Podcasts about onkogen

Es gibt zahlreiche Bemühungen, neue Immuntherapien zur Behandlung von malignen Tumoren zu entwickeln, da die Prognose vieler Krebserkrankungen immer noch schlecht ist. Dazu muss das Verständnis, wie die verschiedenen Immunzellen innerhalb des Tumormilieus miteinander interagieren, verbessert werden. Mausmodelle für Spontantumoren spiegeln die klinische Situation besser wider als transplantierbare Tumoren und stellen somit eine gute Möglichkeit dar, die während der Tumorentwicklung stattfindenden Immunreaktionen zu analysieren. In der vorliegenden Dissertation wurde mit Mäusen gearbeitet, in deren B-Zellen das Onkogen c-MYC konstitutiv exprimiert wird und die nach einigen Wochen spontan B-Zell-Lymphome entwickeln. Frühere Arbeiten haben bereits gezeigt, dass natürliche Killerzellen (NK-Zellen) aus c-MYC-Tumoren im Vergleich zu Organen aus Wildtyp (wt)-Mäusen kaum Interferon-gamma (IFN-) produzierten und die Fähigkeit, Zielzellen zu töten, stark reduziert war. Dementsprechend sezernierten Tumor-infiltrierende dendritische Zellen (TIDZ) geringere Mengen Interleukin-12 (IL-12), das für die Induktion einer Th1 (T-Helferzelle 1) / ZTL (zytotoxischer T-Lymphozyt)-Antwort essenziell ist, aber vermehrt das immuninhibierende Zytokin IL-10. Für die Aktivierung von naiven T-Zellen ist die Hilfe von NK-Zellen und DZ notwendig, die in c-MYC-Mäusen offenbar nicht gegeben war. Es wurde daher erwartet, dass intratumorale T-Zellen nicht bzw. nur ungenügend aktiviert werden. Überraschenderweise wiesen Tumor-infiltrierende T-Zellen jedoch einen aktivierten Phänotyp auf, zeigten zum Teil sogar eine erhöhte IFN--Produktion, konnten degranulieren und proliferierten in vivo. Trotzdem übernahmen intratumorale T-Zellen im Gegensatz zu NK-Zellen keine immunüberwachende Funktion über die Lymphomentstehung, da c-MYC-Mäuse nach Depletion der T-Zell-Population nicht früher erkrankten als unbehandelte Tiere. Offenbar wurden T-Zellen in c-MYC-Tumoren Antigen-spezifisch aktiviert, was dazu führte, dass sie aufgrund der langanhaltenden Stimulation in einen Erschöpfungszustand geraten sind. Dies spiegelte sich in einer hohen Expression des Erschöpfungsmarkers PD-1 (Programmed Cell Death 1) wider. Die Interaktion des koinhibitorischen Rezeptors PD-1 mit dem entsprechenden Liganden PD-L1, der vor allem auf DZ in c-MYC-Tumoren detektiert wurde, führt in T-Effektorzellen zur Inhibierung des aktivierenden T-Zell-Rezeptor (TZR)-Signals. So konnten T-Zellen aus c-MYC-Tumoren im Vergleich zu T-Zellen aus normalen Mäusen in vitro über den TZR tatsächlich nicht mehr stimuliert werden, was ebenfalls für eine Erschöpfung sprach. Zudem exprimierten intratumorale T-Zellen neben PD-1 die koinhibitorischen Moleküle CTLA-4 (Cytotoxic T-Lymphocyte-Associated Antigen 4) und LAG-3 (Lymphocyte Activation Gene 3). Die Stimulierbarkeit der T-Zellen in vitro konnte durch Zugabe blockierender Antikörper (AK) gegen PD-1 und CTLA-4 verbessert werden. Aufgrund dieser Beobachtung wurden junge, noch gesunde c-MYC-Mäuse mit diesen AK behandelt. Durch die PD-1/CTLA-4-Blockade in vivo zeigten die Tiere ein signifikant verlängertes Überleben. Neben CD4+ T-Helferzellen und CD8+ zytotoxischen T-Lymphozyten wurde in c-MYC-Tumoren innerhalb der CD4+ T-Zellpopulation ein sehr hoher Anteil Foxp3+ regulatorischer T-Zellen (Treg) detektiert. Diese waren aktiviert, proliferierten in vivo und produzierten IL-10. Die koinhibitorischen Moleküle, welche auch auf erschöpften T-Zellen zu finden waren (PD-1, LAG-3 und CTLA-4), wurden ebenfalls von Treg exprimiert, was bekanntlich zur Verstärkung ihrer suppressiven Aktivität führt. Es wurden vor allem Helios-exprimierende natürliche Treg (nTreg) detektiert. Doch auch IL-10-produzierende, regulatorische Foxp3- Tr1-Zellen (T Regulatory Type 1 Zelle), die zu den induzierten Treg (iTreg) zählen, waren in c-MYC-Tumoren zu finden. Schließlich fanden sich auch T-Zellen, die sowohl IFN- als auch IL-10 produzierten. Diese könnten aus Th1-Zellen entstanden sein, welche die Zytokinexpression umgestellt haben. Treg unterdrückten in c-MYC-Tieren anscheinend eine effektive Antitumor-Immunantwort. Daher wurden Foxp3+ Treg in DEREG/c-MYC-Mäusen, die einen transgenen Diphtherietoxin (DT)-Rezeptor tragen, spezifisch durch DT-Injektionen in vivo depletiert. Erstmals wurde der DEREG-Mechanismus zur Treg-Depletion in einem endogenen Tumormodell angewandt. Die Depletion der Foxp3+ Treg verschaffte den DEREG/c-MYC-Mäusen einen leichten Überlebensvorteil. Diese Ergebnisse sind relevant für die Entwicklung neuer immuntherapeutischer Verfahren zur Behandlung maligner Erkrankungen in der Klinik.

Das Epstein-Barr Virus (EBV) ist mit einer Reihe von lebensbedrohlichen Krankheiten assoziiert. Dazu zählen unter anderem Nasopharynxkarzinome, Hodgkin-Lymphome und lymphoproliferative Erkrankungen nach Organtransplantationen. Dennoch gibt es bisher keinen wirksamen Therapieansatz, der sich spezifisch mit der Rolle von EBV in diesen malignen Erkrankungen auseinandersetzt. Das latente Membranprotein 1 (LMP1) ist das primäre Onkogen von EBV und essenziell für die Transformation von B-Zellen durch das Virus. Für eine effiziente Transformation von Zellen ist die Aktivierung verschiedener zellulärer Signalwege durch LMP1 notwendig. LMP1 besitzt jedoch keine enzymatische Aktivität und die Induktion der Signalwege ist somit abhängig von der Rekrutierung verschiedener zellulärer Adapterproteine. Die Ausbildung der notwendigen Signalkomplexe wird über zwei C-terminale Aktivierungs-Regionen (CTAR1 und CTAR2) vermittelt. Verschiedene Mitglieder der Tumornekrosefaktor (TNF)-Rezeptor-assoziierten Faktoren (TRAF)-Protein-Familie spielen bei der Induktion der Signalwege durch diese beiden CTAR-Domänen eine zentrale Rolle. Nach grundlegenden Protein-Protein-Interaktionsstudien zwischen LMP1 und rekombinanten TRAF-Proteinen wurde hier die Interaktion zwischen TRAF2 und LMP1 als Zielstruktur für Inhibitoren vorgestellt. TRAF2 ist essenziell für die Aktivierung des NF-κB-Signalweges durch die CTAR1-Domäne und somit für das Überleben EBV-transformierter Zellen. Die Bindung von TRAF2 an LMP1 wurde biochemisch näher charakterisiert und die gewonnen Erkenntnisse verwendet, um ein System zu etablieren, mit dem Inhibitoren gegen den Komplex aus LMP1 und TRAF2 identifiziert werden können. Dieses ELISA-basierte System erfüllt die Anforderungen, die allgemein an hochdurchsatzfähige Systeme gestellt werden. In einem Pilotscreen einer Bibliothek mit Naturstoffen wurden Substanzen identifiziert, die die Bindung von TRAF2 an LMP1 in vitro inhibierten. Die potenteste Substanz inhibierte die Interaktion von TRAF2 und LMP1 mit einem IC50 von 8 µM in diesen in vitro Studien. Weiterhin zeigte diese Substanz eine spezifische biologische Wirkung auf die Vitalität von EBV-transformierten B-Zellen. Zusätzlich konnte in den Protein-Protein-Interaktionsstudien zwischen den verschiedenen TRAF-Proteinen und LMP1 erstmals eine direkte Bindung von TRAF6 an LMP1 gezeigt werden. Entgegen der bisherigen Modellvorstellung, nach der TRAF6 indirekt über Adapterproteine an LMP1 gebunden wird, konnte hier gezeigt werden, dass TRAF6 direkt an die LMP1-Sequenz P379VQLSY innerhalb der CTAR2-Domäne bindet. Diese Sequenz ist essenziell für die Aktivierung verschiedener TRAF6-abhängiger Signalwege durch die CTAR2-Domäne. Auf der Oberfläche von TRAF6 wird die Bindung an LMP1 durch dieselbe Bindetasche vermittelt, über die auch die Interaktion mit zellulären Rezeptoren stattfindet. Diese direkte Interaktion zwischen LMP1 und TRAF6 ist wichtig für die Aktivierung des NF κB-Signalweges durch die CTAR2-Domäne. TRAF6-Mutanten, die nicht mehr in der Lage waren, mit LMP1 zu interagieren, waren ebenfalls nicht mehr dazu fähig, die Induktion von NF κB-Signalen durch die CTAR2-Domäne von LMP1 in embryonalen TRAF6-/- Mausfibroblasten wiederherzustellen. Ebenfalls konnte neben der direkten Bindung von TRAF6 an LMP1 hier eine weitere neue Protein-Protein-Interaktion für TRAF6 beschrieben werden. TRAF6 bindet direkt an das TNF-Rezeptor-assoziierte Todesdomänenprotein (TRADD). Die Interaktion zwischen TRAF6 und TRADD unterscheidet sich jedoch von der Bindung anderer TRAF-Proteine an TRADD. Die in vitro Studien zeigten, dass TRAF6 in der Lage ist, sowohl mit Teilen des N-Terminus, als auch mit Teilen des C-Terminus von TRADD zu interagieren. Diese bisher nicht beschriebene Art der direkten Interaktion von TRAF6 mit TRADD eröffnet neue Einblicke in den Aufbau des LMP1-Signalkomplexes.

HINTERGRUND: Krebserkrankungen sind nach kardiovaskulären Erkrankungen die zweithäufigste Krankheitsgruppe überhaupt in der Medizin. Nach dem aktuellen Stand der Forschung entstehen Tumoren durch Fehlregulation von Proliferation und Differenzierung einzelner Zellen. Diese Vorgänge können in Tiermodellen nachgebildet werden. Eine besonders hohe Aussagekraft haben dabei Tiermodelle, bei denen durch Verwendung eines hybriden Onkogens spontan ein Tumor entsteht. Ein hybrides Onkogen ist aus einem organspezifischen Promotor und einem bekannten Onkogen zusammengesetzt und führt zur Tumorentwicklung in einem bestimmten Organ. Ein Beispiel hierfür sind CEA424/SV 40 large T-Antigen – transgene Mäuse, sie entwickeln reproduzierbar einen Tumor im Antrum des Magens. ZIELSETZUNG: An diesem Tiermodell sollten die Faktoren der organselektiven Entwicklung des Tumors aufgeklärt werden. Hypothesen hierzu waren einerseits, dass dies durch die Integration des Transgens verursacht ist, andererseits, dass im betroffenen Organ spezifische Stimulatoren wirken. Zudem sollte auf der Grundlage von Genexpressionsdaten der Phänotyp der Tumorzellen identifiziert werden. METHODEN: Zunächst wurde mit Walking-PCR die Integrationsstelle identifiziert. Darüber hinaus wurde mit RT-PCR gezielt die Expression von Genen untersucht, welche an der Regulation von Proliferation und Differenzierung des Magens beteiligt sind. Mikroarray-Analysen und ihre computergestützte Auswertung dienten zudem zur Erstellung von Genexpressionsprofilen für verschiedene Zeitpunkte der Tumorentwicklung. ERGEBNISSE: Das Transgen wurde auf dem Chromosom 4 der transgenen Mäuse lokalisiert. Ein Einfluss der Integrationsstelle auf die organspezifische Tumorentstehung konnte dabei nicht gesehen werden. Die Genexpressionsanalyse ergab, dass im Verlauf der Tumorentwicklung die Wnt-Signalkaskade hochreguliert ist. Dieser Signalweg ist als wichtiger Stimulator der Proliferation vor allem in Stammzellmilieus des Gastrointestinaltraktes bekannt. Weiterhin zeigte sich für die Differenzierungsfaktoren Ihh, Notch1 und Pdx1 sowie für das Hormon Gastrin mit fortschreitender Tumorentwicklung eine verminderte Expression, was auf einen Verlust bestimmter Differenzierungswege im Tumorgewebe schließen lässt. In den Genexpressionsprofilen zeigte sich ein neuroendokriner Phänotyp der Tumorzellen.

Das Membranprotein LMP1 des Epstein-Barr Virus (EBV) stellt das primäre Onkogen des Virus dar. Es ist essentiell für eine effiziente Transformation von B-Zellen durch das Virus und ist allein ausreichend, um Nagerfibroblasten zu transformieren. LMP1 aktiviert eine Vielzahl von Signalwegen über zwei carboxyterminale Aktivierungsregionen (CTAR1 und CTAR2), unter anderem die JNK-, die NF-κB, die PI3K- und die Jak/STAT-Signalkaskaden. Die Aufklärung der Signaltransduktion von LMP1 auf molekularer Ebene ist der Fokus intensiver wissenschaftlicher Forschung. Ziel der vorliegenden Doktorarbeit war es, neue Interaktionspartner von LMP1 zu identifizieren und so Lücken zwischen LMP1 und den weiter stromabwärts liegenden Signalwegen zu schließen. Dazu wurde im ersten Teil der Arbeit eine Methodik entwickelt, mit dem der Signalkomplex von LMP1 massenspektrometrisch untersucht werden konnte. Hierzu wurde zunächst ein Zellsystem etabliert, mit dem der LMP1-Multiproteinkomplex aus lymphoblastoiden Zelllinien (LCLs), also im viralen Kontext, präzipitiert werden konnte. Darüber hinaus wurde ein zusätzlicher Aufreinigungsschritt durch die Integration einer TEV-Protease-Schnittstelle zwischen den Transmembrandomänen und dem C-Terminus von LMP1 eingeführt. Mit diesem Verfahren wurde eine Reihe von neuen potenziellen Interaktionspartnern von LMP1 identifiziert. Von diesen konnten bereits zwei Proteine als LMP1 Interaktionspartner mit weiteren Methoden verifiziert werden, das Transmembranprotein CD48 und die Kinase TNIK. Der zweite Teil der Arbeit beleuchtet die Rolle der Protein-Tyrosin-Phosphatase SHP-1 in der Signaltransduktion von LMP1. Sie wurde in unserer Arbeitsgruppe als Interaktionskandidat von LMP1 identifiziert. Neben der Verifikation der Bindung gelang es in dieser Arbeit, die Interaktionsstelle von SHP-1 auf die beiden Tyrosine Y185 und Y186 von LMP1 zu kartieren. Damit wurde neben CTAR1 und CTAR2 ein weiteres, neues Bindemotiv von LMP1 entdeckt. Es konnte im Rahmen dieser Doktorarbeit gezeigt werden, dass LMP1 den NF-κB- und den Jak/STAT-Signalweg nicht nur induziert sondern durch die Interaktion von LMP1 mit SHP-1 diese Aktivierung regu-liert und begrenzt. LMP1 verfügt somit auch direkt auf der Ebene der Signaltransduktion über einen Me-chanismus, der seine eigene Aktivität moduliert.

In der vorliegenden Arbeit sollten monoklonale Antikörper gegen die extrazelluläre Domäne des humanen Notch 1 Rezeptors als Werkzeug für weitergehende Untersuchungen hergestellt werden. Dazu konnte erfolgreich ein Reinigungsprotokoll zur Aufreinigung eines rekombinanten Proteins aus dem extrazellulären Teil von Notch 1 etabliert werden. Das Austesten der Antikörper ergab, dass diese aufgrund von geringer Sensitivität im Western Blot nicht zu verwenden waren. Auch im FACS konnten sie nicht eingesetzt werden, da keine Bindung an natives Notch erfolgte. Daher wurde auf die Verwendung von mittlerweile verfügbaren Antikörpern gegen die intrazelluläre Notch Domäne zurückgegriffen. Damit konnte gezeigt werden, dass Notch 1 Rezeptor auf allen untersuchten Proben von primären Zellen exprimiert wird, sowie auf allen untersuchten Zell-Linien. Unter Verwendung von Notch 3 Antikörpern wurde die parallele Expression von Notch 1 und Notch 3 auf Zell-Linien analysiert und festgestellt, dass auf T-Zell-Linien Notch 1 und Notch 3 gleichzeitig exprimiert werden. Biochemische Untersuchungen zeigten, dass Notch 3 wie Notch 1 einer S1 Prozessierung im Golgi-Netzwerk zu unterliegen scheint. Mit den intrazellulär bindenden Notch 1 Antikörpern konnte eine immunhistochemische intrazelluläre Notch 1 Färbemethode etabliert werden, die eine Untersuchung von (Tumor-) Gewebe erlaubte. Das unterschiedliche Expressionsmuster von Notch lässt auf unterschiedliche Mechanismen bei der Regulation von Zellwachstum und Differenzierung schließen. So konnte in Tumoren der Haut keine Notch 1 Expression gesehen werden, jedoch im Str. basale. In Zellen des Kolonadenoms dagegen war eine Notch 1 Expression zu erkennen. Zusätzlich zu der bereits in der Literatur ausführlich beschriebenen Rolle von Notch als Onkogen tritt, abhängig vom untersuchten System, Notch auch in der Rolle eines Tumorsuppressorgens auf. Allerdings kann durch eine immunhistochemische Untersuchung der Notch 1 Expression allein keine Aussage getroffen werden, ob eine Änderung der Notch Expression Ursache für einen Transformationsprozess ist, oder als Folge eines solchen Prozesses auftritt. Dennoch liefert die parallele Untersuchung von gesundem und Tumor-Gewebe einen ersten Hinweis auf eine wie auch immer geartetete Beteiligung des Notch Signalweges. Prinzipiell ist bei der Interpretation auch zu beachten, dass hier die Notch 1 Färbung keine Aussage über den Aktivierungszustand von Notch liefern kann, da nicht gesichert ist, ob und in welcher Quantität Notch im Zellkern mit dieser Methode nachweisbar ist.

Das Adapterprotein TRADD spielt eine zentrale Rolle in der Signaltransduktion des zellulären TNF-Rezeptors 1 (TNF-R1) und des Latenten Membranproteins 1 (LMP1) vom Epstein-Barr-Virus. Im Gegensatz zur Situation am TNF-R1 bindet TRADD an LMP1 nicht über seine Todesdomäne, sondern über seinen N-terminalen Bereich. Betrachtet man die Zusammensetzung der TNF-R1 und LMP1 Signalkomplexe und der von diesen beiden Membranproteinen aktivierten Signalwege, sind ganz offensichtlich viele Gemeinsamkeiten zu erkennen. Dennoch ist die biologische Funktion dieser beiden Membranproteine zum Teil sehr unterschiedlich. Während der TNF-R1 maßgeblich an der Regulation inflammatorischer Prozesse beteiligt ist und in bestimmten Situationen die Zelle in den programmierten Zelltod (Apoptose) treiben kann, ist LMP1 essentiell an der Immortalisierung von B-Lymphozyten durch das Epstein-Barr-Virus beteiligt. LMP1 ist ein virales Onkogen, das die Expression mitogener Faktoren induziert und gleichzeitig Apoptose und Seneszenz inhibiert. Die Aufklärung der Signaltransduktion dieser beiden Membranproteine auf molekularer Ebene steht seit vielen Jahren im Zentrum intensiver Forschung. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Rolle von TRADD in der Signaltransduktion von TNF-R1 und LMP1 zu klären. Da das einzig wirklich zuverlässige System zur Untersuchung der TRADD Proteinfunktionen ein TRADD „knockout“ Zellsystem ist, wurde im Rahmen dieser Doktorarbeit erstmals ein TRADD-defizientes Zellsystem mittels homologer Rekombination in humanen B-Lymphozyten (DG75) hergestellt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Signaltransduktion von TNF-R1 und LMP1 in DG75 wildtyp und DG75 TRADD-defizienten Zellen untersucht. Dabei konnte erstmals gezeigt werden, dass TRADD für die Aktivierung des klassischen NF-κB Signalwegs sowohl durch die TNF-R1 Signaldomäne als auch durch LMP1 notwendig ist. Zusätzlich konnte durch die Entwicklung einer neuen, auf FACS-basierenden Methode zur Zelltodanalyse nach transienter Transfektion apoptotischer Gene, in DG75 TRADD-defizienten Zellen nachgewiesen werden, dass TRADD an der Induktion von Apoptose durch TNF-R1 essentiell beteiligt ist. Diese beiden Ergebnisse stützen das derzeitige Modell der TNF-R1 bzw. LMP1 Signaltransduktion. Dagegen konnte im Rahmen dieser Doktorarbeit festgestellt werden, dass TRADD weder für die Aktivierung des JNK1 Signalwegs durch die TNF-R1 Signaldomäne noch durch LMP1 benötigt wird. Im Fall von TNF-R1 stellt dieses Ergebnis das bis heute gültige Modell der TNF-R1 Signaltransduktion in Frage und zeigt, dass TRADD nicht das zentrale Adapterprotein zur Induktion aller wichtigen TNF-R1 Signalwege sein kann. Diese Ergebnisse konnten durch Experimente mit TRADD-siRNA in HeLa Zellen bestätigt werden. Abschließend konnte in dieser Arbeit erstmals gezeigt werden, dass TRAF2 unabhängig von TRADD mit dem TNF-R1 interagieren kann und von der TNF-R1 Signaldomäne in Abwesenheit von TRADD in „lipid rafts“ rekrutiert wird. Da TRAF2 für die TNF-R1-vermittelte JNK1 Aktivierung essentiell ist, könnte dies eine Erklärung für die TRADD-unabhängige Induktion des JNK1 Signalwegs durch TNF-R1 sein. Welches Molekül die Bindung von TRAF2 an TNF-R1 vermittelt, ist noch unklar und wird in Zukunft experimentell adressiert werden. Hierfür stellen die DG75 TRADD-defizienten Zellen ein wertvolles experimentelles System dar.

Das Epstein-Barr Virus (EBV) infiziert primäre humane B-Zellen und kann deren unbegrenzte Proliferation induzieren. Dieser Prozess der Wachstumstransformation von B–Zellen ist ein Modellsystem, das die pathogenen Mechanismen bei der Tumorentstehung widerspiegelt. Das Epstein-Barr Virus nukleäre Antigen 1 (EBNA1) wurde als essentiell für den Prozess der Wachstumstransformation primärer humaner B-Lymphozyten beschrieben, weil es an der latenten Replikation über den viralen Replikations-Ursprung oriP, der extrachromosomalen Erhaltung des Virus-Episoms und der transkriptionellen Trans-aktivierung der latenten Gene beteiligt ist (Rickinson und Kieff, 2001). Dieses Postulat wurde nie experimentell untersucht, da die genetische Analyse mit den bisherigen Methoden nicht möglich war. Das Maxi-EBV-System macht das Genom von EBV einer genetischen Manipulation zugänglich und erlaubt auch die Herstellung von Viren, denen essentielle Gene fehlen (Delecluse et al., 1998). Ein Ziel meiner Doktorarbeit war die Herstellung und Analyse eines EBNA1-negativen Virus. Entgegen der Lehrmeinung war es mit EBNA1-negativem Maxi-EBV möglich, wachstums-transformierte Zellklone nach Infektion von primären humanen B-Lymphozyten zu etablieren. Das virale Genom war in sämtlichen erhaltenen lymphoblastoiden Zelllinien so integriert, dass alle untersuchten latenten EBV-Proteine exprimiert wurden. Meine Ergebnisse zeigen eindeutig, dass EBNA1 prinzipiell für die Wachstumstransformation entbehrlich ist. Mit EBNA1-positiven Viren werden die primären B-Zellen jedoch mindestens um den Faktor 10.000 besser wachstumstransformiert. Da EBNA1 den episomalen Status des Virusgenoms vermittelt, scheint die Etablierung des EBV-Genoms in infizierten Zellen der limitierende Schritt zu sein. Auch in vivo im SCID-Maus-Modell erwies sich EBNA1 als entbehrlich für die Tumorbildung, womit es nicht als essentielles Onkogen von EBV betrachtet werden kann. Ein weiterer im Rahmen dieser Doktorarbeit untersuchter Aspekt war die Frage, ob EBNA1 für die extrachromosomale Erhaltung und Replikation des EBV-Episoms durch heterologe Genprodukte ersetzt werden kann. Zu diesem Zweck wurden Fusionsproteine aus der DNA-Bindedomäne von EBNA1 mit den zellulären Proteinen Histon H1 bzw. HMG-I (Mitglied der hoch mobilen Protein-Gruppe) hergestellt. Ich konnte zeigen, dass HMG-I:EBNA1- und H1:EBNA1-Fusionsproteine in der Lage sind, kleine oriP-enthaltende Plasmide und Maxi-EBVs episomal zu erhalten und die zelluläre Replikations-Maschinerie zu rekrutieren. Zusätzlich dazu unterstützen die Fusionsproteine im EBNA1-negativen Maxi-EBV die Produktion infektiöser Viren. Für ein konditional regulierbares Vektorsystem wurden Fusionsproteine aus der EBNA1-Transaktivierungsdomäne und der DNA-Bindedomäne des Tet-Repressors (TetR) hergestellt. Diese Proteine sollten mit Tet-Operator-Sequenzen (TetO, TetR-Bindemotiv) interagieren, die multimerisiert auf oriP-basierte Vektoren kloniert wurden. Dadurch sollte die Erhaltung der oriP-basierten Vektoren in der Zelle konditional regulierbar gestaltet werden. Es gelang in dieser Doktorarbeit zum ersten Mal ein System zu etablieren, mit dem Plasmide episomal erhalten werden und bei Zugabe von Doxyzyklin konditional regulierbar verloren gehen. Dieses erstmals realisierte konditional regulierbare Vektorsystem schafft neue Wege, die virale und zelluläre Replikation genauer zu untersuchen. Außerdem öffnen sich Möglichkeiten für eine sicherere Gentherapie, da die viralen Anteile auf ein Minimum reduziert werden können. Mit einem solchen System könnten EBV-Genvektoren in B-Zellen eingeführt werden und nach Expression des auf dem Vektor kodierten, therapeutischen Gens könnte die Genfähre durch Tetrazyklin-Applikation wieder aus dem Patienten entfernt werden.

Das kolorekatle Karzinhom gehört weltweit zu den häufigsten Todesursachen bei Tukmorerkrankungen. Chronisch entzündliche Darmerkrankungen und kolorektale Karzinome weisen ein erhöhtes Entartungsrisiko auf. Je nach Tumorstadium können der Adenom-Karzinom-Sequenz Mutationen bestimmter Tumorsuppressor- oder Onkogene zugeordnet werden. Von Bedeutung sind hier das p53-Tumorsuppressorgen und das ki-ras Onkogen. Bei 129 Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen und 45 Patienten mit kolorektalen Adenomen wurden Mutationen im p53-Tumorsuppressorgen mittels SSCP-Analyse sowie im ki-ras-Onkogen mittels Hybridisierung von Dot-blots mit Digoxigenin-markierten Oligonukleotiden untersucht. Bei 15.6% der untersuchten Patienten mit Adenomen versus 2.6% in der Kontrollgruppe wurden Mutationen nachgewiesen. Bei Patienten mit Colitis ulcerosa und Morbus Crohn wurden 14.7% beziehungsweise 15.7% Mutationen des p53- und des ki-ras-Gens nachgewiesen. Abhängig von der kummulativen Krankheitsdauer bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen und dem Ausbreitungsgrad zeigte sich ein erhöhter Mutationsnachweis. Bei Patienten mit kolorektalen Adenomen konnte keine Korrelation bezüglich des histopathologischen Befundes sowie der Größe und der Anzahl von parallel bestehenden Adenomen nachgewiesen werden.