Antikörper in infizierten Makrophagen in der Immunfluoreszenz detektieren. Mit einem weiteren Antikörper konnte beta-1-3 Glucan, ein wichtiger Bestandteil der pilzlichen Zellwand, auf ruhenden Sporen detektiert werden. Es zeigte sich, dass die Menge an  1-3 Glucan eine wichtige Rolle bei der Eliminierung von A. fumigatus-Sporen spielt. Vergleiche zwischen ruhenden und angeschwollenen Sporen zeigten, dass angeschwollene Sporen, welche größere Mengen an ß 1-3 Glucan auf ihrer Oberfläche besitzen, effizienter phagozytiert werden können. Auch die A. fumigatus pksP-Mutante, welche mehr  1-3 Glucan auf ihrer Oberfläche besaß, wurde effizienter phagozytiert. Betrachtet man die intrazelluläre Signaltransduktionskaskade, so deuten die Daten darauf hin, dass die Dectin-1-gesteuerte Phagozytose von A. fumigatus-Sporen abhängig von der Syk-Kinase verläuft. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass Dectin-1 und TLR2 für eine effiziente Phagozytose von A. fumigatus-Sporen benötigt werden. Die Ergebnisse legen allerdings nahe, dass außer Dectin-1 und TLR 2 noch weitere Rezeptoren bei der Phagozytose von A. fumigatus-Sporen beteiligt sind. Ein genaues Verständnis der bei der Phagozytose ablaufenden Erkennungsprozesse und der nachgeschalteten Signaltransduktionskaskaden könnte in Zukunft ausgenutzt werden, um die Effiziens der Phagozytose auch in immungeschwächten Patienten zu erhöhen und sie so zu schützen.

Reagible Sauerstoffradikale sind wichtige Bestandteile mikrobizider als auch zytotoxischer Funktionen polymorphkerniger neutrophiler Leukozyten (PMNL). Da dieser ambivalenten Stellung im Verlauf einer Sepsis große Bedeutung zukommt, untersuchten wir die Produktion von H2O2 in Abhängigkeit unterschiedlicher partikulärer und löslicher Stimuli bei Patienten mit zunehmender Schwere einer Sepsis. Es wurden Patienten mit unkomplizierter Sepsis (n=15), schwerer Sepsis (n=12) und Patienten mit septischem Schock (n=33) in eine prospektive Studie eingeschlossen. Die Kontrollgruppe bestand aus gesunden Probanden (n=50) mit vergleichbarer Altersstruktur und Geschlechtsverteilung. Zur Erfassung von Adhärenz, Phagozytose und der mit der Phagozytose assoziierten Sauerstoffradikalproduktion wurden nicht-opsonierte und opsonierte Zymosanpartikel verwendet. Die an β-Glukanen und Lektinstrukturen reiche Oberfläche von Zymosanpartikeln löst vermittelt durch die Lektinbindungsstelle der α-Kette (CD11b) des Komplementrezeptors Typ 3 und der in jüngerer Zeit charakterisierten „C type-lectin-like domain“ (CTLD) des Dektin-1-Rezeptors deren Phagozytose und die Phagozytose-assoziierte H2O2-Produktion des Granulozyten aus. Beide Rezeptoren werden als „non Toll-like“ Rezeptoren klassifiziert, welche zur Gruppe der „pathogene-recognition“ Rezeptoren (PRR) gerechnet werden. Zur Erfassung der durch lösliche Stimuli ausgelösten Zellaktivierung wurden PMNL mit dem chemotaktischen Tripeptid fMLP allein und nach Priming mit TNF-α inkubiert. Die ermittelte H2O2-Produktion war nach Stimulation mit nativem Zymosan reduziert, nach Stimulation mit opsoniertem Zymosan unverändert und nach Stimulation mit fMLP allein, fMLP in Kombination mit TNF-α, sowie in der Kontrollgruppe gesteigert. Alle Veränderungen hatten ihre deutlichste Ausprägung in der Gruppe der Patienten mit septischem Schock. Insbesondere die Phagozytose von Zymosan und die daran assoziierte H2O2-Produktion waren signifikant verringert, während die spontane und die durch lösliche Stimuli ausgelöste H2O2-Produktion stark erhöht waren. Diese Ergebnisse lassen auf die Entwicklung einer mit der Schwere einer Sepsis zunehmenden Granulozytendysfunktion schließen. Diese ist durch die Abnahme mikrobizider Teilfunktionen bei gleichzeitiger Steigerung der die Mikrozirkulation und potenziell das Gewebe schädigenden zytotoxischen Partialfunktionen charakterisiert. Da die Adhärenz von PMNL an nativem Zymosan unverändert blieb, während simultan die Phagozytose und die Phagozytose-assoziierte H2O2-Produktion reduziert waren, kann auf einen Defekt in der Signaltransduktion der Lektinbindungsstelle und/oder dem Dektin-1 β-Glukanrezeptor geschlossen werden.

Makrophagen spielen innerhalb des zellulären unspezifischen Abwehrsystems eine wesentliche Rolle. Für die Ausübung ihrer Funktion sind dynamische Änderungen des Zytoskeletts sowie Aufnahmeprozesse wie Phago- und Pinozytose von entscheidender Bedeutung. Diese Prozesse werden u. a. von Rho-GTPasen und ihren Effektorproteinen reguliert. Zu diesen Effektorproteinen gehören die Proteine der WASp-Familie, die aus WASp, N-WASP und den drei WAVE-Isoformen besteht. In unserer Arbeitsgruppe konnten mittels eines pan-WAVE-Antikörpers Akkumulationen von WAVE an vesikulären Strukturen gezeigt werden (Dissertation B. Schell, 2003). Über eine Beteiligung von WAVE an der Regulation von Vesikeln ist jedoch bisher nichts bekannt. Deshalb beschäftigt sich diese Arbeit mit der Rolle und Funktion von WAVE im Rahmen der Vesikelbildung in Makrophagen. Mittels Färbungen gegen die verschiedenen WAVE-Isoformen konnte erstmals in J774- und primären Makrophagen gezeigt werden, dass WAVE1 an vesikulären Strukturen lokalisiert. Überexpressionen von WAVE1- und WAVE2-GFP bestätigten dieses Ergebnis. Darüber hinaus war es möglich, WAVE1 nach Stimulierung der Makrophagen durch chemoattraktive Stoffe wie fMLP und LPS an Vesikeln zu lokalisieren. Im Rahmen ihrer Rolle als Fresszellen sind Makrophagen insbesondere zu Phagozytose und Pinozytose befähigt. Da Vesikel gerade bei derartigen Prozessen auftreten, wurde untersucht, ob im Rahmen endozytotischer Vorgänge auch WAVE1-Vesikel vorkommen. Da es sich bei der Phagozytose um die Aktin-abhängige Internalisierung von Partikeln > 0,5 µm handelt, wurde ein Phagozytose-Assay mit latex-beads gewählt. Dabei werden von der Zelle Aktin-reiche Strukturen, sog. phagocytic cups, um den aufzunehmenden Partikel erzeugt. In den durchgeführten Experimenten wurde jedoch nur eine geringgradig gesteigerte Bildung von WAVE1-Vesikeln beobachtet. Eine Assoziation zwischen WAVE1 und den entstandenen phagocytic cups wurde dabei nicht festgestellt. Da die phagocytic cups auch nicht den gesuchten vesikulären Strukturen entsprachen, standen Phagozytose und phagocytic cups nicht im Fokus der weiteren Arbeit. Zur Stimulation der Pinozytose wurden sog. fluid phase marker wie z. B. Dextrane und Lysotracker verwendet. Damit konnte gezeigt werden, dass WAVE1-haltige Vesikel mit fluoreszenzmarkierten Dextranen in pinozytotischen Vesikeln kolokalisieren. Durch Verwendung von Lysotracker konnten die kolokalisierenden Vesikel sauren Kompartimenten im endosomallysosomalen Pathway, am ehesten Lysosomen entsprechend, zugeordnet werden. Endozytotische Vorgänge sind hochregulierte Prozesse. Da sich Makropinozytose sowie der anschließende Vesikeltransport entlang von Filamenten u. a. durch Manipulationen des Aktinund Mikrotubuli-Zytoskeletts inhibieren lässt, wurde der Einfluss des Aktin- bzw. Mikrotubuli- Zytoskeletts auf die WAVE1-Vesikel Bildung durch die Verwendung von Cytochalasin D und Nocodazol untersucht. Die Bildung von WAVE1-Vesikeln zeigte sich dabei unabhängig von der Manipulation sowohl des Aktin-Zytoskeletts als auch des Mikrotubuli-Netzwerkes. Im Gegensatz dazu steht die Bildung von Dextran-Vesikeln: diese konnte durch Zerstörung des Aktin- Zytoskeletts mittels Cytochalasin D reduziert werden. Damit konnte die in der Literatur beschriebene Aktin-Abhängigkeit von Dextran-Vesikeln bestätigt werden. Desweiteren scheint, wie erwartet, durch Zerstörung des Mikrotubuli-Netzwerkes mittels Nocodazol nicht die Aufnahme, sondern der intrazelluläre Transport der Dextran-Vesikel entlang von Filamenten inhibiert zu werden. WAVE1 stellt ein Multidomänenprotein dar. Um die Rolle der einzelnen Domänen von WAVE1 in Bezug auf die Bildung von WAVE1- und Dextran-Vesikel zu analysieren, wurden verschiedene Mutanten von WAVE1 als GST-Fusionsproteine in Makrophagen mikroinjiziert. Einen Effekt bezüglich der Bildung von Dextran-Vesikeln konnte mit der WA-Domäne von WAVE1 gezeigt werden. Dieses Resultat stimmt mit der zuvor beschriebenen Aktin- Abhängigkeit der Dextran-Vesikel überein. Die Konstrukte WAVE1-P ebenso wie WAVE1- PWA führten zu einer signifikanten Reduktion der Bildung von Dextran-Vesikeln. Dies lässt den Schluss zu, dass die Prolin-reiche Region eine essentielle Rolle in der Regulation sowohl von WAVE1- als auch Dextran-Vesikeln spielt. Zur Beschreibung eines möglichen Signalweges, der WAVE1- und Dextran-Vesikel beeinflusst, wurde nach Interaktionspartnern von WAVE1 gesucht. Mit NCK-1 und PAK-1 konnten in der Immunfluoreszenz zwei mit WAVE1 kolokalisierende Proteine gefunden werden. Transfektionsversuche lassen den Schluss zu, dass PAK1 die Bildung von WAVE1-Vesikeln beeinflusst. Weitere Experimente mit verschiedenen Mutanten von NCK-1 geben Hinweise auf einen Zusammenhang zwischen NCK-1 und WAVE1. Dabei scheinen vor allem die drei SH3- Domänen von NCK-1 einen Einfluss auf die Bildung der Dextran-Vesikel zu besitzen. WAVE1 wird durch die sog. mitogen activated protein kinase (MAPK) beeinflusst (Miki et al., 1999). Eine Phosphorylierung von WAVE1 durch die MAPK konnte in der vorliegenden Arbeit nicht nachgewiesen werden. Jedoch konnte durch Verwendung eines Inhibitors der MAPK ein deutlicher Einfluss sowohl auf die Bildung der WAVE1-Vesikel als auch auf die Bildung der Dextran-Vesikel gezeigt werden. Dies lässt den Schluss zu, dass die MAPK, ob direkt oder indirekt, eine wichtige Rolle im Rahmen der Bildung von WAVE1- und Dextran-Vesikeln spielt. Es konnte ein hypothetisches Modell eines Signalweges von WAVE1 erstellt werden: Phagozytotische Stimuli wie Dextrane aktivieren die GTPase Rac. Dies führt zur Rekrutierung und Aktivierung von Effektorproteinen wie PAK1 und NCK-1. Aktiviertes NCK-1 bindet WAVE1 und kann dieses seinerseits an die Plasmamembran rekrutieren. Dort könnten bspw. an der Zellfront WAVE1-abhängig membrane ruffles entstehen. Durch einen möglichen positiven feedback loop wird die Aufnahme von Dextran erleichtert. Aktiviertes PAK1 aktiviert die MAPK und beeinflusst WAVE1. Durch die Aktivierung von WAVE1, NCK-1 und PAK1 erfolgt die Bildung von WAVE1-Vesikeln. Diese WAVE1-Vesikel kolokalisieren im Laufe des endolysosomalen Pathway mit den internalisierten Dextran-Vesikeln und werden wahrscheinlich Lysosomen zur Degradierung zugeführt.

Die Polymerisation von monomerem G-Aktin zu filamentösem F-Aktin, die Organisation von Aktin-Filamenten zu spezifischen Zytoskelettstrukturen, sowie die F-Aktin Depolymerisation stellen in ihrem dynamischen Zusammenspiel die Triebkraft vieler zellulärer Bewegungsvorgänge dar. Dies sind u.a. Zell-Polarisation, Zell-Migration, Zell-Teilung, Zell-Zell-Interaktionen, Phagozytose und intrazellulärer Vesikeltransport. Das Verständnis der molekularen Grundlagen der Aktin Organisation hat 1999 einen entscheidenden Fortschritt gemacht: damals wurde entdeckt, dass der sieben Untereinheiten umfassende Arp2/3 Komplex nach Aktivierung durch Proteine der Wiskott-Aldrich Syndrom Protein- (WASp-) Familie Aktin-Filamente de novo polymerisieren kann. Die Experimente für diese Dissertationsarbeit hatten zum Ziel, den Mechanismus der WASp-abhängigen Aktin Nukleation in vitro und in humanen Makrophagen genauer zu untersuchen. Einerseits sollten die Regionen von WASp genauer charakterisiert werden, die für die Aktivierung des Arp2/3 Komplexes verantwortlich sind. Andererseits sollte die Bedeutung von WASp und Arp2/3 Komplex bei der Aktin Nukleation in spezialisierten Adhäsionsstrukturen von Makrophagen, sogenannten Podosomen, geklärt werden. Podosomen sind essentiell für Adhäsion, Migration und vermutlich auch Gewebeinvasion von Makrophagen und ihnen verwandten Zellarten, aber sie finden sich auch in einer Vielzahl weiterer Zelltypen einschließlich metastasierender Tumorzellen. Die Bedeutung von Podosomen wird dadurch verdeutlicht, dass ihr Fehlen bei unter Wiskott-Aldrich Syndrom leidenden Patienten mit klinisch relevanten Immundefekten assoziiert ist. Zur Identifizierung der für die Aktin Nukleation minimal notwendigen WASp Regionen wurden verschiedene GST-Fusionskonstrukte der konstitutiv aktiven VCA (“Verprolin-like“, “Central“, “Acidic“) Domäne hergestellt. Durch Anisotropie Messungen und in GST-“Pulldown“ Versuchen wurde die Bindung von Arp2/3 Komplex und G-Aktin an die verschiedenen Konstrukte in vitro bestimmt. In einem zweiten Schritt wurde getestet, welche Regionen für die Arp2/3 Komplex Aktivierung notwendig sind. Dabei wurde GST-VC als die minimal notwendige Region für die Aktivierung der Aktin Nukleation identifiziert. Durch mikroskopische Analyse von in vitro nukleierten Aktin-Filamenten stellten wir fest, dass der durch GST-VC aktivierte Arp2/3 Komplex auch zur Ausbildung von Aktin-Filament Verzweigungen fähig ist. Die zellulären Effekte der VCA Konstrukte wurden mittels Mikroinjektion in primäre humane Makrophagen untersucht. Aktive Konstrukte führten zum Auftreten von prominenten Aktin-Aggregaten im Zytoplasma und zur Zerstörung von Podosomen. Auch hierbei war GST-VC das kürzeste Konstrukt, das vermutlich durch Aktivierung von zellulärem Arp2/3 Komplex, zur Zunahme des Gehaltes an intrazellulärem polymerisiertem Aktin führte. Obwohl die WASp-A Region als hochaffine Arp2/3 Komplex Bindungsstelle beschrieben worden war (Machesky und Insall, 1998), ist sie für die Arp2/3 Komplex Aktivierung nicht essentiell. Durch Koinjektion von WASp-A oder N-WASP-A mit aktiven GTPasen konnte ein erster experimenteller Hinweise für eine “Priming“- (Sensibilisierungs-) Funktion der A Region am Arp2/3 Komplex gefunden werden. Bei der Untersuchung der Aktin Nukleation und Organisation in Podosomen zeigte sich ein enger funktioneller Zusammenhang zwischen Aktin- und Tubulin-Zytoskelett. So konnte durch Depolymerisierung der Mikrotubuli in adhärierenden Monozyten die Ausbildung von Podosomen verhindert werden. Da bekannt war, dass WASp über seine Polyprolin Domäne an CIP4 (“CDC42 Interacting Protein“) bindet und dieses wiederum mit Mikrotubuli assoziiert, wurde der Einfluss der isolierten WASp-Polyprolin Domäne, aber auch von CIP4 Deletions-Konstrukten, denen entweder die Mikrotubuli oder WASp Bindungsstelle fehlten, auf die Podosomen-Ausbildung untersucht. Einem auf den so erhaltenen Ergebnissen basierendem Modell zufolge könnte WASp durch CIP4 an Mikrotubuli rekrutiert und anschließend via Mikrotubuli an Orte der Podosomen-Bildung transportiert werden. Dort könnte WASp dann zur Aktivierung von Arp2/3 Komplex und zur Nukleation von neuen Aktin-Filamenten führen.

Die hydrophilen pulmonalen Surfactantproteine A und D (SP-A, SP-D) gehören zur Gruppe der C-Typ Lektine und spielen bei der angeborenen, primären Immunantwort der Lunge eine Rolle. In mehreren Studien wurde gezeigt, dass SP-A und SP-D mit einer Reihe von Mikroorganismen und pulmonalen Entzündungszellen interagieren. In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion von SP-A und SP-D bei der Immunabwehr Mukoviszidose-assoziierter Keime wie Pseudomonas aeruginosa, Xanthomonas maltophilia, Burgholderia cepacia und Staphylococcus aureus untersucht. Hierzu wurden zunächst insgesamt 57 klinische Isolate der Bakterien, darunter 35 P. aeruginosa Stämme, durch Sero- beziehungsweise Pyozintypisierung, Alginatbildung oder Kollagenase-aktivität charakterisiert. Wir untersuchten, inwiefern Agglutination und Proliferation der Bakterien sowie die Phagozytose speziell von P. aeruginosa durch SP-A und SP-D beeinflusst werden können. Die hier gezeigten Ergebnisse demonstrieren, dass SP-A und SP-D an P. aeruginosa binden. Die Interaktion mit den Bakterien ist kalziumabhängig, wird durch einfache Kohlehydrate gehemmt und somit über die Lektin/Kohlehydrat-Bindungsstellen der Surfactantproteine vermittelt. Trotz Bindung an plastikadhärente P. aeruginosa induziert SP-A keine Agglutination der Bakterien. SP-D hingegen agglutiniert P. aeruginosa. Darüber hinaus hemmt SP-D unabhängig von der Agglutination konzentrationsabhängig das Wachstum von P. aeruginosa. SP-D stimuliert die Phagozytose von Bakterien, indem es als Opsonin die Aufnahme der Keime durch eine humane Makrophagen Zelllinie verstärkt. SP-A beeinflusste die Phagozytose der untersuchten Keime dagegen nicht. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass SP-A und SP-D unterschiedliche immunmodulatorische Funktionen haben. SP-D stimuliert durch verstärkte Phagozytose unabhängig vom LPS Serotyp die Abwehr Mukoviszidose-assoziierter Keime, speziell nicht mukoider P. aeruginosa. Beide Surfactantproteine binden spezifisch P. aeruginosa, aber nur SP-D induziert deren Agglutination und führt durch die Bildung von größeren Aggregaten möglicherweise zur Steigerung der pulmonalen Clearance der Bakterien.

Da die Prognose für Patienten mit Kopf-Hals-Karzinomen trotz Verbesserung der chirurgischen und strahlen- bzw. chemotherapeutischen Strategien unverändert schlecht ist, werden vermehrt immunologische Therapieansätze erforscht, die eine systemisch wirksame und gleichzeitig tumorspezifische Behandlung ermöglichen sollen. Dadurch soll die Häufigkeit von Lokalrezidiven und Metastasen gesenkt werden. Bispezifische Antikörper werden in diesem Zusammenhang als vielversprechende Therapieoption angesehen. Sie erkennen einerseits Tumorzellen und redirigieren andererseits Immunzellen an den Ort des Tumors. So soll eine immunologische Auseinandersetzung mit dem Tumor angestoßen werden. Komplette bispezifische Antikörper können darüber hinaus akzessorische Zellen binden. Diese Zellen besitzen die Fähigkeit zur Phagozytose und Präsentation phagozytierter Proteine. Hiervon verspricht man sich die Induktion eines langfristigen humoralen Gedächtnisses gegen den Tumor. In der vorliegenden Arbeit wurde der komplette bispezifische Antikörper BiUII (aEpCAM/aCD3) untersucht. Es wurde postuliert, dass dieses Molekül in der Lage sei, sogenannte Tri-Zell-Komplexe aus Tumorzellen, T-Zellen und akzessorischen Zellen zu vermitteln. Die Eingangsexperimente sollten daher die grundlegende Frage klären, welche Zellkontakte durch BiUII herbeigeführt werden können, und ob in vitro Tri-Zell-Komplexe darstellbar sind. Anschließend wurde die antitumorale Wirksamkeit des Antikörpers an Einzelzellen und an dreidimensionalen Tumorzell-Sphäroiden getestet. Mit immunzytochemischen Färbungen an Einzelzell-Präparaten konnte erstmals die Bildung von Tri-Zell-Komplexen nachgewiesen werden. Die durch BiUII angestoßene Immunreaktion führte innerhalb von wenigen Stunden zu einer effizienten Tumorzellelimination. Neben unspezifischen Mechanismen konnte die Phagozytose von Tumorzellen als ein Weg der BiUII-vermittelten Tumorzellzerstörung beobachtet werden. Wir konnten darüber hinaus zeigen, dass BiUII auch in Tumorzell-Sphäroiden, einem dreidimensionalen Modell für Mikrometastasen, zu einer vollständigen Elimination vitaler Tumorzellen führte, ohne dass hierfür die exogene Zufuhr immunstimulatorischer Substanzen erforderlich war. Die beschriebenen in vitro-Ergebnisse zeigen also zum einen, dass der bispezifische Antikörper BiUII diejenigen Anforderungen erfüllt, die aufgrund seiner Konstruktion gefordert wurden und zum anderen, dass das Molekül in vitro ein sehr hohes antitumorales Potential aufweist. Weiterführende Experimente werden unternommen, die die Mechanismen der Tumorzellzerstörung detaillierter beschreiben sollen. Darüber hinaus ist es Ziel der kommenden Untersuchungen, mögliche Komedikationen sowie andere Applikationsformen (z.B. intratumoral) zu testen, um die bei systemischer Gabe beobachteten Nebenwirkungen einzuschränken.

Die enterpathogenen Yersinia-Spezies unterlaufen die primären Abwehrmechanismen des Wirtes durch Einflußnahme auf Signaltransduktionskaskaden. Diese Subversion wird von einem 70 kDa Virulenzplasmid vermittelt, welches für ein Typ III Sekretion/Translokationsssystem und einige Virulenzfaktoren, sogenannte Yops (Yersinia outer proteins) kodiert. Die sechs bisher bekannten Effektor-Yops gelangen über das Sekretionssystem ins Zytoplasma von Makrophagen und Granulozyten, was in diesen zu einer Inhibition von Phagozytose, oxidative burst und Zytokinfreisetzung sowie zur Induktion der Apoptose führt. Ziel dieser Arbeit war es, die zellulären Angriffsproteine der Effektor-Yops YopM und YopO zu identifizieren. Als Methode diente das Yeast Two- Hybrid System. Es stellte sich heraus, dass YopM für diese Methode aufgrund seiner transskriptionsaktivierenden Eigenschaft nicht verwendbar ist. Dies und die Beobachtung, dass YopM in den Zellkern lokalisiert wird (77) deuten darauf hin, dass YopM möglicherweise als Transkriptionsfaktor in der Wirtszelle wirken könnte. Für YopO erbrachte die Two-Hybrid Untersuchung 31 positiv interagierende Klone, die als Rac1 (17 Klone, davon 4 unabhängige), Snk i.p. (11 Klone, davon 6 unabhängige) und Mus musculus spindlin (3 Klone) identifiziert werden konnten. Rac1 gehört zur Familie der Rho-GTPasen zu denen u.a. auch die Proteine RhoA und Cdc42 gehören. Diese kleinen G-Proteine sind in komplexer und in noch unvollkommen verstandener Weise an der Regulation vielfältiger Zellfunktionen beteiligt. Es konnte gezeigt werden, dass YopO neben Rac1 auch mit RhoA, nicht jedoch mit Cdc42 im Yeast Two-Hybrid System interagiert. Für YpkA, dem zu YopO homologen Protein aus Y. pseudotuberculosis zeigte sich das gleiche Interaktionsverhalten. Durch Koimmunopräzipitation konnten die Ergebnisse der Yeast Two-Hybrid Untersuchung mit einer zweiten, unabhängigen Methode bestätigt werden. Aus dem Zellysat von mit Yersinien infizierten humanen COS-Zellen, ließen sich RhoA und Rac1, nicht aber Cdc42 mit Hilfe von Anti-YpkA-Antikörpern koimmunopräzipitieren. In dieser Arbeit konnte mit zwei unabhängigen Methoden eine bis dahin unbekannte Affinität zwischen YpkA/YopO mit RhoA und Rac1 gezeigt werden. Es kann somit davon ausgegangen werden, dass RhoA und Rac1 die intrazellulären Angriffspunkte der Effektor- Yops YpkA bzw. YopO darstellen.