Podcasts about immortalisierung

Für ein genetisches Modell B-Raf(V600E)-mutierter Darmkrebszellen und korrespondierender Wildtyp-Zellen wurde erstmalig in Deutschland das Somatic Cell Gene Targeting eingesetzt. Dabei konnte demonstriert werden, dass RKO eine Oncogene Addiction bezüglich der BRAF-Mutation aufweist. Als weitere B-Raf(V600E)-abhängige Effekte wurden die Selbstversorgung mit Wachstumssignalen (Self-Sufficiency of Growth Signals) und die Resistenz gegen Apoptose in dem Modell festgestellt. Darüber hinaus war die proliferative Kontaktinhibition in V600E-mutierten Klonen durch eine verstärkte Akt-Phosphorylierung aufgehoben und wurde nach Knockout der mutierten Allele im Wildtyp-Zellklon RBW-1 wieder hergestellt. Somit konnten vier zentrale Merkmale der Onkogenität dem mutierten B-Raf(V600E) zugeordnet werden. Andere onkogene Mechanismen waren dagegen vermutlich aufgrund einer Mutation der PI3-Kinase auch in BRAF-Wildtyp-Zellen noch intakt. So waren das Wachstum unter guten Kulturbedingungen und eine verstärkte Expression des EGF-Rezeptors unter Mangelbedingungen nicht vom BRAF-Mutationsstatus abhängig. Außerdem behielten Wildtyp-Zellen ihre Immortalisierung bei und zeigten weiterhin kein relevantes Auftreten von Seneszenz. Es wurden neue Spleißvarianten des BRAF-Gens gefunden und basal charakterisiert. Die alternativen Transkripte zeigten keine Kinase-Aktivität und waren in einem Ausmaß nachweisbar, das eine physiologische Bedeutung vermuten lässt. Hinsichtlich der Herkunft-Allele alternativer Isoformen und den Ursachen für das Auftreten alternativen Spleißens wurden neue Erkenntnisse gewonnen, die zudem die Interpretation publizierter Daten erleichtern. Es wurde gezeigt, dass die durch E-Cadherin vermittelten Zellkontakte essentiell für die epitheliale Komponente der intestinalen Barriere sind. Darüber hinaus wurde der Einfluss von E-Cadherin auf die Ausreifung sekretierender Zellen im Darm ermittelt und damit ein weiterer entscheidender Mechanismus der Abwehr bakterieller Invasionen aufgeklärt.

In vorausgehenden Studien zur malignen Transformation und Immortalisation von primären oesophagealen Plattenepithelzellen konnte gezeigt werden, dass die alleinige ektope Expression der katalytischen Untereinheit der Telomerase zur Verlängerung der Lebenszeit und zur Immortalisation führt. Eine Beteiligung des p53 Tumorsupressorgens bei der Immortalisation konnte ausgeschlossen werden. Des Weiteren war die Inaktivierung des p16/ pRb Signalwegs nicht notwendig. Während der malignen Transformation von Nebennierenrindenzellen in ein autonom wachsendes Nebennierenrindenkarzinom sind neben Mutationen im p53 Tumorsupressorgen und Überexpression des IGF-II Wachstumsfaktors auch der Expressionsverlust des ACTH-Rezeptors beschrieben (Reincke et al., 1994, Gicquel et al., Zwermann et al., 2005). Eine Voraussetzung zur Immortalisierung stellt die Verlängerung der Telomere durch die Aktivierung der Telomerase dar. Die bisherigen Daten zur Telomeraseaktivität in Nebennierenrindenkarzinomen sind jedoch uneinheitlich. Außerdem basieren die Studien zur Telomeraseaktivität in Nebennierenrindenkarzinomen hauptsächlich auf Zellen und Geweben, die sich bereits im Tumorstadium befanden. Welche Faktoren zur malignen Transformation geführt haben, ist dabei schwierig zu analysieren. Es gab bislang keine systematischen Untersuchungen zum Verlauf der Telomerase-Expression in der Tumorgenese von Nebennierenrindenkarzinomzellen. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmalig die Rolle der Telomerase in normalen humanen Nebennierenrindenzellen untersucht und damit schrittweise die Bedeutung der Telomerase in der Tumorgenese von Nebennierenrindenzellen analysiert. Dazu wurden normale primäre humane Nebennierenrindenzellen mit retroviraler Überexpression von hTERT als Modellsystem verwendet. Diese kontinuierlich wachsende Zellpopulation wurde schrittweise hinsichtlich Wachstumseigenschaften, replikativer Seneszenz durch ß-Galaktosidasenachweis, Proliferation mittels BrdU-ELISA, hTERT-Genexpression durch RT-PCR, Telomerlänge durch TRF-Assay und Telomeraseaktivität mittels TRAP untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die alleinige Expression der Telomerase zur Verlängerung der Lebensdauer, jedoch nicht zur Immortalisierung der Nebennierenrindenzellen führt. Die hTERT transfizierten Nebennierenrindenzellen gehen nach etwa 26 Passagen in das Stadium der Seneszenz über, obwohl die Telomerase exprimiert wird, stabile Telomeraseaktivität zeigt und die Telomerlängen sich nicht verkürzen. Der Anstieg der seneszenten Zellen geht mit einem Abfall der Proliferationsrate einher. Western-Blot-Bestimmungen für die Signaltransduktionsproteine p16, p21, Cyclin D1 und p53 konnten zeigen, dass vermutlich weitere genetische Veränderungen in p16 und/oder p53 notwendig sind, um eine Immortalisierung und maligne Transformation der Nebennierenrindenzellen zu Karzinomzellen zu erreichen.

Das Adapterprotein TRADD spielt eine zentrale Rolle in der Signaltransduktion des zellulären TNF-Rezeptors 1 (TNF-R1) und des Latenten Membranproteins 1 (LMP1) vom Epstein-Barr-Virus. Im Gegensatz zur Situation am TNF-R1 bindet TRADD an LMP1 nicht über seine Todesdomäne, sondern über seinen N-terminalen Bereich. Betrachtet man die Zusammensetzung der TNF-R1 und LMP1 Signalkomplexe und der von diesen beiden Membranproteinen aktivierten Signalwege, sind ganz offensichtlich viele Gemeinsamkeiten zu erkennen. Dennoch ist die biologische Funktion dieser beiden Membranproteine zum Teil sehr unterschiedlich. Während der TNF-R1 maßgeblich an der Regulation inflammatorischer Prozesse beteiligt ist und in bestimmten Situationen die Zelle in den programmierten Zelltod (Apoptose) treiben kann, ist LMP1 essentiell an der Immortalisierung von B-Lymphozyten durch das Epstein-Barr-Virus beteiligt. LMP1 ist ein virales Onkogen, das die Expression mitogener Faktoren induziert und gleichzeitig Apoptose und Seneszenz inhibiert. Die Aufklärung der Signaltransduktion dieser beiden Membranproteine auf molekularer Ebene steht seit vielen Jahren im Zentrum intensiver Forschung. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Rolle von TRADD in der Signaltransduktion von TNF-R1 und LMP1 zu klären. Da das einzig wirklich zuverlässige System zur Untersuchung der TRADD Proteinfunktionen ein TRADD „knockout“ Zellsystem ist, wurde im Rahmen dieser Doktorarbeit erstmals ein TRADD-defizientes Zellsystem mittels homologer Rekombination in humanen B-Lymphozyten (DG75) hergestellt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Signaltransduktion von TNF-R1 und LMP1 in DG75 wildtyp und DG75 TRADD-defizienten Zellen untersucht. Dabei konnte erstmals gezeigt werden, dass TRADD für die Aktivierung des klassischen NF-κB Signalwegs sowohl durch die TNF-R1 Signaldomäne als auch durch LMP1 notwendig ist. Zusätzlich konnte durch die Entwicklung einer neuen, auf FACS-basierenden Methode zur Zelltodanalyse nach transienter Transfektion apoptotischer Gene, in DG75 TRADD-defizienten Zellen nachgewiesen werden, dass TRADD an der Induktion von Apoptose durch TNF-R1 essentiell beteiligt ist. Diese beiden Ergebnisse stützen das derzeitige Modell der TNF-R1 bzw. LMP1 Signaltransduktion. Dagegen konnte im Rahmen dieser Doktorarbeit festgestellt werden, dass TRADD weder für die Aktivierung des JNK1 Signalwegs durch die TNF-R1 Signaldomäne noch durch LMP1 benötigt wird. Im Fall von TNF-R1 stellt dieses Ergebnis das bis heute gültige Modell der TNF-R1 Signaltransduktion in Frage und zeigt, dass TRADD nicht das zentrale Adapterprotein zur Induktion aller wichtigen TNF-R1 Signalwege sein kann. Diese Ergebnisse konnten durch Experimente mit TRADD-siRNA in HeLa Zellen bestätigt werden. Abschließend konnte in dieser Arbeit erstmals gezeigt werden, dass TRAF2 unabhängig von TRADD mit dem TNF-R1 interagieren kann und von der TNF-R1 Signaldomäne in Abwesenheit von TRADD in „lipid rafts“ rekrutiert wird. Da TRAF2 für die TNF-R1-vermittelte JNK1 Aktivierung essentiell ist, könnte dies eine Erklärung für die TRADD-unabhängige Induktion des JNK1 Signalwegs durch TNF-R1 sein. Welches Molekül die Bindung von TRAF2 an TNF-R1 vermittelt, ist noch unklar und wird in Zukunft experimentell adressiert werden. Hierfür stellen die DG75 TRADD-defizienten Zellen ein wertvolles experimentelles System dar.

Ziel dieser Arbeit war es, mit Hilfe von Mutanten den Einfluss der Proteine BALF1, BHRF1 und LMP2A von Epstein-Barr Virus (EBV) auf die B-Zell-Immortalisierung zu bestimmen. Diese EBV Mutanten bilden die Grundlage zur Funktionsanalyse der Genprodukte in infizierten humanen B-Zellen, die durch die Infektion mit EBV als stabile B-Zelllinien in vitro proliferieren und latent, d.h. ohne Virus zu produzieren, mit EBV infiziert sind. Die Einzeldeletionen von BALF1 oder BHRF1 im Genom von EBV zeigen keinen Einfluss auf die Effizienz, mit der solche B-Zelllinien entstehen. Die in beiden Genen deletierte Mutante ist dagegen nicht mehr in der Lage, die Proliferation von BLymphozyten zu induzieren. Eine LMP2A Deletionsmutante ist gegenüber Wildtyp EBV in dieser Eigenschaft deutlich beeinträchtigt. LMP2A induziert in frisch infizierten B-Lymphozyten die Expression von EBV Genen, die nicht zur Gruppe der latenten Genprodukte gehören, sondern nur während der Virusproduktion transkribiert werden. Allerdings werden keine Viren gebildet, da der lytische Zyklus nicht vollständig durchlaufen wird. Ebenso unerwartet ist die Expression des anti-apoptotischen Proteins BHRF1, das auch zu den lytischen Genen gehört und dessen Expression kurz nach der Infektion primärer B-Zellen nachzuweisen war. Diese Ergebnisse führten im Rahmen dieser Arbeit zu der Hypothese eines dritten Infektionsmodus von EBV: die Initiation der Latenz. Dabei wird die Apoptose in der infizierten Zelle durch BHRF1 verhindert, bis die Latenz etabliert ist. Später können anderen Proteinen von EBV wie z.B. LMP1, dessen antiapoptotische Eigenschaften bereits beschrieben ist, diese Aufgaben übernehmen. Der bisher ungeklärte Mechanismus der Replikation des viralen Genoms von einem auf bis zu mehreren Hundert Kopien ist während der Initiation der Latenz durch einen der lytischen Replikation ähnlichen Vorgang zu erklären. LMP2A wurde bisher immer mit der Unterdrückung des lytischen Zyklus und der Aufrechterhaltung der Latenz in der infizierten Zelle in Verbindung gebracht. Um die Funktion dieses Proteins besser untersuchen zu können, wurde ein konditionales LMP2A Zellsystem entwickelt. Dieses Systems ermöglicht eine kontrollierte LMP2AAktivierung, um die induzierten Signalwege und Zielgene von LMP2A in der Zelle zu identifizieren.

LMP1 ist das Hauptonkogen des humanen DNA-Tumorvirus EBV (Epstein-Barr Virus). LMP1 ist essentiell für die Immortalisierung von B-Zellen durch das Virus. Darüber hinaus transformiert LMP1 Nagerfibroblasten in Kultur. LMP1 agiert wie ein konstitutiv aktives Rezeptormolekül in der Plasmamembran und induziert intrazelluläre Signaltransduktion durch die Bindung von Signalmolekülen der TNF-Rezeptor Familie. Die bekannten LMP1 Signalwege können die biologischen Funktionen von LMP1 jedoch nur teilweise erklären. In meiner Arbeit sollten daher neue Komponenten der LMP1 Signaltransduktion identifiziert werden. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit konnte TRAF6 als essentielles und spezifisches Signalmolekül für die Induktion von p38 MAPK durch LMP1 auf einem MKK6-abhängigen Signalweg identifiziert werden. In TRAF6 defizienten Maus-Fibroblasten ist eine signifikante p38 MAPK-Aktivierung durch LMP1 von der ektopischen Expression von TRAF6 abhängig. Darüber hinaus ist TRAF6 ebenfalls in der Aktivierung von NF-κB, jedoch nicht von JNK1/AP-1 durch LMP1 involviert. Das PxQxT-Motiv in CTAR1 ist zusammen mit Tyrosin 384 in CTAR2 essentiell für die Aktivierung des LMP1p38 MAPK-Signalweges. Dominant- negatives TRADD, das direkt an CTAR2 bindet, inhibiert die Induktion von p38 MAPK durch LMP1. Zusammengefaßt zeigen diese Ergebnisse zum ersten Mal eine Rolle von TRAF6 als essentielles Signalmolekül in der Signalkaskade eines transformierenden Onkogens, das unterhalb von TRADD und TRAF2 agiert. Im zweiten Teil meiner Arbeit konnte JNK2 als eine weitere, durch LMP1 induzierte MAPK in B-Zellen identifiziert werden. Im Zuge dieser Arbeit wurden dominant-negative Mutanten von JNK1 und JNK2 hergestellt, deren Expression eine Aktivierung von AP-1 durch LMP1 inhibieren und damit eine Rolle von JNK1 und 2 in der Induktion von AP-1 beweisen. In einem konditionalen LMP1-System in B-Zellen induzierte NGF-R:LMP1 die Degradation des p53 Proteins. Dieser Effekt ist spezifisch für p53, erfolgt innerhalb weniger Minuten und ist dominant über der p53-stabilisierenden Wirkung von UV-Strahlung. Somit konnte erstmals ein EBV-spezifischer Mechanismus aufgedeckt werden, der zu einer Deaktivierung des Tumorsuppressors p53 beitragen könnte.

In meiner Arbeit sollte untersucht werden, ob eine Veränderung des Zelltropismus von Epstein-Barr Virus mit genetischen Methoden möglich ist. Ziel war es, durch Verwendung hybrider Glykoproteine oder Glykoproteine anderer Viren die Bindung bzw. die Fusion von EBV Partikeln zu vermitteln und dadurch eine sogenannte Pseudotypisierung zu erreichen. Zu diesem Zweck wurden im ersten Teil EBV Glykoproteinmutanten des viralen Liganden gp350 und des für die Membranfusion wichtigen gp85 Proteins hergestellt. Die Charakterisierung der gp350-negativen EBV Mutante zeigte im Gegensatz zu früheren Beobachtungen, daß gp350 sowohl für die Immortalisierung und Infektion von primären B-Lymphozyten als auch für die Infektion von Burkitt-Lymphom Zellinien wie Raji Zellen nicht absolut notwendig ist. Die Infektionseffizienz war jedoch reduziert. HLA-Klasse-II-negative Raji 2.2.5 Zellen konnten ebenfalls, wenn auch mit einer noch niedrigeren Infektionsrate, infiziert werden. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß gp350 zwar der Hauptligand für die Infektion von B-Zellen sein dürfte, daß es aber einen gp350-unabhängigen Infektionsmechanismus gibt, der durch einen zusätzlichen viralen Liganden vermittelt wird. Die Identität eines solchen Liganden konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht untersucht werden. Die Charakterisierung der gp85-negativen Mutante sowie der Doppel-KO-Mutante bestätigte, daß das gp85 Glykoprotein für die Infektion der Zielzellen von EBV essentiell ist. Durch die Infektion verschiedener, z. T. CD21-positiver Epithelzellinien mit der gp350-negativen Mutante konnte gezeigt werden, daß auch im Fall von Epithelzellen ein weiterer Ligand existieren muß, der die Funktion von gp350 bis zu einem gewissen Grad ersetzen kann. Die Analyse der CD21 Expression von 293 Zellen zeigte, daß diese Zellen geringe Mengen dieses EBV Rezeptors exprimieren und die Infektion durch Wildtyp-EBV in diesem Fall durch die Interaktion zwischen gp350 und CD21 vermittelt wird. Zusätzlich deuten die Ergebnisse darauf hin, daß der Viruseintritt der gp350-negativen Mutante in Epithelzellen über einen anderen Rezeptor als CD21 erfolgt. Dies scheint auch auf die Infektion von B-Zellen zuzutreffen. Im zweiten Teil meiner Arbeit konnte zunächst mit Hilfe von Fusionsproteinen zwischen GFP und gp350 gezeigt werden, daß große N-terminale Bereiche des gp350 Proteins deletiert werden können, ohne dadurch die Expression sowie den Transport dieser Chimären zur Plasmamembran zu beeinträchtigen. Darauf aufbauend wurde ein gp350 Fusionsprotein mit dem humanen Stammzellfaktor konstruiert. Es wurde gezeigt, daß dieses hybride Glykoprotein in die Virushülle von EBV eingebaut wird. Die mit dem Fusionsprotein pseudotypisierten Viren waren in der Lage, c-kit exprimierende Zellen wie TF-1 Zellen und CD34-positive, hämatopoetische Vorläuferzellen, wenn auch mit einer relativ niedrigen Infektionsrate, zu infizieren. Entsprechende Blockierungsexperimente bestätigten, daß die beobachtete Infektion durch die spezifische Interaktion des hSCF Anteils mit dem c-kit Rezeptor erfolgt. Die Retargetierungsversuche mit der nicht infektiösen gp350/gp85-negativen EBV Mutante mit Hilfe des Glykoproteins des "Lymphocytic Choriomeningitis Virus" zeigten, daß ein einziges heterologes, virales Glykoprotein sowohl die Bindung an die Zelloberfläche wie auch den Viruseintritt in HeLa Zellen vermitteln kann.