Podcasts about immunfluoreszenz

Die acidophilen und thermoresistenten Sporenbildner des Genus Alicyclobacillus spielen aufgrund der Bildung von Fehlaromen eine wichtige Rolle als Verderbserreger von Fruchtsäften, wobei dem Guajacol-produzierenden A. acidoterrestris eine besondere Bedeutung zukommt. Um den einfachen, schnellen und zuverlässigen Nachweis von A. acidoterrestris Sporen in verschiedenen Fruchtsäften zu ermöglichen, sollten erstmals spezifische poly- und monoklonale Antikörper (pAK und mAK) entwickelt und darauf basierend hochsensitive und selektive immunchemische Nachweisverfahren etabliert werden. Um eine umfassende und verlässliche Charakterisierung der entwickelten Antikörper zu gewährleisten, wurde eine Alicyclobacillus spp. Stammbibliothek (n = 61) aufgebaut. Die Identifizierung der Isolate erfolgte nach mikrobiologischen Kriterien sowie mittels Real-Time PCR, RAPD-Analysen dienten zur weiteren Differenzierung. Ein Pool aus vier verschiedenen, mittels Paraformaldehyd inaktivierten A. acidoterrestris Stämmen wurde zur Immunisierung von Kaninchen und Mäusen verwendet. Die spezifische Bindung der induzierten pAK an die Sporen konnte mittels Immunfluoreszenz bestätigt werden. Basierend auf den generierten polyklonalen Kaninchenseren wurde ein sensitiver Sandwich Enzymimmuntest (EIA) aufgebaut, die Nachweisgrenzen lagen bei durchschnittlich 5,0 x 10^3 Sporen/ml für die DSM-Referenzstämme, sowie 2,1 x 10^3 – 3,8 x 10^4 Sporen/ml für die untersuchten 38 A. acidoterrestris Isolate. Unter Verwendung der Stammbibliothek und weiterer aerober sowie anaerober Sporenbildner konnte die hohe Inklusivität sowie Exklusivität des Verfahrens bestätigt werden: Alle A. acidoterrestris Stämme wurden als positiv erkannt, während die meisten anderen Alicyclobacillus spp. Stämme, sowie die Vertreter von Nicht-Alicyclobazillen keine Reaktivität zeigten. Anwendungsstudien zeigten die Einsetzbarkeit des pAK-basierten EIA für den direkten Nachweis von Sporen in verschiedenen Fruchtsäften. Nach 48 stündiger Anreicherung der in BAT-Bouillon verdünnten und mit 1 Spore/ml künstlich kontaminierten Proben bei 45 °C konnte in allen untersuchten Fruchtsaftsorten reproduzierbar und zuverlässig A. acidoterrestris nachgewiesen werden. Auch die 16 generierten mAK reagierten entweder in indirekten oder Sandwich EIAs z. T. hochaffin mit Sporen von A. acidoterrestris, mit Nachweisgrenzen von 5,0 x 10^2 – 4,0 x 10^5 Sporen/ml. Ein etablierter mAK-basierter Sandwich EIA wies eine hohe Inklusivität und Exklusivität auf. Mittels Immunoblot konnte für 12 mAK eine ausgeprägte Reaktivität mit Sporenproteinen gezeigt werden, die reaktiven Banden lagen bei ca. 14, 50 bzw. 66 kDa.

Cronobacter spp. sind opportunistische pathogene Erreger, die insbesondere nach der Aufnahme kontaminierter Lebensmittel schwere Infektionen mit hohen Letalitätsraten bei Neugeborenen und immungeschwächten Erwachsenen hervorrufen können. Um spezifische immunchemische Nachweisverfahren für diese Keimgruppe zu etablieren, wurden in der vorliegenden Arbeit monoklonale Antikörper (mAK) zum Nachweis von Cronobacter spp. generiert und umfassend charakterisiert. Zur Präparation der Immunogene wurden Cronobacter-Keime mit Polymyxin B behandelt und anschließend wurden Mäuse entweder mit dem durch Zentrifugation erhaltenem Zellpellet (Ghosts) oder mit dem zellfreien Überstand (Lysat) dieser Präparationen immunisiert. Beide Präparationen erwiesen sich als hoch immunogen, die nachweisbaren Titer lagen üblicherweise bei > 1:10.000. Insgesamt konnten 14 stabile Hybridomzelllinien (sieben je Ansatz) etabliert werden. Die Intra- bzw. Inter-Genus-Spezifität und Affinität der entsprechenden mAK wurde umfassend unter Verwendung von indirekten EIA-Verfahren überprüft. Für Studien zur Epitopspezifität der generierten mAK wurden Immunoblots und Immunfluoreszenz-Analysen eingesetzt. Alle mAK, die aus der Immunisierung mit Cronobacter-Ghosts resultierten, zeichneten sich durch ein sehr breites Reaktionsspektrum aus, Kreuzreaktionen wurden vorzugsweise mit Vertretern aus der Familie der Enterobacteriaceae aber auch mit anderen gramnegativen Keimen beobachtet. Für alle mAK konnten Proteine als antigene Determinanten identifiziert werden, die relativen Molekulargewichte reaktiver Proteinbanden lagen üblicherweise im Bereich von > 40 kDa. Demgegenüber zeigten sechs der sieben mAK, die aus der Immunisierung von Mäusen mit Polymyxin B generierten Lysat-Präparationen resultierten, eine hohe Affinität für die O-spezifische Seitenkette der Cronobacter-typischen Lipopolysaccharide (LPS): mAK 2G4 αL reagierte hochspezifisch mit dem C. turicensis-Stamm (MHI 21026; Serotyp O1). Im indirekten EIA war dieser Erreger bei Keimzahlen von ca. 104 KbE/ml noch nachweisbar. Für die weiteren fünf mAK, die alle spezifisch mit C. sakazakii des Serotyps O1 reagierten, wurden im indirekten EIA Nachweisgrenzen im Bereich von 105-107 KbE/ml ermittelt. Alle mAK gegen LPS gehören zum IgG-Subtyp und reagierten in der Immunfluoreszenz mit lebenden Cronobacter-Keimen.

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Entwicklung und Charakterisierung monoklonaler Antikörper (mAk) gegen die C-Komponente des Non-haemolytic Enterotoxin (Nhe)-Komplexes von Bacillus cereus sowie deren Einsatz zur Analyse der Rolle des NheC im Hinblick auf die Wirkungsweise von Nhe. NheC wurde in Escherichia coli rekombinant exprimiert und mittels Immunaffinitätschromatographie aufgereinigt. Nach Überprüfung durch SDS-PAGE und Quantifizierung mittels SYPRO® Ruby Protein Gel Färbung wurde das gereinigte Toxin als Immunogen eingesetzt. Nachfolgend konnten drei mAk vom IgG-Subtyp (mAk 2G8, 1E12, 2F10) und ein mAk vom IgM-Subtyp (mAk 3D6) gegen NheC hergestellt werden. Die Charakterisierung der mAk erfolgte mittels Enzymimmuntest (EIA), Western Immunblot und Immunfluoreszenzmikroskopie. Bei Verwendung eines indirekten EIAs erlaubten die mAk den sensitiven Nachweis von rNheC im unteren Nanogrammbereich (Nachweisgrenze 10 – 15 ng/ml). Untersuchungen zur Spezifität der mAk innerhalb des Nhe-Komplexes mittels indirekten EIAs und Western Immunblots zeigten, dass die mAk 2G8 und 1E12 substantielle Kreuzreaktionen mit der strukturverwandten NheB-Komponente aufweisen. Dies konnte durch Epitopanalysen und kompetitive Bindungstests noch bestätigt werden. Während die mAk 2G8, 1E12 und 3D6 mit allen überprüften B. cereus-Stämmen reagierten, weist das von dem mAk 2F10 erkannte Epitop eine stammspezifische Variabilität auf. In Zellkulturtests war keiner der vier mAk in der Lage die zytotoxische Aktivität des Nhe-Komplexes zu neutralisieren. Demgegenüber gelang es mit allen mAk mittels Immunfluoreszenz erstmals die direkte Bindung von NheC an die Zielzelle darzustellen. Unter Verwendung eines polyklonalen Kaninchen-Antiserums gegen NheC als Fangantikörper und der vier mAk gegen NheC als Nachweisantikörper wurden hochempfindliche Sandwich-EIAs für den Nachweis von gereinigtem NheC entwickelt. In natürlichen B. cereus-Überständen konnten jedoch nur geringe Mengen (< 10 %) des theroretisch vorhandenen NheC nachgewiesen werden. Die auf diesen Ergebnissen basierende Hypothese, dass NheC in Lösung an NheB gebunden vorliegt, konnte zunächst in artifiziellen Systemen bestätigt werden. Mangels SDS-Stabilität der NheB-NheC-Komplexe, erfolgte der Nachweis mittels intermolekularem Cross-Linking und Dot Blot-Analysen. Durch Kombination des NheC-spezifischen mAk 3D6 als Fangantikörper und des HRP-gekoppelten mAk 1E11 gegen NheB als Nachweisantikörper konnte ein spezifischer NheC/B-Sandwich-EIA zum Nachweis von NheB-NheC-Komplexen in B. cereus-Kulturüberständen etabliert werden. Zur Analyse der Funktion der NheB-NheC-Komplexe wurde zum einen die Komplexbildung mit der Zytotoxizität verglichen, und zum anderen per Durchflusszytometrie deren Zellbindung mittels NheB-Quantifizierung (durch mAk 1E11) bestimmt. Fazit ist, dass scheinbar sowohl eine definierte Menge an NheB-NheC-Komplexen, als auch ausreichend freies NheB vorhanden sein müssen, damit effiziente Zellbindung und Zytotoxizität von Nhe gewährleistet sind.

Produktion von poly- und monoklonalen Antikörpern gegen Staphylococcus aureus, Bacillus cereus und Sporen von Bacillus cereus in Mäusen und Kaninchen, Charakterisierung der Antikörper mittels Enzym-Immunoassays, Immunfluoreszenz, Immunoblots etc., Einsatz der Antikörper in einem bioaffinitätschromatographischen Schnellnachweis mittels monolithischem Säulenmaterial.

Systemic autoimmune diseases are characterized by the presence of antinuclear autoantibodies (ANAs). Diluted patient sera are typically used to screen for the presence of ANAs by immunofluorescence microscopy with fixed HEp-2 cells. Despite high quality test kits, reports of different laboratories frequently present controversial results. This study presents a recommendation for a unified processing and interpretation of HEp-2 based screening for autoantibodies. We provide suggestions for selection of high quality test kits, optimized processing, and diagnostic procedures. For good laboratory practice, in addition to a relevant clinical diagnosis and an experienced laboratory specialist, the following procedure is highly recommended: initial HEp-2 based screening by indirect immunofluorescence, starting with a 1:80 serum dilution and evaluation in a bright fluorescence microscope, pathological values from a titer of 1:160, internal quality checks, and unified interpretation. We aim to improve diagnostics and care for patients with autoimmune diseases as a central focus of the European Autoimmunity Standardization Initiative (EASI).

Das Gefäßendothel hat eine wichtige Funktion in der lokalen Regulation des Gefäßtonus. Veränderungen im Blutfluss („shear stress“) und/oder die Bindung von vasoaktiven Substanzen (Histamin, ATP) führen über einen endothelialen Calciumanstieg zur Bildung von Stickstoffmonoxid (NO), das in der benachbarten glatten Gefäßmuskulatur zur Relaxation der Zellen und damit zur Dilatation des Gefäßes führt. Für eine wirkungsvolle Endothelfunktion ist dabei ein synchrones Verhalten aller Endothelzellen - als Folge eines synchronen zytosolischen Calciumanstiegs – eine wichtige Voraussetzung. Für die vorliegende Arbeit wurde postuliert, dass eine synchrone Calciumantwort nach Stimulation der Endothelzellen mit Histamin oder ATP entscheidend von der Gap Junction Kopplung zwischen den Zellen abhängt. Dieser Kopplung käme somit eine neue modulierende Rolle für die Reaktion des Endothels auf vasodilatierende Substanzen zu. Kultivierte humane Nabelschnurvenenendothelzellen (HUVEC) wurden mit Histamin oder ATP vor, während und nach pharmakologischer Gap Junction Blockade stimuliert und der zeitliche Verlauf des Calciumanstiegs in allen individuellen Zellen eines Sichtfeldes wurde mit Hilfe eines Mikroskop-basierten Kamerasystems analysiert. Als Maß für die calciumabhängige NO-Bildung wurde der Histamin-induzierte cGMP Anstieg in Endothelzellen unter Kontrollbedingungen und nach Gap Junction Inhibition untersucht. Die Verteilung von Histamin- und ATP-Rezeptoren innerhalb der HUVECPopulation wurde mit Durchflusszytometrie bzw. Immunfluoreszenz analysiert. Zusätzlich wurde nach mechanischer Stimulation von Einzelzellen untersucht, ob der von Gap Junctions abhängige zytosolische Calciumanstieg in Nachbarzellen („Calciumwelle“) auf der Ausbreitung von Ca2+ und/oder der Ausbreitung des calciumfreisetzenden Signalstoffs IP3 beruht. Ausgehend von initial reagierenden Zellen erfolgte der Calciumanstieg nach Zugabe von Histamin und ATP zeitlich verzögert in deren Nachbarzellen. Während einer Blockade der gap-junctionalen Kommunikation konnte nur in etwa 40 % der Zellen eine Calciumreaktion beobachtet werden. Diese Beobachtungen an HUVEC wurden zudem in ersten Versuchen am isolierten Gefäß nach Stimulation mit ATP bestätigt. Die Histaminrezeptoren waren in HUVEC-Kulturen inhomogen verteilt und nur in einem Teil der Zellen nachweisbar. Außerdem war nach einer Gap Junction Blockade die cGMP-Konzentration (als Maß für die NO-Bildung) in HUVEC-Zelllysat nach Stimulation mit Histamin deutlich verringert. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass IP3 eine wichtige Rolle für die Ausbreitung der Calciumwelle über Gap Junctions spielt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die interzelluläre Kommunikation über Gap Junctions für eine synchrone Antwort des Endothels auf die vasoaktiven Substanzen Histamin und ATP wesentlich ist. Eine Inhibition der interzellulären Kommunikation führt zu einem verminderten Calciumanstieg und verminderter NO-Produktion in der Endothelschicht. Gap Junctions modulieren somit die Sensitivität des Endothels auf vasoaktive Substanzen. Eine gezielte Beeinflussung der Gap Junction-Permeabilität des Endothels könnte somit ein vielversprechender Ansatzpunkt für die Therapie von pathophysiologischen Gefäßveränderungen wie Atherosklerose oder Diabetes darstellen, die mit vasomotorischen Endothelfunktionsstörungen einhergehen.

Zielsetzung und Fragestellung: Humane mesenchymale Stammzellen (hMSC) exprimieren eine Vielzahl verschiede-ner Antigene. Dennoch ist es nicht möglich eine eindeutige Phänotypisierung dieses Zelltyps vorzunehmen, da keiner der bekannten Zellmarker spezifisch ist. Daher war es Ziel dieser Studie, durch die Etablierung einer 7-Farben Fluoreszenz hMSC auf Einzelzellebene durch ein geeignetes Markerprofil zu charakterisieren und sie ge-genüber Osteoblasten und Fibroblasten abgrenzen zu können. Material und Methoden: Kommerziell erhältliche HMSC, humane Osteoblasten und Fibroblasten wurden als adhärente Zellen auf Einzelzellniveau einer simultanen Mehrfach-Immunfluoreszenzfärbung gegen die Antigene CD105, CD106, CD44, Kollagen IV, Fibronektin und F-Aktin unterzogen. Anschließend wurde mittels eines Sagnac Inter-ferometers eine spectrale Bildanalyse mit Dekomposition der einzelnen Farbstoffe durchgeführt. Ergebnisse: Hinsichtlich aller untersuchten Zellmarker zeigten hMSC ein positives Färbeergebnis, während in humanen Osteoblasten und Fibroblasten CD105 und CD106 nicht nach-gewiesen werden konnte. Eine Unterscheidung zwischen letzteren Zelltypen konnte durch CD44 gewährleistet werden, welches nur in Osteoblasten ein positives Ergeb-nis zeigte. Alle verwendeten Farbstoffe konnten eindeutig in der Spectralanalyse bis zu einem Wellenlängenabstand von 10nm voneinander getrennt werden. Schlussfolgerungen: Es ist in dieser Studie gelungen, ein geeignetes Markerprofil zu definieren, um hMSC von anderen Zellen des Binde- und Stützgewebes abzugrenzen. Besonders die Spectralanalyse eines simultan angewandten Phänotypisierungsprofils auf Einzel-zellniveau erscheint bei der großen Heterogenität dieser Stammzellen als potentes Werkzeug zur Untersuchung gegenüber anderen Zelllinien. Besonders die Oberflä-chenproteine CD105, CD106 und CD44 erscheinen als äußerst geeignete Kandida-ten zur Charakterisierung von hMSC.

Sinus-lining cells (SLC) of lymph nodes (LN) are referred to as (immune-accessory) dendritic cells (DC) and as such, they are part of the Monocyte Macrophage System (MMS). Chimerism of various kinds of DC after sex-mismatched stem cell transplantation (SCT) has been reported, but data on chimerism of SLC have not been available so far. We examined 13 LN of different female individuals after sex-mismatched SCT, using a combined podoplanin immunostain and Y-FISH on single section slides. Twelve out of 13 LN contained chimeric cells, obviously predominantly lymphocytes, and eleven LN stained positive with podoplanin in SLC. In one of the LN simultaneously podoplanin-marked SLC revealed Y-chromosomal chimerism. Our results demonstrate that bone marrow derived cells are capable of regenerating SLC, at least at low frequency. These bone marrow derived cells are most likely hematopoietic stem cells (HSC) differentiating into blood monocytes which then form SLC, and after antigen contact SLC might, again, differentiate into FDC.

Aspergillus fumigatus ist ein opportunistischer Krankheitserreger, der ubiquitär in der Umwelt vorhanden ist. Die schwerwiegende Krankheit, die er verursacht, ist die invasive Aspergillose, welche nur bei immungeschwächten Patienten auftritt und bis heute nur sehr schwierig zu diagnostizieren und zu heilen ist. Die Sporen von A. fumigatus können aufgrund ihrer geringen Größe bis in die Alveolen der Lunge gelangen. Dort bilden Makrophagen die erste Verteidigungslinie, indem sie die Sporen phagozytieren. Die Phagozytose ist Bestandteil der angeborenen Immunantwort und ein initialer Schritt bei der Bekämpfung von A. fumigatus-Sporen durch Makrophagen. Das Verstehen dieses Prozesses gewinnt durch die stetige Zunahme der Patienten mit invasiver Aspergillose immer größere Bedeutung und ist Gegenstand intensivster Forschung. Im Rahmen dieser Dissertation wurden die Interaktionen von murinen und humanen Makrophagen mit A. fumigatus-Sporen untersucht. Die Fragestellung wurde aus zwei unterschiedlichen Perspektiven betrachtet. Zum einen wurde die Oberfläche der A. fumigatus-Sporen analysiert; zum anderen wurden die Interaktionen von A. fumigatus mit phagozytierenden Zellen erforscht. Um die Phagozytose von A. fumigatus-Sporen in murinen und humanen Zellen genauer charakterisieren zu können, wurde in dieser Arbeit der so genannte „Biotin-Calcofluor Staining Assay“ (BCS-Assay) entwickelt. Mit Hilfe dieser Methode war es möglich, zwischen extra- und intrazellulären Sporen zu unterscheiden, ohne auf die Anwesenheit von Antikörpern angewiesen zu sein. Mit Hilfe von diversen Inhibitoren konnte der Mechanismus der Phagozytose genauer untersucht werden. So konnte gezeigt werden, dass die Aufnahme von A. fumigatus-Sporen ein Aktin-abhängiger Prozess ist und dass Makrophagen für die Phagozytose die Aktivierung der Phosphoinositid 3 Phosphat-Kinasen und von Tyrosin-Kinasen benötigen, insbesondere diejenigen der scr Familie. Butanedion Monoxim, ein Inhibitor der Myosinmotor-Aktivität, blockierte ebenfalls effizient die Sporenaufnahme. Die weiteren Untersuchungen der Phagozytoseprozesse von A. fumigatus-Sporen erfolgten u.a. mit Hilfe von Fluoreszenz- und elektronenmikroskopischer Aufnahmen. In der Immunfluoreszenz ließen sich Tyrosin-phosphorylierte Proteine in den Aufnahmestrukturen detektieren, und elektronenmikroskopische Aufnahmen infizierter Makrophagen zeigten so gennante „Ruffle“-Strukturen. Diese Tatsache deutet darauf hin, dass A. fumigatus-Sporen durch einen „Trigger“-ähnlichen Mechanismus aufgenommen werden. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurden die Rezeptoren der Phagozytose von A. fumigatus-Sporen charakterisiert. Die Ergebnisse von Meier und ihren Kollegen zeigten bereits, dass die Erkennung von A. fumigatus durch Makrophagen mittels Toll-like Rezeptor 2 und TLR4 erfolgt. In der vorliegenden Arbeit wurde nun auch der Frage nachgegangen, welche Rolle TLR2 und TLR4 bei der Phagozytose von A. fumigatus-Sporen spielen. Hierzu wurden aus den Mausstämmen C3H/HeN (WT), C3H/HeJ (TLR4-), C3H/HeN TLR2-/- (TLR2-) und C3H/HeJ TLR2-/- (TLR2-/4-) murine Peritonealmakrophagen mittels Peritoneallavage entnommen, mit A. fumigatus-Sporen infiziert und mit Hilfe des BCS-Assays ausgewertet. Es konnte gezeigt werden, dass Toll-like Rezeptor 2 und nicht Toll-like Rezeptor 4 für eine effiziente Phagozytose benötigt wird. Dieses Ergebnis ließ sich wiederum mit Hilfe eines anti TLR2-Antikörpers bestätigen, da dieser auch die Phagozytose von A. fumigatus-Sporen, aber nicht von Kontrollbeads blockieren konnte. Des Weiteren wurde untersucht, ob der von Brown und seinen Mitarbeitern entdeckte Dectin-1 Rezeptor ein potentieller Phagozytoserezeptor von A. fumigatus-Sporen ist (Brown et al., 2001). Es konnte gezeigt werden, dass Laminarin, ein lösliches ß 1-3 Glucan, die Phagozytose von A. fumigatus-Sporen durch Makrophagen blockierte. Außerdem ließ sich mit einem anti-Dectin-1 Antikörper die Phagozytose von A. fumigatus-Sporen in Makrophagen hemmen. Zudem ließ sich Dectin-1 mit diesem Antikörper in infizierten Makrophagen in der Immunfluoreszenz detektieren. Mit einem weiteren Antikörper konnte beta-1-3 Glucan, ein wichtiger Bestandteil der pilzlichen Zellwand, auf ruhenden Sporen detektiert werden. Es zeigte sich, dass die Menge an  1-3 Glucan eine wichtige Rolle bei der Eliminierung von A. fumigatus-Sporen spielt. Vergleiche zwischen ruhenden und angeschwollenen Sporen zeigten, dass angeschwollene Sporen, welche größere Mengen an ß 1-3 Glucan auf ihrer Oberfläche besitzen, effizienter phagozytiert werden können. Auch die A. fumigatus pksP-Mutante, welche mehr  1-3 Glucan auf ihrer Oberfläche besaß, wurde effizienter phagozytiert. Betrachtet man die intrazelluläre Signaltransduktionskaskade, so deuten die Daten darauf hin, dass die Dectin-1-gesteuerte Phagozytose von A. fumigatus-Sporen abhängig von der Syk-Kinase verläuft. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass Dectin-1 und TLR2 für eine effiziente Phagozytose von A. fumigatus-Sporen benötigt werden. Die Ergebnisse legen allerdings nahe, dass außer Dectin-1 und TLR 2 noch weitere Rezeptoren bei der Phagozytose von A. fumigatus-Sporen beteiligt sind. Ein genaues Verständnis der bei der Phagozytose ablaufenden Erkennungsprozesse und der nachgeschalteten Signaltransduktionskaskaden könnte in Zukunft ausgenutzt werden, um die Effiziens der Phagozytose auch in immungeschwächten Patienten zu erhöhen und sie so zu schützen.

Einleitung und Ziel der Arbeit: Immunchemotherapie-Protokolle mit 5-Fluorouracil (5-FU) in Kombination mit Interleukin-2 (IL-2) und Interferon-alpha2a (IFN-alpha) zeigten eine verbesserte Ansprechrate bei Patienten mit metastasiertem Nierenzellkarzinom (NZK). Die Rolle des 5-FU im Rahmen eines synergistischen bzw. additiven Effektes ist bislang nicht geklärt. Die vorliegende Arbeit hinterfragt, ob die Gabe von 5-FU im Zusammenhang einer Immuntherapie aus immunologischer Sicht gerechtfertigt ist. Hierzu wurden die Effekte des 5-FU auf die Lymphozytenfunktion in vitro und ex vivo während der Immunchemotherapie analysiert. Methoden: Periphere Blutmononukleäre Zellen (PBMC) wurden aus dem Blut gesunder Spender isoliert und für 5 Tage mit verschiedenen NZK-Linien in Mixed lymphocyte tumor cell cultures (MLTC) koinkubiert. IL-2, IFN-alpha, 5-FU wurden allein oder in Kombination dazugegeben. Die Lymphozyten wurden im Hinblick auf Proliferation, Zytotoxizität mittels colorimetrischer Verfahren und bezüglich ihrer Aktivität in der Immunfluoreszenz analysiert. Zusätzlich entwickelten wir eine Langzeit-Kultur mit PBMC in Kokultur mit NZK-Linien und den Pharmaka nach dem Hannoveraner Protokoll (IL-2, IFN-alpha, 5-FU). Der Lymphozyten-Phänotyp und ihre Funktion wurden bei 5 Patienten mit metastasiertem NZK, die die Immunchemotherapie nach dem Hannoveraner Protokoll und bei 6 weiteren Patienten in modifizierter Form erhielten, analysiert. Ergebnisse: Die Lymphozyten-Proliferation in der MLTC war um mehr als das doppelte gesteigert nach der Gabe von IL-2 und/oder IFN-alpha. 5-FU inhibierte die Proliferation vollständig allein und in der Kombination mit IL-2 und/oder IFN-alpha. Die Zytotoxizität der aktivierten Lymphozyten war in ähnlicher Weise vermindert. Die Langzeitkultur (MLTC mit PBMC und NZK-Linien, IL-2, IFN-alpha und 5-FU) führte zu einer kontinuierlichen Lymphozyten-Proliferation und ergab einen deutlichen Anstieg der Zellzahl. Die Proliferation und die Vitalität waren nach Gabe von 5-FU vollständig aufgehoben. Nach 14-tägiger Kultur mit NZK-Linien IL-2 und IFN-alpha zeigten die aktivierten Lymphozyten eine allospezifische Zytotoxizität. Die Gabe von 5-FU führte zu einem starken Absinken der zytotoxischen Aktivität der stimulierten Zellen. Analog durchgeführte ex vivo – Analysen der Lymphozyten-Funktion aus dem Vollblut von 5 Patienten mit metastasiertem NZK, die die Immunchemotherapie erhielten, zeigten ähnliche Ergebnisse. Die Zytotoxische Aktivität der stimulierten Lymphozyten der behandelten Patienten gegen NZK-Linien stieg nach der Zytokinbehandlung erst an von 35.5% auf 62.2% allospezifische Lyse (E:T ratio 40:1)und fiel nach der Gabe von 5-FU auf weniger als 30% ab. Analog zeigten die Untersuchungen der 6 weiteren Patienten, die zuerst die Kombination aus 5-FU und IFN-alpha und anschließend IL-2 und IFN-alpha erhielten, zunächst einen Abfall der zytotoxischen Aktivität der NK-Zellen. Die Gabe von IL-2 und IFN-alpha wiederum führte zu einem Anstieg der aktivierten Lymphozyten sowie zu vermehrter zytotoxischer Aktivität der NK-Zellen. Schlussfolgerung: 5-FU führt inhibiert die Proliferation und die Zytotoxizität von aktivierten Lymphozyten auch in Kombination mit Zytokinen in vitro. Die ex vivo – Analysen der behandelten Patienten zeigen den gleichen Effekt. Ob eine Änderung der sequentiellen Applikation der einzelnen Pharmaka eine klinische Konsequenz hat, sollte in einer klinischen Studie überprüft werden.

Das unspezifische Immunsystem und die HHN-Achse stehen in engem Zusammenhang und beeinflussen sich gegenseitig in komplexer Weise: Während die zum Immunsystem zählenden Zytokine bei inflammatorischen Reaktionen auf verschiedenen Ebenen die Aktivierung der HHN-Achse erhöhen und somit zu vermehrter Sekretion von Kortisol aus der Nebenniere führt, hemmt die Zugabe von Glukokortikoiden die Ausschüttung eben dieser inflammatorischen Zytokine aus immunkompetenten Zellen. Bereits kleinste Veränderungen der Spiegel von durch das neuroendokrine System regulierten, zirkulierenden Zytokinen spielen zudem eine wichtige Rolle in der Interaktion von Gehirn und Immunsystem, sowie in Erkrankungen des ZNS: So werden Parameter wie Vigilanz, Appetit, Kognition und Schlaf-Wach-Verhalten durch die Spiegel von IL-1, IL-6 und TNF-a beeinflusst. Demzufolge wirken Glukokortikoide immunmodulatorisch auf das aktivierte, unspezifische Immunsystem und bereits kleine Veränderungen zirkulierender inflammatorischer Zytokine haben physiologische Relevanz in Bezug auf die Interaktion von ZNS und Immunsystem. Es ist jedoch nicht klar, ob geringfügige physiologische Änderungen von Glukokortikoidspiegeln bei Gesunden und nicht immunaktivierten Menschen überhaupt Zytokine supprimieren können. In einer doppelblinden, Plazebo-kontrollierten Studie wurde daher in einer aufwendigen Studie mit Bestimmung von Zytokinen durch ELISA Verfahren und Analyse immunologisch aktiver Zellen mit Hilfe von Immunfluoreszenzdurchflusszytometrie (FACS) der Einfluss von 1.5mg beziehungsweise 3.0mg Dexamethason (DEX), welches zu verschiedenen Zeitpunkten entweder um 9:00 Uhr oder um 21:00 appliziert wurde, an gesunden männlichen Probanden untersucht. Dabei zeigte zunächst, dass die meisten der gemessenen Parameter bereits unter Plazebo - Bedingungen signifikante Unterschiede zwischen den Messzeitpunkten aufwiesen, was sich im wesentlichen mit der bestehenden Literatur deckt, während solche tageszeitlichen Unterschiede für die Anzahl und Leuchtdichte CD16b bzw. CD18 tragender Zellen in der Immunfluoreszenz, sowie für IL-6, TNF-a und die löslichen TNF-Rezeptoren so noch nicht in vivo vorbeschrieben sind. Weiterhin konnte neben einer Dosis- und Applikationszeitpunkts-unabhängigen Suppression der endogenen Kortisolsekretion auch eine signifikante Temperaturerhöhung am Morgen durch abendlich appliziertes DEX nachgewiesen werden. Eine mehrfach vorbeschriebene Leukozytose konnte über die Versuchsreihe über 24 Stunden gezeigt werden, wobei diese nach 12 Stunden auf einen Anstieg der Granulozytenzahlen, nach 24 Stunden auf Anstiege von Lymphozyten- und Granulozytenzahlen zurückzuführen war. In ihrer Aktivität wurden neutrophile Granulozyten 12 Stunden nach morgendlicher Gabe gemindert, während 24 Stunden nach DEX-Gabe sich dagegen sogar ein signifikanter Anstieg bei Abend-Applikation von DEX einstellte. Die Spiegel von TNF-a und des löslichen TNF-Rezeptors p75 wurden nach Applikation für 24 Stunden signifikant gesenkt. Dabei wurden die Spiegel von sTNF-R p75 12 Stunden nach Einnahme stärker beeinflusst, wenn die Applikation am Abend erfolgte. Die Spiegel des anderen löslichen TNF-Rezeptors p55 dagegen waren zwar 12 Stunden nach Einnahme abgesenkt, stiegen nach 24 Stunden jedoch wieder sogar signifikant über das Ausgangsniveau an. Bei den IL-6 Spiegeln konnte nach 12 Stunden dagegen kein signifikanter supprimierender Effekt nachgewiesen werden, nach 24 Stunden nach Einnahme von DEX kam es zu einem signifikanten Anstieg. Die Untersuchung immunmodulatorischer Effekte von Dexamethason auf Leukozyten und Plasmaspiegel von inflammatorischen Zytokinen bestätigte also bekannte Effekte von DEX, lieferte aber auch neue Erkenntnisse und sogar unerwartete Befunde: Zusätzlich zur bekannten Granulozytose konnte bei geringen Mengen DEX auch ein später Anstieg von Lymphozyten und Monozytenzahlen im peripheren Blut nachgewiesen werden. Erstmals konnte in der durchgeführten Studie zudem gezeigt werden, dass sich die geringen, beim Gesunden vorhandenen Spiegel von TNF-a, sTNF-R p55 und p75 durch kleine Mengen Dexamethason supprimieren lassen. Somit konnte gezeigt werden, dass nicht nur eine Erhöhung der Spiegel inflammatorischer Zytokine und deren Rezeptoren, sondern auch Suppression derselben unter physiologischen Bedingungen ohne Aktivierung des Immunsystems eine bedeutende Rolle zum Beispiel in Bezug auf Interaktionen zwischen Gehirn und Immunsystem spielen kann.

Die Organisation der DNA in Nukleosomen hat einen großen Einfluss auf die Regulation von grundliegenden Prozessen wie Transkription, Replikation oder Reparatur der DNA im Zellkern. Um die hinderliche Natur des Chromatins bei diesen fundamentalen Prozessen zu überwinden, existieren mehrere verschiedene Chromatin modifizierende Proteinkomplexe im Zellkern. Chromatin Remodelling Komplexe nützen die Energie der ATP-Hydrolyse um die Position der Nukleosomen so zu verändern, dass verschiedene Abschnitte der DNA für die Interaktion mit regulierenden Faktoren zugänglich werden. Ein Klasse solcher Remodelling Faktoren beinhalten die ATPase ISWI als katalytische Untereinheit. Das Protein wurde zuerst in Drosophila entdeckt und die drei verschiedenen ISWI enthaltenden Komplexe, nämlich NURF, ACF und CHRAC, wurden ausführlich in diesem Modellorganismus untersucht. Homolog zur Fruchtfliege existieren sehr ähnliche Protein Komplexe beim Menschen. Wir haben das humane ISWI mit den Isoformen Snf2h und Snf2L im Prostatakarzinom untersucht. In einem Tissue Microarray wurden Gewebeproben mit Hilfe von polyklonalen Antikörpern gegen ISWI gefärbt. Es folgte ein quantitativer Vergleich der Färbungsintensitäten im Karzinomgewebe sowie in gutartigem Gewebe der Prostata durch Anwendung von digitaler Bildanalyse. Das Ergebnis war eine signifikant stärkere Färbung im neoplastischen Gewebe. Eine Anreicherung von ISWI in Krebszellen ist besonders interessant im Kontext der bekannten Funktionen des Proteins für DNA-Replikation, Zellproliferation und Regulation der Chromatinstruktur. In einem zweiten Projekt sind wir zum Modell der Fruchtfliege zurückgekehrt und entwickelten monoklonale Antikörper gegen Toutatis, das zu einer Proteinfamilie gehört, die auch einige bekannte Interaktionspartner von ISWI umfasst. Die Proteine dieser Familie haben vermutlich eine regulatorische Funktion in den Remodelling Komplexen, denn am Beispiel von Acf1 wurde gezeigt, dass sie die nukleosomale Bindung sowie die Effizienz und Richtung der Mobilisierung von Nukleosomen modifizieren. Unsere Antikörper wurden etabliert, um Toutatis enthaltende Komplexe durch Western Blot Analyse von gereinigten Drosophila-Extrakten und Immunfluoreszenz zu charakterisieren. Mit diesen Methoden fanden wir eine Koelution von Toutatis mit der ATPase Brahma und dem Strukturprotein Spectrin alpha sowie eine Lokalisation in der Lamina des Zellkerns. Ein mögliches Zusammenspiel dieser Proteine in einem neuen Chromatin Remodelling Komplex mit einer Beteiligung an der DNA-Reparatur wird diskutiert.

Es wurden 72 männliche Sprague-Dawley Ratten (403 ± 59g) mit Halothan anästhesiert, intubiert und mit Isofluran (1,5-2,5 Vol % in N2O/O2 mit FiO2 = 0,33) beatmet. Zur Kontrolle des arteriellen Blutdrucks, zur Blutentnahme und zur Applikation der Medikamente legte man in die A. und V. femoralis sowie in die V. jugularis Katheter. Zur Kontrolle der perikraniellen und rektalen Temperatur und weiterer Parameter wurden Sonden angebracht. Nach Beendigung der Präparation wurden die Tiere randomisiert in eine Kontroll-Gruppe (n = 32): 25 µg/kg/h Fentanyl und N2O/O2 (FiO2 = 0,33) und eine Propofol-Gruppe (n = 32): 1,0 mg/kg/min Propofol i.v. eingeteilt und die Narkose gruppenspezifisch gewechselt. Beide Gruppen bekamen zusätzlich ein Muskelrelaxans (Rocuroniumbromid 25 mg/kg/h). Durch eine hämorrhagische Hypotension (MAP = 40 mmHg) und einen temporären Verschluss der rechten A. carotis communis wurde für 45 min eine cerebrale Ischämie mit anschließender Reperfusion induziert. Die Blutgase, die perikranielle Temperatur und den pH-Wert hielt man konstant. Nach Ablauf von 1, 3, 7 oder 28 Tagen wurden die Tiere in tiefer Narkose getötet und das Gehirn zur weiteren Analyse tiefgefroren, geschnitten (7µm) bzw. weiter aufbereitet. Als physiologische Referenz gingen zusätzlich die Gehirne der Tiere einer Nativ-Gruppe (n = 8) ein. Die Apoptose-assoziierten Proteine Bcl-2, Mdm-2, Bax und p53 wurden nach einer Immunfluoreszenz-Färbung mit einem Laserscan-Mikroskop und dem Computerprogramm KS 400 (Zeiss & Microsoft) sowie der Western-Blot-Analyse qualitativ und semiquantitativ bestimmt. Die Ergebnisse zeigen in der Immunfluoreszenz-Färbung der Propofol-Gruppe im Vergleich mit der Kontroll-Gruppe eine signifikant verminderte Expression des pro-apoptotischen Proteins Bax am Tag 1, 3, 7 in beiden Hemisphären und beim Western-Blot signifikant am Tag 3, 7 und 28 für die ischämische Hemisphäre und signifikant für die nicht-ischämische Hemisphäre am Tag 28 und tendenziell am Tag 3 und 7. Das pro-apoptotische Protein p53 weist nur im globalen Vergleich signifikante Effekte in beiden Analyseverfahren auf. Die Expression ist in der Propofol-Gruppe niedriger. Das anti-apoptotische Protein Bcl-2 zeigt signifikante Erhöhung der Propofol-Gruppe im Vergleich mit der Kontroll-Gruppe am Tag 1 und 3 für die ischämische und am Tag 1 und 28 für die nicht-ischämische Hemisphäre in der Immunfluoreszenz. Beim Western-Blot zeigt sich für Bcl-2 eine signifikante Erhöhung am Tag 1 für die ischämische und tendenzielle für die nicht-ischämische Hemisphäre. Die Ergebnisse beider Analyseverfahren für das anti-apoptotische Protein Mdm-2 divergieren. Die Immunfluoreszenz zeigt eine signifikante Erhöhung des Proteins für beide Hemisphären am Tag 1 und eine verminderte Expression am Tag 28 für die ischämische Hemisphäre. Der Western-Blot zeigt im Untergruppentest auf die Tage keine signifikanten Unterschiede. Im globalen Test auf die Behandlung zeigt die Kontroll-Gruppe im Vergleich zur Propofol-Gruppe signifikante Effekte in der Erhöhung der Expression des Mdm-2 Proteins. Die unterschiedlichen Ergebnisse der Analyseverfahren können durch unterschiedliche Probenaufbereitungen erklärt werden. Die Ergebnisse lassen die Vermutung zu, dass Propofol bis zu 28 Tage nach einem ischämischen Insult im Zusammenhang mit Apoptose-assoziierten Proteinen neuroprotektiv wirkt. Dem Effekt können anti-apoptotische Wirkungsmechanismen zu Grunde liegen. Es sind allerdings weitere Untersuchungen notwendig, um einen genaueren Einblick in die Mechanismen zu gewinnen und so Behandlungsmöglichkeiten bei einer cerebralen Ischämie einzuführen.

In dieser Arbeit wurde die biologische Funktion der PTP-Meg2 in der zellulären Signaltransduktion untersucht. Analysen mittels c-DNA-Filter, „Real Time PCR” und Immunblot zeigen eine ubiquitäre Expression der PTP-Meg2 auf ähnlichem, jedoch geringem Niveau in fast allen untersuchten Krebszelllinien unterschiedlicher Gewebeherkunft, wobei die Expressions-stärke nicht in direktem Zusammenhang mit krebsrelevanten Eigenschaften wie Invasivität und Metastasierung steht. Die induzierte Differenzierung von MCF 7-Zellen durch Natriumbutyrat steigert die Meg2-Expression um das 5-fache, wogegen die Differenzierung von SW948- und SK-N- SH-Zellen mit TPA bzw. Retinolsäure die Meg2-Expression reprimiert. Zellfraktionierung und Immunfluoreszenz zeigen eine primär zytosolische, aber partiell auch vesikuläre bzw. strukturierte Lokalisation der PTP-Meg2, für welche die CRALBP-Domäne der PTP-Meg2 mitverantwortlich ist. Untersuchungen der endogenen Meg2-Aktivität nach Immunpräzipitation und in vitro Phosphatasetests zeigen eine erhöhte Phosphataseaktivität nach Stimulation von Zellen mit FCS, EGF und LPA, wogegen TPA stark inhibierenden wirkt. Aktivitätsstudien mit GST-Meg2-Fusionsproteinen zeigen, dass die CRALBP-Domäne die Meg2-Phosphataseaktivität negativ reguliert. Im Protein-Lipid-Overlay interagiert PTP-Meg2 mit PI(3)P, PI(4)P, PI(5)P und Phosphatidylserin. Eine Interaktion mit PI(4)P führt zu einer erhöhten Meg2 Aktivität. Pervanadat-Stimulation von Zellen führt zu einer Tyrosinphosphorylierung sowie einer Mobilitätsänderung der PTP-Meg2, was auch mit einer katalytisch inaktiven Meg2-Mutante beobachtet wurde. PTP-Meg2 interagiert in vitro und in Koexpressionsstudien mit dem EGF-Rezeptor in Abhängigkeit von dessen Aktivierung. Eine physiologische Relevanz konnte nicht gezeigt werden. Die Depletion der PTP-Meg2 durch spezifische siRNA führt zu einer erhöhten Tyrosinphosphorylierung einiger, noch zu identifizierender Proteine. PTP-Meg2 vermindert, die inaktive PTP-Meg2CS-Mutante erhöht die durch v-ErbB und EGF-Rezeptor, nicht aber die durch HER2 und v-Ki-Ras induzierte Transformation von NIH3T3-Zellen im Focusbildungstest. Zudem bewirkt PTP-Meg2CS, mit Ausnahme der v-Ki-Ras infizierten Zellen, eine leicht erhöhte ERK1/2-Aktivität. Ferner stimuliert PTP-Meg2 die Migration von NIH3T3-Zellen im Wundheilungsexperiment. Ein Einfluss auf die basale und durch Stimuli induzierte Proliferation von Zellen in Wachstumstests wurde nicht beobachtet. Ein durch siRNA-vermittelter Meg2- „knockdown“ führte zur Induktion bzw. Repression der Expression von Genen, wie z.B. einiger Liganden, Caveolin-2, Nck und Rock, was auf eine Beteiligung der PTP-Meg2 an der Regulation von Signalwegen kleiner GTPasen bzw. von endo- sowie exocytotischen Prozessen schließen lässt.

Reaktive – Sauerstoff - Spezies (ROS) spielen in der Physiologie und Pathophysiologie des vaskulären Systems eine wichtige Rolle. So kommt es z.B. bei Hypertonie, Atherosklerose, Ischämie / Reperfusion und weiteren Krankheiten und Stoffwechselstörungen, wie z.B. Hypercholesterinämie und Diabetes mellitus zu einem Ungleichgewicht zwischen Sauerstoffradikalbildung und anti - oxidativen Mechanismen. Superoxidanionen (O2 -) spielen insofern eine besondere Rolle, als sie durch direkte Interaktion endotheliales NO inaktivieren, so daß es seine vasodilatatorische, anti – proliferative und plättchenaggregationshemmende Funktion nicht mehr voll erfüllen kann. Damit ist O2 - maßgeblich an der Induktion der Endotheldysfunktion beteiligt. Bei Beginn dieser Arbeit gab es erste Hinweise, daß eine der leukozytären NAD(P)H - Oxidase ähnlichen Oxidase auch im Endothel existiert und wesentlich zur endothelialen O2 - - Bildung beiträgt. Wenig erforscht waren jedoch die Regulationsmechanismen dieser Oxidase. Ein bisher noch nicht bekannter Stimulus zur Steigerung der endothelialen O2 - - Bildung wurde 1996 beschrieben. In Endothelzellen aus bovinen Pulmonararterien führte eine Depolarisation zu einer gesteigerten O2 - - Bildung. Dies kann insofern von Bedeutung sein, als es sowohl unter physiologischen, als auch pathophysiologischen Bedingungen zu akuten oder chronischen Veränderungen des endothelialen Membranpotentials kommt. In dieser Arbeit wurde nun untersucht, ob eine NAD(P)H – Oxidase in der Tat auch in humanen Endothelzellen vorhanden ist, ob sie im Gegensatz zur leukozytären Form konstitutiv aktiv ist, und welchen Beitrag sie zur basalen endothelialen O2 - - Bildung leistet. Weitere Untersuchungen in HUVEC sollten zeigen, ob und wie sich sowohl De – als auch Hyperpolarisation der Zellmembran auf die O2 - - Bildung auswirken, welches Enzym hierbei eine Rolle spielt und welche Signaltransduktionsmechanismen beteiligt sind. Zur O2 - - Messung an vaskulären Zellen war die Verwendung der Lucigenin – Chemilumineszenz – Methode etabliert, so daß auch hier anfänglich mit dieser Methode gearbeitet wurde. Da jedoch dann Befunde veröffentlicht wurden, die zeigten, daß Lucigenin in Enzymsyste-men, die sonst kein oder nur wenig O2 - produzieren, zu einer erheblichen O2 - - Bildung führte, mußte mit weiteren Methoden der O2 - - Messung überprüft werden, ob diese Nachteile auch unter unseren Versuchsbedingungen auftraten. Verwendet wurden hierzu die MCLA – verstärkte Chemilumineszenz, die NBT – und Cytochrom C – Methode. Mit diesen verschiedenen, voneinander unabhängigen Methoden zeigte sich, daß in Anwesenheit von NADH Lucigenin selbst zu einer wesentlich gesteigerten O2 - - Bildung in Lysaten von humanen Umbilikalvenenendothelzellen (HUVEC) führt. Daher wurde zur Untersuchung der endothelialen O2 - - Bildung in dieser Arbeit schließlich nur die Cytochrom C Methode verwendet. Zur Überprüfung der Auswirkungen der verwendeten Substanzen auf das Membranpotential wurde die Membranpotentialmeßmethode mittels dem Potential – sensitiven Fluoreszenzfarbstoff Bis - oxonol aufgebaut und verwendet. Intakte HUVEC zeigten eine basale O2 - - Produktion, die durch bekannte Inhibitoren der leukozytären NAD(P)H – Oxidase, mit unterschiedlichen Wirkmechanismen signifikant gehemmt wurde (Diphenyleniodonium ca. 48%, Phenylarsenoxid ca. 34% ). Ebenso resultierte die Inaktivierung des GTP - bindenden - Proteins rac mit Clostridium difficile Toxin B in einer signifikanten Reduktion der basalen endothelialen O2 - - Produktion um ca. 30%. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß nach Aufhebung der zellulären Integrität durch das Lysieren der HUVEC die Gabe von NADH eine um ca. 2.7 fach erhöhte O2 - - Produktion im Vergleich zu NADPH bewirkte. Mit Hilfe der Immunfluoreszenz bzw. rtPCR konnten außerdem zumindest ein Teil der leukozytären NAD(P)H – Oxidase Untereinheiten, p67phox und gp91phox auch in HUVEC nachgewiesen werden. Zur gezielten Depolarisation des Membranpotentials wurden ein Puffer mit erhöhter Kaliumkonzentration (90 mM), der nicht selektive Kalium – Kanal - Blocker Tetrabutylammonium Chlorid (1 mM) und das Kation – Ionophor Gramicidin (1 µM) verwendet. Die basale endotheliale O2 - - Produktion wurde durch diese Substanzen in ähnlichem Ausmaß (~ 60% ) signifikant gesteigert (n=23, p