Podcasts about nachweisgrenzen

Die acidophilen und thermoresistenten Sporenbildner des Genus Alicyclobacillus spielen aufgrund der Bildung von Fehlaromen eine wichtige Rolle als Verderbserreger von Fruchtsäften, wobei dem Guajacol-produzierenden A. acidoterrestris eine besondere Bedeutung zukommt. Um den einfachen, schnellen und zuverlässigen Nachweis von A. acidoterrestris Sporen in verschiedenen Fruchtsäften zu ermöglichen, sollten erstmals spezifische poly- und monoklonale Antikörper (pAK und mAK) entwickelt und darauf basierend hochsensitive und selektive immunchemische Nachweisverfahren etabliert werden. Um eine umfassende und verlässliche Charakterisierung der entwickelten Antikörper zu gewährleisten, wurde eine Alicyclobacillus spp. Stammbibliothek (n = 61) aufgebaut. Die Identifizierung der Isolate erfolgte nach mikrobiologischen Kriterien sowie mittels Real-Time PCR, RAPD-Analysen dienten zur weiteren Differenzierung. Ein Pool aus vier verschiedenen, mittels Paraformaldehyd inaktivierten A. acidoterrestris Stämmen wurde zur Immunisierung von Kaninchen und Mäusen verwendet. Die spezifische Bindung der induzierten pAK an die Sporen konnte mittels Immunfluoreszenz bestätigt werden. Basierend auf den generierten polyklonalen Kaninchenseren wurde ein sensitiver Sandwich Enzymimmuntest (EIA) aufgebaut, die Nachweisgrenzen lagen bei durchschnittlich 5,0 x 10^3 Sporen/ml für die DSM-Referenzstämme, sowie 2,1 x 10^3 – 3,8 x 10^4 Sporen/ml für die untersuchten 38 A. acidoterrestris Isolate. Unter Verwendung der Stammbibliothek und weiterer aerober sowie anaerober Sporenbildner konnte die hohe Inklusivität sowie Exklusivität des Verfahrens bestätigt werden: Alle A. acidoterrestris Stämme wurden als positiv erkannt, während die meisten anderen Alicyclobacillus spp. Stämme, sowie die Vertreter von Nicht-Alicyclobazillen keine Reaktivität zeigten. Anwendungsstudien zeigten die Einsetzbarkeit des pAK-basierten EIA für den direkten Nachweis von Sporen in verschiedenen Fruchtsäften. Nach 48 stündiger Anreicherung der in BAT-Bouillon verdünnten und mit 1 Spore/ml künstlich kontaminierten Proben bei 45 °C konnte in allen untersuchten Fruchtsaftsorten reproduzierbar und zuverlässig A. acidoterrestris nachgewiesen werden. Auch die 16 generierten mAK reagierten entweder in indirekten oder Sandwich EIAs z. T. hochaffin mit Sporen von A. acidoterrestris, mit Nachweisgrenzen von 5,0 x 10^2 – 4,0 x 10^5 Sporen/ml. Ein etablierter mAK-basierter Sandwich EIA wies eine hohe Inklusivität und Exklusivität auf. Mittels Immunoblot konnte für 12 mAK eine ausgeprägte Reaktivität mit Sporenproteinen gezeigt werden, die reaktiven Banden lagen bei ca. 14, 50 bzw. 66 kDa.

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Entwicklung von monoklonalen Antikörpern (mAk) zum Nachweis verschiedener relevanter Cephalosporin-Rückstände. Zu diesem Zweck wurden einfache, schnelle und effiziente Verfahren zur Synthese von Cephalosporin-Protein-Konjugaten entwickelt. Zur Gewinnung von Antikörpern wurden Mäuse mit den entsprechenden, mittels aktiver-Ester-Methode an Trägerproteine gekoppelten Cephalosporinen immunisiert. Mittels Zellfusion konnten verschiedene Hybridom-Zelllinien etabliert werden, die mAk zum Nachweis von Cefalexin und Ceftiofur sezernierten. Des Weiteren gelang es erstmals, auch mAk zum Nachweis von Cefapirin, Cefoperazon und Cefquinom herzustellen. Basierend auf diesen mAk wurden verschiedene, hauptsächlich indirekt kompetitive EIA-Verfahren entwickelt und für die Analyse von Milch optimiert. Hinsichtlich der angestrebten Sensitivität waren die in der VO (EU) Nr. 37/2010 festgelegten Rückstandshöchstmengen (MRL-Werte) maßgeblich. Alle mAks waren in der Lage, ihr Ziel-Antibiotikum in Konzentrationen weit unterhalb des entsprechenden MRLWerts nachzuweisen; die Nachweisgrenzen der optimierten EIA-Verfahren betrugen 0,3 ng/ml (Ceftiofur), 0,4 ng/ml (Cefquinom), 2,7 ng/ml (Cefalexin), 6,1 ng/ml (Cefoperazon) bzw. 17,2 ng/ml (Cefapirin) und lagen damit ca. 3,5- bis 330-fach unterhalb dem jeweiligen Grenzwert. Die Spezifität der Antikörper wurde v. a. durch die C-7-Seitenkette des zur Immunisierung verwendeten Cephalosporins geprägt. Nachweisbare Kreuzreaktionen der mAks traten daher nur mit solchen Cephalosporinen auf, die einen strukturell verwandten C-7- Substituenten aufwiesen. Diese kreuzreaktiven Cephalosporine sind jedoch nicht zur Therapie Lebensmittel liefernder Tiere zugelassen. Mit Ausnahme von Ceftiofur ermöglichen die Antikörper daher den substanzspezifischen Nachweis von Cephalosporin- Rückständen in Lebensmitteln. Die Anwendbarkeit der etablierten EIA-Verfahren zum Nachweis von Rückständen in Milch wurde anhand künstlich dotierter Milchproben überprüft. In einem Konzentrationsbereich entsprechend dem ½-, 1- sowie 2-fachen des jeweiligen MRLWerts von 20 – 100 μg/kg wurden Wiederfindungsraten von 90 – 120 % erreicht. Damit stehen erstmals unter Routinebedingungen einsetzbare quantitative immunchemische Analyseverfahren zur Verfügung, die den spezifischen Nachweis fast aller der derzeit in der Therapie von Lebensmittel liefernden Tieren eingesetzten Cephalosporine weit unterhalb der festgelegten Rückstandshöchstmengen ermöglichen.

Nachdem die MRT- Darstellung von Gelenken beim Menschen zur Erkennung von ligamentären und chondralen Verletzungen heute Routine geworden ist, galt das Interesse der vorliegenden Studie einer optimalen Darstellung des Ge-lenkknorpels und Validierung von standardisierten Knorpeldefekten im Kniege-lenk des Hundes mit Hilfe der Hochfeld-Magnetresonanztomographie. Die klinische Relevanz der gewählten Fragestellung liegt zum einen in der Fest-legung minimaler Nachweisgrenzen als Voraussetzung für die diagnostische Zuverlässigkeit der Magnetresonanztomographie bei Gelenkknorpeldefekten ganz allgemein und zum anderen speziell im Kniegelenk des Hundes, das auf-grund seiner kleineren Größe und geringeren Gelenkknorpeldicke schwieriger zu beurteilen ist, als das Kniegelenk des Menschen, bei dem die MRT heute als Verfahren der Wahl zur Dokumentation von Knorpelschäden eingesetzt wird. Insbesondere sind Verlaufsbedingungen von Knorpelschäden unter Anwendung von Chondroprotektiva von großem Interesse, da die vielen auf dem Markt an-gebotenen Präparate hinsichtlich ihrer Wirkung bislang nicht hinreichend über-prüft sind. Erst wenn bekannt ist, bis zu welcher minimalen Größe Knorpel-schäden sicher als solche mit der MRT beurteilbar sind, können Heilungsverläu-fe nicht invasiv dokumentiert und objektiv bewertet werden. Als Untersuchungssequenz wurde die T1-FLASH-3D-WE-Sequenz gewählt, die sich beim Menschen schon länger zum Nachweis von Knorpelschäden etabliert hat. Sie wurde mit isotroper und anisotroper Darstellung gemessen. Für die Herstellung von standardisierten Knorpeldefekten mit einer Größe bis minimal 0,3 mm Tiefe wurde eine Methodik entwickelt, die reproduzierbare artefaktfreie Ergebnisse lieferte. Bei der Untersuchung mit der Magnetresonanztomographie wurden neben der Knorpeldicke alle Signalintensitäten, Signal-zu-Rausch- und Kontrast-zu-Rausch- Verhältnisse bestimmt. Es zeigte sich, dass Knorpeldefekte bis zu einer Größe von 3 mm Durchmesser und einer Tiefe von 0,4 mm in anisotroper Darstellung zuverlässig erkennbar sind. Des Weiteren wurde festgestellt, dass für eine optimale Sichtbarmachung des Gelenkknorpels und seiner Defekte eine geringe In-plane-Auflösung mit größerer Schichtdicke, wie in der anisotropen Darstellung, einem besseren Signal-zu-Rausch- und Kontrast-zu-Rausch- Verhältnis in der isotropen Darstel-lung vorzuziehen ist. Dies ist letztlich nur durch eine bessere anatomische „Schärfe“ der Anisotropie zu erklären, deren Effekte den SNR- und CNR- Effekt überkompensiert. Für geplante Verlaufskontrollen von Knorpelschäden liefern diese Erkenntnisse gute Grundlagen zur Beurteilung von Knorpelregeneration und deren zeitliche Einschätzung.