Podcasts about ctar2

Das Epstein-Barr Virus (EBV) ist mit einer Reihe von lebensbedrohlichen Krankheiten assoziiert. Dazu zählen unter anderem Nasopharynxkarzinome, Hodgkin-Lymphome und lymphoproliferative Erkrankungen nach Organtransplantationen. Dennoch gibt es bisher keinen wirksamen Therapieansatz, der sich spezifisch mit der Rolle von EBV in diesen malignen Erkrankungen auseinandersetzt. Das latente Membranprotein 1 (LMP1) ist das primäre Onkogen von EBV und essenziell für die Transformation von B-Zellen durch das Virus. Für eine effiziente Transformation von Zellen ist die Aktivierung verschiedener zellulärer Signalwege durch LMP1 notwendig. LMP1 besitzt jedoch keine enzymatische Aktivität und die Induktion der Signalwege ist somit abhängig von der Rekrutierung verschiedener zellulärer Adapterproteine. Die Ausbildung der notwendigen Signalkomplexe wird über zwei C-terminale Aktivierungs-Regionen (CTAR1 und CTAR2) vermittelt. Verschiedene Mitglieder der Tumornekrosefaktor (TNF)-Rezeptor-assoziierten Faktoren (TRAF)-Protein-Familie spielen bei der Induktion der Signalwege durch diese beiden CTAR-Domänen eine zentrale Rolle. Nach grundlegenden Protein-Protein-Interaktionsstudien zwischen LMP1 und rekombinanten TRAF-Proteinen wurde hier die Interaktion zwischen TRAF2 und LMP1 als Zielstruktur für Inhibitoren vorgestellt. TRAF2 ist essenziell für die Aktivierung des NF-κB-Signalweges durch die CTAR1-Domäne und somit für das Überleben EBV-transformierter Zellen. Die Bindung von TRAF2 an LMP1 wurde biochemisch näher charakterisiert und die gewonnen Erkenntnisse verwendet, um ein System zu etablieren, mit dem Inhibitoren gegen den Komplex aus LMP1 und TRAF2 identifiziert werden können. Dieses ELISA-basierte System erfüllt die Anforderungen, die allgemein an hochdurchsatzfähige Systeme gestellt werden. In einem Pilotscreen einer Bibliothek mit Naturstoffen wurden Substanzen identifiziert, die die Bindung von TRAF2 an LMP1 in vitro inhibierten. Die potenteste Substanz inhibierte die Interaktion von TRAF2 und LMP1 mit einem IC50 von 8 µM in diesen in vitro Studien. Weiterhin zeigte diese Substanz eine spezifische biologische Wirkung auf die Vitalität von EBV-transformierten B-Zellen. Zusätzlich konnte in den Protein-Protein-Interaktionsstudien zwischen den verschiedenen TRAF-Proteinen und LMP1 erstmals eine direkte Bindung von TRAF6 an LMP1 gezeigt werden. Entgegen der bisherigen Modellvorstellung, nach der TRAF6 indirekt über Adapterproteine an LMP1 gebunden wird, konnte hier gezeigt werden, dass TRAF6 direkt an die LMP1-Sequenz P379VQLSY innerhalb der CTAR2-Domäne bindet. Diese Sequenz ist essenziell für die Aktivierung verschiedener TRAF6-abhängiger Signalwege durch die CTAR2-Domäne. Auf der Oberfläche von TRAF6 wird die Bindung an LMP1 durch dieselbe Bindetasche vermittelt, über die auch die Interaktion mit zellulären Rezeptoren stattfindet. Diese direkte Interaktion zwischen LMP1 und TRAF6 ist wichtig für die Aktivierung des NF κB-Signalweges durch die CTAR2-Domäne. TRAF6-Mutanten, die nicht mehr in der Lage waren, mit LMP1 zu interagieren, waren ebenfalls nicht mehr dazu fähig, die Induktion von NF κB-Signalen durch die CTAR2-Domäne von LMP1 in embryonalen TRAF6-/- Mausfibroblasten wiederherzustellen. Ebenfalls konnte neben der direkten Bindung von TRAF6 an LMP1 hier eine weitere neue Protein-Protein-Interaktion für TRAF6 beschrieben werden. TRAF6 bindet direkt an das TNF-Rezeptor-assoziierte Todesdomänenprotein (TRADD). Die Interaktion zwischen TRAF6 und TRADD unterscheidet sich jedoch von der Bindung anderer TRAF-Proteine an TRADD. Die in vitro Studien zeigten, dass TRAF6 in der Lage ist, sowohl mit Teilen des N-Terminus, als auch mit Teilen des C-Terminus von TRADD zu interagieren. Diese bisher nicht beschriebene Art der direkten Interaktion von TRAF6 mit TRADD eröffnet neue Einblicke in den Aufbau des LMP1-Signalkomplexes.

Das Membranprotein LMP1 des Epstein-Barr Virus (EBV) stellt das primäre Onkogen des Virus dar. Es ist essentiell für eine effiziente Transformation von B-Zellen durch das Virus und ist allein ausreichend, um Nagerfibroblasten zu transformieren. LMP1 aktiviert eine Vielzahl von Signalwegen über zwei carboxyterminale Aktivierungsregionen (CTAR1 und CTAR2), unter anderem die JNK-, die NF-κB, die PI3K- und die Jak/STAT-Signalkaskaden. Die Aufklärung der Signaltransduktion von LMP1 auf molekularer Ebene ist der Fokus intensiver wissenschaftlicher Forschung. Ziel der vorliegenden Doktorarbeit war es, neue Interaktionspartner von LMP1 zu identifizieren und so Lücken zwischen LMP1 und den weiter stromabwärts liegenden Signalwegen zu schließen. Dazu wurde im ersten Teil der Arbeit eine Methodik entwickelt, mit dem der Signalkomplex von LMP1 massenspektrometrisch untersucht werden konnte. Hierzu wurde zunächst ein Zellsystem etabliert, mit dem der LMP1-Multiproteinkomplex aus lymphoblastoiden Zelllinien (LCLs), also im viralen Kontext, präzipitiert werden konnte. Darüber hinaus wurde ein zusätzlicher Aufreinigungsschritt durch die Integration einer TEV-Protease-Schnittstelle zwischen den Transmembrandomänen und dem C-Terminus von LMP1 eingeführt. Mit diesem Verfahren wurde eine Reihe von neuen potenziellen Interaktionspartnern von LMP1 identifiziert. Von diesen konnten bereits zwei Proteine als LMP1 Interaktionspartner mit weiteren Methoden verifiziert werden, das Transmembranprotein CD48 und die Kinase TNIK. Der zweite Teil der Arbeit beleuchtet die Rolle der Protein-Tyrosin-Phosphatase SHP-1 in der Signaltransduktion von LMP1. Sie wurde in unserer Arbeitsgruppe als Interaktionskandidat von LMP1 identifiziert. Neben der Verifikation der Bindung gelang es in dieser Arbeit, die Interaktionsstelle von SHP-1 auf die beiden Tyrosine Y185 und Y186 von LMP1 zu kartieren. Damit wurde neben CTAR1 und CTAR2 ein weiteres, neues Bindemotiv von LMP1 entdeckt. Es konnte im Rahmen dieser Doktorarbeit gezeigt werden, dass LMP1 den NF-κB- und den Jak/STAT-Signalweg nicht nur induziert sondern durch die Interaktion von LMP1 mit SHP-1 diese Aktivierung regu-liert und begrenzt. LMP1 verfügt somit auch direkt auf der Ebene der Signaltransduktion über einen Me-chanismus, der seine eigene Aktivität moduliert.

LMP1 ist das Hauptonkogen des humanen DNA-Tumorvirus EBV (Epstein-Barr Virus). LMP1 ist essentiell für die Immortalisierung von B-Zellen durch das Virus. Darüber hinaus transformiert LMP1 Nagerfibroblasten in Kultur. LMP1 agiert wie ein konstitutiv aktives Rezeptormolekül in der Plasmamembran und induziert intrazelluläre Signaltransduktion durch die Bindung von Signalmolekülen der TNF-Rezeptor Familie. Die bekannten LMP1 Signalwege können die biologischen Funktionen von LMP1 jedoch nur teilweise erklären. In meiner Arbeit sollten daher neue Komponenten der LMP1 Signaltransduktion identifiziert werden. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit konnte TRAF6 als essentielles und spezifisches Signalmolekül für die Induktion von p38 MAPK durch LMP1 auf einem MKK6-abhängigen Signalweg identifiziert werden. In TRAF6 defizienten Maus-Fibroblasten ist eine signifikante p38 MAPK-Aktivierung durch LMP1 von der ektopischen Expression von TRAF6 abhängig. Darüber hinaus ist TRAF6 ebenfalls in der Aktivierung von NF-κB, jedoch nicht von JNK1/AP-1 durch LMP1 involviert. Das PxQxT-Motiv in CTAR1 ist zusammen mit Tyrosin 384 in CTAR2 essentiell für die Aktivierung des LMP1p38 MAPK-Signalweges. Dominant- negatives TRADD, das direkt an CTAR2 bindet, inhibiert die Induktion von p38 MAPK durch LMP1. Zusammengefaßt zeigen diese Ergebnisse zum ersten Mal eine Rolle von TRAF6 als essentielles Signalmolekül in der Signalkaskade eines transformierenden Onkogens, das unterhalb von TRADD und TRAF2 agiert. Im zweiten Teil meiner Arbeit konnte JNK2 als eine weitere, durch LMP1 induzierte MAPK in B-Zellen identifiziert werden. Im Zuge dieser Arbeit wurden dominant-negative Mutanten von JNK1 und JNK2 hergestellt, deren Expression eine Aktivierung von AP-1 durch LMP1 inhibieren und damit eine Rolle von JNK1 und 2 in der Induktion von AP-1 beweisen. In einem konditionalen LMP1-System in B-Zellen induzierte NGF-R:LMP1 die Degradation des p53 Proteins. Dieser Effekt ist spezifisch für p53, erfolgt innerhalb weniger Minuten und ist dominant über der p53-stabilisierenden Wirkung von UV-Strahlung. Somit konnte erstmals ein EBV-spezifischer Mechanismus aufgedeckt werden, der zu einer Deaktivierung des Tumorsuppressors p53 beitragen könnte.