Podcasts about serotypen

Chlamydia trachomatis, kleine intrazellulären Bakterien, verursachen weltweit am häufigsten sexuell übertragbare Erkrankungen. Die verschiedenen Serotypen haben dabei ganz unterschiedliche klinische Erscheinungsformen. Till Koch und Axel Baumgarten reden über Chlamydien-Infektionen. Dr. Axel Baumgarten ist Facharzt für Allgemeinmedizin im Zentrum für Infektiologie Berlin Prenzlauer Berg (ZIBP) und im Vorstand der DAGNÄ (Deutsche Arbeitsgemeinschaft niedergelassener Ärzte in der … „Infektiopod#08 – Chlamydia“ weiterlesen

Sat, 18 Jul 2015 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/18891/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/18891/1/Frank_Andreas.pdf Frank, Andreas

Zusammenfassung Die enteropathogenen Yersinia-Arten Y. enterocolitica und Y. pseudotuberculosis verursachen neben Enteritiden und Enterokolitiden auch extraintestinale Erkrankungen wie reaktive Arthritis oder Erythema nodosum. In ihrem Infektionsverlauf zeigen sich allerdings zwischen diesen beiden Arten Unterschiede. So erfolgt eine Dissemination von Y. pseudotuberculosis meist in Form einer mesenterialen Lymphadenitis, im Falle von Y. enterocolitica hingegen kommt es zusätzlich zum Befall und zur Schädigung der weiter proximal und distal gelegenen Darmabschnitte im Sinne einer Enterokolitis. Bislang ist nicht geklärt, wodurch diese Unterschiede im Infektionsverlauf bedingt sind. Das Virulenzplasmid der enteropathogenen Yersinien kodiert für verschiedene Virulenzfaktoren, unter anderem für das Yersinia-Adhäsin YadA. Zwischen den YadA-Varianten der beiden Yersinia-Spezies und ihrer Serovare finden sich Unterschiede in der Aminosäuresequenz, die als Ursache für Unterschiede im Bindungsverhalten der Bakterien an EZM-Proteine diskutiert werden. Da die Bindung an Wirtsgewebe einen entscheidenden Schritt in der Pathogenese einer bakteriellen Infektion darstellt, könnten diese Unterschiede in YadA verantwortlich für die unterschiedlichen Infektionsmuster sein. Um dies zu klären, wurden yadA-Varianten und -Hybride aus beiden Arten in Y. enterocolitica Serotyp O:8, Stamm WA-314 als definiertem Expressionsprototyp eingebracht. Die verschiedenen Varianten wurden hinsichtlich ihres Bindungsverhaltens an immobilisierte EZM-Proteine und ihr Adhärenz- und Invasionsverhalten an HeLa-Zellen untersucht. Hierbei fand sich eine signifikant stärkere Bindung von Mutanten mit einem YadAent an Kollagen I und Fibronektin. In der Adhärenz an HeLa-Zellen konnte dieser Unterschied nicht dargestellt werden, aber alle yadA-positiven Stämme zeigten eine stärkere Adhärenz als die yadA-negativen Kontroll-Mutante. Allerdings ließ sich kein Unterschied der Zellinvasivität in HeLa-Zellen verglichen mit der Negativkontrolle nachweisen. Außerdem wurden zum Vergleich yadA-Knock-out-Mutanten von zwei Y. pseudotuberculosis-Stämmen erstellt. Diese wurden gemeinsam mit ihren Wildtyp-Stämmen mit den o. g. genannten Y. enterocolitica WA-314-Mutanten im oralen Mausinfektionsmodell verglichen. Hierbei fand sich kein Unterschied in der Virulenz zwischen den yadA-positiven und yadA-negativen Y. pseudotuberculosis-Stämmen. Hingegen war die yadA-Deletions-Mutante von Y. enterocolitica WA-314 nicht mausvirulent im Gegensatz zu den yadA-positiven Y. enterocolitica WA-314-Mutanten. Zusammenfassung ___________________________________________________________________________ 118 Die Ergebnisse der histologischen Auswertung von Milz und Peyerschen Plaques weisen auf einen unterschiedlichen Infektionsverlaufs von Y. enterocolitica im Vergleich zu Y. pseudotuberculosis hin. Allerdings zeigte sich auch hier, dass Unterschiede im Infektionserlauf für Y. enterocolitica WA-314 im Mausmodell nicht von der exprimierten YadA-Variante abhängig sind. Es zeigte sich, dass das yadA-Gen von verschiedenen Yersinia-Spezies, Serotypen und Stämmen nach Übertragung auf Y. enterocolitica WA-314 im vergleichenden Mausinfektionsmodell keinen Virulenzunterschied deutlich machte. Zudem konnte die Kopfregion, unter Nutzung der homologen Sequenzen im Konnektor-Bereich, ohne Virulenzminderung ausgetauscht werden. Zudem zeigte sich in dieser Arbeit, in Einklang mit Erkenntnissen, wonach die Kopfregion die EZM-Bindung vermittelt, dass nach einem solchen Austausch das Bindungsverhalten an Kollagen I und Fibronektin durch die Kopfregion bestimmt wurde. Die Analyse der Adhärenz an HeLa-Zellen zeigte allerdings, dass eine stärkere Kollagen I- und Fibronektin-Bindung nicht mit einer stärkeren Zellbindung einhergeht und somit kein ausreichender Prediktor für die Zellbindungsfähigkeit ist. Die Auswertung der Mausinfektionsversuche bestätigen, dass YadA für die Virulenz von Y. enterocolitica entscheidend ist, wohingegen Y. pseudotuberculosis auch ohne YadA seine volle Mausvirulenz behält. YadA, das für Y. enterocolitica ein wichtiger Virulenzfaktor ist, kann unter gewissen Voraussetzungen, wie für Y. pestis nachgewiesen, auch nachteilhaft für das Überleben im Wirt sein. Für Y. pseudotuberculosis könnten andere Virulenzfaktoren eine wichtigere Rolle spielen als YadA.

Gentherapie ist ein vielversprechender neuer Ansatz für die Tumortherapie. Daher ist die Entwicklung eines effizienten Vektorsystems von großer Bedeutung. Bisher wurden unterschiedliche Serotypen des Adeno-assoziierten Virus (AAV) beschrieben, welche einen erheblichen Unterschied im Tropismus für bestimmte Gewebearten und Zelltypen aufweisen. Daraufhin haben wir systematisch den effizientesten Serotyp unter den AAV Serotypen 1 bis 5 bezüglich der Effektivität des Gentransfers in humanen Tumorzellen untereinander verglichen. Um alle Einflüsse außer denen, die auf das Kapsid zurückzuführen sind, auszuschließen, enthalten alle fünf Serotypen die gleiche Transgen-Kassette, einheitlich flankiert von der ITR (Invertierte terminale Wiederholung = inverted terminal repeat) des AAV-Serotyp 2. AAV2 war der effizienteste Serotyp in einer Reihe klinisch relevanter Tumorzelllinien mit einer Transduktionseffizienz von über 99,5±0,2 % bei nur 1000 genomische Partikeln / Zelle. Transduktionseffizienzen um die 70 % konnte durch den Serotyp 1 in Prostata- und Zervixkarzinom und durch den Serotyp 3 in Prostata-, Mamma-, Kolon- und Zervixkarzinom beim Einsatz von 1000 genomischen Partikeln pro Zelle erzielt werden. AAV4 und AAV5 haben durchgehend schlecht transduziert. Die höchste Transduktionseffizienz unter den humanen Tumorzelllinien betrug für AAV4, 40,6±3,1 % und 25,4±2,2 % für AAV5 beim Zervixkarzinom. Die jüngsten Fortschritte in der AAV-Vektor-Technologie weisen darauf hin, dass AAV- basierte Vektoren für die Tumorgentherapie eingesetzt werden können. Unsere Vergleichsanalysen zeigen, dass AAV2 zwar der am vielversprechenste Kandidat für eine solche Anwendung ist, aber AAV1 und AAV3 auch als gute Alternativen verwendet werden können. Dies ist besonders dann von Bedeutung, wenn eine Anwendung mit AAV2 durch neutralisierende Antikörper verhindert wird. Gao et al. konnten zeigen, dass diese Serotypen trotz des Vorhandensein neutralisierender Antikörper gegen AAV2 zum effizienten Gentransfer befähigt sind. Die Transduktionseffizienz von AAV4 und AAV5 ist generell zu niedrig, was eine effiziente Anwendung in der Tumorgentherapie derzeit unmöglich macht. Bei Untersuchungen einiger muriner Zelllinien stellten wir fest, dass sie sich am besten von AAV1 transduzieren lassen. Um nachzuweisen, ob AAV1 generell murine Zellen besser transduziert als AAV2, müssten weitere Untesuchungen durchgeführt werden. Dies ist für die zukünftige AAV-Forschung von Bedeutung, da eine Bestätigung unserer Beobachtung bedeuten würde, dass die Ergebnisse aus den zahlreichen in-vivo-Experimenten mit Mäusen nicht auf den Menschen übertragbar wären.

Yersinien sind auf Grund ihres spezifischen Typ III-Proteinsekretionssystems (TTSS) in der Lage, nach Anlagerung an Zellen bakterielle Virulenzproteine in das Innere der Wirtszelle zu translozieren. Dies führt zu einer Zellparalyse und bei Makrophagen zum Zelltod. Eines der translozierten Virulenzproteine ist YopP/J, das die Signalwege der mitogenaktivierten Proteinkinasen (MAPK) sowie des Transkriptionsfaktors NF-kB in der Wirtszelle inhibiert. Es wird angenommen, dass YopP/J zur Familie der Cystein-Proteasen zählt. Es zeigt Homologien zu AvrRXV/AvrBst von Xanthomonas campestris, welches eine dem apoptotischen Zelltod vergleichbare sogenannte „Hypersensitive Reaktion (HR)“ bei Pflanzen auslösen kann. Die Bakterien der enteropathogenen Spezies Yersinia enterocolitica, welche nach oraler Aufnahme im terminalen Ileum durch M-Zellen in die Lymphfollikel der Peyerschen Plagues wandern, werden anhand ihrer Oberflächen-(O)- und Geißel-(H)-Antigene in verschiedene Serotypen unterteilt. Unsere Studien haben gezeigt, dass sich einzelne Y. enterocolitica-Serotypen in der Apoptoseinduktion bei Makrophagen unterscheiden. In der vorliegenden Arbeit wurde den Mechanismen der Apoptoseinduktion durch die verschiedenen Y. enterocolitica-Serotypen nachgegangen. Zunächst konnte YopP für die unterschiedlichen Apoptose-Effekte verantwortlich gemacht werden. Durch DNA-Austausch und der anschließenden Modifikation einzelner Aminosäuren zwischen YopP von Y. enterocolitica-Serotyp O8 und Y. enterocolitica-Serotyp O9 konnte Arginin (R) an Position 143 als essentielle AS der Effektordomäne von YopPO8 definiert werden. YopP von Y. enterocolitica-Serotyp O9 und Y. enterocolitica-Serotyp O3 besitzt an dieser AS-Position Serin (S). YopPO8 vermittelt deutlich stärker Apoptose als YopPO9 und YopPO3. Der erhöhten Apoptoseinduktion durch YopPO8 geht eine effiziente Unterdrückung der NF-kB-Aktivierung vorraus. Die Inhibition des antiapoptotischen NF-kB-Signalwegs durch YopP scheint Voraussetzung für die Apoptoseinduktion durch Yersinia zu sein. Des weiteren wurde in dieser Arbeit mit Hilfe des Hefe-2-Hybrid-Systems nach neuen unbekannten intrazellulären YopP-Interaktionspartner gesucht. Aus einer Maus-Milz-cDNA-Genbank konnten 22 potentielle YopP-Interaktionspartner isoliert werden. In in vitro-Bindungsstudien konnte bis zum jetzigen Zeitpunkt eine Interaktion von YopP mit vier Proteinen (PP2Ac, FWD2, eEf1bb, Smad1) bestätigt werden. Weiterführende Bindungs- und Funktionsanalysen werden noch durchgeführt. Die möglichen Auswirkungen dieser Interaktionen werden diskutiert. Die durchgeführten Studien erbrachten zudem Hinweise auf eine Modifikation von YopP in der Wirtszelle. Darüberhinaus konnte mit Hilfe des Hefe-2-Hybrid-Systems der Interaktionsbereich von YopP mit seinem Zielprotein IKKb eingeschränkt werden. Die durchgeführten Bindungsanalysen mit IKKb-Deletionsmutationen weisen auf eine Bindung von YopP an den IKKb-N-Terminus hin. Das Ergebniss wurde durch in vitro-Bindungsstudien bestätigt. Unter anderem scheint Alanin an IKKb-Position 120 die Interaktion mit YopP zu bestimmen. So konnten im Rahmen dieser Doktorarbeit unterschiedliche Aspekte der Wechselwirkung von Y. enterocolitica YopP mit der Wirtszelle und Wirtszellproteinen analysiert werden. Diese Studien tragen zum besseren Verständnis der Immunmodulation durch pathogene Bakterien bei.

In dieser Arbeit wurde die Methode der subtraktiven Hybridisierung angewandt, um neue Virulenzfaktoren zu finden, die spezifisch für hochpathogene Yersinia enterocolitica Stämme sind. Hierfür wurde die DNA eines nicht pathogenen „Treiber”-Stammes (Y. enterocolitica NF-O, Biotyp 1A) gegen die DNA eines hochpathogenen „Tester”-Stammes (Y. enterocolitica WA-314, Biotyp 1B) subtrahiert. Mit Hilfe der subtraktiven Hybridisierung konnten verschiedene Tester-spezifische Sequenzen ermittelt werden, die sowohl für bereits bekannte als auch neue potentielle Virulenzmarker kodieren. In dieser Arbeit konnte ein neues TypII-Sekretionscluster, genannt yts1 (Yersinia TypII Sekretion 1), ermittelt werden. Das yts1-Gencluster umfasst ein 13 kb großes Operon-ähnliches Modul, welches die Gene yts1C-S enthält. Mittels reverser Transkription/PCR konnte eine bevorzugte Transkription bei 37 °C gezeigt werden. Southern Blot-Analysen sowie PCR haben gezeigt, dass das yts1-Gencluster nur in den hochpathogenen Y. enterocolitica Stämmen vorkommt. Dagegen sind yts1-Gene weder in schwachpathogenen sowie apathogenen Y. enterocolitica Stämmen noch in Y. pseudotuberculosis- und Y. pestis-Isolaten zu finden. Durch Inaktivierung des yts1E-Gens in Y. enterocolitica wurde eine Mutante hergestellt und hinsichtlich Mauspathogenität mit dem Mutterstamm verglichen. Bei oraler Infektion der Mäuse erwies sich die yts1E-Mutante als attenuiert (geringere Keimzahlen) in Leber und Milz im Vergleich zum Mutterstamm. Im Gegensatz dazu konnte bei intravenöser Infektion der Mäuse kein Unterschied zwischen Mutante und Mutterstamm festgestellt werden. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass das TypII-Sekretionssystem die Erregerdissemination von den Peyer-Plaques in Milz and Leber fördert. Das yts1-Sekretionscluster grenzt stromabwärts an ein Gen, welches für ein potentielles Chitin-Bindungsprotein (ChiY) kodiert. ChiY ist ein mögliches Substrat des Yts1-Sekretons. Sequenzanalysen sagen voraus, dass ChiY ein 55-kDa Protein mit zwei definierten Chitin-Bindungsdomänen ist, von denen sich die eine Domäne am N- und die andere am C-Terminus des Proteins befindet. Es konnte gezeigt werden, dass rekombinantes ChiY Chitin bindet. Sequenzanalysen des zugänglichen fast kompletten Genoms von Y. enterocolitica 8081 (Biotyp 1B) führten zum Nachweis eines möglichen zweiten TypII-Sekretionscluster, das in dieser Arbeit als yts2 bezeichnet wird. Wie mittels PCR gezeigt werden konnte, kommt yts2 - im Gegensatz zu Y. pseudotuberculosis und Y. pestis - in allen getesteten pathogenen und apathogenen Y. enterocolitica-Stämmen vor. Reverse Transkriptionsanalysen/PCR zeigten, dass die yts2 - Gene bevorzugt bei 27 °C abgelesen werden. Mittels subtraktiver Technik konnte auch ein neues Insertionselement (IS1330) charakterisiert werden. Durch Southern Blot-Analysen konnte gezeigt werden, dass IS1330 nur in pathogenen Y. enterocolitica Serotypen vorkommt und somit für die epidemiologische Typisierung dieser Spezies eingesetzt werden kann. Diese Arbeit repräsentiert einen neuen Ansatz zur Aufklärung von unterschiedlichen intraspezifischen Genomsequenzen von Y. enterocolitica mit Hilfe der subtraktiven Hybridisierung, um unser Verständnis der genetischen Vielfalt und Heterogenität dieser bakteriellen Spezies zu erweitern. Das zum ersten Mal hier beschriebene yts1-Cluster repräsentiert einen neuen Lokus, der eine wichtige Rolle für die Pathogenese der hochpathogenen Y. enterocolitica Stämme spielt.