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Wenn Krebszellen sich im Körper ausbreiten, können Tochtergeschwülste, sogenannte Metastasen, entstehen. Diese sind für etwa 90 Prozent der Todesfälle bei Krebspatienten verantwortlich. Ein wichtiger Ausbreitungsweg der Krebszellen verläuft über das Lymphgefässsystem, das, ähnlich wie das Blutgefässsystem, den ganzen Körper durchzieht und Lymphknoten miteinander verbindet. Bei der Wanderung von weißen Blutzellen durch dieses System, um beispielsweise die Abwehr von Krankheitserregern zu koordinieren, spielt ein spezielles Membranprotein, der Chemokin-Rezeptor 7 (CCR7), eine wichtige Rolle. Dieser sitzt in der Hülle der Zellen, der Zellmembran, und zwar so, dass er äussere Signale empfangen und diese in das Innere weiterleiten kann. Im Rahmen eines gemeinsamen Projekts mit dem Pharmaunternehmen F. Hoffmann-La Roche AG (Roche) haben Forschende des Paul Scherrer Instituts PSI erstmals die Struktur von CCR7 entschlüsseln und den Grundstein für die Entwicklung eines Medikaments legen können, das die Metastasierung bestimmter häufiger Krebsarten wie Darmkrebs verhindern könnte. In den Zellen aller Wirbeltiere kommen 20 verschiedene Chemokin-Rezeptoren vor, die mit mehr als 40 Signalproteinen, sogenannten Chemokinen, interagieren können. Jedes dieser Signalproteine passt nur zu ganz speziellen Rezeptoren. Bindet eines der Signalproteine an einen Rezeptor, löst das wiederum Prozesse innerhalb der Zelle aus, die zu einer spezifischen zellulären Antwort auf das Signal führt. Paul Scherrer Institut PSI/Christina Bonanati Lesen Sie den gesamten Beitrag auch auf MEDIZIN ASPEKTE Originalpublikation: Structural basis for allosteric ligand recognition in the human CC chemokine receptor 7 K. Jaeger, S. Bruenle, T. Weinert, W. Guba, J. Muehle1, T. Miyazaki, M. Weber, A. Furrer, N. Haenggi, T. Tetaz, C. Huang, D. Mattle, J.-M. Vonach, A. Gast, A. Kuglstatter, M.G. Rudolph, P. Nogly, J. Benz, R.J.P. Dawson, J. Standfuss Cell, 22. August 2019 (online) DOI: https://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2019.07.028

Proteine werden durch Gene kodiert und sind die Vermittler biologischer Strukturen und Prozesse. Veränderungen der Gene haben einen Einfluss auf die Struktur und Funktion der Proteine. Zur Erfüllung ihrer Aufgaben bilden Proteine über Protein-Protein-Interaktionen (PPI) Komplexe oder Funktionseinheiten. Diese zu kennen, ist wesentlich für das Verständnis der Funktion einzelner Proteine im Gesamtkontext und um den Einfluss von genetischer Variation auf die Proteinfunktion im Rahmen angeborener Erkrankungen besser einordnen zu können. Bislang werden PPI einerseits v.a. mit Hochdurchsatz-Verfahren untersucht, bei welchen die Proteine nicht in ihrer biologischen Umgebung exprimiert oder in denaturierter Form verwendet werden; dadurch ist häufig mit Artefakten zu rechnen. Andererseits erfordern die Verfahren zur in vivo-Untersuchung biologisch relevanter Interaktionen einen hohen Aufwand. Wir beschreiben in dieser Arbeit den Aufbau und die Etablierung eines Verfahrens zur in vivo Hochdurchsatz-Untersuchung von PPI. Dieses beruht auf der Technologie des Biolumineszenz Resonanzenergietransfers (BRET), welche durch Optimierung des Prozesses zu improved BRET (iBRET) hinsichtlich Effizienz, Durchsatz und Validität verbessert wurde. Dabei wurde die Konstrukt-Klonierung durch Einsatz eines auf Rekombination basierenden Klonierungssystems beschleunigt und Effizienz sowie Durchsatz der Transfektion von eukaryonten Zellen mit Hilfe eines Elektroporationsverfahrens im 96-Well Format optimiert. Bei der Detektion wurde ein Substrat verwendet, welches nur von lebenden Zellen verarbeitet werden kann. Die Signalmessungen erfolgten automatisiert an einem Multiwell Plattenlesegerät. Die Auswertung wurde durch eine bioinformatische Methode zur Berechnung von Schwellenwerten für positive Interaktionen verbessert. Mit dieser Technologie konnte die Homodimerisierung von PEX26 erstmals beschrieben und charakterisiert werden. PEX26 ist ein Membranprotein des Peroxisoms, das am Import von Matrixporteinen in das Peroxisom beteiligt ist. Bei genetischen PEX26-Defekten kommt es zum Auftreten von sog. peroxisomal ghosts – dies sind Membrankompartimente ohne Matrixinhalt. Klinisch kommt es v.a. zu Erkrankungen aus dem Zellweger-Spektrum, die sich mit einem unterschiedlichen Schweregrad manifestieren. Anhand von Trunkierungs-Konstrukten identifizierten wir mittels iBRET die zwei Interaktionsdomänen für die Homodimerisierung am C-Terminus des Proteins in der Umgebung der Transmembrandomäne bzw. in der peroxisomalen Matrix. Diese liegen abseits der für den Matrixprotein-Import essentiellen Bindedomäne für PEX6, der sich im zum Zytosol gerichteten N-terminalen Abschnitt von PEX26 befindet. Neben dem Volllängeprotein PEX26 wurde auch die Splice-Variante PEX26Δex5 beschrieben, welcher das Exon 5 und damit die Transmembrandomäne fehlt. Diese Variante ist im Endoplasmatischen Retikulum (ER) und im Zytoplasma lokalisiert. Wir zeigten, dass auch sie Homodimere bildet und zudem das Volllängeprotein PEX26 bindet. Sie ist in der Lage, das Fehlen von funktionellem PEX26 in PEX26-Defektzelllinien zu etwa 50% zu komplementieren, obwohl das Protein nicht am Peroxisom lokalisiert ist. Dies lässt die Schlussfolgerung zu, dass sich PEX26 für den Matrixprotein-Import nicht zwingend am Peroxisom befinden muss. Die physiologische Funktion der Splice-Variante ist noch nicht aufgeklärt. Mittlerweile ist bekannt, dass auch PEX26 anteilig im ER lokalisiert ist und es mehren sich die Hinweise, dass es aufgrund der Herkunft der Peroxisomen aus dem ER bei deren Biogenese und Homöostase eine Rolle spielt. Wir führten eine Literaturrecherche nach Interaktionspartnern von PEX26 und seinem homologen Protein Pex15p aus der Hefe durch, fanden hier jedoch keinen Hinweis auf weitere Funktionsbereiche von PEX26. Klar ist jedoch, dass sich die unterschiedliche Manifestation der Defekte bei den Patienten nicht allein aus seiner Rolle beim Import von Matrixporteinen ableiten lässt. Basierend auf der vorliegenden Arbeit könnten Erkenntnisse aus der derzeit in unserer Arbeitsgruppe umgesetzten Untersuchung des peroxisomalen Interaktoms zu einem besseren Verständnis der Funktion von PEX26 und der Fehlfunktion bei PEX26-Defekt beitragen.

Das Epstein-Barr Virus (EBV) ist mit einer Reihe von lebensbedrohlichen Krankheiten assoziiert. Dazu zählen unter anderem Nasopharynxkarzinome, Hodgkin-Lymphome und lymphoproliferative Erkrankungen nach Organtransplantationen. Dennoch gibt es bisher keinen wirksamen Therapieansatz, der sich spezifisch mit der Rolle von EBV in diesen malignen Erkrankungen auseinandersetzt. Das latente Membranprotein 1 (LMP1) ist das primäre Onkogen von EBV und essenziell für die Transformation von B-Zellen durch das Virus. Für eine effiziente Transformation von Zellen ist die Aktivierung verschiedener zellulärer Signalwege durch LMP1 notwendig. LMP1 besitzt jedoch keine enzymatische Aktivität und die Induktion der Signalwege ist somit abhängig von der Rekrutierung verschiedener zellulärer Adapterproteine. Die Ausbildung der notwendigen Signalkomplexe wird über zwei C-terminale Aktivierungs-Regionen (CTAR1 und CTAR2) vermittelt. Verschiedene Mitglieder der Tumornekrosefaktor (TNF)-Rezeptor-assoziierten Faktoren (TRAF)-Protein-Familie spielen bei der Induktion der Signalwege durch diese beiden CTAR-Domänen eine zentrale Rolle. Nach grundlegenden Protein-Protein-Interaktionsstudien zwischen LMP1 und rekombinanten TRAF-Proteinen wurde hier die Interaktion zwischen TRAF2 und LMP1 als Zielstruktur für Inhibitoren vorgestellt. TRAF2 ist essenziell für die Aktivierung des NF-κB-Signalweges durch die CTAR1-Domäne und somit für das Überleben EBV-transformierter Zellen. Die Bindung von TRAF2 an LMP1 wurde biochemisch näher charakterisiert und die gewonnen Erkenntnisse verwendet, um ein System zu etablieren, mit dem Inhibitoren gegen den Komplex aus LMP1 und TRAF2 identifiziert werden können. Dieses ELISA-basierte System erfüllt die Anforderungen, die allgemein an hochdurchsatzfähige Systeme gestellt werden. In einem Pilotscreen einer Bibliothek mit Naturstoffen wurden Substanzen identifiziert, die die Bindung von TRAF2 an LMP1 in vitro inhibierten. Die potenteste Substanz inhibierte die Interaktion von TRAF2 und LMP1 mit einem IC50 von 8 µM in diesen in vitro Studien. Weiterhin zeigte diese Substanz eine spezifische biologische Wirkung auf die Vitalität von EBV-transformierten B-Zellen. Zusätzlich konnte in den Protein-Protein-Interaktionsstudien zwischen den verschiedenen TRAF-Proteinen und LMP1 erstmals eine direkte Bindung von TRAF6 an LMP1 gezeigt werden. Entgegen der bisherigen Modellvorstellung, nach der TRAF6 indirekt über Adapterproteine an LMP1 gebunden wird, konnte hier gezeigt werden, dass TRAF6 direkt an die LMP1-Sequenz P379VQLSY innerhalb der CTAR2-Domäne bindet. Diese Sequenz ist essenziell für die Aktivierung verschiedener TRAF6-abhängiger Signalwege durch die CTAR2-Domäne. Auf der Oberfläche von TRAF6 wird die Bindung an LMP1 durch dieselbe Bindetasche vermittelt, über die auch die Interaktion mit zellulären Rezeptoren stattfindet. Diese direkte Interaktion zwischen LMP1 und TRAF6 ist wichtig für die Aktivierung des NF κB-Signalweges durch die CTAR2-Domäne. TRAF6-Mutanten, die nicht mehr in der Lage waren, mit LMP1 zu interagieren, waren ebenfalls nicht mehr dazu fähig, die Induktion von NF κB-Signalen durch die CTAR2-Domäne von LMP1 in embryonalen TRAF6-/- Mausfibroblasten wiederherzustellen. Ebenfalls konnte neben der direkten Bindung von TRAF6 an LMP1 hier eine weitere neue Protein-Protein-Interaktion für TRAF6 beschrieben werden. TRAF6 bindet direkt an das TNF-Rezeptor-assoziierte Todesdomänenprotein (TRADD). Die Interaktion zwischen TRAF6 und TRADD unterscheidet sich jedoch von der Bindung anderer TRAF-Proteine an TRADD. Die in vitro Studien zeigten, dass TRAF6 in der Lage ist, sowohl mit Teilen des N-Terminus, als auch mit Teilen des C-Terminus von TRADD zu interagieren. Diese bisher nicht beschriebene Art der direkten Interaktion von TRAF6 mit TRADD eröffnet neue Einblicke in den Aufbau des LMP1-Signalkomplexes.

Herpesviren umfassen eine große Gruppe von human- sowie tierpathogenen Erregern. Auf Grund ihrer hohen Durchseuchungsrate und Fähigkeit zur Etablierung einer latenten Infektion stellen humane Herpesviren vor allem für immunsupprimierte Patienten eine ernsthafte Bedrohung dar. Deshalb ist eine umfassende Aufklärung des viralen Replikationszyklus für die Entwicklung von antiviralen Therapiestrategien zwingend erforderlich. Besonders die membran-assoziierten Vorgänge der Virionmorphogenese - primäre Umhüllung an der inneren Kernmembran mit darauffolgendem Verlust der Virushülle an der äußeren Kernmembran sowie sekundäre Umhüllung an cytoplasmatischen Membranen - sind nur unvollständig entschlüsselt. Um das komplexe Zusammenspiel der viralen Proteine während des Replikationszyklus an den verschiedenen zellulären Membranen aufzudecken, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine genomweite Analyse der Protein-Protein-Interaktion (PPI) der durch Herpes simplex-Virus 1 (HSV-1) kodierten Membranproteine durchgeführt. Außerdem lieferte die Identifizierung von PPI zwischen dem HSV-1 Proteom und Untereinheiten der zellulären ESCRT-Maschinerie (endosomal sortingcomplex required for transport) weitere Belege für die Ausbeutung von Wirtsfaktoren durch das Virus zur Knospung der Partikel. Zur Detektion der genomweiten PPI sowohl intraviral als auch zwischen Virus und Wirt wurde das Hefe-2-Hybridsystem (Y2H) im Hochdurchsatz angewandt. Beide Datensätze konnten eine Vielzahl neuer PPI aufdecken und somit eine solide Grundlage für Interaktionsnetzwerke und zukünftige funktionale Studien schaffen. Auch wurde duch das breite Interaktionsspektrum des Virus mit den z.T. funktionell redundanten ESCRT-Proteinen erneut veranschaulicht, wie die Nutzung flexibler Strategien zur Stabilität des HSV-1 beiträgt. Anhand der Y2H-Analysen wurde ein virales Membranprotein als interessanter Kandidat zur funktionalen Charakterisierung ausgewählt. Glykoprotein M (gM/UL10) von HSV-1 ist ein Typ-III Transmembranprotein, das während der Infektion in verschiedenen Membrankompartimenten lokalisiert. Obwohl evolutionär konserviert, ist es zumindest für HSV-1 nicht-essenziell und seine molekulare Funktion unklar. Auch die funktionale Relevanz einiger potenzieller trafficking Motive von gM ist noch nicht aufgeklärt. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass das targeting von gM zum trans-Golgi Netzwerk (TGN) unabhängig von anderen viralen Faktoren sowie seinen potenziellen C terminalen trafficking Motiven erfolgt und keiner Homooligomerisierung bedarf. Erstaunlicherweise führt die Deletion der C-terminalen Domäne von gM (gMΔC) zu seiner Retention im ER, wohingegen der Vorwärtstransport durch eine kurze, nicht-verwandte Sequenz wiederhergestellt wurde. Demzufolge enthält die C-terminale Domäne von gM wahrscheinlich keine Sequenzinformation für das targeting vom ER zum Golgi-Apparat, jedoch scheint die Faltung und Integrität des Proteins dafür von Bedeutung zu sein. Im Kontext der Virusinfektion führte die Deletion der C-terminalen Domäne von gM (HSV-1 gMΔC) zur Akkumulation von nicht-umhüllten Partikeln im Cytoplasma, verminderter Freisetzung von Viruspartikeln und in ihrer Infektiosität beeinträchtigten reifen Virionen. Alle Effekte wurden durch eine Revertante wieder aufgehoben und sind demnach spezifisch. Im Gegensatz dazu zeigten zwei zusätzliche Mutanten, HSV-1 ΔgM mit einem frühzeitigen Stoppcodon an Position 3 von UL10 und gMΔac ohne potenzielle trafficking Motive, Wildtyp-ähnliche Wachstumskinetiken. Daraus lässt sich schließen, dass zwar gM entbehrlich ist, gMΔC jedoch einen dominant-negativen Effekt ausübt. Daher wird eine Beteiligung der N-terminalen Bereiche von gM (Aminosäuren 1-361) an der Rekrutierung von viralen und/oder zellulären Faktoren zum Ort der sekundären Umhüllung postuliert. Diese Daten enthüllen neue unbekannte Eigenschaften von HSV-1 gM.

Fri, 22 Oct 2010 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/12275/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/12275/1/Medele_Stephanie.pdf Medele, Stephanie ddc:570, ddc:500, Fakultät f

Mitglieder der evolutionär konservierten Oxa-Proteinfamilie wirken an der korrekten Insertion von integralen Membranproteinen in Bakterien, Mitochondrien und Chloroplasten mit. In den sehr proteinreichen Thylakoidmembranen der Chloroplasten höherer Pflanzen spielt das Oxa-Homolog Alb3 eine essentielle Rolle bei der Integration von LHC-Proteinen und weiteren Komponenten des Photosynthese-Apparates. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein weiteres Protein aus Arabidopsis identifiziert und als neues Mitglied der Oxa-Proteinfamilie beschrieben. Die experimentell gestützte Annotation zeigt, dass das Alb4-Protein eine zentrale 60KD_IMP-Domäne besitzt, welche für die Oxa-Proteine charakteristisch ist. Die Zugehörigkeit zur Oxa-Proteinfamilie konnte funktionell durch die Komplementation einer Hefe-oxa1-Mutante bestätigt werden. Immunologische und fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen konnten weiterhin zeigen, dass es sich bei Alb4 um ein chloroplastidäres Protein handelt, welches als integrales Membranprotein in den Thylakoiden lokalisiert ist. Durch die Analyse von T-DNA-Insertions- und RNAi-Linien konnte gezeigt werden, dass eine Reduktion des Alb4-Gehaltes zu vergrößerten und nicht länger linsenförmigen Chloroplasten führt, in denen die Thylakoidmembranen aufgelockerter erscheinen. Ein Verlust der Lebensfähigkeit konnte jedoch nicht beobachtet werden, selbst wenn der Alb4-Gehalt in den Chloroplasten der Pflanzen um mehr als 90% reduziert war. Im Vergleich zu Cyanobakterien besitzt die Thylakoidmembran von Arabidopsis mit Alb4 und Alb3 gleich zwei Oxa-Homologe. Möglicherweise ist nach der Umwandlung des cyanobakteriellen Endosymbionten zu einem eukaryotischen Organell diese Duplizierung nötig geworden, um sowohl die Ausbildung als auch den Erhalt der Thylakoidstruktur zu gewährleisten. Zusätzlich zur Identifizierung von Alb4 konnte durch Transkript-Analysen desweiteren gezeigt werden, dass auch der N-Terminale Teil des ehemaligen Genmodells F21J9.13 (Artemis, nun Alb4 und RWK1) für ein eigenständiges Gen kodiert. Das abgeleitete Protein aus dem N-terminalen Teil, RWK1, ähnelt dem Rezeptor-Teil von pflanzlichen Rezeptor-Kinasen, eine entsprechende Kinase-Domäne fehlt jedoch vollständig. RWK1 kommt in zwei Spleißvarianten vor, der für die meisten eukaryotischen mRNAs typische polyA-Schwanz fehlt jedoch beiden Varianten. RWK1 könnte als neuartiger Rezeptor ein weiteres Glied in der internen Kommunikationskette der Zelle bilden.

BRUCE (BIR repeat-containing ubiquitin-conjugating enzyme) ist ein konserviertes, 528 kDa großes, peripheres Membranprotein des trans-Golgi-Netzwerks und ein strukturell neuartiges Ubiquitin-Konjugationsenzym (UBC) der Maus. Zusätzlich zu der am C-Terminus befindlichen UBC-Domäne enthält BRUCE im N-terminalen Bereich ein BIR (baculovirus inhibitor of apoptosis repeat)-Motiv, die charakteristische Domäne aller BIRPs (BIR-domain containing proteins). Die meisten dieser Proteine haben anti-apoptotische Eigenschaften und werden deshalb in der IAP (inhibitor of apoptosis proteins)-Familie zusammengefasst. Auch BRUCE konnte in vitro als Inhibitor apoptotischer Prozesse beschrieben werden. Um die Funktion von BRUCE in vivo zu untersuchen, wurde eine BRUCE-defiziente Mauslinie etabliert und im Rahmen dieser Arbeit phänotypisch charakterisiert. Die vollständige Inaktivierung des BRUCE-Gens führte zu einer Verzögerung des embryonalen Wachstums sowie zum perinatalen Tod der Knockout-Organismen. BRUCE wird in fast allen embryonalen Geweben exprimiert, deutlich sichtbare morphologische Veränderungen in Folge seiner Deletion traten jedoch hauptsächlich im extra-embryonalen Gewebe der Plazenta auf. Nach störungs-freier Initiierung der Organogenese zeigte sich mit zunehmender Reifung der Plazenta eine Verzögerung der Ausbildung des Labyrinthsystems sowie eine deutliche Reduktion der Spongiotrophoblast-Schicht. Dieses Entwicklungsdefizit kann Ursache einer stark eingeschränkten Effizienz der Nähr- und Sauerstoffversorgung des Embryos sein und sowohl zu Wachstumsretardierung als auch zu perinataler Letalität der transgenen Organismen führen. Die morphologischen Veränderungen im Gewebe wurden nicht, wie ursprünglich angenommen, durch eine erhöhte Apoptoserate der Zellen hervorgerufen. Stattdessen konnten in den defekten plazentalen Geweben drastische Veränderungen in Proliferationsverhalten und Differenzierungsstatus der Trophoblast-Zellen beobachtet werden. Die in dieser Arbeit beschriebenen Auswirkungen des BRUCE-Verlusts auf den Modellorganismus zeigen einerseits die essentielle Bedeutung von BRUCE für die Entwicklung sowie den funktionellen Erhalt der Plazenta und damit für die gesamte Embryonalentwicklung der Maus. Andererseits geben die Ergebnisse Hinweise darauf, dass dieses ungewöhnliche Enzym möglicherweise eine überlebensnotwendige regulative Funktion der Inhibition Apoptose-induzierter oder nicht-apoptotischer Caspase-Aktivität bei Proliferations- und/oder Differenzierungs-ereignissen bestimmter Zelltypen besitzt.

Der programmierte Zelltod, oder Apoptose, ist ein physiologischer Vorgang mit zentraler Bedeutung für die Entwicklung und Homöostase mehrzelliger Organismen. Die Auslösung der Apoptose führt zur Aktivierung von Caspasen. Dies sind Cysteinproteasen, die gezielte Substratproteine spalten und so die koordinierte Zerstörung der Zelle herbeiführen. Apoptose wird durch pro- und antiapoptotische Proteine reguliert, die die Aktivierung von Caspasen stimulieren bzw. unterdrücken. Da diese Proteine sich gegenseitig beeinflussen, wird das Schicksal einer Zelle durch die relative Aktivität pro- und antiapoptotischer Faktoren bestimmt. BRUCE (BIR repeat-containing ubiquitin-conjugating enzyme) ist ein konserviertes, 528 kDa großes, peripheres Membranprotein des trans-Golgi Netzwerks. Seine charakteristischen Merkmale sind eine N-terminale BIR-Domäne und eine C-terminale UBC-Domäne, die dem Molekül Ubiquitin-Konjugationsaktivität verleiht. Diese Arbeit demonstriert, dass BRUCE Zellen vor der Apoptose schützt und als ein inhibitor of apoptosis protein (IAP) wirkt, indem es an aktive Caspasen bindet und diese inhibiert. Die Verwendung von Wildtyp und Mutanten des BRUCE Proteins zeigt, dass diese Aktivitäten von der BIR-Domäne abhängen. Während der Apoptose wird BRUCE durch unterschiedliche Mechanismen blockiert. Zum einen wird BRUCE durch Caspasen und HtrA2 proteolytisch gespalten und dadurch inaktiviert. Zum anderen bindet der mitochondriale IAP-Antagonist Smac an die BIR-Domäne von BRUCE und unterdrückt dessen Caspase-inhibitorische Aktivität, indem es die Bindung von BRUCE an Caspasen verhindert. Aufgrund seiner Lokalisierung an Membranen des trans-Golgi Netzwerks könnte BRUCE ein spezialisiertes, antiapoptotisches Protein mit räumlich begrenzter Aktivität sein. Wie die stark negative Regulation verdeutlicht, scheint außerdem die Entfernung von BRUCE aus der Zelle während der Apoptose wichtig zu sein. Räumlich und zeitlich begrenzte Inhibition von Caspasen während der Apoptose könnte daher für einen geordneten Ablauf apoptotischer Prozesse, wie zum Beispiel den Abbau des Golgi-Apparates und seine Verpackung in apoptotische Vesikel, notwendig sein.

Die Innenmembran von Mitochondrien besitzt zwei Translokasen für den Import von Proteinen. Der TIM23-Komplex vermittelt die Translokation über und in die Innenmembran, der TIM22-Komplex inseriert Proteine mit mehreren hydrophoben Segmenten in die Innenmembran. Im Rahmen dieser Arbeit sollten Komponenten dieser Translokationsmaschinerien in N. crassa und S. cerevisiae identifiziert und charakterisiert werden. In N. crassa waren zu Beginn der Arbeit im Vergleich zu S. cerevisiae nur wenige Komponenten der TIM-Translokasen bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden die Proteine Tim22, Tim54 und Tim44 in N. crassa identifiziert. Dies wurde entweder durch die Verwendung degenerierter Primer in PCR-Reaktionen mit cDNA aus N. crassa oder durch Durchmustern von Datenbanken erreicht. Die identifizierten Proteine des TIM22-Komplexes wurden bezüglich ihrer Lokalisation und Topologie untersucht. Es handelt sich bei Tim22 um ein Membranprotein der inneren mitochondrialen Membran mit vier Transmembranhelices, das sowohl den N- als auch den C-Terminus in den Intermembranraum exponiert. Tim54 ist ebenso in der inneren mitochondrialen Membran lokalisiert und besitzt nur eine Transmembranhelix. Der größte Teil des Proteins liegt im Intermembranraum, nur wenige Aminosäurereste befinden sich in der mitochondrialen Matrix. Ferner wurde der TIM22-Komplex von N. crassa charakterisiert. Dazu zählten die Untersuchungen der beteiligten Komponenten, der Komplexgröße und der Stabilität des Komplexes. In N. crassa besteht der TIM22-Komplex aus den Komponenten Tim22, Tim54, Tim9 und Tim10, die einen etwa 350 kDa großen Komplex bilden. Für spätere funktionelle Untersuchungen wurde der TIM22-Komplex bzw. Tim22 alleine gereinigt. Beides wurde in Lipidvesikel rekonstituiert. Dieses Verfahren bietet die Grundlage für Untersuchungen in einem definierten experimentellen System, wie Proteine der Carrier-Familie in Lipidmembranen inseriert werden. In S. cerevisiae wurde mit Tim16 eine neue Komponente des mitochondrialen Importmotors des TIM23-Komplexes identifiziert. Dies konnte durch Koreinigung mit einer weiteren Komponente des Importmotors, Tim14, erreicht werden. Die strukturelle Vorhersage für Tim16 ähnelt stark der des J-Proteins Tim14. Tim16 fehlt allerdings das für die Funktion von J-Proteinen essentielle HPD-Motiv. Tim16 ist in der mitochondrialen Matrix lokalisiert und peripher mit der inneren mitochondrialen Membran assoziiert. Durch Depletion von Tim16 wird der Import von Substraten in Mitochondrien beeinträchtigt, die vom mitochondrialen Importmotor abhängig sind. Durch Koimmunopräzipitationen und Quervernetzungsexperimente wurde Tim16 als neue Komponente des mitochondrialen Importmotors der TIM23-Translokase definiert. Funktionell spielt Tim16 eine große Rolle für die Integrität des Importmotors. Die genaue Struktur des Importmotors, seine Regulation und dessen Dynamik im Zuge der Translokation von Präproteinen muss in zukünftigen Experimenten geklärt werden.

Im Rahmen dieser Arbeit konnte in Saccharomyces cerevisiae ein neuer Translokationsapparat der mitochondrialen Außenmembran identifiziert werden, der TOB-Komplex (topogenesis of mitochondrial outer membrane beta-barrel proteins). Dieser wird für den Import und die Insertion von mitochondrialen beta-Barrel-Proteinen, wie Porin und Tom40, benötigt. In Eukaryoten kommen beta-Barrel-Membranproteine nur in der Außenmembran von Mitochondrien und Chloroplasten vor; in Prokaryoten nur in der Außenmembran von Gram-negativen Bakterien. Die essenzielle Untereinheit des TOB-Komplexes ist Tob55, das in allen eukaryotischen Genomen präsent ist, aber auch in allen Gram-negativen Bakterien Homologe aufweist. Der TOB-Komplex weist eine molekulare Masse von 220-250 kDa auf und enthält neben Tob55 das nicht-essenzielle Protein Mas37. Dieses ist als peripheres Membranprotein auf der Außenseite der Außenmembran lokalisiert. Die Funktion von Mas37 ist unklar, eine stabilisierende Wirkung auf den TOB-Komplex erscheint möglich. Der TOB-Komplex enthält einen ionenleitenden Kanal. Elektronenmikroskopische Aufnahmen weisen zylindrische Partikel mit einem Durchmesser von 15 nm auf, die eine Kavität von 7-8 nm Durchmesser enthalten. Zusätzlich scheint diese eine zentrale Masse zu enthalten, die möglicherweise von der löslichen N-terminalen Domäne von Tob55 gebildet wird. Diese könnte eine Funktion bei der Regulation des Kanalzugangs ausüben. Tob55 wird von dem offenen Leserahmen YNL026w kodiert und ist ein integrales beta-Barrel-Außenmembranprotein. Die N-terminale Domäne ist im Intermembranraum lokalisiert, während der C-terminale Bereich die membranintegrierte beta-Barrel-Struktur ausbildet. Tob55 ist ein essenzielles Protein für S. cerevisiae und ist somit neben Tom40 das zweite essenzielle Außenmembranprotein. Depletion von Tob55 in vivo führt zum spezifischen Verlust der mitochondrialen beta-Barrel-Membranproteine Porin, Tom40 und Mdm10. Mdm10 konnte als neues mitochondriales beta-Barrel-Protein identifiziert werden. Außenmembranproteine die durch alpha-Helices verankert sind, waren bei der Depletion von Tob55 nicht beeinträchtigt. Tob55 ist für den Import der beta-Barrel-Membranproteine essenziell. Es interagiert mit frühen Importintermediaten der beta-Barrel-Vorstufen, nicht jedoch mit assemblierten beta-Barrel-Proteinen. Vor Interaktion mit Tob55 müssen die beta-Barrel-Vorstufen zuvor mittels des TOM-Komplexes die Außenmembran überqueren. Interaktion der TOM-assoziierten beta-Barrel-Vorstufen mit Tob55 ist für die vollständige Translokation über den TOM-Komplex notwendig. Ein lösliches Intermediat im Intermembranraum scheint nicht vorzukommen. Anschließend erfolgt die Tob55-vermittelte Insertion von der Innenseite der Außenmembran in die Lipidschicht. Ob der TOB-Komplex aktiv an der Faltung der beta-Barrel-Vorstufen in eine insertionskompetente Konformation beteiligt ist oder die Ausbildung der beta-Barrel-Struktur innerhalb der TOB-Kavität stattfindet, ist bisher nicht bekannt. Da Mitochondrien von einem endosymbiotischen bakteriellen Vorläufer abstammen, haben sich offenbar essenzielle Elemente des Biogeneseapparates von beta-Barrel-Membranproteinen während der Evolution erhalten.

Epstein-Barr Virus (EBV) infiziert ruhende primäre humane B-Zellen und induziert deren unbegrenzte Proliferation. Dieser Prozess der B-Zell-Immortalisation ist ein Modellsystem, das die pathogenetischen Mechanismen bei der Tumorentstehung widerspiegelt. In vitro gilt das virale latente Membranprotein 1 (LMP1) für die Immortalisation von B-Zellen als essentiell. LMP1 ist ein integrales Membranprotein, das als konstitutiv aktivierter Pseudorezeptor verschiedene Signalwege in der B-Zelle induziert und dabei analoge Funktionen zum zellulären CD40-Rezeptor wahrnimmt. Das Genom des EBV ist in dem Maxi-EBV-System einer genetischen Manipulation zugänglich. Zuerst habe ich verschiedene Mutanten des LMP1 Gens im Kontext des EBVGenoms etabliert und auf ihren Phänotyp untersucht. Überraschenderweise war es möglich, mit allen LMP1 mutierten EBVs proliferierende B-Zellklone zu generieren, dies gelang sogar mit einer „knock out“ Mutante des kompletten LMP1 Gens. Die zehn verschiedenen LMP1- Mutanten unterschieden sich gravierend in ihrer Effizienz, B-Zellen zu immortalisieren. So wurden bis zu 100 mal mehr Virionen benötigt, um z.B. mit der LMP1-„knock out“-Mutante proliferierende B-Zellklone zu etablieren. Eine solche B-Zelllinie wies in einem in vivo Experiment mit SCID-Mäusen im Gegensatz zu B-Zelllinien mit Wildtypvirus kein onkogenes Potential auf. Im Widerspruch zu den bisherigen Veröffentlichungen einer anderen Gruppe zeigen meine Ergebnisse, dass LMP1 für den Prozess der B-Zell-Immortalisation in vitro zwar kritisch, aber nicht zwingend notwendig ist. Für die Onkogenität von EBV in vivo ist LMP1 dagegen absolut essentiell. Die Zielgene des LMP1, die die verschiedenen Effekte wie B-Zell-Immortalisation, Onkogenität und Tumorentstehung vermitteln, sind nicht vollständig bekannt. Ein zweites Ziel dieser Arbeit war deshalb die umfassende Katalogisierung dieser Zielgene. Da LMP1 und der CD40-Rezeptor analoge Funktionen und gemeinsame Signalmediatoren und -wege aufweisen, sollten vergleichende Untersuchungen von LMP1- und CD40-regulierten Genen durchgeführt werden. Zu diesem Zweck wurde ein konditionales LMP1-System in humanen B-Zellen etabliert, das es erlaubt, LMP1-Signaltransduktion innerhalb eines sehr kurzen, definierten Zeitraums zu induzieren und differentiell exprimierte Gene zu identifizieren. Da der CD40-Rezeptor auf humanen B-Zellen konstitutiv exprimiert ist und durch Interaktion mit seinem Liganden aktiviert werden kann, konnte die Analyse CD40-regulierter Zielgene im selben Zellsystem erfolgen. Unter Anwendung von ATLAS Array-Filtern und Affymetrix Chips wurden 144 LMP1- und 28 CD40-regulierte Gene identifiziert. Schließlich konnte in Zellzyklusanalysen gezeigt werden, dass LMP1-Signale in humanen B-Zellen echte proliferative Effekte vermitteln und nicht nur anti-apoptotische Funktionen erfüllen.

Die X-chromosomal gebundene Adrenoleukodystrophie stellt eine vererbte Störung der peroxisomalen ß-Oxidation von Fettsäuren dar, die zu einer Akkumulation von überlangkettigen Fettsäuren in allen Körperflüssigkeiten führt. X-ALD wird durch Mutationen im ALD-Gen verursacht, welches ein peroxisomales Membranprotein aus der Superfamilie der ABCTransporter (ATP-binding cassette) kodiert. Die Erkrankung führt zu einer fortschreitenden Demyelinisierung des ZNS, einer peripheren Neuropathie sowie adrenokortikaler Insuffizienz. Es findet sich jedoch eine sehr hohe Variabilität phänotypischer Verlaufsformen. Aus bislang unklaren Gründen zeigt ein Großteil der heterozygoten Überträgerinnen - im Gegensatz zu der überwiegenden Mehrzahl anderer X-chromosomal vererbter Erkrankungen - sowohl die biochemischen als auch die klinischen Merkmale einer X-ALD in abgemilderter Form. Zur Erklärung dieses Phänomens sollte die Untersuchung der X-Inaktivierung heterozygoter Überträgerinnen beitragen, da in der Vergangenheit postuliert wurde, daß eine zugunsten des mutierten ALD-Allels verschobene X-Inaktivierung (mit-)verantwortlich sei für das Auftreten erhöhter Konzentrationen überlangkettiger Fettsäuren und neurologischer Symptome bei ALDÜberträgerinnen. Zur Untersuchung der X-Inaktivierung wurde der hochinformative Androgenrezeptor-Test etabliert und in einigen Punkten modifiziert und verbessert. Das Testprinzip beruht auf der PCRAmplifikation eines hochpolymorphen CAG-Repeats im Exon 1 des Androgenrezeptor-Gens nach einer Inkubation von genomischer DNA mit methylierungssensitiven Restriktionsenzymen. Die Verwendung eines fluoreszenz-markierten Primers in der PCR ermöglichte eine präzise automatisierte Auswertung mittels Fragmentanalyse. Neben einer Bestimmung der überlangkettigen Fettsäuren im Plasma wurde der Heterozygotenstatus der ALD-Überträgerinnen durch eine Mutationsanalyse des ALD-Gens eindeutig belegt. Dabei konnten in allen 15 untersuchten Familien Mutationen im ALD-Gen identifiziert werden. Bei 8 Familien fanden sich neue, bislang unveröffentlichte Mutationen. Das Mutationsspektrum umfaßte 10 Missense- (67 %), zwei Nonsense- (13 %), zwei Splice-Site- Mutationen (13 %) und eine Frameshift-Mutation (6 %). Die X-Inaktivierungsmuster in Leukozyten heterozygoter ALD-Überträgerinnen wurden erstmals im Vergleich zu einem verwandten und einem nicht-verwandten Kontrollkollektiv untersucht. Bei 7 von 22 Überträgerinnen (32 %) zeigte sich eine ausgeprägte Verschiebung der X-Inaktivierung (Skewing) zugunsten eines Allels (> 80:100). Im Gegensatz dazu war ein ausgeprägtes Skewing weder bei den Nicht-Überträgerinnen aus ALD-Familien noch bei den Kontrollen zu beobachten. In diesen Gruppen fanden sich nur random X-Inaktivierung und mildes Skewing zu annähernd gleichen Teilen. Bei beiden Gruppen glich die Verteilung der XInaktivierungsmuster einer Gauss’schen Normalverteilungskurve. Die Unterschiede zwischen ALD-Überträgerinnen und unverwandtem Kontrollkollektiv erwiesen sich als statistisch hochsignifikant. Eine Korrelation zwischen dem Grad der X-Inaktivierung in Leukozyten heterozygoter ALDÜberträgerinnen und deren biochemischen Parametern (Konzentration überlangkettiger Fettsäuren im Plasma) war nicht nachweisbar. Unsere Daten belegen, daß das häufige Auftreten einer Verschiebung der X-Inaktivierung zugunsten eines Allels bei ALD-Überträgerinnen mit dem mutierten ALD-Allel in Zusammenhang steht und wahrscheinlich durch Selektionsmechanismen verursacht wird. Diese Selektionsmechanismen wirken nach dem primären X-Inaktivierungsprozeß. Andere sekundäre Einflußvariablen wie Alter oder genetische Faktoren des X-Inaktivierungsprozesses selbst wurden mit hoher Wahrscheinlichkeit ausgeschlossen. Anhand von Transkriptanalysen in kultivierten Fibroblasten konnte darüberhinaus gezeigt werden, daß einerseits eine Selektion zugunsten des Wildtyp-Allels, andererseits jedoch auch eine Selektion zugunsten des mutierten Allels vorkommt. Der bislang in der Literatur postulierte Selektionsvorteil des mutierten ALD-Allels wird somit in Frage gestellt.