Podcasts about real time pcr

When it comes to assessing the microbiome, technology continuously evolves. With that, our understanding of the microbiome deepens. There is a lot of confusion out there regarding technology. Companies use marketing spin to lead you to believe the newest is the best when in fact, every technology has its strengths and weaknesses. No one method can capture the entire dynamic of the microbiome. Here at Genova, we use many methods to give you the most complete look at overall gut health. Today we simplify the science behind laboratory assays used to study the microbiome – culture, qPCR, metagenomics, and transcriptomics. Every method has its advantages and disadvantages. We're cutting through the confusion with no marketing spin, just the facts. Today on The Lab Report: 3:30 So much confusion around laboratory methods - why should we care? 7:45 Culture technology is old but still so important 11:10 Conventional PCR and qPCR (aka Real-Time PCR) 15:40 Beware of these qPCR shortcomings 19:50 Next-Gen Sequencing 21:40 Metagenomics – not all labs are created equally!! 26:55 The vital role of taxonomy libraries 30:30 Transcriptomics and assessing RNA Additional Resources: GI Effects Microbiomix Genova Connect               PROMO CODE:  TheLabReport20 for 20% off Subscribe, Rate, & Review The Lab Report Thanks for tuning in to this week's episode of The Lab Report, presented by Genova Diagnostics, with your hosts Michael Chapman and Patti Devers. If you enjoyed this episode, please hit the subscribe button and give us a rating or leave a review. Don't forget to visit our website, like us on Facebook, follow us on Twitter, Instagram, and LinkedIn. Email Patti and Michael with your most interesting and pressing questions on functional medicine: podcast@gdx.net. And, be sure to share your favorite Lab Report episodes with your friends and colleagues on social media to help others learn more about Genova and all things related to functional medicine and specialty lab testing. To find a qualified healthcare provider to connect you with Genova testing, or to access select products directly yourself, visit Genova Connect. Disclaimer: The content and information shared in The Lab Report is for educational purposes only and should not be taken as medical advice. The views and opinions expressed in The Lab Report represent the opinions and views of Michael Chapman and Patti Devers and their guests.See omnystudio.com/listener for privacy information.

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2023.07.19.549725v1?rss=1 Authors: Parkins, E. V., Brager, D. H., Rymer, J. K., Burwinkel, J. M., Rojas, D., Tiwari, D., Hu, Y.-C., Gross, C. Abstract: MicroRNAs are an emerging class of synaptic regulators. These small noncoding RNAs post-transcriptionally regulate gene expression, thereby altering neuronal pathways and shaping cell-to-cell communication. Their ability to rapidly alter gene expression and target multiple pathways makes them interesting candidates in the study of synaptic plasticity. Here, we demonstrate that the proconvulsive microRNA miR-324-5p regulates excitatory synapse structure and function in the hippocampus of mice. Both Mir324 knockout (KO) and miR-324-5p antagomir treatment significantly reduce dendritic spine density in the hippocampal CA1 subregion, and Mir324 KO, but not miR-324-5p antagomir treatment, shift dendritic spine morphology, reducing the proportion of thin, 'unstable' spines. Western blot and quantitative Real-Time PCR revealed changes in protein and mRNA levels for potassium channels, cytoskeletal components, and synaptic markers, including MAP2 and Kv4.2, which are essential for long-term potentiation (LTP). In line with these findings, slice electrophysiology revealed that LTP is severely impaired in Mir324 KO mice, while baseline excitatory activity remains unchanged. Overall, this study demonstrates that miR-324-5p regulates dendritic spine density, morphology, and plasticity in the hippocampus, potentially via multiple cytoskeletal and synaptic modulators. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info Podcast created by Paper Player, LLC

This episode features Emerson Rogers, the NTD case management lead in the Ministry of Health Liberia and Eric Whey, the mental health and psychosocial coordinator for Grand Bassa County Health Team, Liberia. Together they discuss how Neglected Tropical Diseases (NTDs) and mental health services are being integrated at the primary health care level and the importance of advocating for sustained services for tackling mental health more generally. Tosin Adekeye, our co-host for this series discusses the cultural, logistical and community aspects that are being considered and the lessons that could be applied in other similar contexts.  Dr. Oluwatosin Adekeye Assistant Director of Clinical Psychology, Department of Psychiatry Ahmadu Bello University Hospital Zaria Kaduna A social scientist with varied experience in both clinical and research aspects of health among communities in Northern Nigeria. As a Clinical Psychologist, his work has been both on mental and behavioral disorders and the effects of chronic disease on the well-being of patients and caregivers. As a Social Scientist, he just concluded a study that documented the well-being of people with stigmatizing skin diseases and established a care and support group within the community. More recently he is working on developing a well-being tool for parents and children with disability.  Twitter: @TosinOluw, @Sightsavers Eric T. Weah Mental Health and Psychosocial support pillar lead for EBOLA and the COVID 19 RESPONSE, lecturer at the Grand Bassa Community College.  The mental health department (MHD) is part of the community health department and works with programs to consider a more holistic biopsychosocial approach. This approach seeks to look at the psychological impact that a condition will have on an individual, the family, the community and society at large. It also provides services for the vulnerable groups such as people living with disability, those in prison and at-risk youth. The mental health department also developed the user group and collaborative approach with faith based organisation, traditional healers and religious leaders to help in improve mental health care. The MHD also works with the Community Health Focal persons to ensure community health workers identify, follow up and refer cases to service delivery point for management. Emerson Rogers National Coordinator for Case Management of Neglected Tropical Diseases (NTDs) Management Committee member- REDRESS  Ministry of Health, Liberia  Mr Emerson Rogers has a key role in the Management Committee of REDRESS providing ongoing guidance and support as the National Coordinator for Case Management NTDs in Liberia.  He manages the coordination of all Case Management, project planning, implementation, supervision, research, and timely reporting of progress. Enforcing strategies to ensure adherence to timely interventions for NTDs. Emerson has 14 years' experience working as a Ministry of Health clinician in Liberia in several hospitals.  He served as Clinical Coordinator at the National Ebola Treatment Unit and served as Master Trainer Team Lead for Keep Safe Keep Serving. Emerson served as National Program Director for the Men's Health Screening Program- MOH between 2015-2017. He worked alongside WHO and CDC UK and was responsible for conducting Real Time PCR testing of the semen of Ebola survivors to determine it contained fragments of the virus and therefore help to get a better understanding of the persistence of the virus in the semen of male survivors.  Twitter: @redress_liberia 

Escaping Continuous Contagion (3) (Audio) David Eells - 11/21/21 The Apostate Leadership of God's People Removed   History must repeat.  Ecc 1:9-10  That which hath been is that which shall be; and that which hath been done is that which shall be done: and there is no new thing under the sun.  10  Is there a thing whereof it may be said, See, this is new? it hath been long ago, in the ages which were before us.   History shows that before the DS Babylon is completely taken down by Cyrus Trump, DS must take down the apostate leadership of God's people. This is because the people in Babylonish religious bondage must be set free to follow the Moses type, reformer Man-child leadership into the tribulation wilderness.  Eze 12:12-16 And the prince (This is Zedekiah, representing the apostate leadership of God's people) that is among them shall bear upon his shoulder in the dark, and shall go forth: they shall dig through the wall to carry out thereby: he shall cover his face, because he shall not see the land with his eyes. 13 My net also will I spread upon him, and he shall be taken in my snare; and I will bring him to Babylon to the land of the Chaldeans; yet shall he not see it, though he shall die there. 14  And I will scatter toward every wind all that are round about him to help him, and all his bands; and I will draw out the sword after them. 15  And they shall know that I am Jehovah, when I shall disperse them among the nations, and scatter them through the countries. 16  But I will leave a few men of them from the sword, from the famine, and from the pestilence; that they may declare all their abominations among the nations whither they come; and they shall know that I am Jehovah. While we agree that the Babylonish religious leadership is already in captivity spiritually they are still in control and that must be removed . Jer 21:4-10  Thus saith Jehovah, the God of Israel (Representing God's NT people today), Behold, I will turn back the weapons of war that are in your hands, wherewith ye fight against the king of Babylon, and against the Chaldeans that besiege you, without the walls; and I will gather them into the midst of this city. 5  And I myself will fight against you with an outstretched hand and with a strong arm, even in anger, and in wrath, and in great indignation. (This is because they have departed from the covenant as written to make up their own covenant and Jesus.) 6  And I will smite the inhabitants of this city (The apostate Jerusalem leadership), both man and beast: they shall die of a great pestilence. 7  And afterward, saith Jehovah, I will deliver Zedekiah king of Judah, and his servants, and the people, even such as are left in this city from the pestilence, from the sword, and from the famine, into the hand of Nebuchadrezzar king of Babylon, and into the hand of their enemies, and into the hand of those that seek their life: and he shall smite them with the edge of the sword; he shall not spare them, neither have pity, nor have mercy. 8  And unto this people thou shalt say, Thus saith Jehovah: Behold, I set before you the way of life and the way of death. 9  He that abideth in this city shall die by the sword, and by the famine, and by the pestilence; but he that goeth out, and passeth over to the Chaldeans that besiege you, he shall live, and his life shall be unto him for a prey. 10  For I have set my face upon this city for evil, and not for good, saith Jehovah: it shall be given into the hand of the king of Babylon, and he shall burn it with fire. (Like these two texts we still get regular warning in our morning meeting that Babylon will strike again. The Lord showed us that we could not pray away completely the effects of the DS plagues for he would use them to drain the swamp in the Church and even take some home who are innocent.)   The Alliance is slowly wiping out the DS leadership They are ratting on each other - https://realrawnews.com/  - look at each category. This has been happening for years and it is a huge job. Cyrus won battles before he took the city of Babylon. Confusion comes when people see someone in public who looks like the person arrested.  Both the DS and the Alliance are replacing these people with doubles or clones for opposite purposes.  Before Trump was elected the first time I told you he would be. Then I told you history would repeat and that he is God's modern day Cyrus, who conquered the Babylonian DS and set the people of God free from Babylonish apostasy to rebuild the Temple in Jerusalem, which is God's people.   Over 4 1/2 years ago I warned you when the Lord told us that man made plagues were coming to destroy multitudes. At that time God gave us dreams of particular enemies being killed by God in the religious and secular realm by the plagues, which hasnt happened yet, meaning something bigger is still coming.  Now the DS is losing the battle with the Alliance and are desperate to cause enough pain that the Alliance will back off their prosecution and execution of the the DS murderers. These de-populationist (eugenicists) have released worse plagues just like the ones in Revelations, which the Lord has said there is no cure for but His. /books/pdf/GV.pdf  Desperate people do desperate things, like loose more and worse plagues. I believe quarantine Lockdowns are coming again. Get supplies to stay indoors. C-19 is not the real killer. The DS population control vax is. Studies have shown Marburg, Ebola, and Aids are in the fake vax too and also ready to be released by other means too.  https://thetruereporter.com/doctor-exposes-the-truth-marburg-ebola-aids-all-is-hidden-inside-the-vaxx  https://tv.gab.com/channel/realstewpeters/view/doctor-marburg-aids-ebola-in-vaxx-618d6e68b3d7d282f9f12e9e  And the booster is 10 times more deadly than the first two jabs.  Some received placebos (saline solution) in the beginning so that the crime would not be discerned immediately.   The Death Jab James Red Pill: Dr. Vladimir Zelenko drops many proofs of the depopulation conspiracy. Very few medical experts have the courage to speak out about the DEMONIC DEMOCRATS' DASTARDLY DEPOPULATION plan. https://rumble.com/vp1a8j-breaking-news-presentation-dr.-zelenko-potus-trumps-doctor-just-risked-ever.html  Smallpox has conveniently been discovered at the CDC, which is DS to the core. This is either a distraction from the vaccine plagues above or a threat of greater things coming if the Alliance doesnt back off the arrests. https://strangesounds.org/2021/11/next-smallpox-pandemic-vials-labeled-smallpox-vaccine-research-facility-pennsylvania-video.html CIA spooks are attempting to defect to the Alliance? We know these people from our own DS faction because they have the same demons. They want to sneak back in but are not capable of repenting of witchcraft, fornication, perversion, hatred, slander, lying, and stealing demons. https://realrawnews.com/2021/11/deep-state-cia-spooks-defecting-to-white-hats/  I suggest taking them into custody and giving them a chance to tell the known truth, which will prove who they are.   On Nov 11, 2021 Missy Pollock sent this:    A Deadly Winter Glynda Lomax - 9/21/19 (David's notes in red) Prepare My children, for an intense winter comes your way and death rides on its winds. There will be much lack and hunger and need of heat. Your little ones will starve if you do not prepare. Prepare, for darkness comes your way. This is not a winter such as you have seen before, this one brings new dangers. I warn that you may prepare. Many will not heed My warning and death will claim them. This is a time to walk in much wisdom and prudence, that you may be spared from the jaws of death a little longer. Prepare for lack, for hunger and for cold. Prepare that you may stay warm in this time. Warn your loved ones. A deadly winter comes your way. Proverbs 6:6-8  Go to the ant, thou sluggard; consider her ways, and be wise: 7 Which having no guide, overseer, or ruler, 8 Provideth her meat in the summer, and gathereth her food in the harvest. Hebrews 11:7  By faith Noah, being warned of God of things not seen as yet, moved with fear, prepared an ark to the saving of his house; by the which he condemned the world, and became heir of the righteousness which is by faith. Proverbs 22:3 A prudent man foreseeth the evil, and hideth himself: but the simple pass on, and are punished. https://wingsofprophecy.blogspot.com/2019/09/a-deadly-winter.html?m=1 This message in video form: https://youtu.be/s5A8PcdsOf0 Below is more detail about what Glynda saw in the Spirit concerning the Dark Winter. She said, "This is a little more detail on the deadly winter and a couple more things I have NOT been able to shake about what is soon coming. The next two days after I made the Deadly Winter video, I kept seeing in my spirit that people were dying in their houses and no one could come and remove the bodies, ... I also saw that no police or ambulances were running. (Editors note: It is because of the fear of contagion of the Pestilences) https://m.youtube.com/watch?v=4iYxVBpDQjs    Yes, I think it will be like AA Allens vision of being sprayed from planes and killing very quickly.  Possibly paralyzing the lungs like the pestilent coral snake snow in Eve's dream.   Vision to Evangelist A.A. Allen in the 1950s  ...As I looked, suddenly from the sky I saw a giant hand reach down. That gigantic hand was reaching out toward the Statue of Liberty. In a moment her gleaming torch was torn from her hand, and in it instead was placed a cup; and I saw protruding from that great cup a giant sword, shining as if a great light had been turned upon its glistening edge. Never before had I seen such a sharp, glistening, dangerous sword. It seemed to threaten all the world. As the great cup was placed in the hand of the Statue of Liberty, I heard these words, "Thus saith the Lord of hosts, drink ye and be drunken and spue and fall and rise no more because of the sword which I will send". As I heard these words, I recognized them as a quotation from Jeremiah 25:27. I was amazed to hear the Statue of Liberty speak out in reply, "I WILL NOT DRINK!" Then as the voice of the thunder, I heard again the voice of the Lord saying, "Ye shall certainly drink". (Jeremiah 25:28) Then suddenly the giant hand forced the cup to the lips of the Statue of Liberty, and she became powerless to defend herself. The mighty hand of God forced her to drink every drop from the cup. As she drank the bitter dregs, these were the words that I heard: "Should ye be utterly unpunished? Ye shall not be unpunished, for I will call for a sword upon all the inhabitants of the earth, saith the Lord of hosts". (Jeremiah 27:29) When the cup was withdrawn from the lips of the Statute of Liberty, I noticed the sword was missing from the cup, which could mean but one thing. THE CONTENTS OF THE CUP HAD BEEN COMPLETELY CONSUMED! I knew that the sword merely typified war, death, and destruction, which is no doubt on the way. ... I saw the Statue of Liberty become unsteady on her feet and begin to stagger and to lose her balance. I saw her splashing in the gulf, trying to regain her balance. I saw her stagger again and again and fall to her knees. As I saw her desperate attempts to regain her balance and rise to her feet again, my heart was moved as never before with compassion for her struggles; but as she staggered there in the gulf, once again I heard these words: "Drink ye and be drunken and spue and fall and rise no more because of the sword which I will send among you". (Jeremiah 25:37) ...Then as I watched, another amazing thing was taking place. Far to the northwest, just out over Alaska, a huge, black cloud was arising. As it rose, it was as black as night. It seemed to be in the shape of a man's head. As it continued to arise, I observed two light spots in the black cloud. It rose further, and a gaping hole appeared. I could see that the black cloud was taking the shape of a skull, for now the huge, white, gaping mouth was plainly visible. Finally, the head was complete. Then the shoulders began to appear; and on either side, long, black arms. It seemed that what I saw was the entire North American continent, spread out like a map upon a table with this terrible skeleton-formed cloud arising from behind the table. It rose steadily until the form was visible down to the waist. At the waist the skeleton seemed to bend toward the United States, stretching forth a hand toward the east and one toward the west--one toward New York and one toward Seattle. As the awful form stretched forward, I could see that its entire attention seemed to be focused upon the United States, overlooking Canada at least for the time being. As I saw the horrible black cloud in the form of a skeleton bending toward America, bending from the waist over, reaching down toward Chicago and out toward both coasts, I knew its one interest was to destroy the multitudes. As I watched in horror, the great black cloud stopped just above the Great Lakes region and turned its face toward New York City. Then out of the horrible, great gaping mouth began to appear wisps of white vapor which looked like smoke, as a cigarette smoker would blow puffs of smoke from his mouth. These whitish vapors were being blown toward New York City. The smoke began to spread until it had covered all the eastern part of the United States. Then the skeleton turned to the west and out of the horrible mouth and nostrils came another great puff of white smoke. This time it was blown in the direction of the west coast. In a few moments' time the entire West Coast and Los Angeles area were covered with its vapors. Then toward the center came a third great puff. As I watched, St. Louis and Kansas City were enveloped in its white vapors. Then on they came toward New Orleans. Then on they swept until they reached the Statue of Liberty where she stood staggering drunkenly in the blue waters of the gulf. As the white vapors began to spread around the head of the statue, she took in but one gasping breath and then began to cough as though to rid her lungs of the horrible vapors she had inhaled. One could readily discern by the coughing that those white vapors had seared her lungs. ...As I watched, the coughing grew worse. It sounded like a person about to cough out his lungs. The Statue of Liberty was moaning and groaning. She was in mortal agony. The pain must have been terrific, as again and again she tried to clear her lungs of those horrible white vapors. I watched her there in the gulf as she staggered, clutching her lungs and her breast with her hands. Then she fell to her knees. In a moment she gave one final cough, made a last desperate effort to rise from her knees, and then fell face forward into the waters of the gulf and lay still as death. Tears ran down my face as I realized that she was dead! Only the lapping of the waves, splashing over her body which was partly under the water and partly out of the water, broke the stillness. (Editors note: This is not saying all of the US will die but Liberty will die. The lockdown and failure of supplies that will surely follow these plagues will take away Liberty. The US will recover as the DS falls.) "A fire devoureth before them, and behind them a flame burneth; the land is as the Garden of Eden before them, and behind them a desolate wilderness, yea, and nothing shall escape them". (Joel 2:3) Suddenly the silence was shattered by the screaming of sirens. The sirens seemed to scream, "RUN FOR YOUR LIVES!" Never before had I heard such shrill, screaming sirens. They seemed to be everywhere--to the north, the south, the east, and the west. There seemed to be multitudes of sirens; and as I looked, I saw people everywhere running, but it seemed none of them ran more than a few paces, and then they fell. And even as I had seen the Statue of Liberty struggling to regain her poise and balance and finally falling for the last time to die on her face, I now saw millions of people falling in the streets, on the sidewalks, struggling. I heard their screams for mercy and help. I heard their horrible coughing as though their lungs had been seared with fire. I heard the moanings and groanings of the doomed and the dying. As I watched, a few finally reached shelters, but only a few ever got to the shelters. Above the moaning and the groaning of the dying multitudes, I heard these words: "A noise shall come even to the ends of the earth, for the Lord hath a controversy with the nations. He will plead with all flesh; he will give them that are wicked to the sword, saith the Lord. Thus saith the Lord of hosts, Behold, evil shall go forth from nation to nation, and a great whirlwind shall be raised up from the coasts of the earth, and the slain of the Lord shall be at that day from one end of the earth even unto the other end of the earth. They shall not be lamented, neither gathered, nor buried; they shall be dung upon the ground". (Jeremiah 25:31-33) ...Then to my ears came another sound--a sound of distant singing. It was the sweetest music I had ever heard. There was joyful shouting and sounds of happy laughter. Immediately I knew it was the rejoicing of the saints of God. I looked, and there, high in the heavens, above the smoke and poisonous gases, above the noise of the battle, I saw a huge mountain. It seemed to be of solid rock, and I knew at once that this was the Mountain of the Lord. The sounds of music and rejoicing were coming from a cleft high up in the side of the rock mountain. It was the saints of God who were doing the rejoicing. It was God's own people who were singing and dancing and shouting with joy, safe from all the harm which had come upon the earth, for they were hidden away in the cleft of the rock. There in the cleft they were shut in, protected by a great, giant hand which reached out of the heavens and which was none other than the hand of God, shutting them in until the storm be overpassed. Missy also found this: The Next Plague Will Be Worse Glynda Lomax - 10/2/20 (Missy's notes in green) (David's Notes in Red)   I was thinking this week about how winter is coming, Covid-19 is still hanging around and that I saw another plague coming before Covid-19 is gone. And this next one is more deadly and kills faster. It keeps coming back to me, so I need to make clear what I keep seeing. This is not a “Thus saith the Lord,” this is a “I saw this and believe it is coming.” The next plague will be released by someone, it looks like, in mild weather or in an area where there is mild weather at the time. In the Spirit, I hear a hissing, like the sound an aerosol can makes, and I wondered if the virus is in a container that the person opens and just sets it down somewhere. (Missy: From what she describes it makes me think of it being sprayed from planes. This may be what Eve saw in her dream with the poisonous snakes/deadly snow falling.) This new plague will kill very quickly. I keep hearing three days. And you will SEE it on people. Some kind of sores on their upper bodies – they look an inch or so across to me, and there are lots of them. I can't see their lower bodies, I think they're wearing pants. It makes them very ill and they don't last long. This one is 100 percent released by man and done on purpose. And it has to do with blaming someone. Something about releasing it has to do with wanting to cause blame. … (The DS is releasing this but they will surely blame Trump because conservatives and forsaking the Vaccines.) Because this virus will be released on purpose and to cause blame, ... there will be no warning whatsoever when the mystery illness starts killing people. (Marburg, Aids, and Ebola will spread from the vaccinated as we have seen. But Smallpox can spread from planes.) It will spread very fast from those people. May God have mercy on His own.  Seeing this plague in the spirit again made me think of the following verse. I'm not saying this plague is a judgment –He did not say that, only that it brought this verse to mind. Take Refuge from the Coming Judgment. Isaiah 26:20 Come, my people, enter your chambers, And shut your doors behind you; Hide yourself, as it were, for a little moment, Until the indignation is past. (As in A.A. Allens saints in the cleft of the rock) Missy sent this on 11/16/21 and said, "This may be the new plague released that Glynda Lomax saw since there were sores on people. The article says that there's a concern that it could be released as as bioweapon. The vaccine for it is very harmful and would not be good to vaccinate people except in extreme cases." According to the Mayo Clinic: Smallpox is a contagious, disfiguring and often deadly disease that has affected humans for thousands of years. Naturally occurring smallpox was wiped out worldwide by 1980 — the result of an unprecedented global immunization campaign. Samples of smallpox virus have been kept for research purposes. And advances in synthetic biology have made it possible to create smallpox from published amino acid sequences. This has led to concerns that smallpox could someday be used as a biological warfare agent. No cure or treatment for smallpox exists. A vaccine can prevent smallpox, but the risk of the vaccine's side effects is too high to justify routine vaccination for people at low risk of exposure to the smallpox virus. The first symptoms of smallpox usually appear 10 to 14 days after you're infected. During the incubation period of seven to 17 days, you look and feel healthy and can't infect others. Following the incubation period, a sudden onset of flu-like signs and symptoms occurs. A few days later, flat, red spots appear first on your face, hands and forearms, and later on your trunk. Within a day or two, many of these lesions turn into small blisters filled with clear fluid, which then turns into pus. Scabs begin to form eight to nine days later and eventually fall off, leaving deep, pitted scars. Lesions also develop in the mucous membranes of your nose and mouth and quickly turn into sores that break open.   My Email to the President in 2020 David Eells Prepare for a second Plague not like the first.  I told you that Covid 19 did not fulfill all that the Lord told us three years ago that He would do with the plague to bring down the factions and apostates and that I expected more plague. Then we received this: On Jul 6, 2020, William Steenland had this dream: In this dream the Lord allowed me to follow these satanists into a very rich high rise private apartment condo in NY.  I knew that they had infiltrated the CDC and WHO and were executing a plan for their satanic New World Order. The dream changed and I was still in the same condo at a small medical facility where people were dropping like flies from some unknown pathogen or contagion. There were three women and two men who were so sick they were unable to function. I tried to grab the one woman closest to me while she was falling. In the dream I knew the elite were experimenting with the next Plandemic. I said ma'am ma'am what's wrong get up ? Again and again, but she was dead.  I went over to the nurse who was in a back room. I could tell she knew something and was divided about it. She was very sad and on her knees. I knew it was partially because she was totally helpless to assist or medicate the sick that were there. I picked her up off the ground and somewhat screamed at her ”what is happening to these people?” She told me “don't ask me that question” as she cried in fear and sadness. I yelled again for her to tell me everything you know,  what's happening to these people?! She again told me not to ask that question. She knew they were victims of a trial run for the next pandemic. In the dream I just knew it. That's is the info that kept coming to me in the dream, next plandemic and trial run experiment.    The Next Scamdemic to be Rolled Out is Marburg Virus Sent to UBM by Frances McKenzie - 10/12/21     The next scamdemic to be rolled out is Marburg. The adverse reactions to the current v@x will be blamed on a deadly outbreak of Marburg. Special jab and test are ready to be deployed. End game is depopulation. https://t.me/songsofascent/9444 Please see previous posts starting here https://t.me/songsofascent/9121     Marburg Virus Disease | CDC Marburg virus disease (MVD) is a rare but severe hemorrhagic fever which affects both people and non-human primates. MVD is caused by the Marburg virus, a genetically unique zoonotic (or, animal-borne) RNA virus of the filovirus family. The six species of Ebola virus are the only other known members of the filovirus family. Marburg virus was first recognized in 1967, when outbreaks of hemorrhagic fever occurred simultaneously in laboratories in Marburg and Frankfurt, Germany and in Belgrade, Yugoslavia (now Serbia). Thirty-one people became ill, initially laboratory workers followed by several medical personnel and family members who had cared for them. Seven deaths were reported. The first people infected had been exposed to Ugandan imported African green monkeys or their tissues while conducting research. One additional case was diagnosed retrospectively. The reservoir host of Marburg virus is the African fruit bat, Rousettus aegyptiacus. Fruit bats infected with Marburg virus do not show obvious signs of illness. Primates (including people) can become infected with Marburg virus, and may develop serious disease with high mortality. Further study is needed to determine if other species may also host the virus.  Marburg (Marburg Virus Disease) | CDC Urgent message from university hospital manager and academic Kieran Morrissey. VIDEO (freedommedia Published September 30, 2021)     COVID FADES AS HEMORRHAGIC FEVER RISES?: BEWARE covid-fades-haemorrhagic-fever-rises-beware Beware of narrow thinking. You have suffered 18 months of fake pandemic & been assaulted from every direction. Covid is being more widely exposed as fake, & there is growing awareness that the vaccines are indeed a weapon of mass destruction. As this article warns, the globalists have had the next plan in place for years & the weakened Vax population will be truly on track to follow the Great Reset, to a world population reduced by 6.5 billion peiple.   A Possible Marburg-RiVax Final Solution By Kieran Morrissey - 9/22/21 While it would now appear from Mainstream Media's propaganda and the relaxation of some of the draconian restrictions on freedom, that the war on the COVID pandemic war is being won, however I believe that this is a ruse, reinforcement part of a larger PSYCOPS to complete an ongoing Eugenics agenda. Features of the COVID-19 pandemic are very worrying as follows: – COVID-19 disease has now been overwhelmingly proven to be just another treatable cold / Influenza which was medically mis-managed by denying early treatment which caused premature deaths in very elderly and people with underlying health conditions, this gave the misconception that there were excess deaths occurring and created mass hysteria. Mainstream Media coverage of a possible Wuhan Lab virus leak heightened the fear that a perceived sudden increase in deaths could have been the result of a deadly bioweapon escape and caused further panic to develop a vaccine to stop the spread of COVID, it was stated that this would take at least 10 years further raising public fears. The use of the now debunked real-time PCR test to diagnose COVID produced large numbers of positive results, dubbed “cases” without any symptoms, i.e. asymptomatic infections which are known not to exist, and this further terrorised the population. We now know that at least 97% of those positive results were false due the excessive cycle thresholds used in testing labs. Real-time PCR was developed as a research tool and is considered not suitable for diagnostic purposes. New COVID mRNA and Viral Vector gene therapy technology “vaccine” injections were hastily developed, These injections were administered in a frenzy, in a mass global unlicensed experiment, without informed consent, causing many adverse reactions including symptoms similar to haemorrhagic fever i.e. bleeding and clots, The clots and bleeding have been found to be caused by the spike proteins generated by the body in response to the injections, and this is compounded by an undisclosed ingredient, Graphene Oxide, in the injections which is also known to cause clots and bleeding. The first and second doses of the COVID injections have now weakened the overall health of the population as can be seen by the current situation in hospitals which are well above capacity during the summer months with patients suffering adverse reactions from the injections, many patients have symptoms similar to haemorrhagic fever. The planned COVID booster injections claimed to be necessary due to waning immunity of the initial vaccinations, plus proposed injection of children, will undoubtedly cause more severe haemorrhagic fever like symptoms and also be more widespread. During my research into the false claims of excess deaths caused by COVID-19 and the pseudo-sciences which support it, I have stumbled over some very worrying developments which I will summarize due to the urgency I feel to highlight them to the public as follows: – Bill Gates GAVI published an article on 22-Apr-2021 titled “The next pandemic: Marburg?”. There have been numerous Mainstream Media articles highlighting an upcoming threat, Marburg, and referencing the WHO in recent months. Marburg Virus is a relatively rare haemorrhagic fever which was first described in 1967, there have only been a total of 376 related deaths, and only 16 deaths since 2005. Primerdesign developed a one-step Real-Time PCR test genesig® in 2018 for Marburg haemorrhagic fever. Why would they develop a test in 2018 for an illness which has not had a major outbreak since 2005? Soligenix, are currently rushing to trial a ricin-rich vaccine RiVax® for Marburg haemorrhagic fever. RiVax has Fast Track designation for the prevention of ricin intoxication by the US FDA. Approval of ricin toxin vaccine will utilize the FDA Animal Rule to eliminate the phase 1, 2 & 3 trials. Why such a rush now, to trial a vaccine for which there has only been a total of 376 deaths since 1967 and only 16 deaths since 2005? The main component of the Rivax vaccine is Ricin, this is a lectin and a highly potent toxin produced in the seeds of the castor oil plant. Soligenix shareholders include BlackRrock Fund Advisors, Goldman Sachs & Co. LLC, etc. Ricin is a lectin and a highly potent toxin produced in the seeds of the castor oil plant. Ricin is very toxic if inhaled, injected, or ingested. It acts as a toxin by inhibiting protein synthesis. It prevents cells from assembling various amino acids into proteins according to the messages it receives from messenger RNA in a process conducted by the cell's ribosome (the protein-making machinery) – that is, the most basic level of cell metabolism, essential to all living cells and thus to life itself. A paper titled Asymptomatic Infection of Marburg Virus was published by the NIH in January 2021. The fabrication of the COVID-19 pandemic and its apparent failure leads me to believe that there is a second phase or final solution at hand to catch the public while they are off-guard. Haemorrhagic fever symptoms can be easily increased and made more visible by forcing COVID booster injections on vulnerable, COVID injection injured patients, who are now prisoners in hospitals and nursing homes, plus injecting children. The haemorrhagic fever symptoms would appear as a huge Marburg pandemic and could be confirmed by the new Marburg PCR test causing mass hysteria like the world has never seen. RiVax could be quickly deployed using the existing COVID injection infrastructure and the public would be easily convinced to take it using PSYCOPS on Mainstream Media. The toxic ricin in the RiVax would kill billions of people very quickly and effectively before they realised what was happening as the deaths would be attributed to Marburg haemorrhagic fever based on the symptoms. People who refused the RiVax could be labelled as asymptomatic spreaders and placed in camps like they are doing in Australia claimed to be a COVID protection measure. If you read my previous two COVID articles you will have seen that I began this journey in early 2020 as a vaccine hesitant person. As a result of my recent study of Virology and Immunology in an attempt to understand the SARS‑CoV‑2 virus, my previously held beliefs in the theories being peddled by official science and medicine has been completely upended. I now understand that Louis Pasteur fabricated his Germ Theory of Disease in the 1850's stating that invisible microorganisms known as pathogens or “germs” lead to disease. Pasteur's ideas on Viruses were concocted upon similar theories going back to Ancient Greece and Rome, more like a developing religion or cult rather than real scientific discovery. I now believe that the theory developed by Antoine Bechamp (Pasteur bitter rival) Terrain Theory which states that microorganisms (germs) feed upon the poisonous material which they find in the sick organism and prepare it for excretion, much more similar to the natural immune response which we know to be true. However, Terrain Theory has been actively blocked due to a bias for the Germ Theory by Big Pharma due to its immense profitability. The practice of Variolation dated back to the 16th century in China and is the precursor of the first Vaccine invented for smallpox in 1796 by English physician Edward Jenner. I have discovered that the widespread use of vaccines has killed far more people than they have saved. A bookkeeper, John D. Rockefeller who made his fortune in the oil business was the first philanthropist and his foundations pioneered developments in medical research. The Rockefeller Institute for Medical Research founded in 1901, was in the forefront of research in virology and principal investigator Louis O. Kunkel had researched the biology and pathology of the mosaic virus diseases.  Beginning in 1930, the Rockefeller Foundation provided financial support to the Kaiser Wilhelm Institute of Anthropology, Human Heredity, and Eugenics, which later inspired and conducted eugenics experiments in the Third Reich. The Rockefeller empire in tandem with Chase Manhattan Bank (now JP Morgan Chase), owns over half of the pharmaceutical interests in the United States today. No alternative approach to the Germ Theory in virology, immunology or medicine including the increasing use of vaccines, has been possible due to the indoctrination of the sciences by the most powerful and wealthy industry in the world. Banking and Big Pharma who now control Mainstream Media and all medical and scientific institutions. Please do your own research, quickly, use your critical thinking and let us unite to stop this madness. I believe the Marburg-RiVax final solution could be deployed suddenly while we are relaxing after the worst of COVID and distracted by the now daily revelations on Mainstream Media regarding the Government fraud and public health mismanagement which created the COVID emergency. Watch Kieran Morrissey's full uncensored interview from the Right Now. Stream the full episode now on Ickonic.com   Marburg, Aids and Ebola in the V@X Finish naturopathic Doctor Ariyana Love says there's new research out of Spain supporting the idea that at least some batches of the coronavirus vaccine have graphene oxide in them. She tells Stew Peters that graphene oxide is included as a way to deliver nanotechnology into the blood of the vaccinated, as well as components of Ebola and the Marburg virus. Michelle Malkin has been one of the real warriors on the right over the past few years. She has a new article out: “What Every Parent Must Know About Pfizer.” She says Pfizer has a history of killing kids using the Marburg virus in vac/cines and she joins Stew to discuss the crimes the drug company got away with 25 years ago in Nigeria and is trying to get away with today.      Dr. Judy Mikovits: Antidote for Vaccine Toxin and Warns Against Dangerous Fake One Before its news - Wednesday, November 17, 2021 In this stunning interview, Dr Judy Mikovits joins Ann Vandersteel, who asks her whether COVID-19 is a real virus. Dr Judy, who worked at Fort Detrick and who worked for years with Anthony Fauci at NIH replies, “No, COVID-19, the disease is not caused by SARS-CoV-2, the coronavirus. “SARS-CoV-2 is not a real human virus, it's a monkey virus grown in the vero monkey cell line, always has been, just as SARS was created in that cell line and the variants are in that cell line. “So the disease, COVID never satisfied any of Koch's Postulates or the Hill's Criteria for a causative agent of a disease, because in order for the virus, SARS-CoV-2 to have caused COVID, everybody with evidence of infection has to have disease. “And what we know is, essentially, nobody with evidence of infection by that fraudulent PCR test – that is not testing for SARS-C0V-2 – and PCR does not test for an infectious virus. “Nobody's sick. This has a 99.7% survival rate, so there's no such thing as an ‘asymptomatic carrier' of a disease-causing virus. A virus either makes you sick or it doesn't. “And what we know is this disease called COVID was caused by contaminated flu shots – which are all contaminated with coronaviruses – and they are, every year and that those viruses recombine – the test was testing for the influenza, so this, at 4,000 people a day, in January of 2021 were dying of influenza and the CDC was labeling it, calling it “COVID”. “We know that 5G and the measures; the remdesevir, so that which is killing people by shutting down their kidneys. Everything that's been done: the masks, the shots, the isolation have caused the death and the destruction worldwide, not SARS-CoV-2.” Ann says, “So, essentially, COVID-19 is a marketing hype name to promote fear and get people running to the doctors to get these PCR tests, which are, of course, completely falsely-calibrated and they're not measuring COVID-19. So, has COVID-19 ever been isolated in a lab, then?” Dr Judy replies, “SARS-CoV-2 has been isolated from vero monkey kidney cells – in a lab, grown in –” Ann interrupts, “But not in people.” “Not from people-to-people,” Dr Judy says, “Not from a person with disease and sending it to another…It's a lab virus. All the variants are, they're sequences in a database and they always have been, since 2003 and SARS.” Ann asks, “OK, so these COVID vaccines – or what they're touting to be vaccines, these shots. I call them Clot Shots, Kill Shots. What are they, if they're not supposedly treating or preventing coronavirus?” “Well, they're synthetic, they're gene therapy, number one. They're not vaccines, they don't meet the legal or scientific definition of a vaccine, which is usually a piece of a virus or a bacteria or an ‘attenuated virus', means weakened, you took out the part that usually kills you and then you use that in a vaccine… “The simple answer is they are injecting in you a deadly synthetic virus. Synthetic virus. You are expressing the deadliest – the spike protein from HIV, the XMRV and SARS, so the three deadliest plandemics of our time. You're injecting the disease and you are shedding and spreading it, if your immune system cannot break down that synthetic lipid nanoparticle. “It's a synthetic virus. It's not a vaccine, never was, never was intended – and it's why we've been spreading the news.” Dr Judy says that the spike proteins in the flu and COVID vaccines are shed and spread and have been for years but the good news, she says is that whether you get a real virus or a synthetic virus, the treatment is the same: ivermectin, hydroxychloroquine and ozonated creams on your skin. “Keep your immune system healthy, don't ever wear a mask, because that cripples your own immune system, as you know from our book, ‘The Truth About Masks'… “The good news is, as long as people stop, right now getting any other shot, we can heal this world. Because any other shot is going to kill you and I mean a flu shot, because they have coronaviruses… “This is how they've driven this agenda for the past 30 years. They've weaponized SARS, they've weaponized Ebola – and that was 2014, when Tony Fauci released that virus on the Sierra Leone, on the Liberians, you know by way of a vaccine program. “You know, ‘We're gonna go over there and help you!' with Christian missionaries, and that's all described in our New York Times Bestseller, ‘Plague of Corruption', which came out April 14th, 2020. “I was first on the Epoch Times, April 8th, 2020, telling them all of this, showing them the Journal of Virology paper that showed hydroxychloroquine is a prophylactic treatment strategy for HIV, for SARS. And that means it's a vaccine! “Every 21 days, you got a booster shot, so the entire world could have been saved by hydroxychloroquine, just as in this book, ‘Called for Life', by Kent and Amber Brantly. He's the doctor that got infected with Ebola when Ebola was aerosolized. “And this was in the summer of 2014 and this was the cover-up by Tony Fauci of the William Thompson confession, after 15 years that MMR, giving Blacks and people of color, Hispanics, before the age of 3 had a 2-to-4 times greater risk of getting autism or severe neuro-developmental disease from that shot. “So yes, MMR in susceptible populations, three RNA viruses that'll cause autism. So what does Tony Fauci do? Oh, he released contagious Ebola on Black people, to take everybody's attention away, just like the game they played in COVID, to take everybody's attention away from the corruption… “We caught them. Not ‘we', Judy Mikovits, the Royal We: Children's Health Defense, The Highwire, the Informed Consent Action Network. Lawsuit, lawsuit, lawsuit. Proved that vaccines are not safe, have never been tested since 1989, not a single double-blind placebo controlled study, safe study has been done, as required by Federal Law, by the HHS. “That was the proof in the Fall of 2019…Was COVID started because they cloned the deadly H1N1 in 2005 – cloned – from people who died of the Spanish Flu? “It's all in here. And in our latest book, ‘Ending Plague', because we tell you the solutions are there. We tell you ozone therapy, we tell you Type 1 Interferon, we tell you Peptide T and immune modulation peptides could have stopped AIDS, could have stopped all of these diseases. “And the biggest thing our books tell you is that, ‘Never again get another injection' and you will live and we as a world will experience health.” The Public is Being Warned! Will They Try Smallpox Next or is This Another Distraction?   Vials Labeled ‘Smallpox' Found at Vaccine Research Facility in Pennsylvania The next pandemic is smallpox? - Strange Sounds     Several vials labeled “smallpox” have been found at a vaccine research facility in Pennsylvania, the US Centers for Disease Control and Prevention said Tuesday. “There is no indication that anyone has been exposed to the small number of frozen vials,” the CDC said in a statement emailed to CNN. https://youtu.be/gBmckTa4pC4 “The frozen vials labeled ‘Smallpox' were incidentally discovered by a laboratory worker while cleaning out a freezer in a facility that conducts vaccine research in Pennsylvania. CDC, its Administration partners, and law enforcement are investigating the matter and the vials' contents appear intact,” the CDC added. “The laboratory worker who discovered the vials was wearing gloves and a face mask. We will provide further details as they are available.” https://youtu.be/N2qosli3I8Q Smallpox, also known as variola, was declared eradicated in 1980 by the World Health Organization after a concerted global vaccination effort. Before that, the virus, which passes easily from person to person, infected 15 million people a year and killed about 30% of them. The last known outbreak in the US was in 1947. In 2014, employees of the National Institutes of Health found six vials of smallpox in an unused storage room as they packed up a lab at the NIH's Bethesda, Maryland, campus to move it. Two of the vials contained viable virus. The CDC said at the time there was no evidence anyone had been exposed to the contents of any of the vials. https://youtu.be/mFItWdsVnPg Governments have argued about whether to keep samples of the virus or to destroy all known copies. Most routine vaccination stopped in 1972 but military personnel and some researchers are still vaccinated. The CDC recommends that people get smallpox boosters every 3-5 years to stay protected although at least one study indicated vaccinated people may have at least some immunity for life Terri McGinley found this on twitter - November 13, 2021     BOOM! THIS IS IT. THE U.S. GOVERNMENT IS DEFINITELY GOING TO RELEASE SMALLPOX! Up to Approximately $113 Million of Oral TPOXX® Targeted for Delivery to the U.S. Government in the Fourth Quarter   Marketscreener.com - 11/04/21   - Up to Approximately $113 Million of Oral TPOXX® Targeted for Delivery to the U.S. Government in the Fourth Quarter - - Approximately $13 Million of International Sales for the First Nine Months of 2021 - - Corporate Update Conference Call Today at 4:30 PM ET November 4, 2021, 4:05 pm ET NEW YORK -- SIGA Technologies, Inc. (SIGA) (NASDAQ: SIGA), a commercial-stage pharmaceutical company, today reported financial results for the three and nine months ended September 30, 2021. "SIGA's financial results for the first nine months of 2021 include approximately $13 million of international sales, which represents a more than fourfold increase in comparison to the comparable period in 2020. Additionally, we continue to work with Meridian in a new foreign jurisdiction toward finalizing an order that would be similar in size to the initial orders received from Canada in 2020 and early 2021. The timing of the completion of the order has been and may continue to be impacted by the COVID-19 pandemic," said Phil Gomez, CEO of SIGA.  "Looking forward to the fourth quarter of 2021, we are coordinating with our supply chain to deliver up to approximately $113 million in total of oral TPOXX® to the U.S. government, almost 30% of which was delivered in October. This progress highlights the strong and growing revenue base of TPOXX, as well as its continuing importance in orthopox health security preparedness."     According to the article below, the DS had already done a mock simulation of a widespread Smallpox pandemic back in 2001, code named “Dark Winter" and now they are prepared to give the leftists a pass?? knowing that the right wing people don't trust them and won't receive the CV vaccines.  On 11-7-21, Q The Storm Rider Posted: [DARK WINTER] Now you understand why BILL GATES is TALKING about a Smallpox terror ATTACK → It's all PLANNED  The FINAL stages of the DEEP STATE PLAN are getting ready to hit.  Their Final Chess MOVES of more lockdowns, more Bioweapon release, a controlled COLLAPSE of food, gas, supply chain and weather WEAPONS are coming. https://operationdisclosureofficial.com/2021/11/07/kat-anonup-update-field-mcconnell-on-good-revelations-coming-qtsr-gene-decode-and-ron-giles/   DS Unleashes Small Pox? Missy Pollock - 10/23/19 I dreamed about something having to do with blankets. My thought in the dream was, "They are going to do something like they did to the American Indians." Then I woke up. (What came to me is the DS is going to do something that is going to appear to be helping people but instead it will be to kill people. The dream is just a parable, they aren't going to repeat what was done before by using blankets infected with Smallpox to kill people. [They could just unleash Smallpox through a more modern method upon people.])     The Vaccine Was Designed to Kill the Parents So They Could Have ALL THE CHILDREN! Reader Posted Dream on Operation Disclosure | By Scottish Castle Sent to UBM by Diane Steva - 11/13/21 (David's notes in red) Is this dream actually a nightmare? Sometimes a dream will tell you the truth that no one wants to know. The reader said, "In a recent dream, I was walking down a long, wide, and tall hallway. The floor, walls and ceiling were all stone. I ‘knew' I was traversing the third-floor long hallway from the stairs to the huge balcony overlooking the large courtyard and the fields beyond in front of this majestic Scottish style castle. I was puzzled at first about the noises I heard coming from the balcony door that was about a hundred feet in front of me. The closer I got, the louder the noise got. As I approached the doorway and stepping onto the balcony, I finally realized it was the sound of children crying, thousands of children crying. As I stepped further onto that balcony, I was awestruck by the sheer number of children I saw. I saw children crying by the tens of thousands in the courtyard and immediate fields in front of me. Then I looked to both sides and realized this castle was surrounded by hundreds of thousands of crying children, from infants to teenagers.  I then heard a voice off my left shoulder, and HE (The Lord) said, “All their parents perished from the covid vaccine. They are all alone now.” (Not only are the DS injections causing children to lose their parents but they are also going to cause a mass die off and crippling and maiming of children. There will be great suffering for all those that survive these atrocities committed by the satanist DS who are determined to sacrifice as many as they can to their god satan in exchange for maintaining their world power and dominance.) I awoke at that point, thankfully. I laid there and re-ran the whole dream through my mind a couple of times. ... In another dream last night, I was back on that balcony and the children were still weeping and I heard that voice off my left shoulder from HIM (the Lord) and He said, “The vaccine was designed to kill the parents so they could have ALL THE CHILDREN!” (Is this why they are pushing the vaccines, to GET THE CHILDREN, ALL THE CHILDREN? You know who they are. We hear about them every day. They are the “Deep State; the Satanists.” or whatever label you choose to use for EVIL.)” (The DS satanists would definitely have access to many more children in the orphanages and the foster care system because of the mass die offs. Here is an interview that Stew Peters did with a young lady in her late 20's named Ally Carter who was introduced into this system at a very young age by her mother. It is titled, “Obama and Biden Raped Me: Powerful Elites, Celebs, Demonic Sex Abuse Ring." She is speaking out about her experiences and naming high profile names.)    Witches Using Witchcraft to Spread the Plague Isaac Payne - 10/27/21 In this dream I was in some type of brick, government building about three stories high. I was translated to the second floor of this building where there were a bunch of desks and offices that didn't have walls; they were all in an open concept style. This room also joined another room that looked like a ball room used to host events.   There were women working feverishly, answering calls at the desks, and running around delivering supplies to other desks, and collaborating with the other female workers. It was utter pandemonium on the second floor. I remember phones were ringing off the hook as everyone of them were just a bunch of busy bodies. (This reminds me of Eve's dream of the workers in the kingdom working feverishly on the second floor of the "kingdom warehouse" to round up all the dogs. Isaac's dream here is showing us the flip side of that dream. The enemies of God are also working feverishly to fight against God's kingdom and His elect.) As I continued to observe, I started seeing a few of these women workers slithering like snakes from one end of the room to the other. They slithered extremely fast and in straight lines using neither their hands nor feet. What they used to propel themselves while slithering was their long, black tongues. They would lick the floor as they slithered. (The only power they have is their witchcraft words and prayers.) At this point in time they could not see me as I was invisible to them. As I observed, I began to understand why everyone was working so feverishly in a group effort. They were in distress because the plague they previously released on the world did not take affect as they had hoped, and they were trying to conjure up the strength of this plague back to its original form. However, there was nothing they could do to bring back to life their original plan of mass destruction. (Currently Biden's vaccine mandate is being struck down and ruled against by OSHA and the 5th and 6th district courts. In the state of Tennessee the Governor just passed a bill making the vaccine mandates illegal. This is beginning to happen in many other states too.) I then saw the witches divert to plan B. In a panic, they began to speak cursing over the public and then created a potion and poured the contents into a squirt bottle. (I remember seeing a glimpse of the periodic table and seeing the chemicals added together to create something called Thylutine or Toluene something in that regards I'm not sure. Whatever it was it did start with a T.) (This represents the worse plague that they are planning to replace CV-19.) I watched the witches spread out individually as each of them went to their own designated area. The began to spray many doorknobs in high traffic areas. The intent of these precise locations was because of the population density. The witches knew people would come into contact with the doorknobs and spread this conjured plague. (It has been proven that they have created the vaccines to be able to penetrate the eyes, nasal membranes and even penetrate the skin through aerosolized particles.) As I watched the contents come into contact with the doorknobs it began to instantly rust and corrode the door handles and doorknobs. Afterwards, I watched as black mold began to grow on the surfaces of everything the plague touched. The scene changed and I was back on the second floor of the building and the joy of the Lord instantaneously fell upon me in the midst of these atrocities. I began to praise, speak in tongues, and jump up and down thanking God for the day he had made and the provisions he has given. (This is how God defeated the enemies of Jehoshaphat. He told them to send the praisers out ahead of the army and then God defeated the enemies of Israel for them through the praises of His people. 2Ch 20:14-25) This time the witches could see me as they were still slithering on the floor with their black tongues. I walked up to them with great boldness and started praising God in front of them.  I was saying, “This is the day the Lord has made! He is God and God alone!” I shouted many other praises in front of the witches. They instantly stopped their slithering and looked at me with total confusion.  One of the witches stood before me in shock. She had black purplish hair, pale skin and was wearing a long black dress, and a black pointed witch's hat. At this point, all their evil, feverish work halted. The entire floor of witches stood confounded and halted in their progress they had made spreading this potion or plague. (There is an angel named Jeruel who stands above me in the balcony at my house and he too goes out and fights for UBM with our praises.) I walked up to the head witch and began to praise God in front of her. She couldn't slither anymore because she was confused and her attention was on me. She had blonde hair that seemed dyed, pale skin, pale blue eyes, a long black tongue, and wearing all black garments. She seemed to be younger; in her late 20's.  I looked at her and said, “Blessed be the God of all the universe! The earth is his footstool!” I was shouting and clapping; jumping up and down and smiling as His peace was upon me surpassing all understanding. She began to yell and argue with me saying, “Your God is not more powerful than mine! No, he's not!” She was incoherently babbling the same things over and over.  I looked right at her and said, “My God created your god and at no point did He intend to share his power with your god! My God is Sovereign, and the beginning and the end has already been fulfilled! Your god has already been judged!” Then I said one last thing to her, “You will submit to Jesus!” She couldn't even function for disbelief, confusion, and amazement. (Their god is satan and he has already been defeated.) The second floor of witches could not pick up where they left off conjuring their evil plague because I was praising God uncontrollably! The praising of God also fixed all the doorknobs that were saturated with this potion and all door knobs became as brand new. Praising God halted all their wicked plans! Then I woke up. (Let's remember the power that is in our praises! The demons hate true praise that glorifies God. It will put them to flight every time!)   Be Anxious for Nothing Angelica Garza - 10/29/21 I felt to share what the Lord was saying to me when I was finishing up on a Word study on anxiety, He said, …Don't allow Satan to get you to be anxious. He wants to draw you in different directions, so that your heart, mind, will, and emotions are divided from God. Satan does not want you to give your full attention to our relationship, and your purpose. The time is short, and he will use your emotions to prevent you from bearing fruit, and from having faith and believing the truth of my word. If you're looking  at your emotions, (moved by them) you are walking by sight, and you will be blind. You will be unable to have peace, and unable to enter into my rest. You will always be double-minded, and unable to receive from me. This will ultimately cause you to be drawn away from me, alienated from my life, and be counted as an unbeliever. It is of the utmost importance that you be continually in prayer. Asking me for all that I said I would provide for you. For I care for you. I desire to have communion with you, to interface, to connect with you my daughter. I desire to hear your heart, and answer your requests. There is no shame in asking me for everything. I am the provider and sustainer of all life, and of my children. I desire that you show me thankfulness, for my great love for you. Praise me, worship me, I am your sustainer, I AM Supreme! Humble yourself as my creation. The creation cannot sustain itself. Cry out to me, and I will give you the life that you desire in me. Without me, all things are meaningless, and without purpose. I AM your life; I AM your breath. When you do this, your life will have meaning again. It will be whole and undivided.  Your mind will be sound, and you will not fear! You will be fully assured when you wake, when you sleep, when you go out, when you come in. No weapon formed against you shall prosper. No curse can come upon you. You will have perfect peace, when your mind is solely stayed on me. You will be confident in the knowledge of your salvation, and in the giftings I have given you. You will be content in all things, you will want for nothing, your will be filled by my spirit continually! You will be fully assured that I have called you, and of where you are, and of who you are. You will find your place in the body, and as my daughter (my son). You will prosper in all that you do, so long as you are looking to me to sustain you, to keep you.  The peace that you so desire, surpasses, and is above everything you can see with your eyes, and what you can feel with your senses and emotions. It is real, it is tangible (to the spirit man), it surrounds the one who trusts me beyond their own ability to comprehend what I have planned. I said, “lean not on your own understanding” because it is weak, and limited. I gave you your mental capacity, and designed it. Should not the creation submit to its designer, it creator? My grace is sufficient for you. Your weakness, is my Glory. I am glorified in your weakness. If you had no weakness, you would not need me. How soon am I forgotten by my children when they have strength. Glory in your weaknesses, for in it, my power is shown to all! Guard your heart. Guard your thoughts, mind, submit your will, and emotions to me. No don't exchange my truth for lies. Satan wants to invade your mind, and destroy the fruit that my Son paid for you to have. Is it not precious? Is not my nature longed for and most beloved? Does it not bring peace? Does it not bring joy? There is none like me! Should it not be guarded with truth, and faith? Fight the good fight of faith, and lay hold of life eternal. War against the enemy, and do not submit your mind, will and emotions to him, or he will become your master. If you believe me at my word, then you will receive my peace, you will not be distracted with the things that I said I would do for you, if you let me. In my Son, is peace. He is the Prince of Peace, my beloved Son. Stay connected to the Vine. Please prepare yourselves, friends and family for this plague. We make zero money on these books. Learn from Free God's Vaccine E-Book, How to be Protected Also you can order it in print here: httpss://www.ubm1.org/?page=ubmbooks Listen to the Audio Teachings “God's Vaccine” Parts 1-6:

I denne podcast fortæller Katrine og Kim om qPCR. Hvad er forskellen på PCR og qPCR, hvad er farver, hvad kan man bruge det til og meget mere. Få svar på det hele ved at lytte til denne podcast

Dr. Jake Kerby: Ranavirus Diagnostics (Conventional and Real-time PCR)

Die acidophilen und thermoresistenten Sporenbildner des Genus Alicyclobacillus spielen aufgrund der Bildung von Fehlaromen eine wichtige Rolle als Verderbserreger von Fruchtsäften, wobei dem Guajacol-produzierenden A. acidoterrestris eine besondere Bedeutung zukommt. Um den einfachen, schnellen und zuverlässigen Nachweis von A. acidoterrestris Sporen in verschiedenen Fruchtsäften zu ermöglichen, sollten erstmals spezifische poly- und monoklonale Antikörper (pAK und mAK) entwickelt und darauf basierend hochsensitive und selektive immunchemische Nachweisverfahren etabliert werden. Um eine umfassende und verlässliche Charakterisierung der entwickelten Antikörper zu gewährleisten, wurde eine Alicyclobacillus spp. Stammbibliothek (n = 61) aufgebaut. Die Identifizierung der Isolate erfolgte nach mikrobiologischen Kriterien sowie mittels Real-Time PCR, RAPD-Analysen dienten zur weiteren Differenzierung. Ein Pool aus vier verschiedenen, mittels Paraformaldehyd inaktivierten A. acidoterrestris Stämmen wurde zur Immunisierung von Kaninchen und Mäusen verwendet. Die spezifische Bindung der induzierten pAK an die Sporen konnte mittels Immunfluoreszenz bestätigt werden. Basierend auf den generierten polyklonalen Kaninchenseren wurde ein sensitiver Sandwich Enzymimmuntest (EIA) aufgebaut, die Nachweisgrenzen lagen bei durchschnittlich 5,0 x 10^3 Sporen/ml für die DSM-Referenzstämme, sowie 2,1 x 10^3 – 3,8 x 10^4 Sporen/ml für die untersuchten 38 A. acidoterrestris Isolate. Unter Verwendung der Stammbibliothek und weiterer aerober sowie anaerober Sporenbildner konnte die hohe Inklusivität sowie Exklusivität des Verfahrens bestätigt werden: Alle A. acidoterrestris Stämme wurden als positiv erkannt, während die meisten anderen Alicyclobacillus spp. Stämme, sowie die Vertreter von Nicht-Alicyclobazillen keine Reaktivität zeigten. Anwendungsstudien zeigten die Einsetzbarkeit des pAK-basierten EIA für den direkten Nachweis von Sporen in verschiedenen Fruchtsäften. Nach 48 stündiger Anreicherung der in BAT-Bouillon verdünnten und mit 1 Spore/ml künstlich kontaminierten Proben bei 45 °C konnte in allen untersuchten Fruchtsaftsorten reproduzierbar und zuverlässig A. acidoterrestris nachgewiesen werden. Auch die 16 generierten mAK reagierten entweder in indirekten oder Sandwich EIAs z. T. hochaffin mit Sporen von A. acidoterrestris, mit Nachweisgrenzen von 5,0 x 10^2 – 4,0 x 10^5 Sporen/ml. Ein etablierter mAK-basierter Sandwich EIA wies eine hohe Inklusivität und Exklusivität auf. Mittels Immunoblot konnte für 12 mAK eine ausgeprägte Reaktivität mit Sporenproteinen gezeigt werden, die reaktiven Banden lagen bei ca. 14, 50 bzw. 66 kDa.

Sat, 6 Feb 2016 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/19342/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/19342/1/Cibulski_Sabrina.pdf Cibulski, Sabrina

Thu, 8 Oct 2015 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/18805/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/18805/1/Teusser_Lars-Malte.pdf Teuße

Kleinsäuger sind essentiell für die Entwicklung und die Verbreitung von subadulten Schildzecken. Den Kleinsäugern kommt so eine wichtige Rolle als potentielle Reservoirwirte für Zecken-übertragene Pathogene zu. Die Ziele dieser Studie waren unterschiedliche Zecken-übertragene Pathogene in wildlebenden Kleinsäugern nachzuweisen und die Reservoirfunktion der jeweiligen Kleinsäugerarten, im Zusammenhang mit unterschiedlich strukturierten Habitaten, zu evaluieren. Zwischen 2012 und 2013 wurden Kleinsäuger an drei unterschiedlich strukturierten Standorten gefangen: (1) an einem Stadtpark in Regensburg, (2) an einem silvatischen Standort in Tussenhausen im Unterallgäu und (3) an einem renaturierten Standort, der in der Nähe von Leipzig in Sachsen liegt. Zusätzlich wurden Zecken im Jahr 2013 am Waldstandort geflaggt. DNA wurde aus Blut-, Milz- und Gonaden-Proben der Mäuse und aus Mäuseneonaten extrahiert. Auf den Mäusen befindliche Zecken wurden abgesammelt. Aus diesen und den wirtssuchenden Zecken wurde ebenfalls DNA extrahiert. Zusätzlich wurden bereits vorhandene DNA-Proben aus wirtssuchenden Zecken aus den Jahren 2009-2013 bzw. 2011-2012 vom urbanen bzw. vom silvatischen Standort untersucht. Die Proben wurden mittels konventioneller oder Real-Time PCR auf Anaplasma phagocytophilum, Candidatus Neoehrlichia mikurensis (CNM) und Babesia microti untersucht. Insgesamt wurden 631 Kleinsäuger zehn verschiedener Arten gefangen (4 Apodemus agrarius, 7 Microtus arvalis, 1 M. agrestis, 396 Myodes glareolus, 2 Mustela nivalis, 5 Sorex coronatus, 1 Sorex araneus, 1 Talpa europaea, 36 Ap. sylvaticus, 178 Ap. flavicollis). Davon wurden insgesamt 36 Mäuse im Stadtpark, 243 am silvatischen und 352 am renaturierten Standort, wo die größte Artenvielfalt vorherrschte (n=8), gefangen. Insgesamt wurden 3.391 Zecken drei verschiedener Arten (8 Ixodes trianguliceps, 3.250 Ixodes ricinus, 133 Dermacentor reticulatus) abgesammelt. CNM wurde in insgesamt 28,6 % der Kleinsäuger nachgewiesen. Dabei waren 31,6 % My. glareolus, 28,1 % Ap. flavicollis, 57,1 % M. arvalis und 2,7% Ap. sylvaticus positiv. Die Prävalenzen unterschieden sich signifikant beim Vergleich der jeweiligen Standorte, wobei die Infektionsrate am renaturierten Standort am höchsten war (χ²: 13,4; p: 0,0004). Insgesamt waren 3,8 % der gesogenen und 2,2 % der wirtssuchenden Zecken positiv. In den untersuchten Kleinsäugerföten bzw. -Neonaten, die von positiven Muttertieren stammten, war die Prävalenz für CNM 31,8 %. Insgesamt 60,0 % der positiven Muttertiere hatten wenigstens einen positiven Foetus oder Neonaten. Anaplasma phagocytophilum wurde zu einem geringen Prozentsatz in Nagern festgestellt (0,0-5,6 %), wobei es keinen signifikanten Unterschied zwischen den Standorten, Jahren und Kleinsäugerarten gab. Jedoch waren gesogene Nymphen (I. ricinus) signifikant häufiger befallen als gesogene Larven (χ²: 25,1; p:

Hintergrund: Von den weltweit mehr als zwei Milliarden mit Würmern (griech. Helminthen) infizierten Menschen sind schätzungsweise etwa 22 Millionen zusätzlich mit HIV koinfiziert und verbleiben durch die krankheitsbedingte Produktivitäts- und Leistungsminderung in einer Abwärtsspirale. Trotz großangelegter globaler Versuche, Helminthosen mit präventiven Massenbehandlungen einzudämmen, gibt es weiterhin großen Forschungs- und Handlungsbedarf. Eine sensitivere und zuverlässigere Diagnostikmethode als die klassische Stuhlmikroskopie ist dringend erforderlich. Problemstellung und Zielsetzung: Etablierung eines molekularen Wurmdiagnostikverfahrens (Multiplex-Real- Time-Polymerase Chain Reaction) am Mbeya Medical Research Center (MMRC)-Labor im einkommensschwachen Tansania zur Detektion verschiedener Helminthen im Stuhl und direkter Vergleich mit der Merthiolat- Jod-Formalin (MIF)-Mikroskopie sowie dem derzeitigen Diagnostikgoldstandard der Kato-Katz (KK)-Mikroskopie. Klärung der Frage, ob das neue Verfahren wirklich sensitiver und für weitere Untersuchungen einsetzbar ist. Prüfung der Wirksamkeit von zur Massenbehandlung eingesetzten Medikamenten und Untersuchung von Besonderheiten bei HIV-Helminthen-koinfizierten Probanden mit Hilfe des neuen Verfahrens. Material und Methoden: Zwischen 2008 und 2011 Probensammlung, Erhebung der HI-Viruslast und CD4-Zellzahl, Stuhlmikroskopie nach der MIF- und KK-Methode, sowie Etablierung, Validierung, Durchführung und Evaluierung der Real-Time-PCR (RT-PCR) für 179 Probanden in Mbeya, Tansania. 118 Studienteilnehmer wurden nach einer Einmalgabe von 400 mg Albendazol gegen intestinale Nematoden und 40 mg/kg Praziquantel gegen Schistosomeninfektionen mit der Mikroskopie sowie der RT-PCR nachuntersucht. Zusammenfassung 108 Ergebnisse: Bei fast allen Probanden lagen laut WHO-Klassifikation leichte Infektionen vor. Eine externe sowie interne Qualitätskontrolle bestätigte die Validität unserer RT-PCR. Der Methodenvergleich ergab eine hohe Diskordanz zwischen den einzelnen Verfahren. Die RT-PCR wies 2,2 mal mehr Infektionen als MIF und 1,4 mal mehr Infektionen als KK nach. Bei etwa 17% der untersuchten Probanden lag ein Polyparasitismus vor. Mit der RT-PCR wurden mehr Mischinfektionen nachgewiesen. Ein niedriger Cycle Threshold (CT) korrelierte mit einer hohen Eizahl und umgekehrt. Die Infektionsstärke bei HIV-Wurmkoinfizierten Probanden unterschied sich nicht von der HIV-negativer Probanden. HIV-Positive schieden trotz ihrer Immunschwäche nicht weniger Schistosomeneier am Tag aus als Nichtinfizierte. Ein Polyparasitismus lag bei HIV-Positiven (37% Mischinfektionen) nicht häufiger als bei HIV-Negativen (43% Mischinfektionen) vor. Schlussfolgerung und Ausblick: Die RT-PCR erwies sich als wesentlich sensitiver als die Mikroskopie bei der Detektion von Hakenwürmern und Schistosomeninfektionen; nicht aber bei Askarideninfektionen. Als alleinig eingesetztes Diagnostikverfahren am MMRC hat sie daher keinen Bestand. Sie wird für zukünftige Studien als sensitives Zweitverfahren, das Hakenwurm-, Schistosomen- und Mischinfektionen besser nachweisen kann, neben der klassischen Kato-Katz-Mikroskopie Anwendung finden. Durch diese Arbeit konnte der Grundstein für die Diagnostik zukünftiger Studien am MMRC gelegt werden, die im Rahmen des IDEA-Projektes, einer großen afrikanisch-europäischen Forschungsinitiative, die unter anderem wurminduzierte Immunantworten in Bezug auf Koinfektionen mit HIV, Malaria und Tuberkulose und den Einfluss von Würmern auf Impfstoff-induzierte Immunantworten untersucht, durchgeführt werden. Es sollten weitere Studien zur Sensitivität der verwendeten RT-PCR-Protokolle an anderen Standorten durchgeführt werden. In Mbeya wurde das Verfahren nach meiner Abreise erfolgreich weitergeführt, sodass inzwischen fast 1000 Stühle mit der RT-PCR untersucht worden sind.

Der Diabetes mellitus ist mit einer Anzahl von über 171 Millionen erkrankten Menschen weltweit eine der größten metabolischen Volkserkrankungen. Die immer höhere werdende Zahl von Schwangeren mit Gestationsdiabetes lässt die Frage aufkommen, welche Konsequenzen für Schwangerschaft und Neugeborenen bestehen. Ziel dieser Arbeit war es, anhand von einem erkrankten Probandenkollektiv sowie einer gesunden Referenzgruppe den Einfluss der Glukosestoffwechselstörung auf den Fettsäuremetabolismus von werdender Mutter über die Plazenta zum Ungeborenen bzw. Neugeborenen näher zu charakterisieren. Konkret sollte die Frage beantwortet werden, ob Unterschiede in der plazentaren mRNA-Expression von Fettsäuretransportproteinen bei Schwangeren mit Diabetes mellitus bestehen. In die Studie konnten 11 schwangere Probandinnen mit Diabetes mellitus eingeschlossen werden. Weiterhin konnten als Referenzgruppen 10 gesunde Schwangere gewonnen werden. Alle Probandinnen waren Patientinnen der Klinik und Poliklinik für Frauenheilkunde und Geburtshilfe Innenstadt (Klinikum der Ludwig-Maximilians- Universität München; Direktor Prof. Dr. med. Klaus Friese). Die Probandinnen nahmen 12 Stunden vor einem geplanten Kaiserschnitt eine definierte Menge 13C-markierte Docosahexaensäure, Arachidonsäure und Ölsäure zu sich. Zum Zeitpunkt der Sectio wurde venöses Blut der werdenden Mutter, Nabelschnurvenen und –arterienblut sowie Plazentagewebe gewonnen. Die gewonnen Proben wurden bis zur weiteren Bearbeitung tiefgefroren konserviert. Die durchgeführten Versuche wurde alle mit den Methoden der Real-Time PCR, Immunhistochemie, Gaschromatographie und Massenspektrometrie gemessen. Die Real-Time PCRs wurden mit Primern für die Fettsäuretransportproteine der FATP-Familie FATP-1, FATP-4 und FATP-6, des Fettsäurebindungsproteins FABPpm, der Fettsäuretranslokase FAT/CD36 und des Adipozyten-Fettsäurebindungsproteins aFABP sowie der Fettsäuredesaturasen FADS-1 und FADS-2 und der Fettsäurelipasen hEL und hLPL durchgeführt. Immunhistochemisch wurde Plazentagewebe mit Antikörpern gegen FATP-1 und FATP-4 gefärbt. Mittels Gaschromatographie wurden die Fettsäureverteilungen in den verschiedenen Fettsäurekompartimenten Phospholipide, Triglyzeride, Cholesterinester und freie Fettsäuren im Blutplasma und Plazentagewebe bestimmt. Zusätzlich wurden Fettsäureanteile in der Phosphatidylcholin- und Phosphatidylethanolaminfraktion in Erythrozyten gemessen. Außerdem konnten mit Hilfe der Massenspektrometrie die Anteile der 13C-markierten Fettsäuren detektiert werden. Die mittels Real-Time PCR gemessene mRNA-Expression von Fettsäuretransportproteinen FATP-1, FATP-4 und FATP-6, FABPpm, FAT/CD36, aFABP, von den Fettsäuredesaturasen FADS-1 und FADS-2 und von den Fettsäurelipasen hEL und hLPL zeigten in beiden untersuchten Probandenkollektiven keine signifikanten Unterschiede. Auch der immunhistochemische Lokalisationsnachweis von FATP-1 und FATP-4 im Synzytiothrophoblasten und Kapillarendothel war für beide Gruppen gleich. Bezüglich der Tracer-Fettsäureverteilung in beiden untersuchten Gruppen zeigte sich eine signifikant niedrigere 13C-AA Anreicherung in der GDM-Gruppe. In Hinblick auf die Fettsäureverteilung von nicht-tracermarkierten Fettsäuren zeigten sich in der GDM- Gruppe signifikant höhere PUFA-Anteile in der Phospholipidfraktion des Nabelschnurvenenblutplasmas verglichen mit Nabelschnurarterienblutplasma. Die für diese Arbeit erhobenen Daten zeigen, dass auf mRNA-Ebene keine Regulationsprozesse zu bestehen scheinen, die zu einer unterschiedlichen Verteilung von Fettsäuren von der Schwangeren auf den Neonatus führen. Auch die Darstellung mittels Immunhistochemie von FATP-1 und FATP-4 zeigt, dass diese Fettsäuretransportproteine in beiden untersuchten Gruppen gleich lokalisiert sind. Es ist jedoch nicht auszuschließen, dass Regulationsprozesse zu einem späteren Zeitpunkt aktiv werden, der jedoch in dieser Arbeit nicht untersucht wurde. Bezüglich der 13C-Fettsäureanreicherung ist zu vermuten, dass die niedrigeren 13C-AA-Anteile in der GDM-Gruppe dadurch zustande gekommen sein könnten, dass die Diabetikerinnen und ihre Neugeborenen aufgrund einer höheren inflammatorischen Grundaktivität im Metabolismus mehr 13C-AA direkt utilisieren und diese nach 12 Stunden nicht mehr in Blut und Plazenta messbar sind. Eine mögliche Erklärung für die Tatsache, dass in der GDM-Gruppe mehr PUFAs im Nabelschnurvenenblut als im Nabelschnurarterienblut aufzufinden waren, könnte sein, dass Neugeborene diabeteskranker Mütter mehr PUFAs benötigen und diese sofort aus dem venösen Nabelschnurblut in ihren Metabolismus utilisieren, sodass signifikant niedrigere Anteile im zurückfließenden Nabelschnurarterienblut vorzufinden sind. Weitere Untersuchungen hierzu müssen Aufschluss darüber geben, inwieweit diese Wissen zu interpretieren ist und ob sich hieraus Konsequenzen für die Schwangerschaft von Diabetikerinnen ergeben.

Die gebräuchliche Therapie gegen Milzbrand besteht aus der Gabe von Antibiotika. Als Therapie der Wahl gilt hierbei das Fluorochinolon Ciprofloxacin. Resistenzen gegen dieses Antibiotikum wurden bei B. anthracis in vivo noch nicht, in vitro jedoch im Rahmen mehrerer Studien beschrieben. Es existieren herkömmliche Resistenztests, wie der Gradientendiffusions- oder der Mikrodilutionstest, welche bei einer Milzbranderkrankung genutzt werden können. Diese nehmen jedoch aufgrund der kulturellen Anzucht in einem Labor der Schutzstufe 3 vor der Durchführung des Tests ein bis zwei Tage Zeit in Anspruch. Um diese Zeitspanne zu verkürzen, wurden im Rahmen dieser Arbeit Schnelltests entwickelt. Diese basieren auf einer real-time-PCR Methode, mit welcher Ciprofloxacin-Resistenz verursachende Punktmutationen (= SNPs), nachgewiesen werden. Im ersten Abschnitt dieser Studie wurde der B. cereus Stamm ATCC10987 resistent gegen Ciprofloxacin generiert. Aufgrund der Dual-Use-Research-of-Concern-Problematik wurde dieser, wenig pathogene, aber genotypisch sehr nah mit B. anthracis verwandte, BSL-2-Organismus verwendet. Die Resistenzbildung erfolgte durch natürliche Selektion, indem der B. cereus Wildtyp mehrfach auf Ciprofloxacin-haltigen Agar-Platten, welche eine steigende Konzentration des Antibiotikums enthielten, angezüchtet wurde. Es folgte eine Sequenzierung der Quinolone Resistance Determinig Region (= QRDR), bestehend aus den Genen gyrA, gyrB, parC und parE, von neun B. cereus Mutanten, welche CIP-Resistenzen entwickelt hatten. Eine der Mutanten besaß einen SNP im Gen gyrA an Stelle 254 mit einer Mutation der Base Cytosin in ein Thymin. Solche SNPs stellen eine mögliche Ursache der Resistenz gegen Fluorochinolone dar. Acht der B. cereus Mutanten besaßen jedoch keine SNPs in der QRDR. Die Ursache für deren Resistenz wird in der erhöhten Funktion von Effluxpumpen vermutet. Im zweiten Teil der Studie wurden die Schnelltests entwickelt. Es wurden mehrere Protokolle für die beiden real-time-PCR Methoden TaqMan® und MeltMAMA (= Melt Analysis of Mismatch Amplification Mutation Assays) erstellt und getestet. Der Vergleich beider Methoden wertete den TaqMan® als die Methode der Wahl für die gesetzte Zielstellung. Daraufhin wurden für acht bekannte Ciprofloxacin-Resistenzen auslösende SNPs TaqMan®-Protokolle entwickelt. Im Abschluss wurden diese durch Versuche mit verschiedenen B. anthracis Stämmen, dem B. cereus ATCC10987 Wildtyp und seinen Mutanten, synthetisch hergestellten Templates, die als Mutationskontrollen genutzt wurden, sowie verschiedenen Bacillus Spezies hinsichtlich ihrer Sensitivität und Spezifität erprobt. Es wurden acht TaqMan® Protokolle erarbeitet, welche SNPs in der QRDR von B. anthracis nachweisen und somit eine schnelle Diagnose vieler Ciprofloxacin-resistenter Stämme gewährleisten. Der Einsatz dieser Schnelltests zusätzlich zu den herkömmlichen Empfindlichkeitstests gibt die Möglichkeit eine optimale Therapie von Milzbrandinfektionen in einem verkürzten Zeitraum zu gewährleisten.

It is widely known that cells from epithelial tumors, e.g., breast cancer, detach from their primary tissue and enter blood circulation. We show that the presence of circulating tumor cells (CTCs) in samples of patients with primary and metastatic breast cancer can be detected with an array of selected tumor-marker-genes by reverse transcription real-time PCR. The focus of the presented work is on detecting differences in gene expression between healthy individuals and adjuvant and metastatic breast cancer patients, not an accurate quantification of these differences. Therefore, total RNA was isolated from blood samples of healthy donors and patients with primary or metastatic breast cancer after enrichment of mononuclear cells by density gradient centrifugation. After reverse transcription real-time PCR was carried out with a set of marker genes (BCSP, CK8, Her2, MGL, CK18, CK19). B2M and GAPDH were used as reference genes. Blood samples from patients with metastatic disease revealed increased cytokine gene levels in comparison to normal blood samples. Detection of a single gene was not sufficient to detect CTCs by reverse transcription real-time PCR. Markers used here were selected based on a recent study detecting cancer cells on different protein levels. The combination of such a marker array leads to higher and more specific discovery rates, predominantly in metastatic patients. Identification of CTCs by PCR methods may lead to better diagnosis and prognosis and could help to choose an adequate therapy.

In the February 2014 issue of Clinical Chemistry, the influence of PCR reagents on DNA polymerase extension rates were studied by examining nucleotide incorporation with DNA dyes. We are joined by one of the authors of that study, Dr. Carl Wittwer. He is Professor of Pathology at the University of Utah Health Sciences Center and is also affiliated with ARUP Laboratories, BioFire Diagnostics, and is an Associate Editor of Clinical Chemistry.

Das Schädel-Hirntrauma (SHT) ist bei Kindern und jungen Erwachsen bis zum 45. Lebensjahr mit einer Inzidenz von 332 Verletzten pro 100.000 Einwohner in Deutschland die häufigste Krankheits- und Todesursache. Neben dem persönlichen Leiden und der hohen Rate an posttraumatischer Pflegebedürftigkeit, sollte auch die sozioökonomische Tragweite mit, allein in Deutschland, gesamtgesellschaftlichen Kosten von 2,8 Milliarden Euro pro Jahr berücksichtigt werden. Zwei wesentliche Verletzungsmuster des SHT werden unterschieden: die fokale Kontusion sowie der diffuse Axonschaden. Beide Mechanismen führen zum posttraumatischen Hirnödem und intrakraniellem Druckanstieg, Hauptprädiktoren für ein schlechtes Ergebnis der Patienten. Die daraus resultierende zerebrale Minderperfusion und Hirnischämie münden in einen Circulus vitiosus mit Progredienz des Hirnödems. Ca. 50% des Hirnödems entsteht sekundär und wäre daher einer Behandlung prinzipiell zugänglich. Trotz intensiver Forschung fehlt weiterhin eine kausale und anti-ödematöse Therapie. Vasopressin und V1a-Rezeptoren scheinen eine wesentliche Rolle in der Pathophysiologie von Hirnschädigungen zu spielen, da einerseits die Höhe des Vasopressin-Serumspiegels positiv mit der Schwere von verschiedenen Hirnläsionen korreliert und andererseits eine pharmakologische Hemmung des V1a-Rezeptors das Hirnödem und den sekundären Hirnschaden nach experimentellem Schädel-Hirntrauma mindert. Während die systemische Regulation der Wasserhomöostase in der Niere über den antidiuretischen Effekt von Vasopressin sehr gut bekannt ist, vermittelt über V2-Rezeptoren und Aquaporin 2 (AQP2), ist sowohl die zentrale Funktion von Vasopressin als auch die Regulation zerebraler AQP noch unzureichend verstanden. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher 1. den Einfluss von Vasopressin V1a-Rezeptoren auf den sekundären Hirnschaden nach experimentellem SHT an einem hochspezifischen V1a-Rezeptor knock-out Mausmodell zu untersuchen, 2. die Bedeutung der zerebralen AQP 1, 4 & 9 für den Hirnwassertransport und die post-traumatische Hirnödem Entstehung zu erforschen sowie 3. die Frage zu klären, ob die gezeigten anti-ödematösen Effekte des V1a-Rezeptors über zerebrale AQP nach Controlled Cortical Impact (CCI) im Mausmodell vermittelt werden. An tief anästhesierten Wildtyp und V1a-Rezeptor knock-out Mäusen wurde nach mikrochirurgischer Präparation ein standardisiertes und mittelschweres CCI ausgelöst. Die Hirnentnahme erfolgte je nach Zielparameter jeweils von unbehandelten Mäusen sowie 15 Minuten, 1, 3, 6, 12, 24 h oder 7 Tage nach Trauma. Für die Validierung des knock-out Modells wurden die physiologischen Parameter intrakranieller Druck, mittlerer arterieller Druck und die zerebrale Durchblutung vor und über 30 Minuten nach CCI bestimmt. Für die Untersuchung der neuroprotektiven Effekte des V1a Rezeptors waren die Zielparameter: Hirnwassergehalt, sekundäres Nekrosevolumen, die neurologische Funktion, Gewichtsänderung sowie die Mortalität. Die Entwicklung von maushirnspezifischen Primern war wesentliche Voraussetzung für die Quantifizierung von AQP1, 4 & 9 mRNA durch quantitative Real-Time PCR. Immunhistochemisch wurden mit der Fluorchrom-Methode und dem Infrarot Scan AQP1 & 4 lokalisiert und quantifiziert. Wesentliche Ergebnisse waren der Nachweis der neuroprotektiven Effekte durch die Deletion des V1a-Rezeptors, wodurch das posttraumatische Hirnödem und der sekundäre Hirnschaden 24 h nach Trauma um knapp 30% reduziert wurde, der posttraumatische Gewichtsverlust über 7 Tage verringert sowie die neurologische Funktion über 7 Tage nach experimentellem SHT signifikant verbessert war. Die murinen AQP1, 4 & 9 Primer waren spezifisch und für die quantitative RT-PCR geeignet. Auf Transkriptionsebene wurde AQP1 V1a-Rezeptor-abhängig 24 h nach CCI hochreguliert. AQP4 mRNA wurde konstitutiv exprimiert. AQP9 unterlag auf Transkriptionsebene keiner posttraumatischen Regulation. Auf Proteinebene wurde AQP1 nicht nur auf dem Ependym des Plexus choroideus, sondern erstmals auf kortikalen Neuronen im Maushirn detektiert. AQP4 war ubiquitär auf kortikalen und subkortikalen Astrozyten lokalisiert. Posttraumatisch wurde AQP1 kontralateral und AQP4 periläsional V1a-Rezeptor-abhängig sowohl kurz- als auch langfristig reguliert. Zusammenfassend ist zu sagen, dass Vasopressin an der Entstehung des sekundären Hirnschadens über V1a Rezeptoren nach experimentellem SHT im Mausmodell beteiligt ist. Die gezeigten anti-ödematösen Effekte werden im V1a-Rezeptor knock-out Mausmodell über Aquaporine vermittelt. Die kurz- und langfristige V1a-Rezeptor-abhängige AQP1 & 4 Regulation im Hirnparenchym korreliert dabei mit der Bildung des posttraumatischen Hirnödems. Somit sind der V1a-Rezeptor sowie AQP1 & 4 ein möglicher pharmakologischer Angriffspunkt für die Prävention und Reduktion des posttraumatischen, sekundären Hirnödems.

Enterohämorrhagische E. coli (EHEC) gehören zu den wichtigen, lebensmittelassoziierten Erregern von Gastroenteritiden. Schwere Erkrankungsverläufe, wie die postinfektiöse Komplikation HUS sind bekannt und betreffen meist Kinder unter 5 Lebensjahren. Als Primärquelle gelten Wiederkäuer, in deren Gastrointestinaltrakt das natürliche Habitat von Shigatoxin-bildenden E. coli liegt. Über fäkale Kontamination von Lebensmitteln, Wasser oder auch direkten Kontakt können STEC oral vom Menschen aufgenommen werden, wobei nicht alle STEC gleich virulent sind. Manche, wie z. B. die der Serogruppen O26, O103, O111, O145 und O157 werden wesentlich häufiger bei erkrankten Menschen nachgewiesen als andere. Ziel dieser Studie war es zum einen fünf Singleplex Real-Time PCR-Systeme und ein Pentaplex Real-Time PCR-System zum Nachweis der oben genannten fünf E. coli-Serogruppen am LGL, Oberschleißheim, zu etablieren. Die in der Norm ISO/TS 13136:2012 als „hochpathogen“ eingestuften STEC-Stämme können somit anhand der dort beschriebenen Primer- und Sondensequenzen aus Probenisolaten detektiert werden. Für die Validierung wurden die Selektivität, Sensitivität, Präzision und Richtigkeit der PCR-Systeme bestimmt. Zum anderen wurden die Daten von 8272 humanen Proben (einschließlich der des EHEC O104:H4-Ausbruchs von 2011), 1521 Lebensmittelproben, 240 Tierkotproben, 69 Schlachtkörperproben und 29 Wasserproben aus den Jahren 2009 bis 2011 aus Bayern sowie die STEC-Serotypisierungsergebnisse von 09/2004 bis 12/2011 ausgewertet und beschrieben. Im Vergleich mit der gängigen Serotypisierung mittels Agglutination bietet das Real-Time PCR-Verfahren insbesondere bei großem Probenumfang einen enormen Zeitvorteil. Das Pentaplex PCR-System ermöglicht zudem eine zeitgleiche Analyse von Probenisolaten auf alle fünf Serogruppen. Alle E. coli-Stämme der Serogruppen O26, O103, O111, O145 und O157 wurden durch die PCR-Systeme korrekt nachgewiesen. Die O103-Sondensequenz wurde hierfür zuvor modifiziert. Die Spezifität der Nachweissysteme für O26, O103 und O145 lag in Bezug auf E. coli bei 100 %. Bei den Nachweissystemen für O111 und O157 zeigten auch Bakterienstämme anderer Gattungen ein positives Ergebnis in der PCR (Serratia entomophila / rfbEO157-positiv und Shigella sp. LGL 2869 / wbd1O111-positiv). Die Datenauswertung ergab unter anderem einen hohen Anteil stx-positiver Tierkot- und Schlachtkörperproben von Rindern. Die meisten stx-positiven Lebensmittel stammten von Wiederkäuern. Vereinzelt waren auch potenziell humanvirulente STEC nachzuweisen. Der Großteil der nicht-humanen Proben war weder eae- noch EhlyA-positiv, während nur ein Viertel der humanen Proben keines der beiden Gene aufwies. Bei humanen Proben dominiert die Gruppe der unter 1 bis 5-jährigen Erkrankten und Frauen sind häufiger betroffen als Männer. Die E. coli-Serogruppen O26, O103, O111, O145 und O157 gehören zu den häufigsten in Bayern und 2011 infizierten sich 47 Menschen in Bayern mit EHEC O104:H4.

Background: Acute schistosomiasis constitutes a rare but serious condition in individuals experiencing their first prepatent Schistosoma infection. To circumvent costly and time-consuming diagnostics, an early and rapid diagnosis is required. So far, classic diagnostic tools such as parasite microscopy or serology lack considerable sensitivity at this early stage of Schistosoma infection. To validate the use of a blood based real-time polymerase chain reaction (PCR) test for the detection of Schistosoma DNA in patients with acute schistosomiasis who acquired their infection in various endemic regions we conducted a European-wide prospective study in 11 centres specialized in travel medicine and tropical medicine. Methods: Patients with a history of recent travelling to schistosomiasis endemic regions and freshwater contacts, an episode of fever (body temperature >= 38.5 degrees C) and an absolute or relative eosinophil count of >= 700/mu l or 10%, were eligible for participation. PCR testing with DNA extracted from serum was compared with results from serology and microscopy. Results: Of the 38 patients with acute schistosomiasis included into the study, PCR detected Schistosoma DNA in 35 patients at initial presentation (sensitivity 92%). In contrast, sensitivity of serology (enzyme immunoassay and/or immunofluorescence assay) or parasite microscopy was only 70% and 24%, respectively. Conclusion: For the early diagnosis of acute schistosomiasis, real-time PCR for the detection of schistosoma DNA in serum is more sensitive than classic diagnostic tools such as serology or microscopy, irrespective of the region of infection. Generalization of the results to all Schistosoma species may be difficult as in the study presented here only eggs of S. mansoni were detected by microscopy. A minimum amount of two millilitre of serum is required for sufficient diagnostic accuracy.

Ziel dieser Arbeit war es einen umfassenden Einblick über die Bedeutung und das Vorkommen des Erregers Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) bei Rothirschen im Nationalpark Bayerischer Wald, stellvertretend für die Rothirschpopulation in ganz Bayern, zu erhalten. Untersucht wurden 87 Serumproben aus den Jagdsaisons 2009/ 2010 und 2010/ 2011 sowie Faeces und Ileocaecallymphknoten von 68 Rothirschen aus der Jagdsaison 2010/ 2011. Die Rothirsche der Jagdsaison 2010/ 2011 wurden zudem adspektorisch untersucht. In der vorliegenden Arbeit wurden für den Nachweis von MAP ein ELISA, die konventionelle und die Real-Time PCR verwendet. Die Ergebnisse der adspektorischen, serologischen und molekularbiologischen Untersuchungen deuten darauf hin, dass es sich bei den untersuchten Tieren um paratuberkulosefreie Rothirsche handelte. Dies ist vermutlich auf die seltene gemeinsame Weidenutzung von Rindern und Hirschen, die geringe Bodenvorlage des Futters und die niedrige Bestandsdichte im Nationalpark zurückzuführen.

At the end of the session, the participant will be able to 1) differentiate between PCR, TMA, SDA, and bDNA amplification technologies, 2) distinguish between end-point and real-time PCR, and 3) comprehend the impact on the laboratory of using an ASR versus an IVD product. Speaker: Nicole Robinson, Ph.D., Medical and Scientific Affairs, Roche Diagnostics Duration: 60 minutes Credit hours: 1.0

This presentation will 1) Discuss the differences between end-point and real-time PCR. 2) Describe three different real-time PCR detection technologies. 3) Describe the process of fluorescence resonance energy transfer (FRET). Speaker: Nicole Robinson, Ph.D., Medical and Scientific Affairs, Roche Diagnostics Duration: 30 minutes Credit hours: 1.0

Im Zellkern einer jeden Zelle besteht eine gewisse Ordnung der darin vorhandenen DNA und Proteine. Diese Ordnung wird unter dem Begriff „Zellkernarchitektur“ zusammengefasst. In der vorliegenden Arbeit ging es um die nähere Betrachtung einiger Aspekte der Zellkernarchitektur. Diese Aspekte betrafen 1. die Anordnung von Genen, 2. die Anordnung von Chromatin mit Hilfe unterschiedlicher Histonmodifikationen und 3. die Anordnungen von Chromosomenabschnitten, die mit komplexen messenger RNA-Sonden hybridisiert werden. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde mittels 3D FISH die dreidimensionale Positionierung von drei auf dem Chromosom 1 lokalisierten Genen in Zellkernen der Burkitt- Lymphom Zelllinie DG75 bestimmt. Diese Zelllinie wurde von Stefan Bohlander zur Verfügung gestellt und enthielt einen induzierbaren episomalen Vektor für das CALM-AF 10 Gen. Messungen der Genexpression, die in der Bohlander Gruppe mit Hilfe eines Affymetrix- Chips durchgeführt wurden, zeigten das die Induktion des Transgens zu genomweiten Veränderungen der Expressionsmuster hunderter Gene in dieser Zelllinie führten. Die für die 3D FISH Experimente ausgewählten Markergene zeigten nach der Induktion eine signifikant veränderte Expression. Dennoch änderte sich die radiale Positionierung dieser Gene, darunter versteht man die mehr innere oder mehr periphere Position der Gene, nicht. Dieses Ergebnis schien zuerst darauf hinzuweisen, dass die Transkriptionsstärke keine bedeutsamer Faktor im Hinblick auf die radiale Positionierung ist. Die Befunde der Affymetrix-Chip Analyse für diese Gene konnten jedoch in einer anschließende Untersuchungen der Genexpression mit Real-Time-PCR nicht bestätigt werden, obwohl der Vergleich von Affymetrix-Chip und Real- Time-PCR Daten insgesamt eine klare Korrelation zwischen den Datensätzen zeigte. Bei Diskrepanzen gehen wir davon aus, dass Real-Time-PCR die zuverlässigeren Ergebnisse liefert. Bei der hier durchgeführten Real-Time-PCR Untersuchung wurden auch die Expressionsstärken aller in einer Nachbarschaft von etwa 1 Mbp um die Markergene annotierten Gene ermittelt. Dieses Fenster wurde gewählt, weil Untersuchungen in der Arbeitsgruppe von Thomas Cremer und anderen Gruppen gezeigt haben, dass ~1 Mbp Chromatindomänen die Basisstruktur der Chromatinorganisation darstellen. Als Maß für die gesamte Genexpression einer Chromatindomäne wurde eine „Total Expression Strength“ (TES) berechnet. Dieser Wert basiert auf den Real-Time-PCR Werten der annotierten Gene und berücksichtigt auch die Länge der ungespleissten RNA, die von einem Gen transkribiert wird. Dabei zeigte sich, dass das Markergen in der Domäne mit dem höchsten TES Wert am weitesten innen im Zellkern lokalisiert ist. Dieser Befund unterstützt Befunde aus der wissenschaftlichen Literatur, dass die radiale Positionierung von individuellen Genen von Eigenschaften der lokalen Umgebung abhängt. Da sich die Nachbarschaft der untersuchten Markergene nicht nur im Hinblick auf die TES Werte sondern auch im Hinblick auf die Dichte der dort annotierten Gene und den GC-Gehalt unterscheidet, bleibt offen, welcher dieser Parameter als Prädiktor für die zu erwartende radiale Position individueller Gene eine entscheidende Rolle spielt. Möglich ist auch, dass alle Parameter zusammenwirken oder dass je nach den speziellen Umständen einer Untersuchung verschiedene Parameter die radiale Positionierung eines Gens bevorzugt beeinflussen. Die Stabilität der radialen Positionierung der Markergene trotz einer genomweiten Veränderung des Genexpressionsmusters nach CALM-AF 10 Induktion stimmt mit Befunden verschiedener Arbeitsgruppe überein, die für einen hohen Grad an räumlicher Stabilität der Chromatinanordnung während der Interphase sprechen; ~1 Mbp Chromatindomänen zeigen dementsprechend meist nur sehr begrenzte lokale Bewergungen (

Bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1), an alphaherpesvirus, is a major pathogen of cattle causing different syndromes such as infectious bovine rhinotracheitis (IBR), infectious pustular vulvovaginitis (IPV) and infectious balanoposthitis (IBP). BoHV-1 control programs have been initiated in several European countries including Germany. One of the major components is the vaccination with inactivated or attenuated glycoprotein E (gE)-deleted live marker vaccines. The aim of this study was the development of a triplex real-time polymerase chain reaction (qPCR) assay for the sensitive, specific and reliable BoHV-1 detection. A BoHV-1-specific glycoprotein D (gD) assay was combined with a gE-specific qPCR system for differentiation between wild-type strains and gE-negative vaccine virus strains. Finally, an internal control based on amplification of the bovine beta-actin gene was introduced to verify efficient DNA extraction and PCR amplification. The analytical sensitivity of the triplex BoHV-1 qPCR enables the detection of 10 genome copies per reaction. Furthermore, the sensitivity of the newly developed qPCR assay was compared to an OIE-validated qPCR and the “gold standard” method of virus isolation in cell culture using 10-fold dilution series of BoHV-1 in extended semen as well as in cell culture medium. For all preparations, the tested qPCR assays showed comparable results and the sensitivity of the triplex qPCR was equal or even greater than that of virus isolation. A broad spectrum of reference strains and field isolates was detected reliably. The specificity of the test was confirmed using nasal swabs, semen and different organ materials of BoHV-1-negative cattle. Bovine herpesviruses type 2, 4 and 5 and further ruminant herpesviruses, namely bubaline herpesvirus (BuHV-1), caprine herpesvirus type 1 and cervine herpesvirus type 1 and 2 (CvHV-1, -2) were tested as well. The close genetic and serological relationship between these viruses combined with their ability to infect bovines may interfere with diagnostics resulting in false-positive results. All non-BoHV-1 herpesviruses were negative in the gD-specific assay, while BuHV-1, CvHV-1 and -2 were tested positive by the gE-specific qPCR. Consequently, the triplex qPCR offers for the first time the possibility to detect some related herpesviruses and distinguish them from BoHV-1 in addition to the simultaneous differentiation of BoHV-1 wild-type and gE-deleted vaccine strains.

Helicobacter pylori, ein gramnegatives Stäbchenbakterium, kann durch eine Invasion der Magenschleimhaut Erkrankungen wie die Typ B-Gastritis, die gastroduodenale Ulkuserkrankung, das Magenkarzinom sowie das MALT-Lymphom hervorrufen. Etwa die Hälfte der Weltbevölkerung ist von einer Infektion betroffen und damit potentiell einem erhöhten Risiko für diese Erkrankungen ausgesetzt. Die Behandlung einer Helicobacter pylori-Infektion erfolgt durch eine Kombinationstherapie, bestehend aus zwei Antibiotika – Clarithromycin plus Metronidazol oder Clarithromycin plus Amoxicillin – und einem Protonenpumpen-Inhibitor. Therapeutische Probleme bereiten zunehmende Antibiotika-Resistenzen von Helicobacter pylori – insbesondere Resistenzen gegen Clarithromycin, die fast immer mit einem Therapieversagen assoziiert sind. Die derzeitige Goldstandard-Diagnostik mittels Ösophagogastroduodenoskopie beinhaltet deshalb neben dem Keimnachweis immer auch eine Antibiotika-Sensitivitätstestung. Ziel dieser Arbeit war es, zwei nicht-invasive Tests – einen Enzymimmunoassay (Amplified IDEIA Hp StAR; DakoCytomation) und eine Real-Time PCR (Helicobacter pylori ClariRes assay; Ingenetix) – an Stuhlmaterial von 100 symptomatischen, therapie-naiven Kindern zu testen und mit den gängigen Methoden der Helicobacter pylori-Diagnostik zu vergleichen. Der Infektionsstatus der Kinder wurde durch die Methoden Histologie, Kultur und 13C-Harnstoff-Atemtest festgelegt. Die Standard-Methoden zeigten für 54 Kinder einen negativen Helicobacter pylori-Infektionsstatus. Dieses Ergebnis wurde durch beide Stuhltests bestätigt (Spezifität jeweils 100%). Für die restlichen 46 Kinder wurde durch die Standard-Methoden ein positiver Infektionsstatus festgestellt. Der Stuhl-EIA bestätigte bei 44 dieser Kinder das positive Ergebnis und zeigte nur zwei falsch-negative Tests (Sensitivität 95,7%). Die Real-Time PCR lieferte bei 29 dieser Kinder ein positives Ergebnis (Sensitivität 69%). Für diese 29 Kinder konnte die Clarithromycin-Sensitivitätstestung des Helicobacter pylori ClariRes assay in allen Fällen das Ergebnis des E-Tests bestätigen. Es stellte sich heraus, dass der Stuhl-EIA durch seine exzellente Sensitivität und Spezifität über alle Altersgruppen ein guter Test ist, der günstig und leicht durchzuführen ist. Gerade bei Kindern unter sechs Jahren sollte er statt des ebenfalls nicht-invasiven 13C-Harnstoff-Atemtests angewendet werden. Nachteil des Stuhl-EIA bleibt jedoch eine fehlende Clarithromycin-Sensitivitätstestung. Der Helicobacter pylori ClariRes assay stellte sich zwar ebenfalls als schnelle und einfache diagnostische Methode dar, lieferte aber einige falsch-negative Ergebnisse (14 Kinder) und ist, verglichen mit den anderen nicht-invasiven Tests, relativ teuer. Daher kann dieser Test keine Alternative zur bisherigen Diagnostik darstellen und sollte lediglich als Zusatzuntersuchung für spezielle Fragestellungen eingesetzt werden. So könnte er z.B. als Bestätigungstest nach positivem Stuhl-EIA hilfreich sein, um zusätzliche Informationen über eine möglicherweise vorhandene Clarithromycin-Resistenz zu liefern. In dieser Studie wurden nur therapie-naive Kinder in die Untersuchung einbezogen. Ob diese Tests bei Kindern nach erfolgter Eradikationstherapie ähnliche Ergebnisse liefern, bedarf einer Bestätigung durch weitere Studien.

Exon 12 Nucleophosmin (NPM1) Mutationen stellen die häufigsten molekularen Aberrationen bei Erwachsenen mit akuter myeloischer Leukämie (AML) dar. Molekulare Detektion der Mutation Typ A (NPM1 A), welche 80% aller NPM1 Mutationen ausmacht, könnte für die Bestimmung von minimaler Resterkrankung (MRD) eingesetzt werden. Der molekulardiagnostische Nachweis minimaler Resterkrankung mittels RQ PCR ist von wesentlichem prognostischem Wert, um in Zukunft eine möglichst präzise Abschätzung des individuellen Rezidivrisikos, sowie eine risikoadaptierte Behandlung des Patienten zu ermöglichen. In dieser Arbeit wurde ein RT PCR-Test für die relative Quantifizierung von NPM1 Mutation A Expressionslevels im Vergleich zu Genlevels des Housekeeping-Gens ABL1 entwickelt. Die Expressionsratios wurden zusätzlich zur Normalisierung über das Referenz-Gen ABL1 über das Expressionsratio von NPM1 A zu ABL1 eines Calibrators normalisiert. Die PCR wurde mithilfe der Zelllinie OCI/AML3, welche positiv für die NPM1 A Mutation ist, etabliert. Der Calibrator entspricht einer Probe OCI/AML3 cDNA. Mithilfe einer Verdünnungsreihe von OCI/AML3 cDNA wurden getrennte Standardkurven für die Amplifikation von NPM1 und ABL1 erstellt. Der Assay hat eine Sensitivität von 10-5, das heißt die letzte nachweisbare Verdünnung von für die Mutation positive cDNA ist 1:100 000. Die Spezifität der PCR konnte mit mehreren Zelllinien, welche negativ für die NPM1 Mutation sind und keine Amplifikation gezeigt haben, nachgewiesen werden. Die Ergebnisse hinsichtlich Sensitivität und Spezifität konnten mit ausgewählten Patientenproben bestätigt werden. Die klinische Anwendung wurde mithilfe von Verlaufsmessungen von 51 NPM1 A positiven Patienten durchgeführt. NPM1 A mRNA Expressionslevel wurden in 154 Knochenmark- und Blutproben zu unterschiedlichen Stadien der Krankheit bestimmt. Bei 27 Patienten, die zum Zeitpunkt der Diagnose und nach Induktionstherapie analysiert worden sind, zeigten die NPM1 A Expressionsratios eine mittlere log10 Reduktion von 2,48. Dieses Ergebnis korreliert mit dem Erfolg der Behandlung, auch sichtbar in der Reduzierung der Blastenzahlen im Knochenmark. Von den 51 Patienten die zur Diagnosestellung untersucht worden sind, erlitten 21 ein Rezidiv. Zwei der 21 Patienten mit Rezidiv verloren die NPM1 A Mutation im Rezidiv, was durch eine Schmelzkurven-PCR bestätigt wurde. Die Beobachtung vom Verlust der Mutation durch klonale Evolution bei 9,5% der untersuchten Probenpaare von Diagnose und Rezidiv limitiert den Wert der NPM1 Mutation als molekularer Marker für MRD.

Background The choice of reliable reference genes is a prerequisite for valid results when analyzing gene expression with real-time quantitative PCR (qPCR). This method is frequently applied to study gene expression patterns in immune cells, yet a thorough validation of potential reference genes is still lacking for most leukocyte subtypes and most models of their in vitro stimulation. In the current study, we evaluated the expression stability of common reference genes in two widely used cell culture models-anti-CD3/CD28 activated T cells and lipopolysaccharide stimulated neutrophils-as well as in unselected untreated leukocytes. Results The mRNA expression of 17 (T cells), 7 (neutrophils) or 8 (unselected leukocytes) potential reference genes was quantified by reverse transcription qPCR, and a ranking of the preselected candidate genes according to their expression stability was calculated using the programs NormFinder, geNorm and BestKeeper. IPO8, RPL13A, TBP and SDHA were identified as suitable reference genes in T cells. TBP, ACTB and SDHA were stably expressed in neutrophils. TBP and SDHA were also the most stable genes in untreated total blood leukocytes. The critical impact of reference gene selection on the estimated target gene expression is demonstrated for IL-2 and FIH expression in T cells. Conclusions The study provides a shortlist of suitable reference genes for normalization of gene expression data in unstimulated and stimulated T cells, unstimulated and stimulated neutrophils and in unselected leukocytes.

It is very important to work against the increase of stillbirth and calving difficulties in the German Simmental population from breeding, economics and animal protections point of view. The igf2r, esr1 and sod2 were chosen from earlier analysis as candidate genes for stillbirth. igf2r was excluded as a candidate gene during analysis because the inactivation of the paternal Allel was proven with the microsatellite LMU0901 in comparison between genomic DNA and cDNA. The candidate genes esr1 and sod2 were tested for variations in their sequences and in their expression. Three mutations in the esr1 Exons I, IV and VIII were detected, but none of them leads to an amino acid change. A little change in the expression rate of esr1 could be observed by Real Time PCR analyses which suggest its involvement in the signal cascade of the causal gene for the stillbirth trait. But it is not directly involved. Three mutations could be detected in the mRNA sequence of sod2. One of them causes an amino acid change. However, it could not be associated with the trait of stillbirth. In both RNA samples, heart and liver, no change in expression rate of sod2 through Real Time analyses was detected. Four QTLs were found in the genome wide association and mapping studies. They are localised on BTA01, BTA05, BTA06 and BTA21.

Latent infizierte Nutztiere, und so auch Schafe und Ziegen, können Träger verschiedener lebensmittelrelevanter bakterieller Zoonoseerreger sein, ohne dabei selbst klinische Symptome zu zeigen. Da es im Rahmen des Schlachtprozesses sowie der weiteren Verarbeitung zu einer Kontamination des Schlachttierkörpers und der Organe und somit zu einem Eintrag in die Lebensmittelkette kommen kann, ist es notwendig, das Vorkommen dieser Zoonoseerreger zu kennen, um das Risiko einer Kontamination abschätzen zu können. Das Ziel dieser Studie war, die Prävalenz lebensmittelrelevanter bakterieller Zoonoseerreger bei kleinen Wiederkäuern aus der Schweiz zu ermitteln, um somit ihre Bedeutung als Reservoir und Infektionsquelle für den Menschen beurteilen zu können. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Tonsillen und der Kot von 100 Schafen und 100 Ziegen auf das Vorkommen von thermotoleranten Campylobacter spp., Salmonella spp., enteropathogenen Yersinia spp., STEC sowie L. monocytogenes untersucht. Dabei handelte es sich jeweils um 50 adulte und 50 juvenile Tiere verschiedener landestypischer Rassen. Ein Teil der adulten Tiere war zum Zeitpunkt der Schlachtung trächtig. Im Rahmen der Fleischuntersuchung wurden bei einigen Tieren verschiedene pathologische Veränderungen festgestellt. Zunächst wurde eine direkte kulturelle Untersuchung aller ausgewählten Bakterien unter Verwendung von Selektivnährböden durchgeführt. Die anschließende Screeninguntersuchung auf das Vorkommen thermotoleranter Campylobacter spp., Salmonella spp. und L. monocytogenes erfolgte mittels VIDAS®, der Nachweis enteropathogener Yersinia spp. und STEC mittels Real-Time PCR. Positive Proben der Screeninguntersuchungen wurden dann mit Selektivnährböden kulturell untersucht. Weitergehend erfolgte eine Identifizierung präsumtiv gewachsener Einzelkolonien. Für thermotolerante Campylobacter spp., Salmonella spp. und L. monocytogenes wurde eine biochemische Identifizierung gewählt. Zur Identifizierung von STEC und enteropathogenen Yersinia spp. wurde anhand präsumtiver Einzelkolonien eine zweite Real-Time PCR durchgeführt. Abschließend wurden die Ergebnisse hinsichtlich des Alters der Tiere, des Trächtigkeitsstatus, des Vorkommens pathologischer Veränderungen sowie der Zugehörigkeit zu verschiedenen Rassen ausgewertet. In der Screeninguntersuchung mittels VIDAS® fiel die Nachweisrate für Salmonella spp. sowohl bei den Schafen (Tonsillen 100 %, Kot 95 %) als auch bei den Ziegen (Tonsillen 70 %, Kot 50 %) sehr hoch aus. Auffallend war dabei der hohe Anteil positiver Tonsillenproben. Auch thermotolerante Campylobacter spp. wurden häufig, jedoch nur in den Kotproben der Tiere (Schafe 75 %, Ziegen 85 %), nachgewiesen. Der Nachweis von L. monocytogenes fiel niedriger aus (Schafe 5 %, Ziegen 25 %), und war ebenfalls nur in den Kotproben möglich. In der Screeninguntersuchung auf enteropathogene Yersinia spp. waren lediglich 2 % der Schafe positiv für pathogene Y. enterocolitica (Tonsillen 1 %, Kot 1 %). STEC konnten bei 6 % der Schafe (Tonsillen 2 %, Kot 4 %) und 21 % der Ziegen (Tonsillen 9 %, Kot 12 %) nachgewiesen werden. Eine kulturelle Isolierung der in der Screeninguntersuchung positiven Ergebnisse war nur bei einem geringen Anteil der Proben möglich. Die biochemische Identifizierung erbrachte bei 9 Tonsillenproben von Schafen den Nachweis von Salmonella spp. Aus 5 Schafkotproben, 1 Ziegentonsille und 44 Ziegenkotproben konnten verschiedene apathogene Listeria spp. isoliert und identifiziert werden, jedoch aus keiner Probe L. monocytogenes. Alle STEC-positiven Tonsillenproben von Schafen, sowie 2 von 9 Ziegentonsillenproben ließen sich in der zweiten Real-Time PCR bestätigen. Die Auswertung des kulturellen Direktnachweises gab keinen Hinweis auf ein zum Zeitpunkt der Schlachtung akut infiziertes Tier. Insgesamt fiel die Nachweisrate pathogener Bakterien bei juvenilen Tieren höher aus als bei adulten Tieren. Der Vergleich der Ergebnisse erbrachte sowohl im Hinblick auf eine Trächtigkeit der Tiere als auch hinsichtlich des Vorkommens pathologischer Veränderungen bei keinen der untersuchten Bakterien eine statistische Signifikanz. Ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen der Nachweisrate und der Zugehörigkeit zu einer Rasse war lediglich bei der Identifizierung von Salmonella spp. erkennbar. Die Studie zeigt, dass Schafen und Ziegen eine wesentliche Bedeutung als Reservoir lebensmittelrelevanter bakterieller Zoonoseerreger zukommt. Die Untersuchungen ergaben, dass die Tonsillen insbesondere eine Infektionsquelle für Salmonella spp. und in geringerem Maße auch für STEC darstellen. Der Kot spielt v.a. bei der Übertragung von thermotoleranten Campylobacter spp. und Salmonella spp., aber auch von STEC und L. monocytogenes eine wichtige Rolle. Im Rahmen der Schlachtung kann es daher, sowohl ausgehend von einer fäkalen Verunreinigung, als auch durch das Entfernen der Tonsillen während der Fleischuntersuchung, zu einer Kontamination und einem Eintrag der Zoonoseerreger in die Lebensmittelkette kommen. Enteropathogene Yersinia spp. konnten insgesamt nur in sehr geringem Umfang nachgewiesen werden, so dass hier den kleinen Wiederkäuern als asymptomatische Trägertiere keine wesentliche Bedeutung beigemessen werden kann.

Thu, 29 Apr 2010 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/11514/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/11514/1/Lorenz_Andreas.pdf Lorenz, Andreas

Fri, 6 Feb 2009 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9895/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9895/1/Prohaska_Sarah_Nicole.pdf Prohaska, Sarah Nicole

Fri, 18 Jul 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8932/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8932/1/Spreyer_Philipp.pdf Spreyer, Philipp ddc

Thu, 10 Jul 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8762/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8762/1/Beifuss_Barbara.pdf Beifuß, B

Fri, 8 Feb 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8377/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8377/1/Kraemer_Iris.pdf Kraemer, Iris ddc:500, ddc:5

Thu, 17 Jan 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/7966/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/7966/1/Mayer_Verena.pdf Mayer, Verena

In der vorliegenden Arbeit wurde basierend auf der genotypischen Charakterisierung von Stämmen des Mycobacterium tuberculosis - Komplexes anhand des gyrA-Gens mit Hilfe einer auf dem LightCycler® System basierenden gyrA Real-time-PCR ein neuartiges Testverfahren zur Bestimmung von Chinolonresistenzen konzipiert und etabliert. Bei der Evaluierung des Testverfahrens mit 13 phänotypisch resistenten Stämmen mit einer MHK ≥ 4 µg/ml für Ciprofloxacin zeigten 9 Stämme bei der Schmelzpunktanalyse einen eine Mutation anzeigenden Shift des Tm’s, 2 weitere wiesen die typische Schmelzkurve einer Heteroresistenz auf. Die Sequenzierung ergab, dass 5 dieser Stämme eine Mutation des Codon 90 (Ala→Val, GCG→GTG) und 6 Stämme eine Mutation des Codons 94 (Asp→Gly, GAC→GGC) aufwiesen. Die beiden verbliebenen Stämme hatten den Schmelzpunkt des Wildtyps, der durch die Sequenzierung bestätigt werden konnte. Die molekularepidemiologische Unabhängigkeit der resistenten Stämme wurde durch das IS6110 Fingerprinting bestätigt. 44 phänotypisch sensible Stämme wiesen ebenfalls den Tm des Wildtyps auf. Damit besitzt das Testverfahren für den Nachweis von Chinolonresistenzen eine Sensitivität von 85% und eine Spezifität von 100%. Die Speziesspezifität wurde anhand von 7 typischen und 16 atypischen Mykobakterien sowie humanen DNA-Präparationen und Sputumproben überprüft, wobei sich eine Amplifikation nur bei Mitgliedern des M.tb. - Komplexes fand. Das Testverfahren ist somit hochspezifisch für den Mycobacterium tuberculosis - Komplex. Der Test wurde für die Bestimmung von der Primärkultur und für den Direktnachweis aus dem Sputum evaluiert. Der Nachweis von Mykobakterien direkt aus dem Sputum mit dem Testverfahren ist mit 103 KBE/ml eine Größenordnung sensitiver als die Mikroskopie. Das Testergebnis liegt in der Regel innerhalb eines Tages vor. Für die Testdurchführung und die Testauswertung wurden Standardprotokolle erstellt. Anhand einer kritischen Evaluation der Primärliteratur konnte gezeigt werden, dass eine hohe Konkordanz von über 90% zwischen höhergradigen Chinolonresistenzen (MHK ≥ 4 µg/ml) und Mutationen des gyrA-Gens besteht. Die Informationen aus der phänotypischen und der genotypischen Resistenztestung sollte genutzt werden, um die beiden Verfahren gegenseitig zu evaluieren. So sprechen die bisherigen molekularbiologischen Daten für den von der WHO vorgeschlagenen Grenzwert von >2µg/ml bei der phänotypischen Resistenzbestimmung. Anhand von klinischen Studien sollte die Grenzwertsetzung überprüft und vor allem der Nutzen der Techniken für den Patienten evaluiert werden. Chinolone haben eine stark zunehmende Bedeutung bei der Behandlung der Tuberkulose und werden bisher vor allem bei der Behandlung der MDR-Tuberkulose eingesetzt. In mehreren klinischen Studien wird derzeit auch der Einsatz von Gyrasehemmern der neusten Generation als Standardmedikament untersucht. Hiervon verspricht man sich insbesondere eine Verkürzung und eine bessere Verträglichkeit der Therapie. Sollten sich die Chinolone als First Line Medikament zur Behandlung der Tuberkulose durchsetzten, könnte die im Rahmen dieser Arbeit entwickelte auf dem LightCycler® System basierende gyrA Real-time-PCR aufgrund der schnellen Resistenzbestimmung innerhalb eines Tages dem Kliniker entscheidende Hinweise für die primäre Einleitung einer effektiven Therapie geben.

Nach Angaben des statistischen Bundesamtes starben in Deutschland in den vergangenen Jahren durchschnittlich 11.000 Menschen durch Suizid. Suizidales Verhalten ist sehr komplex und wird sowohl durch Umwelteinflüsse als auch durch genetische Faktoren beeinflusst. Es wird dabei ein polygener Erbgang mit multiplen Suszeptibilitätsgenen angenommen, die jeweils nur einen kleinen Einfluss haben. Insgesamt ist bisher aber nur wenig zu den beteiligten Genen und neurobiologischen Mechanismen bekannt. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Identifikation neuer Kandidatengene für suizidales Verhalten durch Microarrayversuche. Im Rahmen dieser Fragestellung wurde die Expression von mehr als 23.000 Transkripten in post mortem Hirngewebe aus dem orbitofrontalen Cortex von 11 Suizidenten und 10 Kontrollpersonen bestimmt. Bei einem Signifikanzniveau von α = 0,01 waren insgesamt 124 Gene in der Suizidgruppe differentiell exprimiert. Die Validierung der Ergebnisse mit Hilfe der quantitativen Real-Time-PCR konnte die Richtung der Expressionsänderung für 15 von 16 untersuchten Genen bestätigen. Die anschließende Klassifizierung der identifizierten Gene nach ihrer biologischen Funktion zeigte, daß verschiedene Gene Ontology Kategorien signifikant überrepräsentiert waren. Insgesamt geben die gefundenen Expressionsunterschiede erste Hinweise auf eine mögliche Bedeutung dieser Gene und biologischen Funktionskreise für die Entstehung suizidales Verhaltens.

Bradykinin – ein früher Entzündungsmediator – ist ein aktiver Metabolit des Kallikrein-Kinin Systems, der seine Funktion in erster Linie über den konstitutiv exprimierten Kinin B2 Rezeptor vermittelt. Sämtliche Komponenten dieses Systems sind im Gehirn nachgewiesen worden. Pharmakologische Studien mit Kinin B2 Rezeptor Antagonisten lassen vermuten, dass Bradykinin an der Entwicklung des sekundären Hirnschadens nach zerebraler Ischämie beteiligt ist. Ferner gibt es sehr starke Hinweise darauf, dass Bradykinin durch Öffnung der Blut-Hirn Schranke maßgeblich an der Entstehung des Hirnödems nach Ischämie beteiligt ist. Dennoch ist der zeitliche Verlauf der Produktion von Bradykinin und der Expression der Kinin Rezeptoren sowie die Rolle des Kinin B2 Rezeptors für die Entwicklung des Hirnschadens nach experimentellem Schlaganfall bisher nicht weiter beleuchtet worden. Aufgrund der sehr starken Hinweise auf eine pathophysiologische Relevanz des Kallikrein-Kinin Systems bei der zerebralen Ischämie, wollten wir dessen Beteiligung an der Entstehung des sekundären Hirnschadens nach transienter fokaler zerebraler Ischämie genauer untersuchen. Hierfür unterzogen wir Mäuse des Stammes C57/Bl6 einer 45minütigen Okklusion der A. cerebri media (MCA) mittels eines intraluminalen Fadens, was zu einem standardisierten ischämischen Infarkt im MCA-Versorgungsgebiet führte. Zunächst bestimmten wir die Konzentration an Bradykinin mit einem Radioimmunoassay, sowie die Expression der Kinin Rezeptoren auf mRNA- und Protein-Ebene mit Real-Time PCR bzw. Immunhistochemie zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach Ischämie. Nachdem wir die zeitlichen Verläufe der Produktion von Bradykinin und der Expression der Kinin Rezeptoren ermittelt hatten, interessierten wir uns besonders für die funktionelle Bedeutung des B2 Rezeptors, über den vermutlich die pathologischen Mechanismen in Gang gesetzt werden. Um dessen Bedeutung beurteilen zu können, ermittelten wir 24 Stunden nach Ischämie bei B2 Rezeptor knockout Mäusen (B2-/-) gravimetrisch durch Messung von Feucht- und Trockengewicht das Hirnödem, histomorphometrisch das Infarktvolumen, die motorische Funktion mit Hilfe eines Neuroscores und die Mortalität während der ersten Woche nach experimentellem Schlaganfall. Die B2-/- und C57/Bl6 Mäuse waren zuvor ausführlich hinsichtlich der für unsere Versuche relevanten Parameter charakterisiert und verglichen worden, wobei wir die C57/Bl6 Mäuse als geeignete Kontrollen evaluierten. Die Konzentration an Bradykinin im Hirngewebe war 12 Stunden nach Ischämie maximal angestiegen (3-fach), während die Hochregulation der mRNA der Kinin B1 und B2 Rezeptoren nach 24 Stunden ihr Maximum hatte (5-fach bzw. 17-fach). Die Immunhistochemie zeigte, dass die Kinin B1 und B2 Rezeptoren konstitutiv über das gesamte Mäusegehirn verteilt exprimiert wurden, bereits 2 Stunden nach Ischämie in Neuronen, die morphologische Zeichen ischämischer Schädigung zeigten, hochreguliert wurden und über 24 Stunden hochreguliert blieben. Bei der Untersuchung der funktionellen Bedeutung des Kinin B2 Rezeptors für die Entwicklung des sekundären Hirnschadens nach transienter fokaler zerebraler Ischämie zeigte sich, dass die B2 Rezeptor knockout Mäuse verglichen mit ihren wildtyp Kontrollen signifikant vor den Folgen der MCA-Okklusion geschützt waren. Sie hatten verglichen mit ihren Kontrollen eine bessere motorische Funktion (p

Yersinia (Y.) enterocolitica ist ein bedeutender Lebensmittelkeim, der vorwiegend in Schweinefleisch vorkommt. Kulturell ist er sehr schwer nachzuweisen, da er auf Selektivagar sehr schnell von anderen Keimen überwuchert wird. Zudem sind die kulturellen Isolierungsmethoden sehr zeitaufwendig und eine Aussage über pathogene oder apathogene Stämme kann aufgrund der Ergebnisse ohne weitere Diagnostik nicht getroffen werden. Aus diesen Gründen wird in der Diagnostik von Y. enterocolitica aus Lebensmitteln vermehrt der PCR-Nachweis eingesetzt, welcher innerhalb von Stunden, bei vorheriger Anreicherung nach einem Tag, ein zuverlässiges Ergebnis liefert. Abhängig von der Wahl des Zielgenes werden nur pathogene Keime detektiert. Die Sensitivität einer PCR ist in großem Maße von der Aufreinigung abhängig, deshalb sollte ein PCR-Protokoll immer einschließlich Probenvorbereitung etabliert werden. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Real-Time PCR-basiertes Nachweisverfahren, zusammen mit der Probenvorbereitung, für Y. enterocolitica in Lebensmitteln entwickelt. Nachgewiesen wurde das chromosomale ail-Gen, sowie das auf dem Plasmid lokalisierte virF-Gen. In Vorversuchen erfolgte die Optimierung von verschiedenen Bedingungen für eine PCR, wie die Mastermix-Konzentration, Primer-Konzentration und Annealing-Temperatur. Anschließend erfolgte die Untersuchung von gezielt kontaminierten Rinderhackfleischproben. Diese Proben wurden nach Anreicherung mit sechs verschiedenen Extraktionsverfahren aufgereinigt und anschließend mit drei PCR-Methoden, davon eine Real-Time PCR mit SYBR Green und eine TaqMan Real-Time PCR sowie eine konventionelle Multiplex-PCR mit Gelelektrophorese, auf Y. enterocolitica untersucht. Parallel dazu wurde der klassische kulturelle Nachweis mit Anreicherung in TSB und ITC und Ausstrich auf CIN-Agar durchgeführt. Abschließend erfolgte die Untersuchung von 150 Schweinefleischproben aus dem Handel. Diese wurden ebenfalls mittels der drei PCR-Methoden und kulturell untersucht. Die Aufreinigung der Proben erfolgte nach Anreicherung mit drei Extraktionsmethoden, welche in den Versuchen mit den beimpften Proben die besten Ergebnisse lieferten. Mit allen drei PCR-Methoden konnten ail-positive Y. enterocolitica ab einer Impfmenge von 10 KbE/10 g Hackfleisch und nachfolgende Anreicherung nachgewiesen werden. Der Nachweis des virF-Genes gelang nur mit der konventionellen PCR, bei der SYBR Green Real-Time PCR konnte das virF-Gen nur selten und nur bei sehr hohen Keimzahlen detektiert werden. Bei der SYBR Green Real-Time PCR (ail) lagen die Ct-Werte bei der niedrigsten Impfmenge von 10 KbE/10 g, je nach Aufreinigungsmethode, im Bereich von 28,5 bis 34,8, bei der höchsten Impfmenge von 105 KbE/10 g konnten Werte ab 19,6 Zyklen erzielt werden. Die besten Ergebnisse konnten mit der Aufreinigung der InstaGene™ Matrix (Biorad), dem Biorad Genomic Tissue Kit und dem Qiagen DNeasy Tissue Kit erzielt werden. Mit diesen Methoden erfolgt auch die Aufreinigung der Schweinefleischproben aus dam Handel. Insgesamt konnte in 43 Proben (29 %) ail-positive Y. enterocolitica detektiert werden. Die höchste Nachweisrate mit 42 positiven Proben (28 %) wurde mit der SYBR Green Real-Time PCR erzielt, wogegen mit der TaqMan Real-Time PCR in 23 Proben (15 %) und mit der konventionellen PCR nur in 20 Proben (13 %) pathogene Y. enterocolitica detektiert werden konnten. Am höchsten war die Nachweisrate nach Aufreinigung mit dem Biorad Genomic Tissue Kit, welcher schon in den Vorversuchen die beste DNA-Ausbeute lieferte. Kulturell konnte in keiner Probe Y. enterocolitica nachgewiesen werden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Real-Time PCR eine sensitive und schnelle Methode zum Nachweis von pathogenen Y. enterocolitica in Lebensmitteln darstellt. Die Probenaufbereitung mit dem Biorad Genomic Tissue Kit liefert eine hohe DNA-Ausbeute, ist aber zeitaufwendig, wogegen die InstaGene Matrix zwar weniger sensitiv, dafür aber wesentlich schneller ist. Die Real-Time PCR mit SYBR Green eignet sich vor allem als kostengunstiges Screening, positive Ergebnisse sollten noch mit der sequenzspezifischen TaqMan Real-Time PCR bestätigt werden. Mit allen drei PCR-Methoden konnten ail-positive Y. enterocolitica ab einer Impfmenge von 10 KbE/10 g Hackfleisch und nachfolgende Anreicherung nachgewiesen werden. Der Nachweis des virF-Genes gelang nur mit der konventionellen PCR, bei der SYBR Green Real-Time PCR konnte das virF-Gen nur selten und nur bei sehr hohen Keimzahlen detektiert werden. Bei der SYBR Green Real-Time PCR (ail) lagen die Ct-Werte bei der niedrigsten Impfmenge von 10 KbE/10 g, je nach Aufreinigungsmethode, im Bereich von 28,5 bis 34,8, bei der höchsten Impfmenge von 105 KbE/10 g konnten Werte ab 19,6 Zyklen erzielt werden. Die besten Ergebnisse konnten mit der Aufreinigung der InstaGene™ Matrix (Biorad), dem Biorad Genomic Tissue Kit und dem Qiagen DNeasy Tissue Kit erzielt werden. Mit diesen Methoden erfolgt auch die Aufreinigung der Schweinefleischproben aus dam Handel. Insgesamt konnte in 43 Proben (29 %) ail-positive Y. enterocolitica detektiert werden. Die höchste Nachweisrate mit 42 positiven Proben (28 %) wurde mit der SYBR Green Real-Time PCR erzielt, wogegen mit der TaqMan Real-Time PCR in 23 Proben (15 %) und mit der konventionellen PCR nur in 20 Proben (13 %) pathogene Y. enterocolitica detektiert werden konnten. Am höchsten war die Nachweisrate nach Aufreinigung mit dem Biorad Genomic Tissue Kit, welcher schon in den Vorversuchen die beste DNA-Ausbeute lieferte. Kulturell konnte in keiner Probe Y. enterocolitica nachgewiesen werden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Real-Time PCR eine sensitive und schnelle Methode zum Nachweis von pathogenen Y. enterocolitica in Lebensmitteln darstellt. Die Probenaufbereitung mit dem Biorad Genomic Tissue Kit liefert eine hohe DNA-Ausbeute, ist aber zeitaufwendig, wogegen die InstaGene Matrix zwar weniger sensitiv, dafür aber wesentlich schneller ist. Die Real-Time PCR mit SYBR Green eignet sich vor allem als kostengunstiges Screening, positive Ergebnisse sollten noch mit der sequenzspezifischen TaqMan Real-Time PCR bestätigt werden.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden Real-Time PCR-Verfahren auf Basis des TaqMan-Systems für die Detektion von Listeria spp. und von Listeria monocytogenes entwickelt und hinsichtlich der Anwendbarkeit für den Nachweis von Listerien in Milcherzeugnissen und Umfeldproben überprüft. Der genusspezifische Nachweis für Listeria spp. erfasst mit Listeria monocytogenes, Listeria innocua und Listeria seeligeri die wichtigsten und am häufigsten in Milchprodukten nachgewiesenen Listerienspezies. Wenn im gleichen Nachweissystem anstelle der fluoreszenzmarkierten TaqMan-Sonde der interkalierende Fluoreszenzfarbstoff SybrGreen verwendet wird, kann das gesamte Genus Listeria, mit Ausnahme von Listeria grayi ssp. grayi, nachgewiesen werden. Der speziesspezifische Nachweis für Listeria monocytogenes erfasst alle getesteten Stämme dieser Spezies (n = 34) und reagierte mit keiner anderen Spezies falsch positiv. Bei der Untersuchung von Reinkulturen waren für beide Nachweissysteme Keimzahlen von 104-105 KbE/ml für einen sicheren Nachweis erforderlich. Nach der erfolgreichen Etablierung der Nachweise für Reinkulturen wurden künstlich kontaminierte Milchprodukte untersucht. Es wurden sowohl unproblematische Matrizes wie pasteurisierte Vollmilch als auch Produkte mit einem hohen Gehalt an Begleitflora wie Weichkäse untersucht. Hierbei waren für einen zuverlässigen Nachweis niedriger Listerienzahlen von 1-10 KbE/g, aufgrund inhibitorischer Einflüsse einiger Probenmatrizes sowie der Begleitflora auf das Listerienwachstum, Anreicherungszeiten in Halb-Fraser von bis zu 48 h erforderlich. Eine negative Beeinflussung der PCR-Nachweise durch Probenbestandteile wurde nicht beobachtet, wenn die Proben mit dem PrepMan Ultra™ Reagenz aufbereitet wurden. Eine deutliche Verkürzung der Nachweiszeit in problematischen Probenmatrizes konnte durch Separation der Listerien aus der selektiven Anreicherungskultur mittels paramagnetischer Partikel, die mit listerienbindenden Proteinen aus Listeria-spezifischen Phagen beschichtet sind (CBD-MS; KRETZER, 2006), erreicht werden. Die separierten Listerien wurden nach einem kurzen nicht selektiven Anreicherungsschritt (3 h in Trypton-Soja- Bouillon mit Hefeextrakt) mit dem PrepMan Ultra Reagenz aufbereitet und in der PCR eingesetzt. Mit dieser Methode konnte die selektive Anreicherung auf 20 h und die Gesamtnachweiszeit auf 29 h reduziert werden.

Ziel dieser Arbeit war die Vereinfachung und Optimierung der bekannten hochsensitiven RT-Nachweisverfahren. Hochsensitive RT-Nachweisverfahren bestehen aus der Generierung von cDNA aus einem heteropolymeren Template mit anschließender Amplifikation der entstandenen cDNA mittels PCR. Bei den ersten in der Literatur beschriebenen Verfahren zum hochsensitiven RT-Aktivitätsnachweis mit PCR-Amplifikationsschritt (PERT, Pyra 1994; AmpRT, Heneine 1995) handelt es sich um qualitative Verfahren mit Gel-Elektrophorese und Ethidiumbromid Färbung der PCR-Produkte als Read-out. Von diesen beschriebenen Verfahren wurde die Auswahl des heteropolymeren RNA-Templates und der grundsätzliche Ablauf, sowie einige Überlegungen zur Optimierung übernommen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden neue, optimierte Primersequenzen für den RT-Schritt sowie für den PCR-Amplifikationsschritt entworfen. Diese Primersequenzen ermöglichen die Untersuchung der RT-Aktivität im Verlauf des RNA-Templates sowie die Untersuchung des Einflusses von RT-Inhibitoren. Es wurden die üblichen Optimierungsschritte wie MgCl2-Titration, Titration der Primerkonzentration und Variation der Annealing-Temperatur durchgeführt. Um eine Kontamination im Sinne eines Carry-over von PCR-Produkten zu verhindern, wurde ein UNG/dUTP System integriert und in seiner Wirksamkeit überprüft. Zwei verschiedene quantitative Read-out Verfahren wurden verglichen: Die Bestimmung der Menge an entstandenem PCR-Produkt am Ende des PCR-Schrittes stellte sich als arbeitsaufwändig heraus und ermöglichte nur einen geringem linearen Messbereich. Die Real-Time-Quantifizierung zeigte dagegen einen weiten linearen Messbereich und benötigt nach dem PCR-Schritt keine zusätzlichen Arbeitsschritte. Es konnte somit die Überlegenheit des Nachweises mittels Real-Time-PCR im Vergleich zur Endpunkt-Bestimmung gezeigt werden. Zur Real-Time Quantifizierung wurde für die Fluoreszenz-Detektion statt einer Exonuklease-Sonde (TM-PERT, TaqMan-Verfahren, z.B. von Maudru 1998 beschrieben) ein Molecular Beacon verwendet. Auch hier wurden die üblichen Optimierungsverfahren (Sonden-Titration, Einsaatmenge cDNA) durchgeführt. Mit dem entwickelten Verfahren können so geringste Mengen von RT-Aktivität, entsprechend ca. 40 Viruspartikeln mit hoher Kontaminationssicherheit und hoher Spezifität nachgewiesen werden. Es konnte das Ansprechen auf nukleosidische RT-Inhibitoren gesteigert werden, mit der Möglichkeit phänotypische Resistenztests auch gegen AZT durchzuführen. Zahlreiche viel versprechende Anwendungsgebiete des RT-Aktivitäts Nachweises mit dem hier etablierten Test sind jedoch derzeit für die Routineanwendung nicht zugänglich, solange die Probleme durch unspezifische Inhibitoren, wie sie beispielsweise im Blutplasma vorkommen, nicht gelöst sind. Um dieses Nachweisverfahren für die virologische Diagnostik einzuführen, wird ein stabiles und einfaches Aufreinigungsverfahren für RT aus Blutplasma von Patienten benötigt.

Studies on the epidemiology of Canine Babesiosis in Minas Gerais, Brazil. During two stays between April 2004 and February 2005, one in the dry season and the other during the rainy season, a total of 552 samples from 385 dogs (samples from 167 dogs were collected twice) from three different regions (Carrancas, Carlos Chagas and Igarapé) in Minas Gerais, Brazil were collected. While the first collection only included samples from dogs living in rural areas the second collection gathered repeat samples from the dogs from the first collection as well as samples from dogs from the particular urban areas. Blood was taken from each dog and blood smears were prepared. The blood smears were microscopically analysed and the DNA, extracted from the blood, was used for Real-Time PCR analysis of infections with Babesia canis vogeli or other piroplasms. A conventional PCR for the detection of Babesia sp. was carried out. In addition an indirect immunfluorescent-antibody-test, specific for Babesia canis vogeli, was performed with all samples. The analysis of samples from the first collection period resulted in a percentage of prevalence of 10,3 % in the Real-Time PCR and 30,0 % in the indirect immunfluorescent-antibody-test. The second collection period showed a prevalence of 8,2 % in the Real-Time PCR and 21,7 % in the indirect immunfluorescent-antibody-test. No significant difference has been found in the results from the Real-Time PCR and the origin (urban-/rural area) of the dogs in Minas Gerais, in general. However, on examining the three different regions separately, a significant difference in prevalence emerged in Carlos Chagas. In Minas Gerais there was a highly significant difference shown in the results of the indirect immunfluorescent-antibody-test. While Carrancas showed no significance at all, there was a significant difference shown in the results of Carlos Chagas and a highly significant difference shown in Igarapé. Due to the very low sensitivitiy of the microscopically analysation only two from the 552 samples were positive. With regards to the two different time periods (dry and rainy season) in which samples where collected, no significant differences in the results of the Real-Time PCR were recorded in Minas Gerais in general or in the various regions in particular. The results of the indirect immunfluorescent-antibody-test did not show any significance in Minas Gerais, generally, or the regions of Carrancas and Carlos Chagas in particular, whereas in Igarapé a significant difference was visible. Comparing the different age groups, a significant difference was detected in the Real-Time PCR results and a highly significant difference in the results from the indirect immunfluorescent-antibody-test. Concerning the difference in prevalence’s of infections and antibodies based on sex (male/female) the results of the PCR showed no significant difference whereas the difference in seroprevalence was significant. The results of the hematocrit and a comparison with the positivity in the different diagnostical methods revealed no significance for the indirect immunfluorescent-antibody-test and a high significance for the Real-Time PCR. A reason for the differences in prevalences across different age groups, as compared to the results from the Real-Time PCR, could be that puppies are more prone to infections. In the results of the indirect immunfluorescent-antibody-test a higher prevalence in the older age groups points to a certain resistance of those animals after recovering from infections with B. canis vogeli. A likely cause for the differences in prevalence in the results of the Real-Time PCR and the indirect immunfluorescent-antibody-test compared to the origin (rural or urban area) of the dog samples are differences in keeping the dogs as well as a lower occurrence of the vector ticks in the urban areas.

In der vorliegenden Arbeit wurden Real-time PCR-basierte Nachweisverfahren für E. canis und A. phagocytophilum entwickelt, validiert und im Anschluss für die Untersuchung von Patientenproben eingesetzt. Für E. canis wurden für zwei Tests Primer und Sonden des Typs „Molecular Beacon“ konstruiert, die auf unterschiedliche Zielgene gerichtet waren, die Reaktionsbedingungen optimiert und die Leistungsfähigkeit beider Tests verglichen. Die PCR EC-16S hatte hierbei die 16S rDNA als Zielgen, während die PCR ECP-p30 auf das p30-10-Gen von E. canis gerichtet war. Bei der Ermittlung der analytischen Sensitivität und analytischen Spezifität ergab sich, dass beide Tests in ihren Leistungen sehr ähnlich waren. Beide PCRs waren spezifisch und lieferten nur für DNA von E. canis ein positives Ergebnis, während die übrigen getesteten Erreger A. platys, N. risticii, A. phagocytophilum, Babesia canis, B. gibsoni und H. canis in der PCR negativ reagierten. Da die PCR ECP-p30 bei der Sensitivitätsprüfung geringfügig besser beurteilt wurde, wurde entschieden, die weiteren Untersuchungen mit diesem PCR-Protokoll durchzuführen. Zur Bestimmung der diagnostischen Sensitivität und Spezifität dieses Tests wurde eine extern kontrollierte Validierung mit geblindeten Proben durchgeführt. Hierbei ergab sich eine diagnostische Spezifität von 100 %. Die diagnostische Sensitivität der Real-time PCR betrug 82 %. Der prädiktive Wert des positiven Testergebnisses lag für die PCR ECP-p30 bei 100 %, während der prädiktive Wert des negativen Testergebnisses 87,5 % erreichte Als Nachweisgrenze wurden 14,5 Moleküle des Zielgens pro 50 µl Ansatz ermittelt. Im Anschluss wurde die Eignung des Tests an Blutproben von Hunden aus einem für E. canis endemischen Gebiet untersucht. Dabei wurden 244 Blutproben einbezogen und die Ergebnisse der PCR mit denen eines IFATs verglichen. Die Blutproben stammten aus Kampanien, Italien und wurden dort durch Tierärzte von Hunden gewonnen, die in einer Tierarztpraxis mit angeschlossenem Tierheim vorgestellt wurden. Die Tiere waren drei Gruppen zuzuordnen: Ein Teil der Hunde, und zwar 19 Tiere, wurde von privaten Besitzern in der Praxis vorgestellt, 52 Tiere waren unmittelbar zuvor von der Strasse aufgelesen worden und die dritte Gruppe, die 173 Hunde umfasste, hielt sich zum Zeitpunkt der Probennahme schon längere Zeit im Tierheim auf. Innerhalb des Tierheims wird ein hoher diagnostischer und medikamenteller Aufwand zur Erkennung und Bekämpfung von E. canis mittels antibiotischer Therapie und Zecken¬prophylaxe betrieben. In die Untersuchung einbezogen wurden jedoch nur Hunde, die mindestens drei Monate lang nicht mehr mit einem gegen E. canis wirksamen Medikament behandelt worden waren. Bei der serologischen Untersuchung der Hunde mittels IFAT ergab sich ein Anteil seropositiver Tiere von insgesamt 41,8 %, der auch bei Betrachtung der drei verschiedenen Gruppen nur wenig variierte. So betrug der Anteil seropositiver Tiere innerhalb der Gruppe der Hunde aus dem Tierheim 43,4 %, während 40,4 % der Straßenhunde und 31,6 % der Tiere in privatem Besitz seropositiv waren. Diese Unterschiede waren nicht signifikant. Ein direkter Erregernachweis mittels Real-time PCR erfolgte bei 13,9 % der untersuchten Tiere. Beim Vergleich der Untersuchungsergebnisse von PCR und IFAT wurde eine Überein¬stimmung bei 61,9 % der untersuchten Proben ermittelt. Bei Betrachtung der einzelnen Hundegruppen lag der Anteil der in der PCR positiven Tiere bei den Straßenhunden mit 23,1 % ungefähr doppelt so hoch wie bei den Tieren in Privatbesitz (10,5 %) oder den Tierheim¬hunden im Tierheim (11,6 %). Der Unterschied zwischen den Straßenhunden und den Tierheimhunden war somit signifikant. Diese Ergebnisse weisen auf ein häufiges Vorkommen von E. canis im Untersuchungsgebiet hin und stützen die Auffassung, dass eine Erreger¬elimination mittels Antibiotikatherapie nur schwer zu erreichen ist. Für A. phagocytophilum wurde in der vorliegenden Studie ebenfalls eine Real-time PCR entwickelt und das Testverfahren unter Einbeziehung zweier bereits publizierter Real-time PCR-Protokolle und zwar von Pusterla et al. (1999a) und von Courtney et al. (2004), validiert. Bei der Entwicklung der Real-time PCR für A. phagocytophilum wurde als Zielgen die 16S rDNA herangezogen, da nur hierfür vergleichbare Sequenzen nahe verwandter Ehrlichienspezies verfügbar waren. Alle drei vorliegenden Testverfahren wurden auf ihre analytische Spezifität und ihre analytische Sensitivität überprüft und zusätzlich im Rahmen einer extern kontrollierten Validierung mittels geblindeter Proben verglichen. Hierbei zeigte sich, dass nur die PCR nach Courtney et al (2004), hier als PCR AP-MSP2 bezeichnet, eine sehr gute Spezifität für A. phagocytophilum besaß. Die anderen Tests lieferten auch für N. risticii und A. platys positive Ergebnisse. Die analytische Sensitivität war bei diesem Test ebenfalls um mindestens eine Zehnerpotenz höher als bei den anderen beiden PCRs. Im Rahmen der Validierung wurde für die PCR AP-MSP2 eine diagnostische Spezifität von 96 % ermittelt, während die im Rahmen dieser Studie entwickelte PCR AP-16S eine Spezifität von 64 % und die PCR nach Pusterla et al. (1999a) einen Wert von 36 % erreichten. Der prädiktive Wert des positiven Testergebnisses betrug für die drei PCRs somit 96 %, 74 % bzw. 61 %. Für die Untersuchung von Patientenproben auf Befall mit A. phagocytophilum wurde deshalb die PCR AP-MSP2 ausgewählt. In die Studie wurden Hunde aus Deutschland einbezogen, und zwar sowohl 72 Blutproben, die eigens für diese Studie auf Anforderung von Tierärzten eingesandt worden waren, als auch 133 Proben, die aus verschiedensten Gründen in das Routinelabor des Institutes eingesandt worden waren. Die 72 eigens für die Studie gewonnenen Proben wurden mittels Buffy-coat-Ausstrich, PCR und IFAT auf A. phagocytophilum untersucht. Lichtmikroskopisch konnten in keinem Fall Einschluss¬körperchen des Erregers in den Granulozyten nachgewiesen werden. Mittels PCR wurde jedoch bei einem Hund (1,4 %) der Nachweis von A. phagocytophilum erbracht. Im IFAT konnten bei 16,7 % der 72 untersuchten Hundeseren spezifische Antikörper gegen den Erreger nachgewiesen werden. Eine Übereinstimmung der Ergebnisse von PCR und Buffy-coat-Ausstrichen lag bei 98,6 % der Proben vor. Beim Vergleich der Ergebnisse der Buffy-coat-Ausstriche mit den Ergebnissen des IFAT wurde eine prozentuale Übereinstimmung von 65,3 % errechnet. Identische Ergebnisse bei PCR und IFAT wurden bei 66,7 % der untersuchten Hunde erzielt. Die 133 Proben, die zufällig aus allen Einsendungen in das Routinelabor des Instituts für vergleichende Tropenmedizin und Parasitologie ausgewählt worden waren, wurden mittels PCR und IFAT untersucht, wobei zwei Tiere (1,5 %) in der PCR und 34,6 % im IFAT ein positives Ergebnis lieferten. Die Identität des PCR-Produktes eines der positiven Tiere wurde durch Klonierung und anschließende Sequenzierung bestätigt. Eine Übereinstimmung der Testergebnisse von IFAT und PCR bestand bei 52,6 % der untersuchten Proben. Diese Ergebnisse stützen die Auffassung, dass Hunde in Deutschland häufig mit A. phagocytophilum in Kontakt kommen, dass es sich dabei aber meist um eine selbstlimitierende, klinisch inapparente Infektion handelt.

In der Pathogenese atopischer Erkrankungen spielt IL-4 eine wichtige Rolle, da es den Switch zu IgE bewirkt. Außerdem führt IL-4 zur Ausreifung von naiven T-Zellen in TH2-Effektor-Zellen, welche die IL-4-Produktion ihrerseits aufrecht erhalten. Es konnte vermutet werden, dass diese Ausreifung durch sog. NKT-Zellen – die durch die gleichzeitige Expression eines T-Zell-Rezeptors mit einem NK-Zell-Marker sowie eine sehr hohe IL-4-Produktion charakterisiert sind - geschieht. Diese Zellen lassen sich durch die hochselektive Verwendung einer monoklonalen TZR-a-Kette (AV24) nachweisen. Fragestellung der vorliegenden Arbeit war, ob Atopiker gegenüber Nicht-Atopikern vermehrt NKT-Zellen aufweisen. Die Untersuchungen wurden in peripherem Blut freiwilliger, erwachsener Probanden durchgeführt. Atopiker wurden durch das gleichzeitige Vorhandensein klinischer Symptome, erhöhten Gesamt-IgEs und erhöhten spezifischen IgEs definiert. Bei den gesunden Probanden lagen weder klinische Symptome vor, noch waren Gesamt-IgE oder spezifisches IgE erhöht. Auf der zellulären Ebene wurden die Blutproben mittels Durchflusszytometrie analysiert. Innerhalb der CD4+, CD8bright, CD8dim sowie DN Lymphozyten wurde die Frequenz der Va24+CD161+ NKT- Zellen bestimmt. Auf der molekularen Ebene wurde der Anteil der AV24-AJ18-Transkripte an allen TZR-a-Ketten untersucht. Zur Überprüfung der Spezifität wurden 40 AV24-AJ18- Klone zusätzlich sequenziert. Um eventuelle Unterschiede innerhalb der CDR3- Region zwischen den beiden Probanden-Gruppen zu entdecken, wurde diese auf der Einzelnukleotidebene analysiert und hierfür eine neue Real-Time-PCR basierte Methode etabliert. Neben konventionellen Primer wurden zwei fluoreszenzmarkierte Sonden (FITC, LC-Red) verwendet, wobei es bei enger räumlicher Nähe zu einer Energieübertragung auf die fluoreszierende LC-Red Sonde kommt. Die Sondenlage wurde so gewählt, dass die detektierende Sonde die N-Region überragt und es inserierten N-Nukleotiden zu einer erniedrigten Schmelztemperatur kommt. Die genaue Sequenz eingefügter N-Nukleotide wurde durch Sequenzierung der Proben mit erniedrigter Schmelztemperatur überprüft. Inssgesamt wurden 29 erwachsene Probanden untersucht, 13 Atopiker und 16 gesunde Kontrollpersonen. Der Prozentsatz aller Va24+ Zellen betrug im Median 0,35% (Spannweite: 0,03-1,45%) ohne signifikanten Unterschied zwischen den beiden Gruppen. Zwischen der Anzahl aller Va24+ Zellen und CD8dim Va24+CD161+ Zellen bestand ein statistischer Zusammenhang (r=0,648; p

625 adult unfed I. ricinus ticks from three recreational areas located near Munich and Passau, 275 adult engorged I. ricinus ticks from dogs of Bavaria and Baden-Württemberg and 25 adult engorged I. ricinus ticks from cattle of an area in Switzerland, which is endemic for bovine granulocytic ehrlichiosis, were collected over a specific period (3/2003-3/2004). The ticks were examined for an infection with B. burgdorferi sensu lato spp., A. phagocytophilum and piroplasms by the use of Real-Time PCR and nested PCR. In addition RFLP analysis and sequencing were chosen for the differentiation of the species and OspA types of B. burgdorferi sensu lato. The examination of unfed ticks resulted in a prevalence of 35,4% for B. burgdorferi sensu lato, 4,5% for A. phagocytophilum and 1,3% for piroplasms. There was no significant difference for the infection rates of B. burgdorferi sensu lato between the different sampling areas, whereas A. phagocytophilum showed a significantly higher prevalence in one sampling side in Munich and a significantly lower prevalence in Passau. Apart from infections with only one pathogen, coinfections with B. burgdorferi sensu lato and A. phagocytophilum could be detected in 1,1% of the unfed ticks, with a local cluster in one area in Munich and 0,3% of the unfed ticks showed a coinfection with B. burgdorferi sensu lato and piroplasms. Prevalence rates of 8,4%, 4,7% and 5,1% were identified for B. burgdorferi sensu lato, A. phagocytophilum and piroplasms respectively in engorged ticks from dogs, 0,7% of these ticks were coinfected with B. burgdorferi sensu lato and A. phagocytophilum. The examination of engorged ticks from cattle revealed in a prevalence rate of 8,0% for B. burgdorferi sensu lato and 60,0% for A. phagocytophilum. The high infection rate of A. phagocytophilum probably resulted from an infection of the cattle with this pathogen. The difference in the prevalence rate of B. burgdorferi sensu lato in unfed and engorged ticks might be caused by their distinct geographical origin, the degree of blood uptake and different factors in the blood of the different host species which are able to protect the host from being infected with Borrelia. The differentiation of B. burgdorferi sensu lato into the species and OspA types showed that the clinically relevant species B. afzelii, B. burgdorferi sensu stricto and B. garinii, in which B. garinii was represented by the OspA types 3, 4, 5, 6 and 8 could be detected. Additionally, B. valaisiana, a species which is suspected of being pathogenic to humans and the recently described new Borrelia genospecies, B. spielmanii (previously A14S), were detected. Alltogether a broad heterogeneity for Borrelia species and subspecies (classified by OspA types) could be observed in unfed ticks, above all in one sampling side in Munich. Ticks engorgd from dogs and cattle showed a less heterogeneous pattern of distribution.

In der vorliegenden Arbeit wurden die immunogenen Eigenschaften des Nichtstruktur-proteins 3 (NS3) des Virus der Bovinen Virusdiarrhö (BVDV) erstmals im natürlichen Wirt charakterisiert. Hierzu wurden sechs Kälber dreimal im Abstand von vier Wochen mit BVDV-NS3-rekombinantem modifiziertem Vacciniavirus Ankara (MVA) intramuskulär immunisiert (>108 infektiöse Einheiten). Vier Kälber, die mit LacZ-rekombinantem MVA (>108 infektiöse Einheiten) immunisiert wurden, bildeten die Kontrollgruppe. Fünf Wochen nach der letzten Immunisierung erfolgte eine Belastungsinfektion mit dem BVD-Virusisolat PT810 (106 kulturinfektiöse Dosen50). Für die Untersuchung der BVDV-spezifischen zellulären Immunitätsmechanismen wurden die Lymphozyten aller Tiere mit infektiösem BVDV-PT810 in vitro restimuliert und mit Hilfe verschiedener Testsysteme untersucht. Eine zytofluorometrische Nachweismethode (Fluoreszenzfarbstoff: Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester [CFSE]) diente der Detektion einer antigenspezifischen Lymphozytenproliferation. Die Aktivität BVDV-spezifischer zytotoxischer T-Lymphozyten (CTL) gegen autologe, BVDV-infizierte Zielzellen wurde mit Durchflusszytometrie gemessen. Mit Hilfe einer Real Time PCR wurde die Interleukin-2 (IL-2) und 4 (IL-4) mRNA-Synthese untersucht. Ein kommerziell erhältlicher ELISA (Bovigam) diente dem Nachweis der γ-Interferon-Synthese. Über einen Zeitraum von 19 Tagen nach der intranasalen BVDV-Testinfektion wurden die Kälber täglich klinisch untersucht, die Gesamtleukozytenzahl im peripheren Blut bestimmt, quantitative BVDV-Isolierungen aus den Leukozyten durchgeführt und BVDV-spezifische Antikörper mit Serumneutralisationstesten gemessen. Bereits vor der Belastungsinfektion ließ sich bei allen Kälbern, die mit BVDV-NS3-rekombinatem MVA immunisiert wurden, eine antigenspezifische Lymphozytentransformation nachweisen. Ebenso konnte bei vier Tieren der Versuchsgruppe (N = 6) nach der dritten Immunisierung eine deutliche BVDV-spezifische Zytotoxizität gegenüber autologen Hodenzellen detektiert werden. Nach der BVDV-Belastungsinfektion war die spezifische Zytotoxizität bei fünf der sechs BVDV-NS3-MVA-Impftiere höher als bei den Tieren der LacZ-Kontrolle. Im Gegensatz zur Kontrollgruppe ließ sich bei der Versuchsgruppe nach der dritten Immunisierung ein deutlicher Anstieg der IL-2 und IL-4 mRNA-Syntheserate von in vitro mit BVDV-restimulierten Lymphozyten nachweisen. Bei fünf der sechs Kälber war zu diesem Zeitpunkt auch γ-Interferon detektierbar. Der Nachweis von BVDV-neutralisierenden Antikörpern war vor der Testinfektion bei keinem Kalb möglich. Nach der Testinfektion konnte ein spezifischer Priming-Effekt für alle immunologischen Parameter, einschließlich der Bildung BVDV-neutralisierender Antikörper, festgestellt werden. Erwartungsgemäß wurden bei beiden Tiergruppen keine Krankheitssymptome beobachtet. Das Ausmaß der Leukopenie infolge der Testinfektion war gleich. Dagegen war der semiquantitativ bestimmte BVDV-Titer in Blutproben der Kontrollgruppe an den Tagen 3-13 nach der Infektion etwa doppelt so hoch (1,9-fach) wie bei der Versuchsgruppe (p = 0,016; signifikant). Im Mittel war bei der Versuchgruppe an 6,7 Tagen und bei der Kontrollgruppe an 8,0 Tagen BVDV reisolierbar (p = 0,121; nicht signifikant). Neben den beachtlichen immunologischen Stimulationseffekten wurde die Reduktion der Viruslast als Hinweis für eine protektive Wirkung des BVDV-NS3 gewertet.

In dieser Arbeit wurde die biologische Funktion der PTP-Meg2 in der zellulären Signaltransduktion untersucht. Analysen mittels c-DNA-Filter, „Real Time PCR” und Immunblot zeigen eine ubiquitäre Expression der PTP-Meg2 auf ähnlichem, jedoch geringem Niveau in fast allen untersuchten Krebszelllinien unterschiedlicher Gewebeherkunft, wobei die Expressions-stärke nicht in direktem Zusammenhang mit krebsrelevanten Eigenschaften wie Invasivität und Metastasierung steht. Die induzierte Differenzierung von MCF 7-Zellen durch Natriumbutyrat steigert die Meg2-Expression um das 5-fache, wogegen die Differenzierung von SW948- und SK-N- SH-Zellen mit TPA bzw. Retinolsäure die Meg2-Expression reprimiert. Zellfraktionierung und Immunfluoreszenz zeigen eine primär zytosolische, aber partiell auch vesikuläre bzw. strukturierte Lokalisation der PTP-Meg2, für welche die CRALBP-Domäne der PTP-Meg2 mitverantwortlich ist. Untersuchungen der endogenen Meg2-Aktivität nach Immunpräzipitation und in vitro Phosphatasetests zeigen eine erhöhte Phosphataseaktivität nach Stimulation von Zellen mit FCS, EGF und LPA, wogegen TPA stark inhibierenden wirkt. Aktivitätsstudien mit GST-Meg2-Fusionsproteinen zeigen, dass die CRALBP-Domäne die Meg2-Phosphataseaktivität negativ reguliert. Im Protein-Lipid-Overlay interagiert PTP-Meg2 mit PI(3)P, PI(4)P, PI(5)P und Phosphatidylserin. Eine Interaktion mit PI(4)P führt zu einer erhöhten Meg2 Aktivität. Pervanadat-Stimulation von Zellen führt zu einer Tyrosinphosphorylierung sowie einer Mobilitätsänderung der PTP-Meg2, was auch mit einer katalytisch inaktiven Meg2-Mutante beobachtet wurde. PTP-Meg2 interagiert in vitro und in Koexpressionsstudien mit dem EGF-Rezeptor in Abhängigkeit von dessen Aktivierung. Eine physiologische Relevanz konnte nicht gezeigt werden. Die Depletion der PTP-Meg2 durch spezifische siRNA führt zu einer erhöhten Tyrosinphosphorylierung einiger, noch zu identifizierender Proteine. PTP-Meg2 vermindert, die inaktive PTP-Meg2CS-Mutante erhöht die durch v-ErbB und EGF-Rezeptor, nicht aber die durch HER2 und v-Ki-Ras induzierte Transformation von NIH3T3-Zellen im Focusbildungstest. Zudem bewirkt PTP-Meg2CS, mit Ausnahme der v-Ki-Ras infizierten Zellen, eine leicht erhöhte ERK1/2-Aktivität. Ferner stimuliert PTP-Meg2 die Migration von NIH3T3-Zellen im Wundheilungsexperiment. Ein Einfluss auf die basale und durch Stimuli induzierte Proliferation von Zellen in Wachstumstests wurde nicht beobachtet. Ein durch siRNA-vermittelter Meg2- „knockdown“ führte zur Induktion bzw. Repression der Expression von Genen, wie z.B. einiger Liganden, Caveolin-2, Nck und Rock, was auf eine Beteiligung der PTP-Meg2 an der Regulation von Signalwegen kleiner GTPasen bzw. von endo- sowie exocytotischen Prozessen schließen lässt.