Podcasts about signaltransduktion

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Exercise Inside Out
#006 - Was ist Training?

Exercise Inside Out

Play Episode Listen Later Jan 13, 2023 88:55


Über Superkompensation, Signaltransduktion und den "inneren Schweinehund".  Neues Jahr - neue Vorsätze! Viele nehmen sich zum Jahreswechsel vor, mehr Sport zu treiben. Aber: - Was ist Training überhaupt?  - Wie und warum passt sich unser Körper an Belastung an?! UND:   - Was kann ich gegen den "inneren Schweinehund" tun?!?!?    Die Anworten auf diese spannenden Fragen gibt es pünktlich zum neuen Jahr!  Im ersten Teil werden wir unter anderem den Begriff "Training" definieren und ihn von "Übung", "Coaching" usw. abgrenzen. Im zweiten Teil widmen wir uns den Trainingsprinzipen und stellen ihre Limitationen heraus. In Teil 3 stelle ich euch ein alternatives Modell vor, was #training physiologisch erklärt: das Signaltransduktionsmodell. Und zum Abschluss gebe ich euch noch 6 Tipps, die euch gegen den inneren #schweinehund helfen werden! Zwischendurch machen wir noch einen kleinen Abstecher in die Welt der Zellen. Aber wie sagte schon Heinz Erhardt:    "Das Leben kommt auf alle Fälle aus einer Zelle,   doch manchmal endet's auch bei Strolchen, in einer solchen."   Link zum Videopodcast auf YouTube.  Literatur:  Bergström & Hultman (1966): https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/5954569/   Friedrich (2010): https://de.book-info.com/isbn/3-938509-44-9.mobi.htm   Harre (1970): https://aleph.zbsport.de/F/L3N3UC8KIED9GLNA7VCQ2NKI5888NNC4RXHM2MGKDHPIC1C346-03309?func=full-set-set&set_number=002339&set_entry=000013&format=999   Henriksson et al. (1989): https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/2527028/   Hickson (1980): https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/7193134/   Hollmann & Strüder (2009): https://www.bisp-surf.de/Record/PU200905002653/Solr   Hoole (1888): https://iiif.wellcomecollection.org/pdf/b28090275   Mader (2015): https://www.iat.uni-leipzig.de/datenbanken/iks/ta/Record/3048008   Wackerhage (2022): https://www.routledge.com/Molecular-Exercise-Physiology-An-Introduction/Sharples-Wackerhage-Morton-Wackerhage/p/book/9781138086883   Weineck (2010): https://www.bisp-surf.de/Record/PU200708002394    0:00:00 Intro 0:01:54 Thema der Episode 0:04:30 Zitate von Henry Hoole 0:09:47 Definitionen "Training" 0:17:49 Min-Max-Prinzip 0:18:21 Abgrenzung zu "Übung" 0:20:04 Die "Trainierbarkeit" 0:22:25 Die "Fitness" vs. "Trainiertsein" 0:24:12 Abgrenzung zu "Coaching" 0:26:18 TL/TW 0:29:13 Trainingsprinzipien Hoole 0:33:54 Trainingsbelastung 0:38:26 Homöos- und Heterosthase 0:40:06 Definition "Superkompensation" 0:45:17 Kritik an "Superkompensation" 0:50:17 Trainingsprinzipien Weineck 0:53:24 Kritik von Alois Mader 0:59:15 Zellen als kleinste Einheit 1:00:39 Es war einmal das Leben... 1:03:50 Signaltransduktionsmodell 1:10:26 Anwendung des Modells 1:15:44 Concurrent Training 1:17:56 Tipps vs. den "Schweinehund" 1:27:06 Persönliches Fazit 1:27:51 Outro

BIOLOGO
#035 - LassDirSchmeggn

BIOLOGO

Play Episode Listen Later May 21, 2021 23:23


Eli's Abitur Crashkurs
#65 Abi Biologie - Neurobiologie (Signaltransduktion an Sinneszellen)

Eli's Abitur Crashkurs

Play Episode Listen Later May 3, 2020 12:51


Hallo, schön, dass Du mit mir das heutige Thema Neurobiologie vertiefen möchtest. Nachdem wir uns der Neurobiologie überwiegend in der #20, #23 und #25 Folge gewidmet haben, wollen wir es heute etwas vertiefen. Dazu werden wir uns die Signaltransduktion an Sinneszellen anschauen. Nachdem ich Dir einen kleinen Einblick gegeben habe, was die Signaltransduktion überhaupt ist, werden wir uns die Abfolge einer Signaltransduktion an Sinneszellen ganz genau anschauen. Ich hoffe, diese Folge hilft Dir und Du konntest einen tieferen Einblick in die Neurobiologie bekommen. :) Übrigens haben wir jetzt auch eine eigene Website, schaue doch gerne mal auf: https://www.9thwear.com vorbei. :) Dein Name als Unterstützer am Anfang jeder Podcast-Folge? Ich werde Dich am Anfang der nächsten Podcast-Folge namentlich aufführen. Wenn Dir der Podcast zu einem besseren Gefühl oder einer besseren Note verholfen hat, dann freue ich mich über Deine Unterstützung, damit können wir sicherstellen, dass wir weiterhin für Dich tolle Lerninhalte präsentieren können. Mit Paypal kannst Du uns mit folgendem Link unterstützen: https://www.paypal.me/abiturcrashkurs Auch mit einer Bewertung bei Apple Podcasts oder einer lieben Nachricht von Dir kannst Du uns gern unterstützen ❤ Audiovisuelle Direktion & Produktion: Christian Horn

ZellKultur
ZK014 – Enzyme

ZellKultur

Play Episode Listen Later Jul 26, 2018 65:27


Heute geht es um Enzyme.Eigentlich sind Enzyme einfach nur BioMoleküle, die irgendwas machen. Meistens bestehen Sie aus Proteinen, manchmal aber auch aus RNA. Enzyme haben Kofaktoren oder Koenzyme, Sie können gehemmt werden - manchmal durch andere Proteine und manchmal durch ihre eigenen Produkte. Diese Modulation der Aktivität ist wichtig in der Signaltransduktion. Die Effizient der Enzyme berechnen wir mit der Michaelis-Menten-Gleichung. Enzyme finden wir unter anderem in Waschmittel und Obst. In der Bio-Frage geht es um Menschenfressende Ananas. Bzw. ob Ananas bei Entzündungen hilft.   Nicht erwähnt, aber dennoch schamloses Self-Plugging: Mein Artikel im Laborjournal: Brennen für die Wissenschaft

Tierärztliche Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 07/07
Differentielle Proteomanalyse in einem Modell der Epileptogenese

Tierärztliche Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 07/07

Play Episode Listen Later Feb 6, 2016


Bei Hund und Katze sowie beim Menschen zählen Epilepsien zu den häufigsten chronischen neurologischen Erkrankungen. Im Hinblick auf eine vollständige Prävention der Epilepsieentstehung (Epileptogenese) haben sich bis heute alle therapeutischen Strategien als klinisch unwirksam erwiesen. Ein besseres Verständnis der Mechanismen, die der Epileptogenese zugrunde liegen, stellt die Grundvoraussetzung für die Identifizierung von therapeutischen Zielstrukturen und Biomarkern dar. Differentielle Proteomanalysen könnten wesentlich dazu beitragen die komplexen epileptogenese-assoziierten molekularen Veränderungen zu erforschen. Daher wurde in der vorliegenden Dissertationsstudie eine differentielle Proteomanalyse in einem Tiermodell der Epileptogenese durchgeführt. Die Induktion der Epileptogenese erfolgte in einem elektrischen Post-Status-Epilepticus-(SE)-Modell bei weiblichen Sprague-Dawley-Ratten. Hippocampales (HC) und parahippocampales (PHC) Gehirngewebe von SE- und Kontrolltieren wurde zu drei unterschiedlichen Zeitpunkten (zwei Tage, zehn Tage und acht Wochen nach SE) entnommen und mittels markierungsfreier Liquid-Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie analysiert. Die Zeitpunkte reflektieren die Post-Insult-Phase, die Latenzphase und die chronische Phase mit spontanen wiederkehrenden Anfällen. Unter Berücksichtigung der besonderen Rolle inflammatorischer Signalwege im Kontext der Epileptogenese, erfolgte neben der unspezifischen Datenanalyse eine fokussierte Auswertung immun- und inflammations-assoziierter Prozesse. Die anschließende immunhistochemische Untersuchung der Gewebe diente sowohl der Validierung der Methodik, als auch der Validierung des differentiellen Expressionsmusters ausgewählter Proteine. Durch die Studie konnte gezeigt werden, dass zu allen untersuchten Zeitpunkten im PHC mehr Proteine reguliert waren als im HC. Des Weiteren ließen sich in beiden Gehirnregionen die umfangreichsten molekularen Veränderungen in der Latenzphase nachweisen. Durch die Pathway-Enrichment-Analyse konnte im HC während der Post-Insult-Phase eine ausgeprägte Neurodegeneration dargestellt werden. Weiterhin zeigte sich in beiden Gehirnregionen eine Regulation Integrin-assoziierter Prozesse während der Latenzphase und der chronischen Phase. Ein signifikantes Enrichment neurodegenerativer und proliferativer Signalwege ließ sich im PHC acht Wochen nach SE darstellen. Im Hinblick auf immun- und inflammations-assoziierte Prozesse konnte eine Überrepräsentation entsprechender Pathways während der Post-Insult-Phase und der Latenzphase nachgewiesen werden. Die regulierten Pathways umfassten unter anderem Toll-like-Rezeptor-(TLR)-vermittelte Signalwege, Synthese und Regulation von Prostaglandinen, leukozytäre transendotheliale Migration und die Signaltransduktion durch transformierenden Wachstumsfaktor-β (TGF beta). Die inflammatorische Antwort während der chronischen Phase zeigte im PHC eine stärkere Regulation als im HC. Im Rahmen der immunhistochemischen Validierung konnte das differentielle Expressionsmuster der Proteine Heat shock 70 kDa protein (Hspa1a), P2Y Purinoceptor 12 (P2ry12) und P2X Purinoceptor 7 (P2rx7) bestätigt werden, die eine bedeutende Rolle bei der Aktivierung von Mikroglia spielen. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie liefern neue Erkenntnisse über die komplexen molekularen Veränderungen der Epileptogenese. Darüber hinaus deuten sie auf eine unterschiedliche Veränderung der molekularen Muster von HC und PHC während dem Zeitverlauf der Epileptogenese hin. Die Daten stellen zudem neue Informationen über das differentielle Expressionsmuster zahlreicher Proteine zur Verfügung, die bei wichtigen inflammatorischen Prozessen und Signalwegen eine Rolle spielen. Von besonderer Bedeutung ist hierbei die Regulation TLR-assoziierter Proteine und Purinozeptoren, die zu den essentiellen Modulatoren der inflammatorischen Antwort gezählt werden. Zusammenfassend trägt die vorliegende Arbeit wesentlich zu unserem Verständnis über die molekularen und im Besonderen die inflammatorischen Mechanismen der Epileptogenese bei. Die Ergebnisse liefern eine umfassende Grundlage für die zukünftige Identifikation und Entwicklung von therapeutischen Zielstrukturen und Biomarkern für molekulare Bildgebungsverfahren. Die funktionellen Einflüsse einzelner Proteine sollten in zukünftigen Studien (zum Beispiel in Knock-out-Maus-Modellen) bestätigt und genauer untersucht werden.

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 18/19

Zusammenfassung Die Schizophrenie ist eine der schwerwiegendsten psychiatrischen Erkrankungen mit weit reichenden psychischen und sozialen Auswirkungen auf die betroffenen Patienten und ihre Angehörigen. Die Lebenszeit-Prävalenz beträgt etwa 1%. Die Ergebnisse von Kopplungs- und Assoziationsuntersuchungen zeigen den starken Einfluss einer genetischen Komponente bei der Entstehung der Krankheit. Die bisherigen Forschungsergebnisse weisen darauf hin, dass es sich bei der Schizophrenie um eine genetisch komplexe Erkrankung handelt, deren Ätiologie sich durch das Zusammenwirken von Umweltfaktoren und genetischen Faktoren auszeichnet. Bislang ist es noch nicht gelungen, alle an der Pathogenese beteiligten Faktoren, vor allem aber die Mechanismen ihres Zusammenspiels zu entschlüsseln. Aufgrund von morphologischen und molekularbiologischen Untersuchungen sowie genetischen Kopplungs- und Assoziationsstudien fand sich eine Reihe von Suszibilitätsgenen für Schizophrenie, darunter auch das Gen DTNBP1. Es ist auf dem Chromosom 6 in der Region 22.3 lokalisiert und kodiert für das Protein Dysbindin-1. Im Gehirn nimmt dieses Protein Einfluss auf das Zytoskelett und die synaptische Plastizität und ist an der Signaltransduktion von Neuronen über NMDA- und GABA-Rezeptoren und damit am Glutamat- und Dopaminstoffwechsel beteiligt (Benson et al. 2001; Harrison und Weinberger, 2005). Morphologische Untersuchungen zeigen, dass die Konzentration von Dysbindin-1 in wichtigen Bereichen des Gehirns bei schizophrenen Patienten vermindert ist (Talbot et al. 2004; Tang et al. 2009). Eine Reihe von Assoziationsstudien, teils auch familienbasiert, haben in unabhängigen Kollektiven mit verschiedenstem ethnischen Hintergrund signifikante Assoziationssignale an unterschiedlichen Varianten im DTNBP1-Gen gefunden (Straub et al. 2002b; van den Oord et al. 2003; Schwab et al. 2003; Morris et al. 2003; van den Bogaert et al. 2003;, Tang et al. 2003; Kirov et al. 2004; Williams et al. 2004; Numakawa et al. 2004; Funke et al. 2004; de Luca et al. 2005; Duan et al. 2007; Riley et al. 2009 und Voisey et al. 2010). Dabei handelte es sich teilweise um Einzelbasen-Polymorphismen oder Haplotypen im DTNBP1-Gen, die sich als signifikant mit Schizophrenie assoziiert gezeigt haben. Folgestudien konnten diese Ergebnisse oftmals aber nicht bestätigen (Turunen et al. 2006, Datta et al. 2007, Joo et al. 2007, Holliday et al. 2006, Peters et al. 2008, Sanders et al. 2008; Strohmaier et al. 2010). In der vorliegenden Arbeit wurden die sechs Einzelbasenpolymorphismen, rs3213207, rs2619538, rs1011313, rs1047631, rs2056943 und rs2619522 untersucht. Bei ihnen hatten sich in Studien zuvor teilweise deutliche Assoziationsbefunde gezeigt. Die Marker wurden hier erneut an einem unabhängigen kaukasischen Kollektiv von 503 Patienten und 1290 gesunden Kontrollpersonen untersucht. Zustätzlich wurde die Patientengruppe in vier verschiedene Kategorien unterteilt, je nachdem ob Angehörige mit psychischen Störungen, mit Schizophrenie oder Angehörige 1.Grades mit Schizophrenie in der Familienanamnese vorlagen, sowie als vierte Gruppe das Patientenkollektiv insgesamt. Dabei zeigten sich in den unterschiedlichen Patientengruppen signifikante Assoziationshinweise und Trends zur Assoziation bei den Markern rs3213207 und rs2619538, der Marker rs1011313 zeigte lediglich Trends zur Assoziation mit Schizophrenie. Die höchste Signifikanz erreichte mit einem p-Wert von 0,034 der Marker rs3213207 in der Gruppe der Patienten mit schizophrenen Angehörigen. Hier trat der heterozygote Genotyp A/G signifikant häufiger bei Patienten auf als die homozygoten Genotypen A/A und G/G. Ebenfalls Signifikanzniveau erreichte der Marker rs2619538. Dabei zeigte sich in der Gruppe der Patienten mit schizophrenen Angehörigen ersten Grades ein signifikant niedrigerer Anteil homozygoter Träger des selteneren Allels Adenin bei einem p-Wert von 0,044. Die Marker rs1047631, rs2056943 und rs2619522 zeigten in dieser Arbeit keine Hinweise auf Assoziation mit Schizophrenie. Aufgrund der Ergebnisse dieser Arbeit und der anderer Forschungsgruppen besteht weiterhin Grund zur Annahme, dass es sich bei DTNBP1 um ein Suszeptibilitäts-Gen für Schizophrenie handelt. Zwar konnten auch in dieser Arbeit die positiven Assoziationsergebnisse von Vorläuferstudien nicht in vollem Umfang repliziert werden, jedoch stützen die Ergebnisse die Annahme, dass Variationen im DTNBP1-Gen an der Pathogenese der Schizophrenie beteiligt sind. Dabei weisen die Ergebnisse in dieser Arbeit durchaus darauf hin, dass es einen Zusammenhang gibt zwischen positiver Familienanamnese in Bezug auf Schizophrenie und genetischen Variationen im DTNBP1-Gen. Gründe für die Inkonsistenz in den Ergebnissen der bisherigen Untersuchungen könnten die abweichenden Stichprobengrößen sowie die unterschiedliche ethnische Herkunft der untersuchten Kollektive sein. Auch die Einschlusskriterien für die Patienten- und Kontrollgruppen wichen voneinander ab. Vermutlich aber ist eine der Hauptursachen auch die genetische und phänotypische Heterogenität der Erkrankung an Schizophrenie. Weitere Studien mit höheren Fallzahlen werden nötig sein, um die genetischen Risikomarker auf dem DTNBP1-Gen und ihr mögliches Zusammenspiel mit Markern auf anderen Genen genauer zu detektieren.

Tierärztliche Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 07/07
Elektrophysiologische Studien, Impedanzmessungen und Histologie bei PTFEP-beschichteten Cochlea-Implantaten am Meerschweinchen-Modell

Tierärztliche Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 07/07

Play Episode Listen Later Jul 18, 2015


Die Cochlea-Implantat (CI)-Forschung ist ständig bestrebt, CI-Elektroden weiterzuentwickeln sowie neue Implantattypen zu etablieren, um einen immer besseren Höreindruck bei den CI-Patienten zu erzeugen. Ein entscheidendes Ziel in diesem Zusammenhang ist es, chronische Entzündungsprozesse und fibrotische Gewebeproliferationen, die als Reaktion auf den implantierten Fremdkörper in der Cochlea auftreten können, zu minimieren. So können bindegewebige Einkapselungen des Implantates zu einer Erhöhung der Impedanzen an den Elektrodenkontakten und damit zu einer geringeren Spannbreite in der Dynamik, also dem Lautstärkebereich, führen. Weiterhin können die cochleäre Mechanik wie auch die Signaltransduktion zum Hörnerv durch fibrotische Gewebereaktionen beeinträchtigt werden. Darüber hinaus können chronisch inflammatorische Prozesse eine fortschreitende Zerstörung sensorineuraler Strukturen in der Cochlea verursachen. Es gibt verschiedene Ansätze, diesen implantationsbedingten chronischen Entzündungsprozessen und fibrotischen Proliferationen entgegenzuwirken. Eine erfolgversprechende Methode zielt darauf ab, die chemische Zusammensetzung der Materialien auf der Oberfläche des Implantates zu modifizieren. Poly[bis(trifluoroethoxy)phosphazen] (PTFEP) ist ein hoch biokompatibles, anorganisches Polymer, das bereits erfolgreich als passivierende Oberflächenbeschichtung von kardiovaskulären Stents eingesetzt wird. In dieser in-vivo Studie am Meerschweinchen-Modell wurde PTFEP erstmals als Oberflächenbeschichtung von CIs untersucht. Impedanzuntersuchungen und ABR-Hörmessungen implantierter Meerschweinchen (mit oder ohne Beschichtung) wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Implantation (Woche 1, 2, 5, 9, 12 und 16) durchgeführt. Ferner wurde 16 Wochen nach der Implantation eine abschließende histologische Untersuchung der Cochleae einschließlich einer immunhistologischen Analyse von degenerierten Spiralganglienzellen (SGN) vorgenommen. Obwohl die Hörmessungen zwar in keinem Frequenzbereich einen signifikanten Unterschied zwischen beiden Gruppen ergaben, zeigten Meerschweinchen mit beschichteten Implantaten dennoch ein zumindest tendenziell besseres Hörvermögen in den hohen Frequenzbereichen (4-32 kHz). Die histologische Untersuchung zeigte bei Cochleae mit beschichteten Implantaten zudem eine signifikant geringere lymphoplasmatische Infiltration der basalen Windung (p = 0,012). Ein überraschendes und zugleich positives Ergebnis war außerdem, dass der SGN-Verlust in der basalen Windung bei beschichteten Implantaten gegenüber unbeschichteten Implantaten nach 16 Wochen signifikant geringer war (p = 0,003). Trotz dieser vielversprechenden Resultate sind dennoch weiterführende Untersuchungen nötig, da bei beiden Implantat-Typen kein signifikanter Unterschied hinsichtlich der Anzahl an Fremdkörperriesenzellen (p = 0,800) zu erkennen war. Weiterhin konnten keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der bindegewebigen Proliferationen (p = 0,382) und der Knochenneubildung (p = 0,239) beobachtet werden. Es ist daher davon auszugehen, dass eine PTFEP-Beschichtung keinen direkten Einfluss auf die bindegewebigen Proliferationen um das Implantat hatte und eine Fremdkörperreaktion auf das Implantat in der Cochlea nicht unterdrücken konnte. Ein unerwartetes Ergebnis ergaben auch die Impedanzmessungen. Die Ausgangsmessungen an Tag 0 unmittelbar nach der Implantation zeigten bei beschichteten Implantaten signifikant geringere Impedanzwerte im Vergleich zu unbeschichteten Implantaten (basaler Elektrodenkontakt: p = 0,019, apikaler Elektrodenkontakt: p = 0,024). Ab dem nächsten Messzeitpunkt Woche 1 bis zum Messzeitpunkt Woche 12 jedoch waren die Impedanzen bei den PTFEP-beschichteten Implantaten signifikant größer statt, wie zu erwarten war, kleiner. Die Ursachen für dieses überraschende Ergebnis konnten in dieser Untersuchung allerdings nicht hinreichend geklärt werden und müssen in Folgestudien weiter evaluiert werden. Die Studie konnte zeigen, dass die hoch biokompatible Beschichtung möglicherweise einer mononukleären Infiltration in der basalen Windung und einer Degeneration von Spiralganglienzellen nach der Implantation entgegenwirkt. Diese passive Beschichtung scheint daher ein vielversprechender Ansatz zur Verbesserung künftiger Implantate zu sein, möglicherweise in Kombination mit anti-inflammatorischen, pharmakologisch aktiven Substanzen, wie beispielsweise Glukokortikoiden. Dennoch wird es notwendig sein, weitere Untersuchung durchzuführen, da andere Parameter in der histologischen Untersuchung sowie die Hörmessungen keinen signifikanten Unterschied zwischen beschichteten und unbeschichteten Implantaten ergaben. Auch führten die Impedanzmessungen zu unerwarteten Ergebnissen und bedürfen einer Evaluation in weiteren Untersuchungen.

Tierärztliche Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 07/07
Relevanz des signaltransduzierenden Adaptorproteins Paxillin für den Lebenszyklus des Hepatitis-B-Virus

Tierärztliche Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 07/07

Play Episode Listen Later Jul 18, 2015


Am 28. Juli 2014 rief die Weltgesundheitsorganisation (WHO) erneut zum World Hepatitis Day auf. Zusammen mit der World Hepatitis Alliance kämpft die WHO für das aktive Einschreiten der Regierungen gegen Infektionserkrankungen auf der ganzen Welt, für bessere Präventionsprogramme und den Zugang zu Impfstoffen und Medikamenten auch für die Menschen in Entwicklungsländern. Ein Hauptvertreter der Krankheit ist das Hepatitis-B-Virus (HBV). Warum hat HBV eine solche Relevanz für die gesamte Weltbevölkerung? Die globale Ausbreitung dieses Erregers ist immens und betrifft zur Zeit etwa zwei Milliarden Menschen. Diese sind an einer akuten oder chronischen Form erkrankt oder haben eine HBV-Erkrankung überstanden. Über 600.000 Menschen sterben jährlich daran. Schätzungsweise 350 Millionen Menschen weltweit leben mit einer chronischen HBV-Infektion und tragen ein sehr hohes Risiko, an Leberzirrhose oder dem hepatozellulärem Karzinom (HCC) zu erkranken (Ott et al., 2012; Teh and Sasadeusz, 2014). Durch die ubiquitäre Verteilung des Virus weisen Regionen wie Südostasien und Subsahara-Afrika eine hohe Prävalenz auf. Weniger als 1 % der Bevölkerung in Westeuropa, Nordamerika und Australien sind Träger einer chronischen Hepatitis-B-Virusinfektion (Janahi, 2014). Trotz der präventiven Impfung und Behandlung von Patienten mit antiviralen Langzeittherapien ist die Entwicklung von Methoden der Resistenzvermeidung und das Aufstellen neuer Konzepte zum Schutz von non-respondern in der Zukunft unumgänglich (Zuckerman, 1996). Nicht nur die Suche nach einem therapeutischen Impfstoff und effizienteren Medikamenten treibt die Forschung voran, auch sind viele Fragen des Lebenszyklus des Hepatitis-B-Virus nur teilweise entschlüsselt. Die Wissenschaft kann noch keine Antwort über den genauen Viruseintritt in die Leberzellen sowie die komplexe Bedeutung der subviralen Partikel geben. Auf diesem Gebiet ist Grundlagenforschung unerlässlich. Für eine gute Replikation benötigt das Hepatitis-B-Virus eine sessile Zelle. Es sind fokale Adhäsionen vorhanden, welche eine entscheidene Rolle bei der Zelladhäsion und Zellwanderung spielen (Gallant et al., 2002). Das Protein Paxillin (PXN) ist ein wichtiger Baustein bei der Koordination der Signaltransduktion zwischen extrazellulärer Matrix (EZM), den fokalen Adhäsionen und dem Aktin-Zytoskelett. Paxillin agiert als Vermittler zwischen vielfältigsten biologischen Makromolekülen (Schaller, 2001; Brown and Turner, 2004). Diese Erkenntnisse sind Ausgangspunkt für die weitere Forschung nach der Verbindung des signaltransduzierenden Adapterproteins Paxillin und dem Lebenszyklus des Hepatitis-B-Virus.

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 18/19
Relevanz posttranslationaler Modifikation der Glutathionperoxidase 4 (Gpx4) in der Signaltransduktion sowie Identifizierung genetischer Polymorphismen der humanen GPX4 zur präferenziellen Ausbildung einer delayed graft function (DGF)

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 18/19

Play Episode Listen Later Jul 2, 2015


Thu, 2 Jul 2015 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/18395/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/18395/1/Seibt_Tob

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 05/06
Strukturelle und funktionale Analyse der Effektordomäne des pH-abhängigen Einkomponentensystems CadC in Escherichia coli

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 05/06

Play Episode Listen Later May 6, 2015


Das Einkomponentensystem CadC in Escherichia coli zählt zur Gruppe der ToxR-ähnlichen Transkriptionsregulatoren und aktiviert bei niedrigem pH-Wert die Expression des cadBA-Operons, einem Säure-induzierbaren Lysin-Decarboxylase-System. Transkriptionsregulatoren der ToxR-Familie zeichnen sich durch einen gemeinsamen modularen Aufbau aus und bestehen aus einer periplasmatischen Sensordomäne, einer Transmembranhelix und einer zytoplasmatischen Effektordomäne. Die Signalwahrnehmung, -weiterleitung und -verarbeitung erfolgt bei den ToxR-ähnlichen Transkriptionsregulatoren innerhalb eines einzelnen Proteins. Die molekularen Mechanismen der Reizwahrnehmung durch CadC sind bekannt, die Signalweiterleitung und -verarbeitung im Zytoplasma sind hingegen weitgehend ungeklärt. In CadC ist ein zytoplasmatischer Linker (51 Aminosäuren) essentiell für die Signaltransduktion von der sensorischen Domäne zur DNA-Bindedomäne. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der Mechanismus der Signalweiterleitung von der sensorischen Domäne zur DNA-Bindedomäne untersucht. Mit Hilfe der Kernspinresonanzspektroskopie konnte gezeigt werden, dass die Linkerregion unstrukturiert vorliegt. Im Rahmen einer umfangreichen Mutagenesestudie wurde beobachtet, dass sowohl eine Vielzahl an Aminosäuresubstitutionen (Veränderungen der Ladung, der Rigidität oder der Wahrscheinlichkeit zur Bildung einer α-Helix) als auch die Verlängerung des CadC-Linkers zu keiner funktionellen Beeinträchtigung führte. Jedoch wurde die Signalverarbeitung im Zytoplasma durch Verkürzung des Linkers modifiziert und verursachte ein invertiertes Expressionsprofil des Zieloperons cadBA oder die Entkopplung der Expression vom externen pH. Der Linkerregion in CadC konnte keine Rolle in der Oligomerisierung zugeordnet werden. Unabhängig vom Linker wurde in einer in vivo Interaktionsstudie eine pH-abhängige Interaktion (pH < 6,8) zwischen CadC-Monomeren gezeigt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Röntgenkristallstruktur (2,0 Ångström) und in einem parallelen Ansatz die NMR-Struktur (0,46 backbone RMSD) der zytoplasmatischen Effektordomäne in CadC als erste dreidimensionale Struktur der DNA-Bindedomäne eines ToxR-ähnlichen Regulators aufgeklärt. In der Struktur von CadC1-107 wurde ein „winged Helix-Turn-Helix“-Motiv aus der Familie der OmpR-ähnlichen Transkriptionsregulatoren beobachtet. Im Gegensatz zu der Topologie bereits gelöster OmpR-ähnlichen Regulatoren enthält CadC am Übergang von DNA-Bindedomäne und Linkerregion einen zusätzlichen β-Strang (β-Strang 7), welcher sich stabilisierend auf die DNA-Bindung auswirken könnte. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde der DNA-Bindemechanismus von CadC an den cadBA-Promotor untersucht. In in vitro Versuchen zur Bindung von löslichen CadC-Varianten an DNA konnte eine sehr geringe Dissoziationsrate beobachtet werden. Somit ist nicht die Affinität zur DNA sondern die Stimulus-abhängige Interaktion von CadC mit der α-Untereinheit der RNA-Polymerase essentiell für die Aktivierung des cadBA-Operons. Außerdem wurden, basierend auf der Kristallstruktur der DNA-Bindedomäne von CadC Aminosäuresubstitutionen durchgeführt. Die Aminosäure His66 in der Erkennungshelix α3 ist an der Interaktion mit der großen Furche der DNA beteiligt, während die Aminosäuren Lys95 und Arg96 die Interaktion mit der kleinen Furche der DNA vermitteln. Die Ergebnisse dieser Arbeit postulieren ein Modell zur Signalverarbeitung in CadC, in welchem die Signalwahrnehmung im Periplasma zu konformationellen Veränderungen des unstrukturierten CadC-Linkers führt und somit die räumliche Positionierung der DNA-Bindedomänen im CadC-Dimer ermöglicht wird.

Modellansatz
Systembiologie

Modellansatz

Play Episode Listen Later Nov 27, 2014 93:01


Auf den Vorschlag von Henning Krause verbreiteten viele Forschende unter dem Hashtag #1TweetForschung ihr Forschungsthema in Kurzform. So auch Lorenz Adlung, der in der Abteilung Systembiologie der Signaltransduktion am Deutschen Krebsforschungszentrum in Heidelberg die mathematische Modellbildung für biologische Prozesse erforscht. Bei der Anwendung einer Chemotherapie leiden Krebspatienten oft unter Blutarmut. Hier kann neben der Bluttransfusion das Hormon Erythropoetin, kurz EPO, helfen, da es die körpereigene Erzeugung von roten Blutkörperchen (Erythrozyten) unterstützt. Leider ist EPO als Dopingmittel bekannt, und um dem Doping noch deutlicher Einhalt zu gebieten, wurde im November 2014 in Deutschland ein Entwurf eines Anti-Doping-Gesetz vorgelegt. Trotz gängigem Einsatz und erprobter Wirkung von EPO ist die genaue Wirkung von EPO auf Krebszellen nicht bekannt. Daher verfolgt Lorenz Adlung den Ansatz der Systembiologie, um im Zusammenwirken von Modellbildung und Mathematik, Biologie und Simulationen sowohl qualitativ und quantitativ analysieren und bewerten zu können. Vereinfacht sind rote Blutkörperchen kleine Sauerstoff-transportierende Säckchen aus Hämoglobin, die auch die rote Farbe des Bluts verursachen. Sie stammen ursprünglich aus Stammzellen, aus denen sich im Differenzierungs-Prozess Vorläuferzellen bzw. Progenitorzellen bilden, die wiederum durch weitere Spezialisierung zu roten Blutkörperchen werden. Da es nur wenige Stammzellen gibt, aus denen eine unglaubliche große Anzahl von Trillionen von Blutkörperchen werden müssen, gibt es verschiedene Teilungs- bzw. Proliferationsprozesse. Das Ganze ergibt einen sehr komplexen Prozess, dessen Verständnis zu neuen Methoden zur Vermehrung von roten Blutkörperchen führen können. Den durch Differenzierung und Proliferation gekennzeichnete Prozess kann man mathematisch beschreiben. Eine zentrale Ansichtsweise in der Systembiologie der Signaltransduktion ist, Zellen als informationsverarbeitende Objekte zu verstehen, die zum Beispiel auf die Information einer höheren EPO-Konzentration in der Umgebung reagieren. Von diesem Ansatz werden durch Messungen Modelle und Parameter bestimmt, die das Verhalten angemessen beschreiben können. Diese Modelle werden in Einklang mit bekannten Prozessen auf molekularer Ebene gebracht, um mehr über die Abläufe zu lernen. Die erforderlichen quantitativen Messungen basieren sowohl auf manuellem Abzählen unter dem Mikroskop, als auch der Durchflusszytometrie, bei der durch Streuung von Laserlicht an Zellen durch Verwendung von Markern sogar Aussagen über die Zelloberflächen getroffen werden können. Zusätzlich kann mit der Massenspektrometrie auch das Innere von Zellen ausgemessen werden. In diesem Anwendungsfall werden die mathematischen Modelle in der Regel durch gekoppelte gewöhnliche Differenzialgleichungen beschrieben, die Zell- oder Proteinkonzentrationen über die Zeit beschreiben. Die Differenzialgleichungen und deren Parameter werden dabei sowohl mit Messungen kalibriert, als auch mit den Kenntnissen in der Molekularbiologie in Einklang gebracht. Die Anzahl der Parameter ist aber oft zu hoch, um naiv auf geeignete zu den Messungen passende Werte zu gelangen. Daher wird unter anderem das Latin Hypercube Sampling verwendet, um schnell nahe sinnvollen Parameterwerten zu gelangen, die durch gradienten-basierte Optimierungsverfahren verbessert werden können. Die Basis für diese Art von Optimierungsverfahren ist das Newton-Verfahren, mit dem man Nullstellen von Funktionen finden kann. Ein wichtiger Aspekt im Umgang mit Messergebnissen ist die Berücksichtigung von Messfehlern, die auch vom Wert der Messung abhängig verstanden werden muss- denn nahe der Messgenauigkeit oder der Sättigung können die relativen Fehler extrem groß werden. Die Bestimmung der Modellparameter ist schließlich auch ein Parameteridentifikationsproblem, wo insbesondere durch eine Sensitivitätsanalyse auch der Einfluss der geschätzten Parameter bestimmt werden kann. Sowohl die Parameter als auch die Sensitivitäten werden mit den biologischen Prozessen analysiert, ob die Ergebnisse stimmig sind, oder vielleicht auf neue Zusammenhänge gedeuten werden können. Hier ist die Hauptkomponentenanalyse ein wichtiges Werkzeug, um zentrale beeinflussende Faktoren erfassen zu können. Ein wichtiges Ziel der Modellbildung ist die numerische Simulation von Vorgängen, die als digitale Experimente sich zu einem eigenen Bereich der experimentellen Forschung entwickelt haben. Darüber hinaus ermöglicht das digitale Modell auch die optimale Planung von Experimenten, um bestimmte Fragestellungen möglichst gut untersuchen zu können. Die Umsetzung auf dem Computer erfolgt unter anderem mit Matlab, R (The R Project for Statistical Computing) und mit der spezialisierten und freien Software D2D - Data to Dynamics.Literatur und Zusatzinformationen M. Boehm, L. Adlung, M. Schilling, S. Roth, U. Klingmüller, W. Lehmann: Identification of Isoform-Specific Dynamics in Phosphorylation-Dependent STAT5 Dimerization by Quantitative Mass Spectrometry and Mathematical Modeling, Journal of Proteome Research, American Chemical Society, 2014. (PubMed) Studium der Systembiologie D2D-Software L. Adlung, C. Hopp, A. Köthe, N. Schnellbächer, O. Staufer: Tutorium Mathe für Biologen, Springer Spektrum, 2014. Science: NextGen Voices zur globalen wissenschaftlichen Zusammenarbeit- mit Lorenz Adlung Lorenz Adlung auf Twitter L. Adlung, et. al: Synbio meets Poetry, CreateSpace, 2013. Kollaborationspartner: U.a. Thomas Höfer, Heidelberg, Jens Timmer, Freiburg i. B., Fabian Theis, München Resonator-Podcast 015: DKFZ-Forscher Christof von Kalle Resonator-Podcast 014: Das DKFZ in Heidelberg Omega Tau-Podcast 069: Grundlagen der Zellbiologie Omega Tau-Podcast 072: Forschung in der Zellbiologie Konscience-Podcast 024, Kapitel 5: Das Hochlandgen aus "Wie kam das bloß durch die Ethikkommission?"

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 17/19
Proteolytische Spaltung und Signaltransduktion des tumorassoziierten Antigens EpCAM in murinen Teratom- und embryonalen Stammzellen

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 17/19

Play Episode Listen Later Oct 9, 2014


Thu, 9 Oct 2014 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/17544/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/17544/1/Hachmeister_Matthias.pdf Hachmeister, Matthias

Fakultät für Physik - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 05/05
Cortical actomyosin network organization in epithelial cells

Fakultät für Physik - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 05/05

Play Episode Listen Later Jun 5, 2014


Epithelzellen, die Modell-Zelllinien dieser Dissertation, sind für die Aufteilung und Abtrennung verschiedener Kompartimente eines Organismus zuständig, indem sie sich zu Grenzflächen zusammenschliessen, welche häufig hohen physikalischen Spannungen und Kräften ausgesetzt sind. Um diese physikalischen Kräfte zu verarbeiten oder sie selbst zu produzieren, verwenden Epithelzellen, wie alle anderen Zelltypen auch, das Zytoskelett, das sich im Allgemeinen aus den Komponenten Mikrotubuli, Intermediär-Filamenten und Aktin sowie den damit korrespondierenden Motorproteinen Dynein, Kinesin sowie Myosin zusammensetzt. In dieser Dissertation wird das Zusammenspiel von Aktin und Myosin auf der apikalen Seite von Epithelzellen untersucht. Im Falle von konfluenten Zellen mit vollständig ausgebildeten Zell-Zell-Kontakten sind auf der apikalen Seite der Zellen Mikrovilli zu finden, kleine, mit Aktin-Bündeln gefüllte Ausstülpungen aus der Zelloberfläche, welche für die optimierte Nahrungsaufnahme sowie als Antennen für Signalverarbeitung zuständig sind. Im Zuge der Arbeit konnten wir feststellen, dass sich der Aktin-Myosin-Aufbau auf der apikalen Seite von Einzelzellen ohne Zell-Zell-Kontakte, sogenannten nicht-konfluenten Zellen, grundsätzlich ändert. Mittels Fluoreszenz-Mikroskopie und anderen experimentellen Methoden zeigen wir, dass zwar ähnliche Ausstülpungen auf der apikalen Oberfläche von Einzelzellen zu finden, diese jedoch häufig verlängert, gebogen, hoch-dynamisch und oft parallel zur Zellmembran orientiert sind. Wir zeigen mittels molekularbiologischer Methoden, dass ein zusätzliches, innerhalb der apikalen Zellmembran liegendes isotropes Akto-Myosin-Netzwerk für die dynamische Reorganisation der Mikrovilli-Ausstülpungen verantwortlich ist. Der Identifzierung des isotropen Akto-Myosin-Netzwerkes, welches eine der Hauptaussagen dieser Dissertation ist, wird eine detaillierte Analyse der dynamischen Netzwerkreorganisation angefügt, die mittels temporaler und örtlicher Bild-Korrelationsanalysen charakteristische Zeiten und Längen der Dynamik definiert. Des Weiteren entwickeln wir mehrere Bild- Analyseverfahren, allen voran die Methode der iterativen temporalen Bildkorellation sowie des optischen Flusses, wodurch wir eine Oszillation der Netzwerk-Reorganisationsgeschwindigkeit identifizieren und parametrisieren können. Verschiedene, auf Fluoreszenzmikroskopie und automatisierter optischer Fluss-Bildanalyse basierende Experimente geben Hinweise auf zwei mögliche Erklärungen für die identifizierten Oszillationen. Sowohl Myosin aktivitätsregulierende Proteine als auch spontan auftretende Spannungsfluktuationen im unter Zugspannung liegenden Netzwerk können mögliche Ursachen für die identifizierten Netzwerkoszillationen sein. Obwohl eine eindeutige zelluläre Funktion des apikalen Akto-Myosin-Netzwerkes im Rahmen dieser Doktorarbeit noch nicht identifiziert werden konnte, so können wir aufgrund von verschiedenen Resultaten dennoch postulieren, dass das hier identifizierte Netzwerk eine entscheidende Rolle bei der Zellmigration und Signaltransduktion einnimmt. Unabhängig davon repräsentiert das hier gefundene Netzwerk die faszinierende Möglichkeit, ein aktives, zweidimensionales Akto-Myosin-Netzwerk nicht nur in vitro, sondern in seiner natürlichen Umgebung studieren und biophysikalische Eigenschaften analysieren zu können.

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 16/19
Molekulare Regulationsmechanismen der Frizzled 8-Transkription in humanen Fibrosarkomzellen und mesenchymalen Stammzellen

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 16/19

Play Episode Listen Later Jan 9, 2014


Der in der Evolution hochkonservierte Wnt-Signalweg spielt in der Embryonalentwicklung, der Stammzellbiologie sowie in der Entstehung von Tumoren eine tragende Rolle. Es werden dabei verschiedene Arten der Wnt-vermittelten Signalübertragung unterschieden: Einerseits der sogenannte kanonische, über β-Catenin vermittelte Wnt-Signalweg und andererseits der Wnt/Ca2+- sowie der planar cell polarity (PCP)-like-Weg, die beide die Signaltransduktion unabhängig von β-Catenin übermitteln. Bislang sind die Mechanismen des Wnt/β-Catenin-Signalweges nur teilweise aufgeklärt, wobei insbesondere das Zusammenspiel von Wnts, Frizzleds und deren Korezeptoren auf funktioneller und struktureller Ebene bis heute nur rudimentär beschrieben wurden. In unserer Arbeitsgruppe konnte in vorangegangenen Arbeiten gezeigt werden, dass der Frizzled-8-Rezeptor (Fzd8) in HT1080-Fibrosarkomzellen im Verhältnis zu den übrigen Fzds sehr stark exprimiert wird und seine erhöhte Expression mit einer Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Signalweges sowie mit einer erhöhten Invasivität und Proliferation assoziiert ist (Leitenstern et al., mündliche Mitteilung). Ferner wurde gezeigt, dass die Expression von Fzd8 durch Wnt3a bzw. den kanonischen Wnt-Signalweg negativ reguliert wird (Karow 2008; Kolben, Perobner et al. 2012). Vor diesem Hintergrund sollte nun im Rahmen dieser Arbeit mit Hilfe von Reportergenexperimenten die transkriptionelle Regulation von Fzd8 im Detail untersucht werden. Hierzu wurden die Fzd8-Promotorregion und verschiedene 5’- und 3’-terminale Verkürzungsvarianten in den Vektor pGLuc-Basic kloniert, der eine Quantifizierung der Promotoraktivität mittels des Reporterproteins Gaussia Luciferase erlaubt. Der Fzd8-Promotor konnte durch dieses Verfahren in aktivierende und repressive Elemente unterteilt werden, wobei auch ein putatives Enhancer-Element identifiziert werden konnte. Unter Wnt3a-Stimulation zeigten alle untersuchten Promotorkonstrukte eine verringerte Reporterproteinaktivität, was auf eine negative Regulation von Fzd8 durch Wnt3a hinweist. Interessanterweise aber führten Manipulationen am Wnt/β-Catenin-Signalweg weiter downstream zu entgegengesetzten Ergebnissen. So führte ein APC-Knockdown, der mit einer starken Aktivitätszunahme des Wnt/β-Catenin-Signalweges einhergeht, zu einer Zunahme der Fzd8-Promotoraktivität. Im Gegensatz hierzu ging ein Knockdown von β-Catenin, der einer Inhibierung des Wnt/β-Catenin-Signalweges gleichkommt, mit einer verminderten Fzd8-Promotoraktivität einher. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Wnt3a-vermittelte Repression von Fzd8 auch unabhängig vom kanonischen Wnt/β-Catenin-Signalweg erfolgen könnte. Des Weiteren wurde die Fzd8-Promotorregion einer in silico-Analyse mit der Software MatInspector unterzogen, um mögliche Transkriptionsfaktoren zu identifizieren, die für die Fzd8-Regulation maßgeblich sein könnten. Dabei zeigte sich, dass der Transkriptionsfaktor ZF5, der sowohl aktivierend als auch reprimierend an verschiedenen Promotoren wirken kann, aufgrund des Verteilungsmusters seiner Bindungsstellen am Fzd8-Promotor als möglicher Regulator fungieren könnte. ZF5 konnte dabei als putativ positives Wnt/β-Catenin-Zielgen charakterisiert werden. Es konnte ferner gezeigt werden, dass Fzd8 indirekt über ZF5 durch den Wnt/β-Catenin-Signalweg induziert werden kann. Da ZF5 wie auch Fzd8 in HT1080-Fibrosarkomzellen stark exprimiert wird und die ZF5-Überexpression mit einer Zunahme des Wnt/β-Catenin-Signals einhergeht, könnte hier ein positiver feedback loop vorliegen. Somit könnte diese Amplifikation des Wnt/β-Catenin-Signals von maßgeblicher Bedeutung für die verstärkte Proliferation und Invasivität von mesodermalen Tumoren sein.

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 16/19
Die Bradykinin B1 und B2 Rezeptoren als Modell für die Untersuchung der Regulation G-Protein-gekoppelter Rezeptoren

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 16/19

Play Episode Listen Later Dec 5, 2013


Die Familie A der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) bildet die größte und vielfältigste aller Transmembranrezeptorfamilien. Ihre Mitglieder spielen eine wesentliche Rolle in fast allen (patho)physiologischen Prozessen. Nach Agonistenbindung aktivieren GPCRs, wie ihr Name andeutet, heterotrimere G-Proteine aber auch G-Protein-unabhängige Signalwege. Die verschiedenen aktiven G-Proteinuntereinheiten (Gα-GTP und βγ) induzieren nach Dissoziation vom Rezeptor entsprechende Signalkaskaden z.B. über Phospholipase A und Cβ. Um eine Fehlregulation zellulärer Prozesse z.B. durch „Überstimulation“ zu verhindern, unterliegen GPCRs strengen Regulationsmechanismen, die ihre Fähigkeit zur Signaltransduktion und ihre Verfügbarkeit an der Zelloberfläche bestimmen. Die Bradykininrezeptoren B1 und B2 (B1R, B2R) gehören zur Familie A der GPCRs, also zu den Rhodopsin-ähnlichen GPCRs, und werden durch die pro-inflammatorischen Peptide desArg9-Bradykinin/desArg10-Kallidin (DABK/DAK) bzw. Bradykinin (BK)/Kallidin aktiviert. Im Gegensatz zum konstitutiv exprimierten B2R, der nach Stimulation schnell desensitisiert und internalisiert wird, erfolgt eine B1R-Expression fast ausschließlich unter pathophysiologischen Bedingungen über Induktion durch Zytokine. Nach Stimulation wird der B1R nicht internalisiert, sondern verbleibt an der Zelloberfläche. Beide Rezeptoren koppeln sowohl an Gαq/11 als auch an Gαi und aktivieren somit weitgehend identische Signalwege [vor allem Phospholipase Cβ (PLCβ) und „mitogen activated protein kinase“ (MAPK)-Kaskaden]. Durch ihre - besonders im Hinblick auf ihre Internalisierungs-eigenschaften - konträre Regulation, stellen die Bradykininrezeptoren ein interessantes Modell zur Untersuchung regulatorischer Mechanismen und deren Einflüsse auf die Signalübertragung von GPCRs dar. Beide Bradykininrezeptoren spielen bei inflammatorischen Prozessen eine Rolle. Sie fördern die Ausschüttung pro-inflammatorischer Zytokine und rekrutieren Immunzellen. Während entzündlicher Ereignisse kommt es zu erhöhter Zytokinfreisetzung z.B. von Interleukin-1β (IL-1β) und dadurch zur de novo Synthese von B1R. Pro-inflammatorische Zytokine wie IL-1β, die zur B1R-Expression führen, induzieren unter anderem aber auch einen Anstieg der Körpertemperatur (Fieber), eine häufige Begleiterscheinung inflammatorischer Vorgänge. Trotz des bekannten Zusammenhangs zwischen Inflammation und erhöhter Temperatur war über den Einfluss eines Temperaturanstiegs auf Membranrezeptoren und ihre Signalvermittlung auf zellulärer Ebene bisher nur sehr wenig bekannt. In dieser Arbeit wurde - unseres Wissens nach - erstmals auf die Temperatur als regulatorische Komponente für GPCR-vermittelte Signalübertragung eingegangen. Am Beispiel der Bradykininrezeptoren wurde gezeigt, dass die Stärke der Signalübertragung von GPCRs signifikant durch eine Temperaturerhöhung von 37°C auf 41°C beeinflusst werden kann. Hierbei war jedoch zwischen einer Temperaturabhängigkeit des Signalwegs selbst und einer rezeptorspezifischen Temperatursensitivität zu unterscheiden. So wurde die Aktivierung von ERK1/2 unter pathophysiologisch erhöhter Temperatur (41°C; normale Körpertemperatur: 37°C) signifikant gesteigert, unabhängig davon ob sie durch B1 oder B2 Rezeptoren stimuliert wurde. Die gesteigerte Aktivität PLCβ-vermittelter Signalkaskaden bei 41°C konnte hingegen auf eine nur für den B1R spezifische Temperaturabhängigkeit zurückgeführt werden. Diese Beobachtung zusammen mit der Tatsache, dass die B1R-Expression unter pathophysiologischen Bedingungen besonders induziert wird, deutet darauf hin, dass der B1R in Kombination mit Fieber eine verstärkte Wirkung im Organismus haben könnte. Ob diese Heilungs-fördernd oder -abträglich wirkt, müsste noch genauer untersucht werden. Neben dem Einfluss der Temperatur wird die Signalübertragung der GPCRs durch die jeweiligen Rezeptorkonformationen und die sich daraus ergebenden Funktionsunterschiede bestimmt. Die Familie A der GPCRs wird durch einige hoch konservierte Strukturmerkmale wie die E/DRY-Sequenz mit R3.50 in der dritten Transmembrandomäne (TM) oder die NPXXY-Sequenz am Ende der siebten TM charakterisiert. Publizierte Ergebnisse deuten darauf hin, dass bovines Rhodopsin durch eine Salzbrücke zwischen R3.50135 (TM3) und E6.30247 (TM6), auch „ionic lock“ genannt, im inaktiven Zustand gehalten wird. Der B2R ist einer der wenigen Peptid-GPCRs, der ein Glutamat an Position 6.30 (E6.30238) trägt, und eignete sich daher zur Untersuchung der Anwesenheit und Funktion eines möglichen „ionic lock“ auch in „nicht-Rhodopsin“-GPCRs. Für alle bisher entsprechend untersuchten GPCRs ist bekannt, dass R3.50 für eine effiziente G-Protein-Aktivierung unabdingbar ist (selbiges wurde in der vorliegenden Arbeit auch für den B2R bestätigt). Die funktionelle Analyse eines „ionic lock“ anhand einer R3.50 Mutation und G-Protein-abhängiger Kaskaden ist deshalb nicht möglich. Die Rolle eines „ionic lock“ im Hinblick auf G-Protein-unabhängige Mechanismen wie die Rezeptorinternalisierung, einem wichtigen Regulationsschritt für die meisten GPCRs, wurde bisher jedoch noch nicht untersucht. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals gezeigt, dass die Rezeptorendozytose durch Mutation von R3.50128 zu Alanin (R3.50128A), im Gegensatz zur G-Protein-Aktivierung, nicht zum Erliegen kommt. Die mutierten Rezeptorkonstrukte wiesen sogar ein konstitutives Internalisierungsverhalten auf. Dies verwies auf unterschiedliche Funktionen dieser Aminosäure bei der G-Protein-vermittelten Signaltransduktion und bei der Rezeptorinternalisierung. Ein Aufbrechen des möglichen „ionic lock“ durch Mutation von E6.30238 zu Alanin oder Arginin resultierte ebenfalls in konstitutiv internalisierenden Rezeptorkonstrukten. Im Gegensatz zur Endozytose zeigten diese Mutanten zwar keine konstitutive Signalübertragung, wurden aber auch durch prinzipiell als Antagonisten klassifizierte Verbindungen effizient aktiviert. Diese Ergebnisse legen einen mehrstufigen Aktivierungsprozess nahe, dessen Stufen sich durch verschiedene Rezeptorkonformationen mit unterschiedlichen Interaktionsmöglichkeiten für die G-Protein-Rekrutierung/Aktivierung oder mit der Internalisierungsmaschinerie [GPCR-Kinasen (GRKs), Arrestine] auszeichnen. Der wechselseitige Austausch der beiden hoch konservierten Aminosäuren R3.50128 und E6.30238 ermöglichte wahrscheinlich die Bildung eines inversen „ionic lock“, wodurch normales B2R-Verhalten wieder hergestellt wurde. Diese Arbeit zeigt somit erstmals, dass ein Aufbrechen eines möglichen „ionic lock“ in einem Peptidrezeptor unterschiedliche Auswirkungen für die Prozesse der G-Protein-Aktivierung und der Rezeptorendozytose haben kann. Dadurch wird die Annahme bestärkt, dass es bei einem GPCR mehrere aktive Konformationen geben kann, die unterschiedliche Affinitäten gegenüber regulatorischen Proteinen (GRKs, Arrestinen) oder Effektoren (G-Proteinen, Arrestinen) aufweisen und dadurch differenziert zelluläre Signale auslösen können. Die Aufklärung der unterschiedlichen Aktivierungsmechanismen von GPCRs in Kombination mit der Herstellung von Verbindungen z.B. sogenannten „small molecule compounds“, die bestimmte Rezeptorkonformationen mit ihren signalspezifischen Eigenschaften stabilisieren können, wäre möglicherweise für die Entwicklung von Agonisten oder Antagonisten, die nur ganz bestimmte Signalwege modulieren und so eine optimierte therapeutische Anwendung erlauben, hilfreich.

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 16/19
Ligandenunabhängige Aktivierung heptahelikaler Transmembranrezeptoren

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 16/19

Play Episode Listen Later Nov 14, 2013


Die vorliegend präsentierten Experimente hatten zum Ziel, die hypothetische Rolle von Gq/11- bzw. G12/13-koppelnden heptahelikalen Transmembrandomänenrezeptoren (7TMR) als Mechanosensoren für die Initiation des myogenen Tonus zu untersuchen. Um festzustellen, welche 7TMR hierfür besonders relevant sind, wurden Leitungsgefäße mit Widerstandsgefäßen in ihren RNA-Leveln für eine Reihe von 7TMR verglichen. Dies geschah auf der Grundlage, dass Leitungsgefäße einen geringeren myogenen Tonus aufweisen als Widerstandsgefäße. Eine aus höheren RNA-Leveln ableitbare größere Anzahl an putativen Sensormolekülen sollte also über eine größere Mechanosensitivität des Gefäßes zu einem höheren Ausmaß an myogener Vasokonstriktion führen. Die RNA-Level wurden mittels quantitativer RT-PCR (qRT-PCR) bestimmt. Die Quantifizierung erfolgte relativ zum geometrischen Mittel dreier Haushaltsgene. Die untersuchten Widerstandsgefäße umfassten kleine Mesenterialarterien, Nierenarterien und Gehirnarterien. Die untersuchten Leitungsgefäße umfassten die A. mesenterica superior, Bauchaorta, A. carotis communis und die Pulmonalarterie. Folgende Rezeptoren stellten sich in der qRT-PCR aufgrund ihres Expressionsprofils als vielversprechende molekulare Sensorproteine in Widerstandsgefäßen heraus: AT1B-Angiotensinrezeptor, ETA-Endothelinrezeptor, V1A-Vasopressinrezeptor, �1A-Adrenozeptor. In einem zweiten Schritt wurde versucht, über pharmakologische Inhibition der vorgenannten Rezeptoren eine Reduktion des myogenen Tonus zu erreichen. Die eingesetzte Methode war die isobare Konstriktionsmessung (Arteriographie) an isolierten kleinen Mesenterialarterien. Die Methode erforderte vor der eigentlichen Applikation der Pharmaka die Registrierung eines myogenen Tonus in Abwesenheit jeglicher Pharmaka. Dann erst wurde der myogene Tonus unter Anwesenheit von Pharmaka ein zweites Mal registriert. Bei der genaueren Analyse des ersten myogenen Tonus fiel dessen bisigmoider Verlauf auf. Möglicherweise liegt dieser charakteristischen Form eine zeitversetzte Aktivierung der an die putativen mechanosensitiven 7TMR koppelnden G-Proteine zugrunde: Zunächst werden wahrscheinlich Gq/11-Proteine aktiviert, dann G12/13-Proteine. Bei der Analyse des Kurvenverlaufs zum zweiten myogenen Tonus zeigte sich unter Kontrollbedingungen, d.h. unter Abwesenheit von Pharmaka, eine Linksverschiebung relativ zum ersten myogenen Tonus. Darüberhinaus änderte sich die Kurvenform von bisigmoid zu monosigmoid. Wahrscheinlich sind auch für diese Charakteristika Eigenheiten der an die putativ mechanosensitiven 7TMR koppelnden G-Proteine verantwortlich: Die im Zuge des ersten myogenen Tonus aktivierten G12/13-Proteine inaktivieren möglicherweise langsamer durch GTP-Hydrolyse als die Gq/11-Proteine. Deshalb könnten zu Beginn des zweiten myogenen Tonus beide G-Protein-Spezies aktiv sein und so die Mechanosensitivität der glatten Muskelzellen drastisch erhöhen, was die Linksverschiebung erklären würde. Die nun konzertiert erfolgende G-Protein-Aktivierung könnte ferner den monosigmoiden Kurvenverlauf erklären. Die Applikation der Pharmaka erfolgte zunächst als Kombination von antagonistischen Substanzen an AT1-, ETA-, V1A- und �1-Rezeptoren. Eingesetzt wurden Candesartan, BQ-123, Relcovaptan und Prazosin. Diese Kombination reduzierte den myogenen Tonus signifikant in seiner Amplitude. Anschließend wurde Prazosin als Monosubstanz getestet. Der Hemmeffekt unterschied sich nicht von der ursprünglichen Viererkombination. Schließlich erfolgte eine Testung der ursprünglichen Kombination unter Auslassung von Prazosin. Auch hier war der hemmende Effekt derselbe. Zur Erklärung dieser Befunde wurde das Konzept der negativen Interferenz herangezogen: Dabei konkurrieren 7TMR um einen limitierten Pool an G-Proteinen. Inverse Agonisten (wie sie die Substanzen Candesartan und Prazosin darstellen) führen zu einer Sequestrierung von G-Proteinen an den jeweiligen Rezeptoren ohne folgende Signaltransduktion. Dabei könnte die Applikation eines inversen Agonisten dieselben Effekte erzielen wie eine kombinierte Applikation. Letztlich konnte durch den hemmenden Effekt von Prazosin für �1-Adrenozeptoren bestätigt werden, dass sie eine mechanosensitive Funktion ausüben. Unter Berücksichtigung der Ergebnisse des qPCR-Teils handelt es sich wahrscheinlich um �1A-Adrenozeptoren. Deren Mechanosensitivität kann einen Teil der Kontraktion glatter Muskelzellen auf einen steigenden intravasalen Druck vermitteln und damit einen entsprechenden Anteil am myogenen Tonus erklären.

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 15/19
Die Funktion des Interferon-regulierenden Faktors 4 in intrarenalen Antigen-präsentierenden Zellen beim akuten Nierenversagen

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 15/19

Play Episode Listen Later Dec 20, 2012


Die Ischämie-Reperfusion in der Niere führt zur Aktivierung des angeborenen Immunsystems mit nachfolgender steriler Entzündungsreaktion und Gewebeschädigung der Niere, das v.a. das Tubulussystem betrifft. Es werden v.a. residente dendritische Zellen aktiviert, die die größte Immunzellpopulation in der Niere darstellen.In der weiteren Signaltransduktion sind v.a. TLR2 und TLR4 involviert, die über MyD88 proinflammatorischen Zytokinen/Chemokinen induzieren. Die proinflammatorische Wirkung wird dabei u.a. über IRF5 bewirkt, das an MyD88 andockt. Diese Funktion wird von IRF4 gehemmt, das als kompetitiver Faktor IRF5 von seiner Bindungsstelle verdrängt. Die negativ regulatorische Wirkung von IRF4 schützt die Niere vor zu starker Entzündung und dadurch vor zu starker Gewebeschädigung. Dadurch wird das Ausmaß des aktuen Nierenversagens reduziert. IRF4 wird durch Sauerstoffradikale im Rahmen der Ischämie-Reperfusion induziert. Nach der Gewebeschädigung und Induktion einer Entzündung wird IRF4 erst verzögert exprimiert, um die Entzündung wieder zu begrenzen.

Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/06
Der Wnt/β-Catenin-Signalweg in humanen mesenchymalen Stammzellen

Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/06

Play Episode Listen Later Nov 27, 2012


Humane mesenchymale Stammzellen (hMSC) haben in den vergangenen Jahren auf-grund ihres potenziellen Einsatzes in der regenerativen Medizin sowie in der Prävention und Behandlung diverser Krankheiten ein großes wissenschaftliches Interesse geweckt. Einen wichtigen Aspekt stellt in diesem Zusammenhang die Regulation von Stammzell-funktionen durch Signalwege wie beispielsweise den Wnt/β-Catenin-Signaltransduk-tionsweg dar. Während am Signalweg beteiligte Komponenten und Teilfunktionen bereits beschrieben sind, existieren bezüglich der Initiation der Signaltransduktion an der Zelloberfläche auf Rezeptorebene lediglich rudimentäre Kenntnisse. Vor diesem Hintergrund wurde in dieser Arbeit die molekulare Funktion der Wnt-Ko-rezeptoren LRP5 und LRP6 (low-density lipoprotein receptor-related protein) im Wnt/β-Catenin-Signalweg von hMSC genauer untersucht. Für die spezifische Quantifizierung β-Catenin-abhängiger Transkriptionsprozesse wurde zunächst ein TCF/LEF-Reportergen-System in hMSC etabliert. In diesem System erfolgt die Expression des Reporterproteins erst nach Translokation von β-Catenin in den Zellkern und dessen Assoziation mit Transkriptionsfaktoren der TCF/LEF-Familie. Im Vergleich mit dem konventionellen TOP/FOP-Flash-Reportergen-System zeigte das TCF/LEF-Reportergen-System eine deutlich höhere Sensitivität. Mittels vergleichender Studien zur molekularen Funktion von LRP5 und LRP6, die neben der RNA-Interferenz (RNAi)-basierten Technologie auch Überexpressionsstudien und Rescue-Experimente beinhalteten, konnte eindeutig gezeigt werden, dass LRP6 eine entscheidende Rolle in der β-Catenin-vermittelten Signaltransduktion von hMSC übernimmt. Nach Applikation von Wnt-3a führte RNAi gegen LRP6 zu einer starken Ab-nahme der Wnt/β-Catenin-Signaltransduktion, wohingegen der Knockdown von LRP5 keine Veränderung zeigte. In einem umgekehrten Ansatz resultierte die Überexpression von LRP6 in einer starken Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Weges, während die Über-expression von LRP5 keinen nachhaltigen Einfluss zeigte. Darüber hinaus führte in LRP6 -Knockdown-hMSC die Überexpression von LRP6 – jedoch nicht die von LRP5 – zur Rekonstitution der Wnt-3a-induzierten, β-Catenin-vermittelten Signaltransduktion. Diese Daten weisen LRP6 als den Hauptrezeptor für die Wnt-3a/β-Catenin-vermittelte Signaltransduktion in hMSC aus, wobei diese Funktion nicht durch LRP5 ersetzt werden kann. Da der Wnt/β-Catenin-Signalweg eng mit Differenzierungsprozessen assoziiert ist, wurde in diesem Kontext die Bedeutung der Wnt-Korezeptoren in hMSC evaluiert. Nach Knockdown von LRP6 war eine Differenzierung in die adipogene Richtung zu beobachten, die mit der Bildung fettähnlicher Vakuolen und einer erhöhten Expression des Transkriptionsfaktors PPAR-γ (Peroxisom-Proliferator-aktivierter Rezeptor-γ) assoziiert war. Unter dem Einsatz adipogener Zusätze konnte die Differenzierung von LRP6-Knockdown-hMSC in fettähnliche Zellen weiter verstärkt werden, was mit einer deutlich gesteigerten Akkumulation von Fettvakuolen sowie einer weiteren Erhöhung der PPAR-γ Expression einherging. Interessanterweise resultierte die Überexpression von LRP6 in diesen fettähnlichen Zellen in einer Zunahme der Wnt/β-Catenin-Signaltransduktion mit einer gleichzeitigen Abnahme der Expression von PPAR-γ. Zusammenfassend zeigen diese Erkenntnisse, dass LRP6 nicht nur in der Wnt-3a-induzierten, β-Catenin-vermittelten Signaltransduktion von hMSC eine tragende Rolle spielt, sondern auch für die Suppression der Differenzierung von hMSC in die adipogene Linie und damit für die Aufrechterhaltung des Stammzellcharakters entscheidend ist. Somit stellt der Wnt-Korezeptor LRP6 ein vielversprechendes Ziel zur therapeutischen Manipulation von hMSC in zukünftigen klinischen Anwendungen, wie z.B. der regenerativen und präventiven Medizin, dar.

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 13/19
Einfluss der endothelialen DNA abhängigen Proteinkinase, DNA-PK, auf wachstumsfaktorabhängige angiogene Prozesse und Signaltransduktion

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 13/19

Play Episode Listen Later Jul 21, 2011


Thu, 21 Jul 2011 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/13297/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/13297/1/Hammitzsch_Ariane.pdf Hammitzsch, Ariane

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 12/19
Einfluss des RGS4-Gens auf Schizophrenie und schizophrenierelevante neuropsychologische Endophänotypen

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 12/19

Play Episode Listen Later Dec 1, 2010


Die Schizophrenie ist eine schwerwiegende psychiatrische Störung, von der weltweit etwa 1% der Bevölkerung betroffen ist. Die multifaktorielle Ätiopathogenese der Erkrankung ist noch weitgehend ungeklärt, wobei eine genetisch bedingte Vulnerabilität im Mittelpunkt steht. Dabei wird von einem polygenen Erbgang ausgegangen, wobei die risikomodulierenden Genvarianten bei verschiedenen Personen möglicherweise in unterschiedlicher Ausprägung vorliegen und für die Erkrankung prädisponieren. Bei der Suche nach kausalen chromosomalen Loci wurden bislang mehrere Gene mit jeweils nur geringen Beiträgen zu Entstehung und Ausprägung der Schizophrenie identifiziert. Dennoch sind die Anzahl der prädisponierenden Genloci, das von jedem Genort übertragene anteilige Risiko sowie epistatische Effekte derzeit unbekannt. Ein Grund für die inkonsistente Ergebnislage wird in der ätiologischen Heterogenität der klinisch-psychiatrischen Diagnose Schizophrenie gesehen. Das Konzept der Endophänotpyen bzw. intermediärer Phänotypen bietet eine Möglichkeit ätiologisch homogenere Subgruppen zu bilden. Endophänotypen sind zeitstabile, quantitativ messbare neurobiologische Korrelate. Es wird angenommen, dass ihre Ätiologie homogener und ihre genetische Determination weniger komplex ist als diejenige klinischer Krankheitsphänotypen. RGS4 ist ein Kandidatengen für Schizophrenie, das auf Chromosom 1 lokalisiert ist, in einer Region, die mit Schizophrenie gekoppelt zu sein scheint. Die Relation von RGS4 zur Pathogenese der Schizophrenie erscheint plausibel, da RGS4-Proteine die zeitliche Koordination und die Dauer der Signaltransduktion spezifischer Neurotransmittersysteme regulieren, die in der Pathophysiologie und der Behandlung der Schizophrenie eine Rolle spielen. Die Expression von RGS4 ist im Neokortex hoch und bei schizophrenen Patienten signifikant reduziert. In mehreren Assoziationsstudien (familienbasierte- und Fall-Kontroll-Designs) wurde ein signifikanter Zusammenhang unterschiedlicher RGS4-Polymorphismen und der Schizophrenie berichtet, wobei die Ergebnislage in Bezug auf die krankheitsassoziierten Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs), Allele und Haplotypen inkonsistent ist. In der vorliegenden Fall-Kontroll-Assoziationsstudie wurde der Zusammenhang von sechs Basenaustauschpolymorphismen des RGS4-Gens und der Schizophrenie an 504 Schizophreniepatienten sowie 1315 deutschstämmigen Kontrollprobanden untersucht. In einer Subgruppe von 102 Patienten und 248 gesunden Kontrollprobanden wurde auch der Zusammenhang der sechs RGS4-Polymorphismen und neuropsychologischen Endophänotypen untersucht. Hierzu wurden die Patienten und Kontrollprobanden mit einer umfassenden neuropsychologischen Testbatterie untersucht. Die sechs SNPs (rs951436, rs951439, rs2661319, rs2842030, rs10759 und rs2063142) wurden mittels iPLEX genotypisiert und die Massen anschließend im MALDI-TOF Massenspektrometer analysiert. Signifikante Assoziationen der untersuchten RGS4-Polymorphismen konnten in dieser Arbeit sowohl mit dem Phänotypen Schizophrenie als auch mit dem neuropsychologischen Endophänotypen verbales Gedächtnis gefunden werden. Drei der untersuchten RGS4-Polymorphismen (rs951436, rs951439, rs2063142) waren mit Schizophrenie assoziiert, ein weiterer (rs10759) zeigte eine Tendenz zur Assoziation. In der Endophänotypen-Studie wurde eine signifikante Assoziation zwischen dem Marker rs2661319 und dem Faktor verbales Gedächtnis gefunden. In einem nächsten Schritt wurde untersucht, ob die Untertests bzw. Indizes, die den Faktor verbales Gedächtnis bilden, ebenfalls mit den analysierten RGS4-Polymorphismen assoziiert sind. Vier RGS4-Marker (951436, rs2661319, rs2842030, rs10759) zeigten eine Assoziation mit unterschiedlichen Indizes des Faktors verbales Gedächtnis, ein Marker (rs2063142) war tendenziell mit einem Index assoziiert. Die durchgeführte Haplotypenanalyse konnte diese Befunde bestätigen. Interessanterweise war das jeweilige C-Allel der Marker rs951436 und rs951439 sowohl mit Schizophrenie als auch mit einer schlechteren Leistung in einem Index assoziiert. Die Resultate der vorliegenden Untersuchung deuten auf einen Zusammenhang des RGS4-Gens sowohl mit Schizophrenie als auch mit dem neuropsychologischen Endophänotypen verbales Gedächtnis hin. Aufgrund der insgesamt jedoch inkonsistenten Ergebnislage im Hinblick auf krankheitsassoziierte SNPs, Allele und Haplotypen des RGS4-Gens sind weitere Studien nötig, um die mit Schizophrenie assoziierten RGS4-Polymorphismen zu identifizieren. Erst wenn die Identifikation der Genvarianten gelungen ist, die mit dem Risiko an Schizophrenie zu erkranken assoziiert sind, können in einem nächsten Schritt die bislang unbekannten molekularen Signalwege untersucht werden, durch deren Kenntnis eine kausale Therapie der Erkrankung ermöglicht würde.

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/06
Funktion von Malt1 in der Antigenrezeptor-induzierten NF-κB Aktivierung in T-Lymphozyten

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/06

Play Episode Listen Later Oct 13, 2010


Antigenstimulation-abhängige NF-κB Aktivierung beeinflusst die adaptive Immunantwort durch Induktion von zytotoxischen und Antikörper-vermittelten Abwehrmechanismen. Die zentrale Schaltstelle der NF-κB Aktivierung ist der IKK Komplex. Der Carma1/Bcl10/Malt1 (CBM) Komplex ist die essentielle Komponente für die Antigenrezeptor-induzierte Aktivierung des IKK Komplexes in T-Zellen. Die Regulation des CBM Komplexes ist daher entscheidend für die Signalweitergabe aber auch für das Beenden der Signaltransduktion zu IKK und NF-κB. Ziel dieser Arbeit war es die Malt1-vermittelte Regulation des CBM Komplexes zu untersuchen. Malt1 spielt eine zentrale Rolle in der Rekrutierung des IKK Komplexes an den CBM Komplex und wurde erst kürzlich als Träger proteolytischer Aktivität identifiziert. Durch einen Yeast-Two-Hybrid Screen sollten neue Interaktionspartner von Malt1 identifiziert und die Interaktion in Zelllinien und primären Zellen unter nativen Bedingungen bestätigt werden. Weiterhin galt es, die Interaktorfunktion für Malt1 und den CBM Komplex aufzuklären. Im zweiten Teil der Arbeit sollte die Bedeutung der unterschiedlichen Malt1 Isoformen und deren Paracaspase-Aktivität in der Induktion von NF-κB in Zelllinien und primären Zellen auf genetischer Ebene untersucht werden. In verschieden Spezies sind zwei Malt1 Splicevarianten bekannt und es ist nicht klar, ob die Isoformen Unterschiede in ihrer Fähigkeit zur NF-κB Aktivierung aufweisen. Auch ist die Bedeutung der proteolytischen Malt1 Paracaspase-Aktivität für die Antigen-vermittelte Aktivierung von NF-κB nicht geklärt

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/06

Der Naturstoff Betulinsäure (BA) induziert effektiv Apoptose in Tumorzellen. Vorarbeiten der Arbeitsgruppe zeigten, dass BA auf primären Leukämiezellen besser Apoptose in vitro induziert als viele der heute verwendeten Zytostatika. Zelltod wird dabei direkt über Aktivierung des intrinsischen Apoptosesignalwegs am Mitochondrium ausgelöst. Aufbauend auf diesen Daten war es Ziel dieser Dissertation, BA in die Kombinationsabfolge der Polychemotherapie der Leukämie einzuordnen. Zunächst wurde untersucht, mit welchen Zytostatika der heutigen Leukämietherapie Betulinsäure kooperiert, so dass der gemeinsame Einsatz beider Substanzen synergistische Apoptose auslöst. Dabei stellte sich heraus, dass Betulinsäure mit den drei Medikamenten Asparaginase, Doxorubicin und Vincristin kooperiert, sowohl auf sensitiven Tumorzelllinien, auf Zytostatika-resistenten Zelllinien als auch auf primären Zellen von Kindern mit akuter Leukämie. Im Hauptteil der Arbeit wurde untersucht, welche intrazellulären Signalmechanismen für die effektive Apoptoseinduktion von BA mit Asparaginase, Doxorubicin oder Vincristin verantwortlich sind. Dabei erwiesen sich für alle drei untersuchten Zytostatika die Signalmechanismen als identisch. Mittels des Einsatzes von transgenen Tumorzellinien, der Überexpression rekombinanter Proteine sowie des Knockdowns endogener Proteine über RNA-Interferenz konnte gezeigt werden, dass folgende Signalmoleküle die synergistische Apoptoseinduktion vermitteln: der Transkriptionsfaktor p53; das pro-apoptotische BCL-2 Familienmitglied NOXA, dessen Expression über p53 reguliert wurde; die mitochondriale Aktivierung mit Freisetzung von z.B. Cytochrom-C, die durch Mitglieder der BCL-2 Familie reguliert wurde; hierbei ermöglichte die p53-abhängige Regulation von NOXA eine Verschiebung des Gleichgewichts in Richtung zur Apoptose; Caspasen (Casp-3 und -9). Um die intrazelluläre Signaltransduktion auch an Patienten-abgeleiteten Zellen untersuchen zu können, wurde eine neue Technik etabliert: Kindliche ALL-Zellen wurden in immuninkompetenten Mäusen vermehrt und mittels eines optimierten Protokolls der Elektroporation mit small interfering RNA transfiziert. Auch hier zeigte sich eine Abhängigkeit der synergistischen Apoptoseinduktion von p53 und NOXA. Die dargelegten Untersuchungen legen nahe, BA in zukünftigen prä-klinischen und klinischen Studien der Leukämie in der Nähe von Doxorubicin, Asparaginase oder Vincristin einzusetzen, um von der günstigen p53-abhängigen Aktivierung von NOXA durch Zytostatika-Kombination zu profitieren.

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/06
Untersuchungen zur Signaltransduktion des tumorassoziierten Antigens EpCAM

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/06

Play Episode Listen Later Jul 5, 2010


Mon, 5 Jul 2010 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/12012/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/12012/1/Denzel_Sabine.pdf Denzel, Sabine ddc:570, ddc:500, Fakultät für Biolo

Tierärztliche Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/07
Einfluss der Dynein-Mutation auf zelluläre Mediatoren der neuronalen Signaltransduktion im Cra1-Mausmodell der Motoneurondegeneration

Tierärztliche Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/07

Play Episode Listen Later Jul 17, 2009


Fri, 17 Jul 2009 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/10633/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/10633/1/Baehr_Jennifer.pdf Bähr, Jennifer

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 03/06
Analysis of Multiprotein Complexes in the Mammalian REtina

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 03/06

Play Episode Listen Later Dec 19, 2008


Eine große Gruppe genetisch vererbter Erblindungskrankheiten steht im Zusammenhang mit Mutation in Genen, die in Photorezeptoren exprimiert sind. Diese Mutationen führen nicht nur zu einer Beeinträchtigung des mutierten Proteins selbst, sondern auch zu einer Störung von funktionell nachgeschalteten Proteinnetzwerken. In der Folge ändern sich die Zusammensetzung von Multiproteinkomplexen sowie die Proteinlokalisation, was schwerwiegende physiologische Konsequenzen nach sich zieht. Alleine im lichtwahrnehmenden Molekül Rhodopsin sind mehr als hundert unterschiedliche Mutationen beschrieben worden, die vermutlich im Zusammenhang mit Retinitis pigmentosa, einer degenerativen Erkrankung der Retina, stehen (http://www.sph.uth.tmc.edu/RetNet/). In Saccharose-Dichte Gadienten Experimenten von Dr. Magdalena Swiatek-deLange, die dieser Studie vorangegangen sind, wurde Rhodopsin als Teil eines potentiellen Rhodopsin/Ras Homolog Gene Family, Member A (RhoA)/Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (Rac1)/RhoKinase II (Rock II)/ Collapsin response mediator protein 2 (CRMP2) Signal-Multiproteinkomplexes in Außensegmenten von Stäbchen Photorezeptoren (ROS) identifiziert, welcher im Zuge dieser Studie bestätigt und eingehender untersucht wurde. Ein Zusammenhang zwischen einer Rhodopsin-vermittelten Degeneration von Photorezeptoren und der Regulation des Cytoskeletts durch die kleine GTPase Rac1, wurde von Chang und Kollegen (Chang and Ready, 2000) hergestellt. Sie haben gezeigt, dass die Expression von dominant-aktivem Rac1 in Rhodopsin-Null Mutanten von Drosophila die Rhabdomer Morphogenese erhalten kann. In Zellen fungiert Rac1 durch den Wechsel zwischen einem inaktiven, vorwiegend cytosolischen und einem aktiven, überwiegend membranassoziierten Zustand, als molekularer Schalter in der Signaltransduktion und vermittelt Signale von Membranrezeptoren an das Cytoskelett. Obwohl die Rolle von Rac1 bereits in einer großen Zahl unteerschiedlicher Zellen untersucht worden ist, ist seine Funktion in Photorezeptoren noch immer weitgehend ungeklärt. Die wenigen vorhanden Studien, in denen beispielsweise gezeigt wurde, dass Rac1 an der Fusion von Rhodpsintransportcarriern in Rana barlandieri (Deretic et al., 2004) oder auch an der lichtinduzierten Degeneration von murinen Photorezeptoren beteiligt ist (Belmonte et al., 2006), machen aber deutlich, dass Rac1 ein für die Funktion und Regulation von Photorezeptoren wichtiges Molekül ist. In dieser Studie wurde daher die Rolle von Rac1 in Photorezeptoren eingehender untersucht und ein Rac1-Interaktom in ROS, bestehend aus 22 Interaktoren, identifiziert. Von diesen 22 identifizierten Interaktoren sind fünf bereits als Interaktoren von Rac1 beschrieben worden, darunter CRMP2, einer der Hauptregulatoren von Polarität in neuronalen Zellen, sowie die cytoskelettalen Proteine Aktin ( and  und Tubulin ( and Unter den 17 neuen potentiellen Rac1 Interaktoren befindet sich das Aryl Hydrocarbon Receptor-Interacting Protein Like 1 (AIPL1), das im Zusammenhang mit Leberscher kongenitaler Amaurose (LCA) sowie mit retinalem Proteintransport steht (Sohocki et al., 2000), sowie eine Reihe von Proteinen, die Teil der Phototransduktionskaskade sind, wie die Untereinheit der 3´, 5´-cyclic-GMP Phosphodiesterase 6, Recoverin, Arrestin sowie die ,  und  Untereinheiten von Transducin. Rac1 verbindet damit die Lichtwahrnehmung durch Rhodopsin mit einer Regulation des Cytoskeletts und legt damit eine Interdependenz von Lichtwahrnehmung mit einer korrekten zellulären und funktionalen Struktur von Photorezeptoren nahe. In dieser Studie wurde nicht nur die Existenz des potentiellen Rhodopsin/RhoA/Rac1/Rock II/CRMP2 Multiproteinkomplexes in ROS bestätigt, sonder auch eine lichtabhängige Dynamik und Interaktion der einzelnen Komplexbestandteile beschrieben. In Übereinstimmung mit Daten aus verschiedenen Organismen ((Wieland et al., 1990), (Petrov et al., 1994), (Balasubramanian and Slepak, 2003)) konnte eine lichtabhängige Aktivierung von Rac1 in ROS von Schweinen nachgewiesen werden. Während lichtaktiviertes, GTP-gebundenes Rac1 überwiegend membranassoziiert vorliegt, konnte in dunkeladaptierten ROS insgesamt nur eine sehr geringe Menge an aktivem Rac1 detektiert werden. Des Weiteren wurden in dieser Studie auch deutliche Hinweise geliefert, die auf eine CRMP2 vermittelte Verbindung von Rac1 und RhoA assoziierten Signalwegen hinweisen, wohingegen die Kinase Rock II nur Teil des RhoA assoziierten Signalkomplexes zu sein scheint. Als Funktion von CRMP2 liegt daher eine Rolle als physiologischer Schalter nahe, der die Balance zwischen Rac1 und RhoA vermittelter Signaltransduktion koordiniert. Eine solche Funktion für CRMP2 wurde von Ariumura und Kollegen bereits für die Signaltransduktion in Neuronen vorgeschlagen (Arimura et al., 2000). Um die Signaltransduktion von CRMP2 in ROS eingehender untersuchen zu können, sind CRMP2 Antikörper unabdingbar, welche aber zu Beginn dieser Arbeit kommerziell nicht erhältlich waren. Daher war die Produktion und Charakterisierung von monoklonlalen CRMP2 spezifischen Antikörpern ein wichtiger Teil dieser Studie. Von den vier erhaltenen stabilen Linien monoklonaler, CRMP2 spezifischer Antikörper waren alle für den Einsatz im Western Blot sowie in der Immunohistochemie geeignet, aber nur ein Antikörper erwies sich auch als geeignet für die Immunopräzipitation von nativem CRMP2 aus primärem retinalen Gewebe. Dieser Antikörper stellt damit ein exzellentes Werkzeug für die weitere Charakterisierung der Funktion von CRMP2 in ROS dar. Drei Klassen von Proteinen regulieren die Aktivität von Rac1. Sie alle haben einen Einfluss auf den GTP/GDP-Austausch. Einer dieser Regulatoren ist der Rho GDP Dissociation Inhibitor (RhoGDI). Er kontrolliert die Interaktion von Rac1 mit weiteren regulatorischen Proteinen und Effektoren, sowie durch Interaktion mit dem Prenylrest von Rac1 das Pendeln zwischen Cytosol und Membran. Da aber der RhoGDI nicht in ROS nachgewiesen werden konnte (Balasubramanian and Slepak, 2003), legt dies den Schluss nahe, dass ein anderes Protein diese Funktion in ROS übernimmt. Das 17-kDa große Protein PDEdas lange Zeit als Untereinheit der retinalen cGMP Phosphodiesterase 6 aus Stäbchen galt, weist starke strukturelle Homologien zu RhoGDI auf. Es interagiert mit einer ganzen Reihe von prenylierten und unprenylierten Proteinen. Seine Fähigkeit, prenylierte Proteine von Zellmembranen zu lösen, erinnert stark an die Funktion, welche RhoGDI auf GTPasen der Rho Familie hat. Es wurde daher im Zuge dieser Studie untersucht, ob PDE in ROS GDI Funktion auf Rac1 ausübt. In dieser Arbeit konnte eine lichtabhängige Interaktion von Rac1 mit PDE in ROS von Schweinen nachgewiesen werden. Des Weiteren wurde gezeigt, dass aufgereinigtes PDE Rac1 von isolierten ROS Membranen lösen kann, eine Eigenschaft, die deutlich auf eine GDI-Funktion von PDE für Rac1 hinweist. Zudem wurde gezeigt, dass die Interaktion von Rac1 mit PDE mit einer lichtabhängigen Carboxylmethylierung von Rac1 in ROS korreliert, was ein Hinweis darauf sein kann, dass die die GDI Funktion von PDE durch die Methylierung von Rac1 reguliert wird. Alles in Allem zeigen diese Daten, das PDE für Rac1 in ROS die Funktion eines GDIs ausübt. In dieser Studie geben die identifizierten und mit Rac1 assoziierten Multiproteinkomplexe sowie deren lichtregulierte Dynamik einen deutlichen Hinweis darauf, dass Rac1 die Lichtwahrnehmung durch Rhodopsin mit Signalnetzwerken verbindet, die eine Rolle bei der strukturellen Integrität und Polarität von Photorezeptoren spielen. Dies deutet auf eine Abhängigkeit von Lichtwahrnehmung und funktioneller zellulärer Struktur hin. Mit der Bereitstellung von qualitativ sehr hochwertigen CRMP2 spezifischen Antikörpern liefert diese Studie zudem eine gute Basis für weiterführende Studien in diesem Forschungsfeld. Neben Rhodopsin assoziierten Komplexen stehen auch eine ganze Reihe von ciliären Komplexen in Zusammenhang mit degenerativen Erkrankungen der Retina. Im kürzlich entdeckten ciliären Protein Lebercilin (den Hollander et al., 2007) wurden Mutationen mit Leberscher kongenitaler Amaurose (LCA) in Verbindung gebracht, einer sehr schweren Form einer erblichen retinalen Dystrophie ((Kaplan et al., 1990), (Perrault et al., 1999)). Mit Hilfe von SF-TAP und LC/MS/MS Analysen konnten 24 Lebercilin Interaktoren in HEK Zellen identifiziert werden (den Hollander et al., 2007). Hier in dieser Studie wurden schließlich diese potentiellen Lebercilin Interaktoren auch in Photorezeptoren von Schweinen bestätigt (veröffentlicht in (den Hollander et al., 2007). Die identifizierten Interaktoren stellen mögliche Kandidaten für Gene für LCA und andere Ciliopathien dar und weisen Lebercilin als ein ciliär und mikrotubulär assoziiertes Protein in der Retina aus. Dies betont den Stellenwert, welche gestörte ciliäre Prozesse in der molekularen Pathogenese von LCA besitzen.

Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 03/06
Mechanismen der cholinergen Signaltransduktion im glatten Muskel der Harnblase

Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 03/06

Play Episode Listen Later Nov 18, 2008


Die glatte Muskulatur steuert eine Vielzahl wichtiger physiologischer Funktionen, wie beispielsweise den Blutdruck, die Magen-Darm-Motilität und die Harnblasen Entleerung. Die Kontraktion des glatten Muskel wird nach hormoneller Stimulation G-Protein-gekoppelter Rezeptoren vor allem durch L-Typ Ca2+-Kanäle vermittelt. Dies konnte mit Untersuchungen an genetisch veränderten Mauslinien, die glattmuskelspezifisch eine Deletion des Cav1.2 Ca2+-Kanals aufweisen (SMACKO Mäuse), belegt werden. Die Ansteuerung des L-Typ Ca2+-Kanals nach hormoneller Stimulation ist jedoch noch nicht vollständig geklärt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist daher, den Kopplungsmechanismus sowie eventuell beteiligte Linkerproteine zwischen dem M3 Rezeptor und dem L-Typ Ca2+-Kanal in der Harnblase zu untersuchen. Die Experimente wurden sowohl an Harnblasen von Wildtyp und SMACKO Mäusen, als auch an Schweineharnblasen durchgeführt. Die funktionellen Untersuchungen legten eine cholinerge Modulation des Cav1.2 Ca2+-Kanal über die PKC nahe. So bewirkte der Einsatz von PKC- und Cav1.2 Ca2+-Kanal-Antagonisten eine Hemmung der cholinergen Kontraktion. Eine Aktivierung der PKC durch den Phorbolester PdBu hingegen führte zu einer Verstärkung der cholinergen Kontraktionsantwort mit einer gleichzeitigen Erhöhung des intrazellulären Ca2+-Signals. Den Beleg einer direkten Assoziation von PKC und Cav1.2 Ca2+-Kanal lieferten die biochemischen Untersuchungen. Die BN Page Versuche zeigten die Anwesenheit der PKC im Cav1.2 Proteinkomplex. Eine Mitfällung der PKC mit dem Cav1.2 Antikörper bestätigten die Hypothese einer direkten Interaktion beider Proteine. Die Phosphorylierungsversuche belegten, dass die α1C-Untereinheit und im Schwein auch die β3-Untereinheit des Cav1.2 Ca2+-Kanals verstärkt nach cholinerger Stimulation phosphoryliert werden. Die Ergebnisse zeigten die Beteiligung eines PKC/ Cav1.2 Signalkomplexes bei der cholinerg induzierten Kontraktion der Harnblase von Maus und Schwein.

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 03/06
Identifikation und Charakterisierung von neuen Interaktionspartnern des latenten Membranproteins 1 (LMP1) des Epstein-Barr Virus

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 03/06

Play Episode Listen Later Nov 10, 2008


Das Membranprotein LMP1 des Epstein-Barr Virus (EBV) stellt das primäre Onkogen des Virus dar. Es ist essentiell für eine effiziente Transformation von B-Zellen durch das Virus und ist allein ausreichend, um Nagerfibroblasten zu transformieren. LMP1 aktiviert eine Vielzahl von Signalwegen über zwei carboxyterminale Aktivierungsregionen (CTAR1 und CTAR2), unter anderem die JNK-, die NF-κB, die PI3K- und die Jak/STAT-Signalkaskaden. Die Aufklärung der Signaltransduktion von LMP1 auf molekularer Ebene ist der Fokus intensiver wissenschaftlicher Forschung. Ziel der vorliegenden Doktorarbeit war es, neue Interaktionspartner von LMP1 zu identifizieren und so Lücken zwischen LMP1 und den weiter stromabwärts liegenden Signalwegen zu schließen. Dazu wurde im ersten Teil der Arbeit eine Methodik entwickelt, mit dem der Signalkomplex von LMP1 massenspektrometrisch untersucht werden konnte. Hierzu wurde zunächst ein Zellsystem etabliert, mit dem der LMP1-Multiproteinkomplex aus lymphoblastoiden Zelllinien (LCLs), also im viralen Kontext, präzipitiert werden konnte. Darüber hinaus wurde ein zusätzlicher Aufreinigungsschritt durch die Integration einer TEV-Protease-Schnittstelle zwischen den Transmembrandomänen und dem C-Terminus von LMP1 eingeführt. Mit diesem Verfahren wurde eine Reihe von neuen potenziellen Interaktionspartnern von LMP1 identifiziert. Von diesen konnten bereits zwei Proteine als LMP1 Interaktionspartner mit weiteren Methoden verifiziert werden, das Transmembranprotein CD48 und die Kinase TNIK. Der zweite Teil der Arbeit beleuchtet die Rolle der Protein-Tyrosin-Phosphatase SHP-1 in der Signaltransduktion von LMP1. Sie wurde in unserer Arbeitsgruppe als Interaktionskandidat von LMP1 identifiziert. Neben der Verifikation der Bindung gelang es in dieser Arbeit, die Interaktionsstelle von SHP-1 auf die beiden Tyrosine Y185 und Y186 von LMP1 zu kartieren. Damit wurde neben CTAR1 und CTAR2 ein weiteres, neues Bindemotiv von LMP1 entdeckt. Es konnte im Rahmen dieser Doktorarbeit gezeigt werden, dass LMP1 den NF-κB- und den Jak/STAT-Signalweg nicht nur induziert sondern durch die Interaktion von LMP1 mit SHP-1 diese Aktivierung regu-liert und begrenzt. LMP1 verfügt somit auch direkt auf der Ebene der Signaltransduktion über einen Me-chanismus, der seine eigene Aktivität moduliert.

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 09/19
Verstärkung der Kardiovaskulogenese in murinen Embryonalen Stammzellen durch Überexpression des Transkriptionsfaktors Mesoderm Posterior 1 (MesP1)

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 09/19

Play Episode Listen Later Oct 9, 2008


Herz-Kreislauf-Erkrankungen stellen heute in der westlichen Welt die häufigste Todesursache überhaupt dar. In der Vergangenheit wurde deshalb zu deren Therapie bereits eine Vielzahl an medikamentösen und chirurgischen Behandlungsmöglichkeiten entwickelt, die jedoch insbesondere in schweren Erkrankungsfällen keine langfristig zufrieden stellenden Optionen bieten konnten. Von Embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) erhofft man sich deshalb ganz neue, zelltherapeutische Möglichkeiten. Durch das Potential, vitales Herzmuskelgewebe aus diesen pluripotenten Zellen in vitro generieren zu können, eröffnen sich dabei für die kausale Behandlung der Herzinsuffizienz bisher ungeahnte Perspektiven. Zwei der Hauptprobleme bei der Gewinnung von Kardiomyozyten aus der differenzierten ES-Zell-Kultur stellen jedoch zum einen der geringe Anteil von Herzmuskelzellen an der Mischkultur und zum anderen deren schwierige hochselektive Aufreinigung dar. Durch Entschlüsselung der Stammzellentwicklung und der daran beteiligten Faktoren und Signalkaskaden könnte es jedoch in Zukunft möglich werden, die Steuerung für diese Differenzierung zu übernehmen, um so aus den hoch proliferativen, pluripotenten Vorläuferzellen Kardiomyozytenreinkulturen gewinnen zu können. In der vorliegenden Arbeit wurde der früh während der Embryonalentwicklung exprimierte Transkriptionsfaktor mesoderm posterior 1 (MesP1) als mögliche Schlüsselkomponente der kardiovaskulären Entwicklung detailliert untersucht. Mithilfe eines dafür konstruierten Vektors konnte der Faktor MesP1 in stabil-transfizierten, murinen embryonalen Stammzellen überexprimiert – und so dessen induktive Wirkung auf die Entwicklung von Herz- und Endothelzellen während der ES Zell-Differenzierung auf molekularer wie auch zellulärer Ebene nachgewiesen werden. So zeigte sich in den transgenen Zellen bereits zu einem frühen Zeitpunkt der Entwicklung eine verstärkte Expression u. a. der frühen kardialen Transkriptionsfaktoren Nkx2.5 und GATA-4, die sich später während der Differenzierung in einer mehrfach erhöhten Ausbeute an Kardiomyozyten und Endothelzellen in der Zellkultur widerspiegelte. Die Funktionalität der amplifizierten Kardiomyozyten bezüglich Kontraktionsfrequenz und Reagibiliät auf vegetative Reize blieb dabei unverändert erhalten. Bei der Analyse der Keimblattentwicklung fiel auf, dass durch Überexpression des mesoderm posterior 1 in den transgenen Zellen die Menge an Gesamtmesoderm unverändert blieb, jedoch innerhalb dieses Keimblattes die Differenzierung deutlich in Richtung kardiovaskulär und zu Lasten der Skelettmuskelentwicklung verschoben war. Im Ektoderm zeigte sich eine verstärkte neurale Entwicklung, induziert durch die vermehrt vorhandenen kardiogenen Zellen. Die Bildung des Endoderms war unbeeinträchtigt. Im Folgenden konnte schließlich in Untersuchungen zur Signaltransduktion der Mechanismus der MesP1-vermittelten kardiovaskulären Induktion aufgeklärt werden, indem der Faktor Dickkopf-1, ein Inhibitor des Wnt-Signalweges, als Zielgen des Transkriptionsfaktors MesP1 identifiziert und in Folgeversuchen mittels Bandshift auch bestätigt werden konnte. Die Blockade des Wnt-Signalweges ist verantwortlich für die Initiierung der kardiovaskulären Differenzierung während der Embryonalentwicklung. MesP1 stellt damit einen besonderen Faktor während der Embryogenese dar und einen wichtigen Startpunkt für die weitere Entzifferung der komplexen Signaltransduktionskaskaden der Herz- und Gefäßentwicklung. Das vollständige Verständnis dieses komplexen Netzwerkes sowie die Übertragung auf das humane ES-Zell-System könnte es einmal ermöglichen, Herzmuskelerkrankungen des Menschen mit embryonalen Stammzellen therapieren zu können.

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 08/19
Untersuchungen zur Bedeutung der cAMP- und cGMP- abhängigen Signaltransduktion in der Kontrolle der glatten Muskulatur des humanen Ureters

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 08/19

Play Episode Listen Later Apr 10, 2008


Relaxation of human ureteral smooth muscle in vitro by modulation of cyclic nucleotide-dependent pathways

Tierärztliche Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 03/07
Funktionelle Besonderheiten des equinen Histamin H1 Rezeptors

Tierärztliche Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 03/07

Play Episode Listen Later Feb 8, 2008


In der vorliegenden Arbeit wurden funktionelle Besonderheiten des klonierten equinen Histamin H1 Rezeptors (eH1) aufgeklärt. Insbesondere wurde die agonistvermittelte Regulation von Oberflächenrezeptoren sowie die intrazelluläre Signaltransduktion im Vergleich zum humanen Histamin H1 Rezeptor (hH1) dargestellt. Die Studie erfolgte an stabil die nativen eH1 bzw. hH1 oder die entsprechenden EGFP-Fusionsproteine exprimierenden HEK 293-Zellen. Die verwendeten Zellklone (HEK-hH1 und HEK-eH1) wiesen eine vergleichbare Rezeptorendichte auf. Im Vergleich zum hH1 induziert Histamin am eH1 nur eine geringe Internalisierung des Rezeptors, ein Effekt der sowohl mittels Radioligandenbindung an intakten Zellen als auch im konfokalen Mikroskop (LSM) nachgewiesen wurde. Die Internalisierung des eH1 erfolgt clathrinabhängig unter Beteiligung der GRK 2 und β-Arrestin 1. Dagegen scheint die Internalisierung des hH1 clathrinunabhängig mittels Lipidvesikel abzulaufen. Die klinische Wirksamkeit von Antihistaminika korreliert stark mit ihrer negativ intrinsischen Aktivität. Dabei zeigt der eH1 im Vergleich zum hH1 eine deutlich geringere spontane oder konstitutive Aktivität. Diese spiegelt sich in einer niedrigeren basalen GTPy35S Bindung (Rezeptor/G-Protein Kopplung) wieder, die in Anwesenheit von Diphenhydramin zunimmt. Das Antihistaminikum weist demnach am eH1 eine partielle agonistische Aktivität auf. Aufgrund seiner niedrigen konstitutiven Aktivität wird über den equinen Histamin H1 Rezeptor in HEK 293-Zellen keine basale ERK 1/2 Aktivierung induziert, so dass in diesem System keine dem Diphenhydramin am hH1 entsprechende inverse Aktivität bestimmt werden kann. Im Gegensatz zu hH1 führt die Aktivierung des eH1 mit Histamin zu einer sehr starken Stimulation der intrazellulären cAMP-Akkumulation. Diese ist im Vergleich zum hH1 nicht PTX- und PLC-abhängig, während beide Rezeptoren über PKA- und PKC-abhängige Mechanismen an die Adenylatcyclase (AC) gekoppelt sind. Zusammenfassend weisen die Ergebnisse auf vielfältige funktionelle und regulatorische Besonderheiten des equinen Histamin H1 Rezeptors hin, die bei der klinischen Anwendung und Entwicklung neuer Antihistaminika beim Pferd berücksichtigt werden müssen.

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 08/19
Differentielle Genexpression in Monozyten polytraumatisierter Patienten

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 08/19

Play Episode Listen Later Jan 24, 2008


Polytraumatisierte Patienten entwickeln eine systemische Entzündungsreaktion (systemic inflammatory response syndrome, SIRS), die entscheidend den klinischen Verlauf der Patienten determiniert. Zahlreiche Untersuchungen weisen dem Immunsystem dabei eine zentrale steuernde Funktion zu, wobei die initialen Triggermechanismen der traumabedingten Immunantwort bisher unbekannt ist. Obwohl den Monozyten dabei eine führende Rolle zugesprochen wird, sind die hierfür verantwortlichen intrazellulären Steuerungsmechanismen, insbesondere die Signaltransduktion, die Transkription sowie die Modulation der Translation von inflammatorisch wirksamen Proteinen bislang nur ansatzweise aufgeklärt. Ziele der vorliegenden Untersuchungen waren daher: i) zu überprüfen, ob es überhaupt spezifische, Trauma-responsive mRNA Expressionsmuster in Monozyten polytraumatisierter Patienten in der frühen posttraumatischen Phase gibt, ii) in einem zweiten Schritt zu untersuchen, ob es darüber hinaus Genexpressionsprofile gibt, die in Abhängigkeit von klinischen Parametern einer signifikant unterschiedlichen Expression unterliegen iii) und schließlich diese identifizierten Faktoren auf ihre biologisch funktionelle Rolle im Organismus zu untersuchen Mittels Affymetrix Oligonukleotid Microarray (22.000 Probe Sets, 14.500 Gene) wurde eine Genom-weite mRNA Expressionsanalyse in Monozyten polytraumatisierter Patienten in der unmittelbar posttraumatischen Phase (0h-72h) durchgeführt und in einem mehrstufigen biostatistischen Verfahren mit klinischen Einflussfaktoren korreliert. Zur Überprüfung der biologischen Funktion der identifizierter Genexpressionsprofile wurden biologisch-funktionelle Pathway Analysen mittels Ingenuity Pathway Systems durchgeführt. Um das erste Teilziel zu erreichen wurde eine unsupervised-Analyse anhand der ermittelten Microarray Daten durchgeführt. Zentrales Kriterium der unsupervised Analyse ist nun der Variationskoeffizient eines einzelnen Faktors/Gens. Somit lassen sich diejenigen genetischen Expressionsprofile identifizieren, die durch das gemeinsame klinische Ereignis „Trauma“ zu einer gemeinsamen Expressionsänderung angeregt wurden. Dabei fanden sich 318 Probe Sets (280 Gene) signifikant durch das klinische Ereignis „Trauma“ verändert. Somit lässt sich anhand der vorliegenden Studie die Fragestellung i) klar dahingehend beantworten, dass Trauma-sensitive Gene Zeichen der gleichsinnigen Aktivierung bzw. Deaktivierung zeigen können. Um die Teilfragestellung ii) zu beantworten, wurden die Patienten im Anschluss in klinisch relevante Gruppen unterteilt. Führende Zielparameter waren dabei zunächst die Quantifizierung der anatomischen Verletzungsschwere quantifiziert mittels Injury Severity Score (ISS). In den so gruppierten Datensätzen fanden sich interessanterweise 295 Probe Sets (273 Gene), hochsignifikant verschieden exprimiert in Patienten mit einem ISS > 40 im Vergleich zu weniger schwer verletzten Patienten (ISS < 40 Punkte). Eine ähnliche supervised- Analyse wurde anhand des Kriteriums „Massive Substitution von Erythrozytenkonzentraten“ (>10 EKs/24h) berechnet. Dabei fanden sich 224 Probe Sets (205 Gene) differentiell exprimiert. Besonders interessant zeigten sich die Ergebnisse der supervised-Analyse nach Einteilung der Patienten anhand der Ausprägung eines Multiorganversagens. 660 Probe Sets (642 Gene) waren bei Patienten mit Anzeichen eines solchen (MOF Score ≥4 Punkte) hochsignifikant differentiell exprimiert im Vergleich zu Patienten ohne klinische Hinweise auf ein manifestes Multiorganversagen (MOF-Score < 4 Punkte). Schließlich konnten in einer weiteren supervised-Analyse 763 Probe Sets (696 Gene) identifiziert werden, deren Expression je nach dem, ob der Patient das Trauma überlebt hatte, oder im späteren posttraumatischen Verlauf verstorben war, erneut ein hochdifferentiell unterschiedliches Expressionsprofil aufweisen. Somit lässt sich Fragestellung ii) dahingehen beantworten, dass es tatsächlich spezifische Genxpressionsmuster gibt, die durch verschiedene klinische Situationen, wie z.B. die Verletzungsschwere, Massentransfusionen, die Entwicklung eines Multiorganversagens oder das endgültige klinische Outcome induziert werden können. Zur Beantwortung der Fragestellung iii) wurden Pathway Analysen durchgeführt. Dieses Instrumentarium fasst den derzeitigen Stand der wissenschaftlichen Erkenntnisse in einer groß-dimensionierten Software zusammen und zeigt die biologisch-funktionellen Beziehungen der einzelnen Faktoren auf. Dabei fanden sich für die klinische Entität der Verletzungsschwere vor allem Gene, die bei der oxydativen Phosphorylierung von Proteinen eine Rolle spielen, als differentiell exprimiert. Patienten, die einer massiven Bluttransfusion zugeführt werden mussten, zeigen eine signifikant andere Regulation des Ubiquitin-C Pathways als Patienten mit geringerem Transfusionsbedarf. Bei polytraumatisierten Patienten, die im Beobachtungszeitraum Anzeichen eines Multiorganversagens entwickelten, zeigte die Pathway Analyse Software eine unterschiedliche Regulation des Ephrin Rezeptor Pathways. Betrachtet man schließlich das Datenset der Outcome-klassifizierenden Gene, so fällt auf, dass Patienten mit positivem klinischen Outcome eine hochsignifikant andere Expression der PPAR-Signalkaskade aufweisen im Vergleich zu Patienten, die im späteren posttraumatischen Verlauf verstorben waren. Somit lässt sich Fragestellung iii) dahingehend beantworten, dass in der Tat einzelnen, biologisch relevanten, funktionellen Gruppen spezifische, klinische Ereignisse zugeordnet werden können. Die vorliegende Arbeit zeigt somit erstmals, dass es Trauma-responsive, hochspezifische mRNA Expressionsmuster und Signalkaskaden in Monozyten polytraumatisierter Patienten in der unmittelbaren posttraumatischen Phase gibt, die nicht nur mit dem Ausmaß des Traumas, sondern auch mit dem klinischen Verlauf des Patienten hochsignifikant korrelierbar sind.

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 07/19
Expression, Signaltransduktion und biologische Funktionen des CCL20/CCR6-Chemokin-Ligand-Rezeptor-Systems in intestinalen Epithelzellen

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 07/19

Play Episode Listen Later Dec 20, 2007


Thu, 20 Dec 2007 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/7867/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/7867/1/Olszak_Torsten_M.pdf Olszak, Torsten Michael

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06
Regulation von Apoptose und Überleben durch Signalwege von LMP1 und TNF-Rezeptor 1

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06

Play Episode Listen Later Nov 21, 2007


TRADD spielt als Adaptermolekül eine zentrale Rolle in der Signaltransduktion von LMP1 und TNF-Rezeptor 1. Während es allerdings durch den TNFR1 neben der Aktivierung verschiedener Signalwege auch zur Induktion von Apoptose und Nekrose kommt, handelt es sich bei LMP1 um ein Protein mit transformierendem Potential. Bei den jeweiligen TRADD-Bindestellen von LMP1 und TNFR1 handelt es sich um zwei strukturell vollkommen unterschiedliche Domänen. Und auch auf der Seite von TRADD wird die Bindung über zwei verschiedene Domänen vermittelt. Im Rahmen dieser Doktorarbeit sollte die Frage beantwortet werden, ob die TRADD-Bindestelle intrinsisch die biologischen Effekte der Signaltransduktion bestimmt oder ob diese durch den Rezeptorkontext festgelegt werden. Zur Beantwortung dieser Frage wurde in einem Domain Swapping Experiment die TRADD-Bindestelle des konstitutiv aktiven LMP1-TNFR1 sowie des TNFR1 gegen die putative TRADD-Bindestelle von LMP1 ausgetauscht. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass die Aminosäuren 370-386 die vollständige TRADD-Bindestelle von LMP1 umfassen. Weiter konnte gezeigt werden, dass diese Aminosäuren im LMP1-TNFR1- sowie im TNFR1-Kontext ausreichend sind, um den NF-κB und den JNK1 Signalweg zu aktivieren. Die Aktivierung des JNK1 Signalweges durch LMP1-TNFR1-CTAR2 verläuft unabhängig von TRAF2 und abhängig von TRAF6 und auch die Aktivierung des NF-κB Signalweges durch dieses Rezeptorkonstrukt verläuft TRAF6-abhängig. Damit konnte gezeigt werden, dass die LMP1-spezifischen Charakteristika der Signaltransduktion durch die TRADD-Bindestelle festgelegt und mit ihr zusammen übertragen werden. Obwohl die Aminosäuren 370-386 von LMP1 funktionell sind, sind sie auch im LMP1-TNFR1 sowie im TNFR1 Kontext nicht in der Lage Apoptose zu induzieren. Damit konnte im Rahmen dieser Doktorarbeit gezeigt werden, dass die Aminosäuren 370-386 von LMP1 intrinsisch und unabhängig vom Rezeptorkontext den nicht-apoptotischen Phänotyp der Signaltransduktion festlegen. Außerdem wurde im Rahmen dieser Doktorarbeit die Beteiligung von TRAF7 an der Signaltransduktion von LMP1 untersucht. Dazu wurde traf7 aus einer cDNA kloniert. Zusätzlich wurden verschiedene Deletionsmutanten sowie Fusionen mit dem fluoreszierenden Protein mRFP hergestellt. Es konnte eine Threonin-Phosphorylierung von TRAF7(1-383) nachgewiesen werden. Mittels Fluoreszenzmikroskopie konnte eine Lokalisierung von TRAF7 in vesikulären Strukturen beobachtet werden. Eine Mutante, der der RING- sowie der Zink-Finger fehlen, zeigte hingegen eine gleichmäßige zytosolische Verteilung. Außerdem konnte in dieser Doktorarbeit mit Hilfe von spezifischer siRNA gezeigt werden, dass TRAF7 an der Aktivierung des JNK1 Signalweges durch LMP1 beteiligt ist.

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 07/19
Unterschiede in IFN-alpha-Produktion und Signaltransduktion der plasmazytoiden dendritischen Zelle nach Stimulation mit CpG-A und CpG-B

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 07/19

Play Episode Listen Later Oct 18, 2007


CpG-Oligonukleotide stellen synthetische Imitate mikrobieller DNA dar, die über Toll like-Rezeptor9 B-Zellen und plasmazytoide dendritische Zellen aktivieren. Es existieren verschiedene Klassen, die sich in ihrer Fähigkeit zur Induktion von Interferon-alpha und zur Aktivierung von Immunzellen unterscheiden. Aktuell werden CpG-ODN in klinischen Studien zur Therapie von Malignomen, Infektionen und allergischen Erkrankungen und als Impf-Adjuvans erprobt. Zielsetzung dieser Arbeit war die genauere Charakterisierung der Effekte der verschiedenen CpG-ODN auf die PDC und die weitere Aufklärung der Signaltransduktionswege, die diese Effekte vermitteln. Die verwendeten Methoden waren ELISA, Durchflusszytometrie, Western Blot und molekularbiologische Methoden inclusive PCR, Klonierung und Sequenzierung. Dabei konnte gezeigt werden, dass nur CpG-A in der Lage ist, eine starke und lang anhaltende IFN-alpha-Produktion in der PDC zu induzieren mit einem bestimmten Spektrum an IFN-alpha-Subtypen. Sowohl die CpG-A als auch die CpG-B induzierte IFN-alpha-Produktion erwiesen sich als abhängig von p38-Aktivierung aber unabhängig von JNK und ERK. Interessanterweise beeinflusste NF-kB die CpG-induzierte IFN-alpha-Produktion gegensätzlich, wobei die CpG-A induzierte IFN-alpha-Produktion gefördert und die CpG-B-abhängige IFN-alpha-Produktion gehemmt wurde. Diese Ergebnisse liefern einen Beitrag zur weiteren Aufklärung des molekularen Wirkmechanismus der CpG-Deoxyoligonukleotide.

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 06/19
Aberrante Aktivierung der Rezeptortyrosinkinase FLT3 in der akuten myeloischen Leukämie

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 06/19

Play Episode Listen Later Jan 15, 2007


In der akuten myeloischen Leukämie (AML) sind zwei Cluster aktivierender Mutationen im ´FMS-like tyrosine kinase-3´ (FLT3)-Gen bekannt: FLT3-´internal tandem duplications´ (FLT3-ITD) in der juxtamembranösen (JM)-Domäne in 20 - 25 % der Patienten und FLT3-Punktmutationen in der Tyrosinkinasedomäne (FLT3-TKD) in 7 – 10 % der Patienten. In dieser Studie haben wir eine neue Klasse aktivierender Punktmutationen (PM) charakterisiert, die in einem 16-Aminosäuren-Abschnitt der JM-Domäne von FLT3 (FLT3-JM-PM) lokalisiert sind. Die Expression von vier FLT3-JM-PM in IL-3-abhängigen Ba/F3-Zellen führte zu wachstumsfaktor-unabhängigem Wachstum, Hyperproliferation in Gegenwart von FL und Resistenz gegenüber apoptotischem Zelltod. FLT3-JM-PM-Rezeptoren waren autophosphoryliert und zeigten verglichen mit FLT3-WT-Rezeptoren eine höhere konstitutive Dimerisierungsrate. Als einen molekularen Mechanismus konnten wir die Aktivierung von STAT5 und eine erhöhte Expression von Bcl-x(L) in allen FLT3-JM-PM-exprimierenden Zellen im Vergleich zu FLT3-WT-Zellen zeigen. Der FLT3-Inhibitor PKC412 inhibierte das wachstumsfaktor-unabhängige Wachstum der FLT3-JM-PM-Zellen. Verglichen mit FLT3-ITD- und FLT3-TKD-Zellen, zeigten die FLT3-JM-PM-Zellen ein schwächeres Transformationspotential, verbunden mit geringerer Autophosphorylierung des Rezeptors und dessen nachgeordneten Ziel-Protein STAT5. Die Kartierung der FLT3-JM-PM auf die Kristallstruktur des FLT3-Proteins zeigte, dass diese Punktmutationen wahrscheinlich die Stabilität der autoinhibitorischen JM-Domäne reduzieren. Dies liefert eine strukturelle Erklärung für das transformierende Potential dieser neuen Klasse aktivierender Mutationen von FLT3. Die defekte Negativ-Regulation aktivierter Rezeptortyrosinkinasen (RTKs) ist ein bekannter Mechanismus der Onkogenese. Die RTK FLT3 wird in frühen myeloischen und lymphoiden Progenitorzellen exprimiert und ist an der Pathogenese der AML beteiligt. Das ´Casitas B-lineage lymphoma´ (CBL)-Protein ist in der Evolution stark konserviert und übernimmt wichtige Funktionen in der Negativ-Regulation der Signalübertragung verschiedener Zelloberflächenrezeptoren. Zwei CBL-Deletionsmutanten, die in vitro Fibroblasten transformieren, wurden aus murinen Retroviren isoliert, die Vorläufer-B-Zelllymphome induzieren. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass CBL nach FL-Stimulierung von FLT3-WT-exprimierenden Ba/F3-Zellen phosphoryliert wird und damit in die FLT3-nachgeordnete Signaltransduktion involviert ist. Die Koexpression der CBL-Deletionsmutanten CBL-70Z oder v-CBL mit FLT3 führt zur Transformation von Ba/F3-Zellen. Das transformierende Potential wird durch den FLT3-Rezeptor vermittelt, da die selektiven FLT3-PTK-Inhibitoren SU5614 und PKC412 die Proliferation der FLT3-WT/CBL-mutanten-Zellen vollständig aufheben. Die Aktivierung des PI3K/mTOR/AKT-Signalweges, jedoch nicht der SRC-Kinasen und MAPK, trägt wesentlich zum hyperproliferierenden Phänotyp der FLT3-WT/CBL-mutanten Zellen nach Ligandenstimulierung bei. Die Koexpression von CBL-70Z oder v-CBL mit FLT3 führt zur konstitutiven Aktivierung der FLT3-Rezeptoren sowie STAT5 und AKT. Nach FL-Stimulierung konnten wir eine Hyperaktivierung von STAT5 und AKT in FLT3-WT/CBL-70Z und FLT3-WT/v-CBL-Zellen beobachten. An der Interaktion von CBL und FLT3 sind die TKB-Domäne des CBL-Proteins und die JM-Tyrosine Y589 und Y599 des FLT3-Rezeptors beteiligt. Die Internalisierung der FLT3-Rezeptoren wird durch die Koexpression von CBL-70Z nicht verändert. Allerdings ist CBL an der Ubiquitinierung und Degradierung von Rezeptoren beteiligt und wir konnten zeigen, dass CBL-WT die Dephosphorylierung und Degradierung des FLT3-Rezeptors fördert. Es wurde vorgeschlagen, dass die CBL-Deletionsmutanten in dominant-negativer Weise agieren und die negativ-regulatorische Funktion von CBL-WT blockieren. Wir haben eine CBL-Deletionsmutante in den AML Zelllinie MOLM-13 und MOLM-14 identifiziert. Dieser CBL-Mutante fehlt Exon 8, das für Teile der Linker- und RING-Finger-Domäne kodiert, und erinnert an CBL-70Z. Die Entdeckung einer möglicherweise transformierenden CBL-Mutante in AML-Zellen unterstützt die Hypothese, dass CBL zum malignen Phänotyp der AML beiträgt. Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass die strukturelle oder funktionelle Inaktivierung negativ-regulatorischer Mechanismen das transformierende Potential von FLT3 aktivieren kann: 1. Der Verlust der Autoinhibition durch Punktmutationen, die die geordnete Konformation der autoinhibitorischen JM-Domäne stören. 2. Die funktionelle Inaktivierung eines negativ-regulatorischen Proteins durch ´loss-of-function´-Mutationen. Diese Daten unterstreichen die zentrale Rolle von FLT3 in der Leukämogenese und als ein Zielprotein für therapeutische Ansätze.

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 06/19
Mikrobizide und zytotoxische Funktionen polymorphkerniger Leukozyten bei Patienten mit Sepsis

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 06/19

Play Episode Listen Later Nov 23, 2006


Reagible Sauerstoffradikale sind wichtige Bestandteile mikrobizider als auch zytotoxischer Funktionen polymorphkerniger neutrophiler Leukozyten (PMNL). Da dieser ambivalenten Stellung im Verlauf einer Sepsis große Bedeutung zukommt, untersuchten wir die Produktion von H2O2 in Abhängigkeit unterschiedlicher partikulärer und löslicher Stimuli bei Patienten mit zunehmender Schwere einer Sepsis. Es wurden Patienten mit unkomplizierter Sepsis (n=15), schwerer Sepsis (n=12) und Patienten mit septischem Schock (n=33) in eine prospektive Studie eingeschlossen. Die Kontrollgruppe bestand aus gesunden Probanden (n=50) mit vergleichbarer Altersstruktur und Geschlechtsverteilung. Zur Erfassung von Adhärenz, Phagozytose und der mit der Phagozytose assoziierten Sauerstoffradikalproduktion wurden nicht-opsonierte und opsonierte Zymosanpartikel verwendet. Die an β-Glukanen und Lektinstrukturen reiche Oberfläche von Zymosanpartikeln löst vermittelt durch die Lektinbindungsstelle der α-Kette (CD11b) des Komplementrezeptors Typ 3 und der in jüngerer Zeit charakterisierten „C type-lectin-like domain“ (CTLD) des Dektin-1-Rezeptors deren Phagozytose und die Phagozytose-assoziierte H2O2-Produktion des Granulozyten aus. Beide Rezeptoren werden als „non Toll-like“ Rezeptoren klassifiziert, welche zur Gruppe der „pathogene-recognition“ Rezeptoren (PRR) gerechnet werden. Zur Erfassung der durch lösliche Stimuli ausgelösten Zellaktivierung wurden PMNL mit dem chemotaktischen Tripeptid fMLP allein und nach Priming mit TNF-α inkubiert. Die ermittelte H2O2-Produktion war nach Stimulation mit nativem Zymosan reduziert, nach Stimulation mit opsoniertem Zymosan unverändert und nach Stimulation mit fMLP allein, fMLP in Kombination mit TNF-α, sowie in der Kontrollgruppe gesteigert. Alle Veränderungen hatten ihre deutlichste Ausprägung in der Gruppe der Patienten mit septischem Schock. Insbesondere die Phagozytose von Zymosan und die daran assoziierte H2O2-Produktion waren signifikant verringert, während die spontane und die durch lösliche Stimuli ausgelöste H2O2-Produktion stark erhöht waren. Diese Ergebnisse lassen auf die Entwicklung einer mit der Schwere einer Sepsis zunehmenden Granulozytendysfunktion schließen. Diese ist durch die Abnahme mikrobizider Teilfunktionen bei gleichzeitiger Steigerung der die Mikrozirkulation und potenziell das Gewebe schädigenden zytotoxischen Partialfunktionen charakterisiert. Da die Adhärenz von PMNL an nativem Zymosan unverändert blieb, während simultan die Phagozytose und die Phagozytose-assoziierte H2O2-Produktion reduziert waren, kann auf einen Defekt in der Signaltransduktion der Lektinbindungsstelle und/oder dem Dektin-1 β-Glukanrezeptor geschlossen werden.

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 05/19
Signaltransduktion durch TRAF-bindende Mitglieder der TNF-Rezeptor-Superfamilie (TNFR-SF)

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 05/19

Play Episode Listen Later Jul 27, 2006


Thu, 27 Jul 2006 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/5766/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/5766/1/Hauer_Julia.pdf.pdf Hauer, Julia ddc:610, ddc:600, M

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06
Untersuchungen zur Signaltransduktion des epithelialen Adhäsionsmoleküls EpCAM

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06

Play Episode Listen Later Jul 26, 2006


Das Epithelial Cell Adhesion Molecule, kurz EpCAM, ist ein transmembranes Zelladhäsionsmolekül, dessen Expression mit einer erhöhten Proliferation epithelialer Zellen einhergeht. Die veränderten proliferativen Eigenschaften werden durch eine EpCAM-vermittelte Signaltransduktion hervorgerufen, die u.a. die Transkription des Proto-Onkogens c-myc induziert. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass EpCAM die Transkription weiterer „down stream“-Zielmoleküle reguliert. Die mRNA-Synthese des Transkriptions-faktors Egr-1 wird durch EpCAM reprimiert. Dagegen induziert EpCAM die Transkription der Gene für RhoB und Calmodulin I. Außerdem korreliert in unterschiedlichen Karzinomzelllinien die native EpCAM-Expression mit der Transkriptionsrate von Calmodulin I. Zur Identifikation intrazellulärer Interaktionspartner wurde mit der kurzen zytoplasmatischen Domäne (26 Aminosäuren) von EpCAM ein Two-Hybrid Screening in Hefen durchgeführt. Es konnten 17 potentielle Interaktionspartner aus einer humanen cDNA-Bank identifiziert werden. Für die zwei Signaltransduktions-moleküle FHL2 und Cyclophilin A war es möglich, eine Interaktion mit EpCAM in humanen Zellen nachzuweisen. Darüberhinaus konnte gezeigt werden, dass die C-terminale LIM-Domäne von FHL2 für eine Assoziation mit EpCAM notwendig ist. Somit konnte in dieser Arbeit die Grundlage für eine weitere Analyse der EpCAM-vermittelten Signaltransduktion geschaffen werden.

Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06
Signaltransduktion durch Zwei-Komponenten Systeme in dem halophilen Archaeon Halobacterium salinarum

Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06

Play Episode Listen Later Jul 1, 2006


Die vorliegende Arbeit diente der funktionellen Charakterisierung der Zwei-Komponenten Systeme (ZKS) des halophilen Archaeons Halobacterium salinarum. Von der Existenz mehrerer Histidinkinasen (HK) und Antwortregulatoren (RR) neben dem Chemotaxis-ZKS CheA/CheY weiss man nur aufgrund der Sequenzierung des Genoms. Folglich fehlten bislang funktionelle Beschreibungen dieser Proteine. Die vorgelegte Dissertation begann, diesen Mangel zu beheben. Den Laborversuchen war eine bioinformatische Bestandsaufnahme vorgeschaltet, welche die Sensordomänen der HK, die Effektordomänen der RR und die konservierten ZKS-Domänen beider Proteinklassen nach greifbaren Anhaltspunkten durchforstete. Diese Rasterfahndung vermochte jedoch nur bescheidene Hinweise auf die Funktionen und Wechselwirkungen der HK und RR zu erbringen. Die praktischen Arbeiten zur funktionellen Charakterisierung der halobakteriellen ZKS basierten auf zwei unterschiedlichen Strategien. Der erste Ansatz bestand in dem Versuch einer Funktionszuordnung über die Applikation eines Phosphatmangels, dem alle bislang daraufhin untersuchten Prokaryoten durch eine exklusiv ZKS gesteuerte, differentielle Genexpression entgegenwirken. Im zweiten Ansatz wurde mit OE3855R eine der wenigen HK, deren Primärsequenz einen Hinweis auf die Proteinfunktion lieferte, eingehend biochemisch analysiert. Für die Phosphatmangelversuche musste zunächst geprüft werden, bei welchem Nährstoffangebot H. salinarum in eine Unterversorgung gerät. Den Experimenten zufolge limitiert ein Phosphatgehalt von weniger als 0,5mM im Medium die finale Wachstumsdichte. Die mangelhafte Phosphatversorgung induziert das Gen aph, was zu einer verstärkten Produktion und Sekretion des Enzyms Alkalische Phosphatase führt. Mikroarray-Analysen und RT-qPCR-Experimente deckten auf, dass das halobakterielle Pho-Regulon mehrere ABC-Transportsysteme und verschiedene sekretierte Enzyme umfasst. Über die somit stark verbesserten Phosphataufnahmefähigkeiten hinaus ändert sich die Transkription einer Vielzahl weiterer Gene, wobei es sich wahrscheinlich um sekundäre Effekte handelt. Während der Hungerphase verbraucht H. salinarum drei Viertel seines intrazellulären Phosphatspeichers. Die massive Abnahme des Phosphatvorrats ist nicht nur die Folge der Mangelversorgung, sondern gleichzeitig verantwortlich für die Induktion des Pho-Regulons. Das zuständige Regulatorprotein wurde bislang nicht enttarnt. Durch Konstruktion mehrerer Deletionsstämme konnten klassische ZKS als Signaltransduktoren überraschenderweise ausgeschlossen werden. Die Induktion von Proteinen mit Homologien zu DNA bindenden Bereichen von Transkriptionsfaktoren und zu dem regulatorischen Mediatorprotein PhoU deutet auf einen alternativen Regelkreis hin. Dieser wäre exklusiv für Archaea, da solche PhoU-Chimären ausschließlich in archaealen Genomen zu finden sind. Von der Anpassung des Proteininventars abgesehen orientieren H. salinarum-Zellen ihre Bewegungen an einem Phosphatgradienten. Diese Chemotaxis wird durch Phosphatmangel induziert und durch das Zwei-Komponenten System CheA-CheY vermittelt. Erstmals in einem Archaeon gezeigt, wird die Phosphattaxis von H. salinarum ausschließlich von anorganischem Phosphat ausgelöst. Laut Primärsequenzanalyse besitzt die Histidinkinase OE3855R eine Häm bindende PAS-Domäne (PAS3855) und könnte daher einen Sauerstoffsensor darstellen. Eine heterologe Expression von PAS3855 sollte dieser Hypothese Substanz verleihen. Das exprimierte Polypeptid enthielt geringe Mengen eines Kofaktors, der mittels Absorptionsspektroskopie und LC-MS-Analyse als Häm des Typs B identifiziert wurde. Auf Basis dieses Wissens erfolgte die Rekonstitution der Domäne mit HämB, was die Bildung eines Tetramers induzierte. Die spektroskopische Analyse entlarvte große Ähnlichkeiten zwischen den elektronischen Zuständen der zentralen Häm-Eisenionen von PAS3855 und dem Häm bindenden Redoxsensorprotein Dos aus E. coli. Da die Reduktion von FeIII- zu FeII-PAS3855 die Oligomerisierung der Domäne von einem Tetramer zu einem Dimer veränderte, lag eine redoxabhängige Signalfunktion der Histidinkinase OE3855R nahe. Die Deletion des kodierenden Gens führte zu keinem erkennbaren Phänotyp, weshalb zum gegenwärtigen Zeitpunkt keine Aussage getroffen werden kann, ob diese HK in vivo tatsächlich als Redox- oder auch Sauerstoffsensor fungiert.

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/19
Die Bedeutung von Genveränderungen bei Tyrosinphosphatasen

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/19

Play Episode Listen Later Nov 10, 2005


In der vorliegenden Arbeit wurde die Tyrosinphosphatase hVH-5 nach Genveränderungen untersucht. Als Mitglied der Familie der dual-spezifischen Phosphatasen ist hVH-5 (homologue of vaccinia virus H1 phosphatase gene clone 5) an der Signaltransduktion der Zelle durch Dephosphorylierung von stress-aktivierter Proteinkinase (SAPK) und p38 beteiligt. Aufgrund seiner Rolle als potentielles Tumorsuppressorgen können Genveränderungen oder Fehlregulationen von hVH-5 zur Entstehung von Tumoren beitragen. Wie bereits bekannt ist, zählt die Lokalisation dieses Gens auf Chromosom 11p15.5 zu häufig beobachteten Loss Of Heterozygosity (LOH)-Regionen bei Krebserkrankungen, u.a auch bei Brustkrebs. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Expressionsanalyse der hVH-5 Phosphatase in Normalgewebe und Brustkrebszelllinien durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass hVH-5 nicht nur, wie schon bekannt, in humanem Gehirn, Herz und Skelettmuskel transkribiert wird, sondern eine Trankription darüber hinaus auch noch in 10 weiteren humanen Geweben sowie in allen untersuchten Brustkrebszelllinien nachgewiesen werden konnte. Um ein zeitsparendes und effektives Mutationsscreening zu ermöglichen, wurde eine neue Methode, Conformation Sensitive Gel Electrophoresis (CSGE), etabliert. Dadurch konnte bereits im ersten Exon dieser Phosphatase eine Heteroduplexbildung als Hinweis auf eine Genveränderung sichtbar gemacht werden. Mittels Sequenzierungs- sowie Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus-Analyse konnte die exakte Nukleotidsequenz bestimmt werden. Es wurde festgestellt, dass es sich hierbei um eine bisher unbekannte Gensequenz eines prozessierten Pseudogens der hVH-5 Phosphatase handelt. Prozessierte Pseudogene sind dadurch definiert, dass sie typischerweise durch einen Verlust des Promotors transkriptionell inaktiv sind. Eine Datenbankrecherche (Sanger Center) ermöglichte die Lokalisation des Pseudogens auf Chromosom 10q22.2. Phylogenetische Analysen führten zu dem Ergebnis, dass das Gen vor ca. 6,8 Mio. Jahren entstanden sein müsste. Es konnte gezeigt werden, dass das in dieser Arbeit beschriebene Pseudogen von hVH-5 (ψhVH-5) entgegen der Definition eines Pseudogens in gesunden menschlichen Geweben transkribiert wird. Diese Tatsache deutet auf eine evtl. funktionelle Bedeutung dieses Gens hin. Weiterhin konnte ein möglicher Zusammenhang zwischen der Transkription des Pseudogens und der Entstehung von Brustkrebs nicht ausgeschlossen werden, da dieses in drei von 14 untersuchten Brustkrebszelllinien nicht transkribiert wird. Aus der Übersetzung der Nukleinsäuresequenz von ψhVH-5 in Aminosäuren resultierte ein Peptid von 8.8 kDa, welches sich stark vom hVH-5 Wildtyp unterscheidet und keinerlei funktionelle Domänen aufweist. Es konnte weder ein Nachweis des transient überexprimierten Proteins noch eines in vivo translatierten Proteins erbracht werden. Die Akkumulation der zahlreichen Mutationen im Pseudogen verglichen mit dem Wildtyp deutet stark darauf hin, dass dieses Gen in der Evolutionsgeschichte aufgrund fehlender funktioneller Bedeutung zumindest zeitweise keinem Selektionsdruck unterlag oder aber sich zu einem selbständigen Gen mit noch unbekannter Funktion weiterentwickelte. In der vorliegenden Arbeit konnten Hinweise dafür gebracht werden, dass ψhVH-5 sich möglicherweise derart entwickelt hat, um durch andere Regulationsmechanismen, beispielsweise solche, die für nicht-kodierende RNAs bekannt sind, mit dem Wildtypgen der hVH-5 Phosphatase zu interagieren.

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/19
Untersuchung zur Regulation des epithelialen Zelladhäsionsmoleküls EpCAM

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/19

Play Episode Listen Later Oct 20, 2005


Im Rahmen der Arbeit wurde ein zelluläres System etabliert mit dem die transkriptionelle Aktivität des EpCAM-Promotors, ausgehend von der bisherig bekannten Promotorsequenz, beurteilbar ist. Experimentelle Basis war der Luziferase-Assay für den ein Luziferase-Reporterplasmid unter transkriptioneller Kontrolle der bisher bekannten EpCAM-Promotorsequenz generiert wurde. Es konnte mit Hilfe von FACS-Analysen und Immunoblots gezeigt werden, daß sich die gemessene transkriptionelle Aktivität in der tatsächlichen EpCAM-Expression widerspiegelt. Desweiteren konnte gezeigt werden, daß die kanzeromodulierenden Substanzen TNFalpha und TPA auf den EpCAM-Promotor reprimierend wirken. Im Falle von TNFalpha konnte experimentell belegt werden, daß die Repression über die spezifische Signaltransduktion über den NF-kappa-B-Signalweg zustande kommt, in dem letztlich NF-kappa-B über eine Kompetition um den wichtigen Transkriptionskoaktivator p300/CBP eine Repression des EpCAM-Promotors vermittelt.

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06
14-3-3 Bindeproteine und deren Rolle in Signaltransduktion und Vesikeltransport in Hydra

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06

Play Episode Listen Later Sep 30, 2005


Fri, 30 Sep 2005 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/4284/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/4284/1/Pauly_Barbara.pdf Pauly, Barbara ddc:570, ddc:500, Fakult

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06
Die Rolle des TRADD Adapterproteins in der Signaltransduktion des zellulären TNF-Rezeptors 1 und des Latenten Membranproteins 1 des Epstein-Barr-Virus

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06

Play Episode Listen Later Sep 26, 2005


Das Adapterprotein TRADD spielt eine zentrale Rolle in der Signaltransduktion des zellulären TNF-Rezeptors 1 (TNF-R1) und des Latenten Membranproteins 1 (LMP1) vom Epstein-Barr-Virus. Im Gegensatz zur Situation am TNF-R1 bindet TRADD an LMP1 nicht über seine Todesdomäne, sondern über seinen N-terminalen Bereich. Betrachtet man die Zusammensetzung der TNF-R1 und LMP1 Signalkomplexe und der von diesen beiden Membranproteinen aktivierten Signalwege, sind ganz offensichtlich viele Gemeinsamkeiten zu erkennen. Dennoch ist die biologische Funktion dieser beiden Membranproteine zum Teil sehr unterschiedlich. Während der TNF-R1 maßgeblich an der Regulation inflammatorischer Prozesse beteiligt ist und in bestimmten Situationen die Zelle in den programmierten Zelltod (Apoptose) treiben kann, ist LMP1 essentiell an der Immortalisierung von B-Lymphozyten durch das Epstein-Barr-Virus beteiligt. LMP1 ist ein virales Onkogen, das die Expression mitogener Faktoren induziert und gleichzeitig Apoptose und Seneszenz inhibiert. Die Aufklärung der Signaltransduktion dieser beiden Membranproteine auf molekularer Ebene steht seit vielen Jahren im Zentrum intensiver Forschung. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Rolle von TRADD in der Signaltransduktion von TNF-R1 und LMP1 zu klären. Da das einzig wirklich zuverlässige System zur Untersuchung der TRADD Proteinfunktionen ein TRADD „knockout“ Zellsystem ist, wurde im Rahmen dieser Doktorarbeit erstmals ein TRADD-defizientes Zellsystem mittels homologer Rekombination in humanen B-Lymphozyten (DG75) hergestellt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Signaltransduktion von TNF-R1 und LMP1 in DG75 wildtyp und DG75 TRADD-defizienten Zellen untersucht. Dabei konnte erstmals gezeigt werden, dass TRADD für die Aktivierung des klassischen NF-κB Signalwegs sowohl durch die TNF-R1 Signaldomäne als auch durch LMP1 notwendig ist. Zusätzlich konnte durch die Entwicklung einer neuen, auf FACS-basierenden Methode zur Zelltodanalyse nach transienter Transfektion apoptotischer Gene, in DG75 TRADD-defizienten Zellen nachgewiesen werden, dass TRADD an der Induktion von Apoptose durch TNF-R1 essentiell beteiligt ist. Diese beiden Ergebnisse stützen das derzeitige Modell der TNF-R1 bzw. LMP1 Signaltransduktion. Dagegen konnte im Rahmen dieser Doktorarbeit festgestellt werden, dass TRADD weder für die Aktivierung des JNK1 Signalwegs durch die TNF-R1 Signaldomäne noch durch LMP1 benötigt wird. Im Fall von TNF-R1 stellt dieses Ergebnis das bis heute gültige Modell der TNF-R1 Signaltransduktion in Frage und zeigt, dass TRADD nicht das zentrale Adapterprotein zur Induktion aller wichtigen TNF-R1 Signalwege sein kann. Diese Ergebnisse konnten durch Experimente mit TRADD-siRNA in HeLa Zellen bestätigt werden. Abschließend konnte in dieser Arbeit erstmals gezeigt werden, dass TRAF2 unabhängig von TRADD mit dem TNF-R1 interagieren kann und von der TNF-R1 Signaldomäne in Abwesenheit von TRADD in „lipid rafts“ rekrutiert wird. Da TRAF2 für die TNF-R1-vermittelte JNK1 Aktivierung essentiell ist, könnte dies eine Erklärung für die TRADD-unabhängige Induktion des JNK1 Signalwegs durch TNF-R1 sein. Welches Molekül die Bindung von TRAF2 an TNF-R1 vermittelt, ist noch unklar und wird in Zukunft experimentell adressiert werden. Hierfür stellen die DG75 TRADD-defizienten Zellen ein wertvolles experimentelles System dar.

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/19
Rolle von Cytochrom P450-Metaboliten bei der EDHF-vermittelten Dilatation von Widerstandsarterien und Effekte von chronisch erhöhtem Perfusionsdruck auf glattmuskuläre und endotheliale Funktionen

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/19

Play Episode Listen Later Jul 28, 2005


Widerstandsarterien spielen eine wichtige Rolle bei der Durchblutungsregulation. Bisher konnte der wichtigste endotheliale Dilatator in diesen Gefäßen, EDHF, nicht eindeutig identifiziert werden, da pharmakologische Inhibitoren unspezifische Nebenwirkungen aufwiesen. Die spezifische Inhibition von Enzymen mittels Antisensetechnik konnte in intakten Arterien nicht durchgeführt werden, da diese nur über einen kurzen Zeitraum funktionell intakt erhalten werden konnten. Im Rahmen dieser Dissertation wurde ein neues Organkulturmodell entwickelt, in dem erstmalig die endothelabhängigen EDHF- und NO-vermittelten Dilatationen über 48 h vollständig erhalten werden konnten. Zusätzlich entwickelten die kultivierten Arterien einen mit dem frisch isolierter Arterien vergleichbaren Spontantonus und zeigten eine myogene Reaktion, die sich in Kinetik und Ausmaß der Kontraktion nicht von den Kontrollarterien unterschied. Ebenso kontrahierten die chronisch perfundierten Arterien auf Stimulation mit Noradrenalin und dilatierten nach Applikation des NO-Donors SNP in vergleichbarem Ausmaß wie frisch isolierte Arterien. Um zu untersuchen, ob möglicherweise eine CytochromP450-Epoxygenase in der Signalkaskade des EDHF eine Rolle spielt, wurde zunächst die Expression von CYP2C8 in Widerstandsarterien mittels rtPCR und in-situ-Hybridisierung nachgewiesen. Da mit dem Organkulturmodell die Arterien funktionell vollständig intakt gehalten werden konnten, wurde die Wirkung von Antisense-Oligonucleotiden, die gegen CYP2C8 gerichtet waren, untersucht. Mittels konfokaler Mikroskopie konnte gezeigt werden, dass die FITC-markierten Oligonucleotide sich nur in der Intima befanden und die Transfektion des Endothels eine hohe Effizienz aufwies. Die Transfektion hatte keinen Effekt auf die NA-induzierte Kontraktion, auf die durch NS1619 (KCa-Kanalöffner)- oder die SNP- vermittelte Relaxation, was zeigt, dass die Funktion des glatten Muskels durch die Transfektion unbeeinträchtigt blieb. Die EDHF-vermittelten Dilatationen wurden durch die Transfektion mit den Antisense-Oligonucleotiden um 76% und die korrespondierenden Calciumabfälle um 58 % reduziert, während die Kontrolltransfektionen mit Scrambled- oder Senseoligonucleotiden keinen Einfluss auf die EDHF-mediierten Dilatationen hatten. Die endothelialen Calciumanstiege nach Stimulation mit ACh blieben in den Antisense-transfizierten Arterien unverändert. Das bedeutet, dass die Signaltransduktion der ACh-Rezeptoren durch die Transfektion funktionell nicht beeinträchtigt wurde. Auf diese Weise konnte mit einem spezifischen Inhibitor gezeigt werden, dass CYP2C8 eine EDHF-Synthase ist oder dessen Metabolit einen permissiven Faktor für einen anderen EDHF darstellt und ein elementarer Bestandteil der EDHF-Signalkaskade ist. Zusätzlich wurden mit diesem Organkulturmodell die Auswirkungen des kardiovaskulären Risikofaktors Hochdruck durch isolierte Erhöhung des transmuralen Drucks auf 120 und 160 mmHg (SMA120 bzw. SMA160) während einer Kulturperiode (48 h) untersucht. In den funktionellen Testungen zeigten sich nach 48 h geringere Außendurchmesserwerte in SMA120 und SMA160 im Sinne eines Remodelings. Der erhöhte Perfusionsdruck führte darüber hinaus zu einer Verstärkung der Noradrenalin-vermittelten Kontraktion. Dies ist jedoch nicht durch eine Erhöhung der Calciumsensitivität der Myofilamente zu erklären, da diese im Vergleich zur Kontrolle unverändert war, sondern durch eine Verstärkung der NA-induzierten Calciumanstiege. Neben den Veränderungen in der glatten Muskulatur zeigte sich insbesondere auch eine Beeinträchtigung der Endothel-vermittelten Relaxationen. Die NO-mediierte Dilatation wurde durch die chronische Perfusion bei 120 mmHg um 38% reduziert und bei SMA160 vollständig aufgehoben. Ebenso wurde die EDHF-vermittelte Relaxation bei SMA120 um 20 % und bei SMA160 um 47% verringert und der korrespondierende Calciumabfall um 41 % reduziert. Diese Reduktion der endothelialen Dilatationen wurde nicht durch eine Erhöhung der Elastance der Arterienwand hervorgerufen, da die dosisabhängige SNP-mediierte Relaxation unbeeinträchtigt war. Zusätzlich scheint eine strukturelle Schädigung des Endothels durch den erhöhten Druck unwahrscheinlich, da mittels Rasterelektronenmikroskopie keine Schäden an der Intima dargestellt werden konnten. Die Expression des ACh-Rezeptors scheint auch nicht in dem Maße verringert zu sein, dass sich daraus die verringerten NO- und EDHF-mediierten Relaxationen erklären ließen, da der endotheliale Calciumanstieg in SMA120 im Vergleich zu SMA45 unverändert war. Daher wird die Beeinträchtigung durch den erhöhten Druck in einem nachgeschalteten Signaltransduktionsweg vermutet. Erhöhter transmuraler Druck hat in diesem Modell innerhalb von 2 Tagen schon zu einer erheblichen Beeinträchtigung der endothelialen Funktionen und zu einer verstärkten Reaktivität des glatten Muskels in Widerstandsarterien geführt. Zwar ist eine Erhöhung des transmuralen Drucks für 48 h nicht mit einem jahrelang bestehenden Hypertonus vergleichbar, jedoch könnte man die so erhobenen Befunde als Hinweis werten, dass eine frühzeitige konsequente antihypertensive Therapie sinnvoll ist, um die druckinduzierte Verstärkung der glattmuskulären Reaktivität und die Einschränkung der Endothelfunktion zu verringern und eine daraus resultierende weitere Erhöhung des Blutdruckes zu verhindern.

Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06
Die Funktion der Cochaperone FKBP51, FKBP52 und p23 bei der Signaltransduktion der Corticoidrezeptoren

Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06

Play Episode Listen Later Aug 12, 2004


Um die Therapiemöglichkeiten bei depressiven Störungen zu verbessern, ist die Kenntnis der molekularen Grundlagen dieser Erkrankungen notwendig. Die erhöhten basalen Cortisolwerte im Serum von depressiven Patienten und die gestörte negative Rückkopplung der HPA-Achse sind Hinweise darauf, daß die Funktionsweise der Rezeptoren für Corticoide wie Cortisol eingeschränkt ist. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit den Cochaperonen für die Corticoid-Signaltransduktion, insbesondere den Immunophiline FKBP51 und FKBP52, sowie p23. Für die Immunophiline wurde entdeckt, daß für ihren Beitrag zu einer effizienten Aktivierung Corticoid-abhängiger Promotoren drei Eigenschaften von Bedeutung sind: 1. Interaktion mit Hsp90, um überhaupt den Zugang zum Heterokomplex zu erhalten, 2. Wechselwirkung mit Dynein, um den nukleären Transport der Rezeptoren zu begünstigen und 3. die Peptidyl-Prolyl-Isomerase-Aktivität. Diese Postulate gründen sich auf die folgenden experimentellen Befunde: Das Immunophilin FKBP51 reduziert als Bestandteil des Heterokomplexes mit Hsp90 und den Corticoidrezeptoren sowohl die Bindungsaffinität (Denny et al., 2000) als auch die nukleäre Translokation des Glucocorticoidrezeptors (GRs) und des Mineralocorticoidrezeptors (MRs). Im Gegensatz zu seinem Homologen FKBP52 zeigt FKBP51 nur eine geringe Interaktion mit dem Motorprotein Dynein, welches für den retrograden Transport verantwortlich ist. Durch Einführung einer Punktmutation, die die Peptidyl-Prolyl-Isomerase-Aktivität inaktiviert, konnte gezeigt werden, daß FKBP51 diese Aktivität nicht für seine inhibierende Wirkung benötigt. Im Gegensatz dazu liefert die PPIase-Aktivität von FKBP52 einen aktiven Beitrag für die Funktionalität der Corticoidrezeptoren, weil die analoge Mutation in FKBP52 zur einer Hemmung der Transaktivierung und nukleären Translokation des GRs und des MRs führt. Da diese Mutante immer noch mit Dynein interagiert, ist allein die Wechselwirkung mit diesem Motorprotein offensichtlich nicht ausreichend für die volle GR-Aktivität. Des weiteren konnte gezeigt werden, daß Polymorphismen im FKBP51-Gen nicht nur mit dem Erfolg einer Antidepressivabehandlung korrelieren, sondern auch mit den Proteinmengen von FKPB51 in Lymphozyten. Schließlich wurde die Bedeutung von p23 analysiert, einem kleinen Cochaperon von Hsp90, dem aber auch eigene Chaperonaktivität zugeschrieben wurde. Durch gezielte Mutationen im p23-Protein war es möglich, seine Chaperonaktivität getrennt von seiner Cochaperon-Funktion zu untersuchen. Dabei stellte sich heraus, daß p23 für die Hemmung der GR-abhängigen Transkription nur als Hsp90-Cochaperon fungiert, weil zwar seine Interaktion mit Hsp90 für diesen Effekt notwendig war, nicht aber seine Chaperonaktivität. Um die beschriebene nukleäre Rolle von p23, die zum Zerfall von GR-Transkriptionskomplexen führt, zu untersuchen, wurde ein konstitutiv nukleärer GR verwendet. Auch hier benötigt p23 für die Hemmung des Rezeptors seine Hsp90-Interaktion, nicht aber seine Chaperonaktivität. Diese Arbeit leistet einen Beitrag zum Verständnis der Rolle von Chaperonen in der Steroid-Signaltransduktion. Darüber hinaus wurden starke Hinweise für eine mögliche Rolle von FKBP51 bei der Depression entdeckt.

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06
Untersuchungen zur physiologischen Rolle der Proteintyrosinkinase Syk in humanen Brustepithelzellen

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06

Play Episode Listen Later Jun 2, 2004


Die Proteintyrosinkinase (PTK) Syk wird ubiquitär in hämatopoetischen Zellen exprimiert und ist für die Weiterleitung von Signalen aktivierter Immunrezeptoren unerlässlich. Eine biologische Funktion von Syk wurde auch außerhalb hämatopoetischer Zellen postuliert. In Anbetracht dessen sollten in der vorliegenden Arbeit Untersuchungen zur Funktion von Syk in humanen Brustepithelzellen durchgeführt werden. Einen Schwerpunkt bildete dabei die Analyse zur Expression und katalytischen Aktivität von Syk in nichttransformierten und transformierten humanen Brustzelllinien. So konnte katalytisch-aktives Syk in nichttransformierten und schwach-tumorigenen humanen Brustepithelzellen nachgewiesen werden, jedoch nicht in invasiven Brustkrebszellen, was bereits veröffentlichte Daten bestätigte (Coopman et al., 2000). Die Unterdrückung der endogenen Expression von Syk in nichttransformierten Brustepithelzellen vermittelte eine erhöhte EGF-induzierte Tyrosinphosphorylierung des EGFRs, während die exogene Expression von katalytisch-aktivem Syk diese reduzieren konnte. Ferner konnte gezeigt werden, dass reduzierte Syk-Level die EGF-stimulierte Tyrosinphosphorylierung von Signalproteinen steigerte und somit die Proliferationsrate nichttransformierter Brustepithelzellen sowie deren Resistenz gegenüber oxidativem Stress erhöhte. Aufbauend auf diesen Daten kann eine Funktion von Syk in der Regulation von EGFR-vermittelten Signalen in Brustepithelzellen postuliert werden. Die gesteigerte autokatalytische Aktivität von Syk in vitro, die durch die chemische Inhibition der EGFR-Kinase erzielt werden konnte, sowie die nachgewiesene Assoziation beider Proteine, suggerieren ebenfalls einen wechselseitigen Einfluss von Syk und EGFR. Andere Untersuchungen demonstrierten einen Syk-abhängigen Einfluss auf das Migrationsverhalten von Brustepithelzellen, wobei nichttransformierte Zellen mit reduzierter Expression von Syk in ihrer Motilität eingeschränkt waren, während invasive Brustkrebszellen durch die exogener Expression von katalytisch-aktivem Syk sowohl in ihrem Migrations- als auch in ihrem Invasionsvermögen supprimiert wurden. Zusätzlich konnte ein Syk-spezifischer Einfluss auf die Tyrosinphosphorylierung des Adaptorproteins Shc nachgewiesen werden, der über die Kinaseaktivität von Syk vermittelt wurde. Zusammengenommen liefern die vorgestellten Ergebnisse neue Erkenntnisse zur Funktion, Expression und Regulation von Syk in Brustepithelzellen und postulieren für Syk eine regulative Funktion innerhalb der EGF-stimulierten Signaltransduktion.

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06
Die Funktion des vakuolisierenden Cytotoxins (VacA) und die Prozessierung des Cytotoxin-assoziierten Antigens (CagA) von Helicobacter pylori in Immunzellen

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06

Play Episode Listen Later Mar 9, 2004


Das humanpathogene Bakterium H. pylori persistiert im Gastroduodenaltrakt für Jahre oder sogar Jahrzehnte und löst durch die Kolonisation der Magenmukosa eine chronische Entzündungsreaktion aus. In den meisten Fällen bleibt diese symptomlos, es können jedoch auch schwerwiegende Erkrankungen wie ein Magen- oder Zwölffingerdarm-Geschwür oder Magenkrebs daraus hervorgehen. Obwohl die Infektion eine starke zelluläre und humorale Immunantwort hervorruft, kann H. pylori durch das Immunsystem nicht eliminiert werden. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von H. pylori auf die Proliferation und Aktivierung von CD4+ T-Zellen untersucht. Dabei zeigte sich, dass H. pylori zwei Faktoren besitzt, um die Expansion der T-Zellen zu hemmen. Der eine, nicht näher charakterisierte Faktor scheint mit der Oberfläche der Bakterien assoziiert zu sein und inhibiert die Proliferation der T-Zellen bei direktem Kontakt der Bakterien mit den Zellen. Der zweite Faktor wurde als vakuolisierendes Zytotoxin VacA identifiziert, das, wie bisher bekannt war, in Epithelzellen die Bildung saurer Vakuolen auslöst. T-Zellen produzieren, wenn sie aktiviert werden, den Wachstumsfaktor IL- 2, beginnen sich zu vermehren und setzen eine Immunreaktion gegen das Pathogen in Gang. Das VacA-Toxin hemmt jedoch die Bildung von IL-2 und bewirkt eine Hemmung des Zellzyklus bei T-Zellen, indem es die Expression der Cycline D3 und E reprimiert. Diese sind essentiell für die Aktivierung des Retinoblastom-Proteins, das den Übergang des Zellzyklus von der G1- in die S-Phase vermittelt. Durch die Hemmung der IL-2-Produktion und die Erniedrigung der Oberflächenlokalisation von CD25, der -Kette des IL-2-Rezeptors, unterbricht VacA die Signaltransduktion, die normalerweise über den IL-2-Rezeptor zur Expression der Cycline führt. Die Hemmung der IL-2-Produktion durch VacA erfolgt auf transkriptioneller Ebene, indem die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFAT (Nuclear Factor of Activated T cells) verhindert wird. Die anderen für die Transkription des IL-2-Gens essentiellen Transkriptionsfaktoren AP-1 und NF-B werden durch VacA nicht beeinflusst. Die Stimulation der T-Zellen aktiviert zwei Haupt-Signalwege: einer führt über den MAPKinase / ERK-Kinase Weg zur Aktivierung von AP-1 und NF-B, der andere löst eine Erhöhung der Calcium-Konzentration im Zytoplasma aus, was die Ca2+-abhängige Phosphatase Calcineurin aktiviert. Calcineurin dephosphoryliert daraufhin den Transkriptionsfaktor NFAT und NFAT wird in den Zellkern transportiert, wo es zusammen mit AP-1 und NF-B die Transkription des IL-2-Gens initiiert. Es konnte gezeigt werden, dass VacA die Translokation von NFAT in den Kern durch Hemmung der Phosphatase-Aktivität von Calcineurin verhindert. Dies hat zur Folge, dass NFAT-abhängige Gene, wie das IL-2- Gen oder das für CD25 codierende Gen, nicht abgelesen werden können. Dass Calcineurin ein geeignetes Zielmolekül ist, um eine Immunantwort zu unterdrücken, zeigen auch die medizinisch bedeutsamen Substanzen FK506 (Tacrolimus) und Cyclosporin A. Beide V Zusammenfassung 91 Substanzen verursachen durch Hemmung von Calcineurin eine starke Immunsuppression. In DNA-Microarray-Analysen wurde untersucht, ob VacA einen ähnlich drastischen Effekt auf die Funktion der T-Zellen hat wie FK506. Dabei zeigte der Vergleich der Genexpression von VacA- und FK506-behandelten T-Zellen, dass VacA eine Untergruppe der Gene, die auch von FK506 reprimiert werden, herunterreguliert, wie z.B. die Gene für die Zytokine Macrophage Inflammatory Protein (MIP)-1, MIP-1, Single C Motif-1 (SCM-1) und SCM- 1. VacA scheint also die Genaktivität von T-Zellen ähnlich wie FK506 zu modulieren, was auf einen ähnlichen Mechanismus, nämlich die Calcineurin-Hemmung schließen lässt. Da das VacA-Toxin ein sekretiertes Protein ist, das auch in den tieferen Schichten des Magengewebes nachgewiesen werden kann, erreicht H. pylori nicht nur die vereinzelt im Magenepithel vorkommenden T-Zellen, sondern auch die T-Zellen, die bei der Infektion in die Lamina propria, eine tiefere Schicht der Magenmukosa, einwandern. Durch die Unterdrückung der T-Zell-Aktivierung und die Repression von Zytokin-Genen, die wichtig sind für die Modulation der Immunantwort, induziert H. pylori so vermutlich eine lokale Immunsuppression, die seine Eliminierung durch das Immunsystem verhindert und eine chronische Infektion des Magens ermöglicht. In einem zweiten Projekt wurde die Spaltung von CagA in ein 100 kD- und ein Tyrosinphosphoryliertes 40 kD- Fragment nach dessen Translokation in diverse Zelltypen untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Prozessierung nicht nur in Makrophagen, sondern auch in dendritischen Zellen und in T-Zellen auftritt. Die Spaltung scheint von der Tyrosin-Phosphorylierung des CagA-Proteins und von Calcium abhängig zu sein. Dabei wurde die Ca2+-abhängige Protease Calpain in einem in vitro-Ansatz als ein CagAprozessierendes Enzym identifiziert. Auch in Makrophagen kann die Spaltung von CagA in P100 und P40P-Tyr durch den Calpain-Inhibitor Calpeptin verhindert werden. Die Tatsache, dass transloziertes CagA in allen getesteten eukaryontischen Zelltypen außer der Magenepithelzellinie AGS prozessiert wird, deutet darauf hin, dass diese Prozessierung eine biologische Bedeutung hat.

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/19
Etablierung eines Expressions- und Testsystems für Membranrezeptoren an Oozyten von Xenopus laevis

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/19

Play Episode Listen Later Jun 5, 2003


Entwicklungsbiologen haben vor über 25 Jahren festgestellt, daß Progesteron (PROG) die Fortsetzung der Reifeteilung an Xenopus Oozyten durch nicht-genomische Mechanismen an der Plasmamembran initiiert. Obwohl mehrere Publikationen dabei keine oder nur späte Veränderungen der intrazellulären Calciumkonzentration [Ca2+]i beschreiben, konnten Wasserman et al. an einigen Oozyten [Ca2+]i-Erhöhungen innerhalb der ersten Minute nach PROG-Zugabe beobachten. Diese Versuche sollten mit der Methode des Calcium Imaging reproduziert werden, wobei der Verlauf von [Ca2+]i durch Fluoreszenzmessung und dem Ca2+-Indikatorfarbstoff Fura-2 gemessen wurde. Dabei konnten innerhalb der ersten Minuten nach PROG-Zugabe keine Veränderungen von [Ca2+]i gefunden werden. Lysophosphatidylsäure (LPA) hingegen löste sehr zuverlässig Calcium-Signale aus. Durch Thrombin, Angiotensin II und Acetylcholin ausgelöste Effekte ließen sich, wenn auch seltener, ebenfalls zeigen. Xenopus Oozyten sind molekularbiologisch als eukaryontisches Expressionssystem nutzbar. Zur Etablierung des Expressions- und Testsystems wurde RNA in die Oozyten injiziert, die für den GnRH-Rezeptor kodiert. Nach erfolgreicher Expression steigt [Ca2+]i 1-3 Minuten nach der Rezeptorbindung über eine Aktivierung von Phospholipase Cb und das InsP3 System an. Auch bei Injektion von weniger als 0,5ng RNA pro Oozyte in das Zytosol konnte nach zwei Tagen, bei weniger als 0,15ng nach vier Tagen, ein schnelles Ca2+-Signal auf GnRH-Zugabe gesehen werden. Ebenso zeigten diese Effekte auch Oozyten, bei denen ein eukaryontischer GnRH-Rezeptor-Expressionsvektor in den Kern mikroinjiziert wurde, nicht aber unbehandelte Oozyten oder andere Negativkontrollen. An glatten Gefäßmuskelzellen (RSMC) kann in vitro eine schnelle Erhöhung von [Ca2+]i auf Aldosteron (ALDO) und an Spermatozoen auf PROG gezeigt werden. Zur Anwendung des Expressionssystems auf schnelle nicht-genomische Steroideffekte wurde einerseits aus diesen Zellen isolierte RNA in den Oozyten exprimiert, als auch RNA, welche für ein membranständiges Progesteron-bindendes Protein (mPR) kodiert. Durch Expression von RSMC-RNA konnte an Oozyten allerdings keine Calciumreaktion auf ALDO beobachtet werden; ebensowenig auf PROG durch Expression von RNA aus Mäusehoden oder mPR-RNA. Die hier vorgestellte Methode ist daher weniger geeignet zur Screening-Untersuchung bei der Expressionsklonierung zur Isolierung putativer Rezeptoren aus Genbanken oder Gesamt-RNA. Insgesamt handelt es sich jedoch um ein sehr gutes System, die Expression eines Rezeptors funktionell nachzuweisen; weitere Untersuchungen zur Rezeptoraktivierung, Signaltransduktion und topographischen Signalausbreitung lassen sich anschließen.

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06
Identifikation und Charakterisierung von neuen Interaktionspartnern des CDK-Inhibitors p27Kip1

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Play Episode Listen Later Mar 13, 2003


Der eukaryontische Zellzyklus wird durch die Aktivität verschiedener Cyclinabhängiger Kinasen (CDKs) reguliert. Die zelluläre Menge des CDK-Inhibitorproteins p27Kip1 spielt eine entscheidende Rolle beim Übergang der Zelle von der G1- zur SPhase. Die Menge von p27Kip1 steigt während der G0- oder der G1-Phase an und nimmt zu Beginn der S-Phase rasch wieder ab. Die Bindung von p27Kip1 an die CDKKomplexe der G1-Phase inaktiviert diese und verhindert dadurch die Initiation der SPhase. Eine verminderte Menge von p27Kip1 am G1/S-Phaseübergang findet man dagegen häufig in verschiedenen Tumorgeweben. Die geringere zelluläre Menge des Inhibitors ist dabei mit einer hohen Patientensterblichkeit und einem aggressiven Verlauf der Erkrankung verbunden. Die zelluläre Aktivität und Menge von p27Kip1 wird entscheidend durch Proteine reguliert, die mit p27Kip1 interagieren. In dieser Arbeit wurden deshalb mit Hilfe von rekombinantem p27Kip1 Interaktionspartner des Inhibitors in HeLa-Zellextrakt identifiziert. Es konnte gezeigt werden, daß p27Kip1 an die CDK-Proteine und an Grb2 bindet. Grb2 ist ein Adapterprotein der Signaltransduktion. Die Interaktion zwischen p27Kip1 und Grb2 könnte damit, nach Stimulation der Zelle durch verschiedene Mitogene, die Signalweitergabe mit der Zellzyklusmaschinerie verbinden. Die zu dieser Interaktion notwendige Domäne in p27Kip1 konnte in weiteren Analysen auf eine acht Aminosäuren lange Prolin-reiche Region eingegrenzt werden. Auf der anderen Seite interagiert Grb2 vornehmlich über seine C-terminale SH3-Domäne mit p27Kip1. Die beiden mit p27Kip1 nah verwandten Inhibitorproteine p21Cip1 und p57Kip2 interagieren dagegen nicht mit Grb2. In einer erweiterten Analyse wurden 41 verschiedene rekombinante SH3-Domänen auf eine Interaktion mit p27Kip1 hin getestet. Es konnte gezeigt werden, daß p27Kip1 nur mit der C-terminalen SH3-Domäne von Grf40/Mona und der SH3-Domäne der Tyrosinkinase Lyn wechselwirkt. Die Interaktion der Tyrosinkinase Lyn in vivo führte zur Hypothese, daß p27Kip1 durch Lyn phosphoryliert werden könnte. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde deshalb die Tyrosinphosphorylierung von p27Kip1 untersucht. In Phosphoaminosäureanalysen mit metabolisch markierten Zellen konnte gezeigt werden, daß p27K i p 1 in vivo an Tyrosinresten phosphoryliert wird. Diese Zusammenfassung 13 Phosphorylierung konnte durch rekombinant hergestellte Tyrosinkinasen und verschiedene Tyrosin/Phenylalanin-Austausche in p27Kip1 auf Tyrosin 88 und 89 eingegrenzt werden. Nach Kristallstrukturdaten des trimeren Komplexes aus p27Kip1, CDK2 und Cyclin A kommt der Tyrosinrest 88 von p27Kip1 in der ATP-Bindetasche der Kinase zu liegen und blockiert diese. Es wurde deshalb untersucht, inwieweit eine Phosphorylierung von p27Kip1 an Tyrosin 88 oder 89 Einfluß auf die Aktivität des Inhibitors hat. Die Tyrosinphosphorylierung von p27Kip1 verhindert nicht die Bindung an den CDK-Komplex. Allerdings konnte mit in vitro-phosphoryliertem p27Kip1 gezeigt werden, daß eine Tyrosinphosphorylierung zu einer etwa 40%-igen Reduktion der Aktivität des Inhibitors führt. Diese Ergebnis konnte in vivo bestätigt werden. Interessanterweise verstärkt die Tyrosinphosphorylierung des Inhibitors die Phosphorylierung von p27Kip1 an Threonin 187 durch den gebundenen CDK-Komplex. Die Phosphorylierung von p27Kip1 an Threonin 187 ist in der Zelle ein initiales Signal zum Abbau von p27Kip1 durch das 26S-Proteasom. Das so markierte p27Kip1 wird von einem E3-Ligase-Komplex erkannt und ubiquitiniert. Es wurde deshalb untersucht, welchen Einfluß die Tyrosinphosphorylierung auf den Abbau von p27Kip1 besitzt. In Halbwertszeitbestimmungen mit einer SH3-bindedefizienten Form von p27Kip1 und einer Tyrosin/Phenylalanin-Austauschform von p27Kip1 konnte zeigten werden, daß beide Formen, im Vergleich zu unverändertem p27Kip1, eine höhere Stabilität aufweisen. Die Interaktion von p27Kip1 mit der Tyrosinkinase Lyn und die Inaktivierung des Inhibitors durch die Phosphorylierung von Tyrosinresten zeigt eine Möglichkeit auf wie p27Kip1, in Abhängigkeit von mitogenen Stimuli, reguliert werden kann. Die in dieser Arbeit gefundene Interaktion von Grb2, Grf40 und Lyn mit p27Kip1 verbindet damit die Signaltransduktion mit der Zellzykluskontrolle.

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/19
Monozytäre Expression von CD 14 ("Endotoxin-Rezeptor") und proinflammatorische Subpopulationen antigenpräsentierender Leukozyten

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/19

Play Episode Listen Later Nov 14, 2002


Fragestellung: Um mögliche proinflammatorische Zeichen bzw. Frühindikatoren (sog. Mikroinflammation) bei Patienten mit chronischem Nierenversagen und nierentransplantierten Patienten aufzuspüren, die an späteren Organkomplikationen (chronische Transplantatdysfunktion, Herz-Kreislaufmorbidität, endotheliale Dysfunktion, Infektanfälligkeiten) beteiligt sein können, untersuchten wir die Expression funktioneller monozytärer Oberflächenantigene. Als immunologischen Marker der Aktivität einer Entzündungsreaktion verglichen wir die in der Durchflusszytometrie (fluorescence-activated cell sorter (FACS))gemessene Expression sog. mCD14-Rezeptoren und der CD14+CD16++-Rezeptoren auf peripheren Blut-Monozyten mit serologischen Parametern wie C-reaktives Protein und Leukozytenzahl. Die Frage, ob die beiden Oberflächenantigene CD14 und CD16 sowie die Koexpression beider Antigene (proinflammatorisch aktivierte Monozyten) zum „immunologischen Monitoring“ geeignet sind, sollte erstmalig klinisch an Gesunden, Patienten nach Nierentransplantation sowie Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz im Endstadium ohne Dialysebehandlung untersucht werden. Ergänzend wurden nichtorgantransplantierte Patienten mit akuten infektiösen Komplikationen auf mögliche Modulationen proinflammatorischer Blutmonozyten (CD14+/CD16++-Zellen) hin untersucht. CD14 existiert membrangebunden (mCD14) und in löslicher Form (sCD14) und ist verantwortlich für die Interaktion von Endotoxin (LPS) mit Monozyten und Neutrophilen. LPS ist ein Glykoprotein der äußeren Membranschicht gramnegativer Bakterien. CD14 ist der wichtigste Rezeptor für gram-negative bakterielle Lipopolysaccharide (Endotoxin), jedoch auch für Peptidoglykan und Lipoteichonsäure gram-positiver Erreger. CD 16 ist der funktionell wichtige Fcγ–Rezeptor Typ III (FcγRIII, IgG-Rezeptor Typ III), der mit niedriger Affinität monomeres IgG sowie polymeres IgG oder Immunkomplexe bindet. Er vermittelt wichtige immunphysiologische Funktionen wie antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität, Beseitigung zirkulierender Immunkomplexe, Superoxidbildung und ist auch an der Signaltransduktion beteiligt. Die untersuchten CD14+CD16++-Monozyten bewirken im Zusammenwirken von TNFα, IL-1, IL-6 und IL-10 bewirkt eine stärkere Entzündungsreaktion als die konventionellen CD14++CD16negativen-Zellen; sie sind sehr potente Antigen-präsentierende Zellen, besitzen eine hohe Phagozytoseaktivität und verstärken die endotheliale Adhäsion. Untersuchungsaufbau: Wir untersuchten 69 Patienten nach Nierentransplantation (23 Frauen, 46 Männer) im Alter von durchschnittlich 52,63 +/- 11,42 Jahren (Median 53,84 Jahre). Die Patienten erhielten durchschnittlich vor 6,38 +/- 5,2 Jahren ein Nieren- Transplantat (Median 8,16 Jahre). Wir unterschieden diese Patienten hinsichtlich ihrer Immunsuppression in folgende Gruppen: 1) Mycophenolat-Mofetil-Monotherapie (MMFmono), 2) Cyclosporin-Monotherapie (CyAmono) und 3) einer Kombination aus MMF und CyA (MMF-CyAkombi). In die Gruppe mit MMF-Monotherapie wurden16 Personen eingeschlossen (3 Frauen, 13 Männer) im Alter von durchschnittlich 51,29 +/- 10,47 Jahren (Median 51,15 Jahre). In der Gruppe der CyA-monotherapierten Patienten befanden sich 11 Personen (3 Frauen, 8 Männer) im Durchschnittsalter von 58,43 +/- 8,01 Jahren (Median 59,96 Jahre). Zur Gruppe der MMF-CyA-kombinationstherapierten Patienten gehörten 18 Patienten (3 Frauen, 15 Männer) im Alter von 46,69 +/- 10,22 Jahren (Median 47,44 Jahre). Des weiteren wurden 13 Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz (12 Männer, eine Frau) im Alter von 32 bis 74 Jahren (Median 65,0 Jahre; Mittelwert 63,5 Jahre +/- 10,3 Jahre) in die Analysen miteinbezogen. Parallel wurden 8 Patienten (6 Frauen, 2 Männer) im Verlauf einer akuten Infektion erfasst (Mittelwert 74,6 +/- 10,53 Jahre; Median 78 Jahre). Unser Kontrollkollektiv bestand aus 18 klinisch gesunden freiwilligen Probanden im Alter zwischen 24 und 54 Jahren (Median 31Jahre; Mittelwert 33,42 +/- 9,91 Jahre; 10 Frauen, 8 Männer). Ergebnisse: 1. Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz hatten signifikant höhere CRP-Serumkonzentrationen als Gesunde (p=0,010)(Gesunde 0,33 mg/dl vs. Urämiker 0,7 mg/dl). 2. Die mCD14-Expression auf peripheren Blutmonozyten war bei Urämikern (p=0,024) und bei nierentransplantierten Patienten (p=0,026) signifikant niedriger als bei Gesunden.(Gesunde 517 MFI vs. Urämiker 426 MFI vs. NTX 433 MFI) 3. Der prozentuale Anteil CD14+CD16++-Monozyten im Blut war sowohl bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz (p=0,00000487; MFI= 13,0%) als auch bei Patienten nach Nierentransplantation (p=0,00298; MFI=9,3%) signifikant höher. 4. Die Leukozytenzahl im Blut war weder bei immunsupprimierten Nierentransplantierten noch bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz im Endstadium signifikant gegenüber Gesunden verändert. 5. Hinsichtlich der verschiedenen Strategien der immunsuppressiven Therapie ließen sich keine Unterschiede zwischen den Gruppen der MMF-mono, der CyA-mono und der MMF-CyA-kombi-behandelten Nt-Patienten feststellen. 6. Die Absolutzahl CD14+CD16++-Monozyten war sowohl bei urämischen Patienten (p=0,003; 430/µl) als auch bei nierentransplantierten Patienten (p=0,005; 413/µl) gegenüber Gesunden signifikant erhöht. 7. Bei Nierentransplantierten fiel die CRP-Konzentration im Serum mit steigendem Alter des Transplantates logarithmisch ab (p=0,065), die mCD14-Expression fiel linear ab (p=0,063) wohingegen der prozentuale Anteil der CD14+CD16++- Monozyten invers ansteigt (p=0,0036). 8. Im Verlauf akuter infektiöser Erkrankungen war der Anteil der CD14+CD16++- Monozyten signifikant höher als bei Gesunden (p=0,000049) und fiel bis zur stationären Entlassung so signifikant ab (p=0,012), so dass kein Unterschied mehr zwischen Gesunden und Kranken mehr nachweisbar war. Schlußfolgerungen: 1. Sowohl bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz wie bei Nierentransplantierten finden sich anhand erhöhter Zahlen proinflammatorischer Blutmonozyten (CD14+CD16++-Phänotyp) eindeutig Zeichen einer sog. „Mikroinflammation“; dies ausdrücklich auch bei NTX-Patienten, obwohl diese unter einer dauerhaften immunsuppressiven Behandlung stehen. 2. Proinflammatorische Blutmonozyten sind Ziel- und Effektorzellen der Immunabwehr. Darüber hinaus sind sie pathophysiologisch an den Vorgängen einer Atheromatose beteiligt. CD14+CD16++-Blutmonozyten entsprechen dem Phänotyp von Gewebsmakrophagen. Erhöhte Anteile CD14+CD16++-Blutmonozyten gehen möglicherweise parallel mit der erhöhten Progressionsrate der Atheromatose von Organtransplantierten und Patienten mit Niereninsuffizienz. Andererseits sind sie an der Auslösung und Perpetuation der chronischen Transplantatdysfunktion (chronisches Transplantatversagen) ursächlich beteiligt, was aus Biopsiedaten hervorgeht. Die hier erfolgten Blutzellanalysen unterstützen diese These. 3. Dauerimmunsuppression bei Nierentransplantierten vermag nicht den proinflammatorischen Status diese Patienten zu unterdrücken. Damit gilt für alle NTXPatienten, dass sich mehr oder weniger schnell trotz potenter Immunsuppression irgendwann ein Transplantatversagen einstellt. Es spricht alles dafür, dass aktivierte Blutmonozyten hier die Schlüsselrolle spielen. Wir postulieren, dass dies nur dann abgeschwächt oder vermindert werden könnte, wenn sich die zellulären Marker, die auf chronische inflammatorische Aktivität hinweisen, pharmakologisch günstig beeinflussen ließen.

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06
Identifizierung und Charakterisierung von Interaktoren des zellulären Prion-Proteins

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06

Play Episode Listen Later Nov 11, 2002


Das Prion-Protein ist in seiner infektiösen Form für das Auftreten und die Übertragung von transmissiblen spongiformen Enzephalopathien verantwortlich. Diese Erkrankungen können bei Mensch und Tier auftreten, wobei die bekannteste tierische Form der „Rinderwahn“ bzw. BSE ist. Die häufigste Prion-Krankheit beim Menschen ist die Creutzfeldt-Jacob-Krankheit, deren neue Variante im Zusammenhang mit dem Auftreten von BSE steht. Die pathologische Form des Prion-Proteins (PrPSc) wird durch posttranslationale Umwandlung aus der apathogenen physiologischen Isoform PrPC gebildet. Dieses Protein wird vor allem in neuronalem Gewebe exprimiert und ist in allen Säugetieren hoch konserviert. Die Funktion des zellulären, apathogenen Prion-Proteins ist noch immer nicht geklärt, da Mäuse ohne dieses Protein gesund sind und keinen pathologischen Phänotyp haben. Daher müssen alternative experimentelle Ansätze unternommen werden, um zur Klärung der physiologischen Funktion beizutragen. In der vorliegenden Arbeit wurde deshalb mittels eines „Yeast-Two-Hybrid“-Screens nach Interaktoren des zellulären Prion-Proteins der Maus gesucht, welche in murinem Gehirn exprimiert werden. Es konnten in Hefe erfolgreich mehrere Proteine identifiziert werden, die bislang noch nicht als mögliche Interaktoren des zellulären Prion-Proteins beschrieben worden waren. Drei dieser Isolate wurden ausgesucht, um deren physiologische Interaktion mit PrP näher zu charakterisieren: Pint1, Synapsin Ib und Grb2. Mittels Copräzipitation konnte bestätigt werden, dass auch in Säugetierzellen eine physiologische Wechselwirkung zwischen den identifizierten Interaktoren und PrP auftritt. Das Protein Pint1 wurde bislang noch nicht beschrieben und besitzt eine hoch konservierte Aminosäureregion, die in Proteinfragmenten vom Menschen bis zum Wurm C. elegans zu finden ist. Die beiden anderen untersuchten Proteine sind beide an verschiedenen Wegen der zellulären Signaltransduktion beteiligt. Synapsin Ib ist mit synaptischen Vesikeln assoziiert, womit eine mögliche Verbindung zwischen der zellulären Funktion von PrPC und extrazellulären bzw. endokrinen Signalwegen besteht. Grb2 ist ein Adaptorprotein mit vielfältigen Aufgaben, vor allem der Kopplung von Membranrezeptoren mit intrazellulären Signalkaskaden. Durch den Nachweis einer Interaktion dieser beiden Proteine mit dem zellulären Prion-Protein konnte in der vorliegenden Arbeit erstmals ein physiologischer Zusammenhang zwischen PrPC und intrazellulären Signaltransduktionswegen gezeigt werden.

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/19
Einfluß von Komponenten der extrazellulären Matrix auf Hypophysenzellphysiologie und Hypophysentumorpathogenese

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/19

Play Episode Listen Later Jul 4, 2002


Die extrazelluläre Matrix umgibt Zellen, stabilisiert Gewebe und reguliert Zellfunktionen. Bestandteile der ECM transduzieren Signale durch Zellmembranrezeptoren, sog. Integrine. Integrine vermitteln Änderungen der Zellmorphologie, Proliferation, Differenzierung und Apoptose in Zellen. Die Frage ob die ECM eine wichtige Rolle in der Physiologie und Tumorgenese der Hypophyse spielt, ist immer noch offen. In der vorliegenden Arbeit wurden zum ersten Mal die regulatorischen Möglichkeiten der ECM in der Hypophyse dargestellt. Es wurde der Einfluß der extrazellulären Matrix auf das Wachstum und die Zytokinsekretion von follikulostellaren Zellen, sowie Hormonsekretion, Proliferation und Signaltransduktion in kortikotropen Zellen untersucht. Desweiteren werden in dieser Arbeit Änderungen der Expression von Laminin, als auch deren mögliche funktionale Konsequenzen innerhalb der Prolaktinomgenese demonstriert. In der follikulostellaren Zellinie TtT-GF konnte gezeigt werden, daß Fibronektin und Kollagen I die Zellproliferation stimulieren. Simultan führte nur Kollagen I zu einer Erhöhung der Interleukin-6 Sekretion, welches ein bekannter Wachstumsfaktor für follikulostellare Zellen ist. Die signifikante Hemmung der Proliferation von FS-Zellen bei Kombination von Kollagen I mit einem anti-IL6-Antikörper läßt darauf schließen, daß Kollagen I die Proliferation und Zytokinsekretion von follikulostellaren Zellen reguliert. Die Fibronektin vermittelte Proliferationsteigerung scheint dagegen einem anderen Mechanismus zugrunde zu liegen. In der kortikotropen Tumorzellinie AtT-20 konnte nachgewiesen werden, daß die ACTH Sekretion durch Fibronektin, Laminin und Kollagen I inhibiert wird. Ein Reporterkonstrukt bestehend aus dem POMC Promoter und Luciferasegen zeigte ähnliche Ergebnisse, was auf eine Hemmung der ACTH Sekretion bereits auf Ebene der POMC-Transkription schließen läßt. Im Gegensatz dazu konnte keine signifikante Veränderung der ACTH Sekretion in normalen Hypophysenzellen festgestellt werden. AtT-20 Zellproliferation wurde durch Kollagen IV und Fibronektin stimuliert, wogegen Kollagen I und Laminin zu einer Inhibition führten. Parallel dazu fand eine Veränderung der Zellform statt. Ein möglicher integrinvermittelter Signalweg umfasst die Aktivierung von Rac, einer kleinen GTPase, mit der konsekutiven Produktion von reaktiven Sauerstoffradikalen (ROS) und einer runden Zellform. Es konnte gezeigt werden, daß eine Inhibition der AtT-20 Proliferation durch Laminin mit einer signifikanten Erhöhung der reaktiven Sauerstoffradikalen und einer runden Zellform einhergeht. Dieser Effekt war mit NAcetylcystein (NAC), einem ROS-Antagonisten, umkehrbar und am ehesten Rac vermittelt. Unter Kollagen IV fand ebenfalls eine Inhibition des Zellwachstums statt. AtT-20 Zellen nahmen auch hier eine runde Zellform an und produzierten, wenn auch weniger stark als Laminin und Kollagen I, ROS. Dieser Effekt war jedoch nicht durch NAC umkehrbar. Kollagen I führte dagegen zu einer Steigerung der Proliferation und ROS-Produktion, sowie zu ausgebreiteten als auch runden Zellen. Diese z.T. gegensätzlichen durch Kollagen I+IV vermittelten Effekte könnten durch simultane Aktivierung alternativer Mechanismen, wie z.B. eine integrinbedingte Aktivierung als auch Hemmung von Rezeptoren für Wachstumsfaktoren, verursacht sein. Ein weiterer, oft mit Fibronektin assoziierter Signalweg, beinhaltet die integrinvermittelte Aktivierung von Rho, einer weiteren kleinen GTPase. Die fehlende ROS Erhöhung, der Einsatz eines β1-integrin stimulierenden Antikörpers, sowie die integrinunabhängige Stimulation von Rho durch Lysophosphatidatsäure läßt auf eine Rho assoziierte Proliferationserhöhung in AtT-20 Zellen durch Fibronektin schließen. In GH3 Zellen führte Laminin zu einer Abnahme der Prolaktinsekretion und zur Inhibition der Proliferation. Im Gegensatz dazu konnten keine Veränderungen der Prolaktinsekretion in normalen Rattenhypophysenzellen beobachtet werden. Übereinstimmend zeigte sich im Dopamin2 Rezeptor defizienten Mausprolaktinom, einem Knock-Out in vivo Modell für spontane Prolaktinomentwicklung, und humanen Prolaktinom eine bereits sehr frühe Abnahme der Lamininexpression. Diese Hemmung der Lamininexpression während der Prolaktinomgenese könnte einen weiteren Faktor für erhöhte Hormonproduktion und Zellproliferation in Prolaktinomen darstellen. Die hier erstmalig beschriebenen Auswirkungen der extrazellulären Matrix auf Hypophysenzellproliferation und -hormonsekretion verdeutlichen die wichtige, aber wenig erforschte Rolle der ECM in der Hypophyse. Diese Resultate sind nicht nur neue Ansatzpunkte der Hypophysenphysiologie und -pathophysiologie, sondern lassen auch die Weitläufigkeit der unterschiedlichen regulativen Systeme innerhalb der Hypophyse erkennen.

Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06
Untersuchungen zur Signaltransduktion Ajoen-induzierter Apoptose in Leukämiezellen

Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06

Play Episode Listen Later May 13, 2002


Die vorliegende Arbeit wurde durch den SFB 369 (Teilprojekt B7) unterstützt. Sie sollte auf Basis der bereits vorliegenden Erkenntnisse klären, welcher Mechanismus der Apoptoseinduktion durch Ajoen in HL-60 Zellen zu Grunde liegt. Dirsch et al. 5 zeigten bereits 1998, dass Ajoen Apoptose in humanen akut-myeloischen Leukämiezellen (HL-60) induziert. Weiterhin zeigte sich eine dosis- und zeitabhängige Produktion der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). N-Acetylcystein (NAC), ein Antioxidans, verhinderte partiell die Ajoeninduzierte ROS-Produktion und die Apoptose. Auf dieser Grundlage konnten folgende Ergebnisse erarbeitet werden: 1) Ajoen verursacht in HL-60 Zellen die Aktivierung der Caspase-3 sowie der Caspase-8. Eine generelle Aktivierung von Caspasen ist für die Ajoen-induzierte Apoptose nötig, da der Breitbandcaspaseinhibitor z-VAD-fmk die durch Ajoen provozierte DNA-Fragmentation völlig verhindert. 2) Die Ajoen-induzierte Apoptose wird nicht durch den Todesrezeptor CD95 vermittelt. Dafür sprechen folgende Ergebnisse: a) Unsere HL-60 Zellen exprimieren den CD95-Rezeptor, jedoch kann der natürliche CD95-Ligand (CD95L) keine Apoptose hervorrufen. Wahrscheinlich ist der CD95-Rezeptor inaktiv. b) Außerdem kann für die Caspase-8, die für die Signalweiterleitung vom CD95-Rezeptor u.a. mit verantwortlich ist, durch Einsatz eines spezifischen Caspase-8 Inhibitors keine Bedeutung für die Ajoeninduzierten Apoptose gezeigt werden. c) CD95-resistente Jurkat Zellen (JurkatR) sind auf Ajoen genauso empfindlich wie die Kontrollzellen. 3) Es konnte bewiesen werden, dass Ajoen Apoptose über den mitochondrialen Signalweg induziert: a) Ajoen verursacht sowohl den Verlust des mitochondrialen Membranpotentials der inneren Membran als auch eine Cytochrom c- Freisetzung aus dem intermembranären Spalt. b) Die Ajoen-induzierte Apoptose hängt von der provozierten mitochondrialen Dysfunktion ab: HL-60 Zellen, die das anti-apoptotische Protein Bcl-xL überexprimieren, sind vor Apoptose geschützt. c) Die höhere Sensitivität der HL-60/neo bzw. die niedrigere Sensitivität der HL-60/bcl-xL Zellen auf Ajoen konnte auch morphologisch durch TEM-Untersuchungen untermauert werden. Zusammenfassend konnte also für die Ajoen-induzierte Apoptose eine von Mitochondrien abhängige Signalweiterleitung gezeigt werden. 4) Untersuchungen zur Frage, wie es zur Ajoen-induzierten mitochondrialen Dysfunktion kommt, brachten folgende Erkenntnisse: a) Eine Aktivierung von Caspasen ist für die Auslösung der mitochondrialen Ereignisse nicht notwendig. Die abgeschwächte und verzögerte Caspaseaktivierung in HL-60/bcl-xL Zellen beweist: Caspasen werden „downstream“ der mitochondrialen „Aktivierung“ gespalten. b) Die ROS-Entstehung ist ein Ereignis vor („upstream“) der mitochondrialen Dysfunktion. c) Die folgerichtige Untersuchung der MAPK JNK, p38 und ERK1/2 (die Aktivierung des Transkriptionsfaktors AP-1 war bereits bekannt), ergab deren Aktivierung, jedoch ist diese für die Signalvermittlung nicht nötig. Nur für die ERK1/2 Kinase konnte eine direkte Beteiligung, und zwar als „survival“-Faktor, festgestellt werden, während die Akt als „survival“- Faktor keine Bedeutung hat. Ergebnisübersicht: CD95 Caspase-8 ROS p 38 MAPK ERK1/2 JNK Akt DNA- Fragmentierung Apoptose Caspase-3 Caspase-8 Aktivierung Caspase-3- ähnlicherCaspasen z-VAD-fmk Cytochrom c- Freisetzung z-VAD-fmk AP-1 Extrinsischer intrinsischer Signalweg Signalweg Bcl-xL Ajoen Abb. 61: Ergebnisübersicht Rot:-- Involvierung im Signalweg, blau:-- kein kausaler Zusammenhang gegeben; –I = Hemmung.

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Identifizierung von Signaltransduktionskomponenten des Latenten Membranproteins 1 des Epstein-Barr Virus

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Play Episode Listen Later Feb 6, 2002


LMP1 ist das Hauptonkogen des humanen DNA-Tumorvirus EBV (Epstein-Barr Virus). LMP1 ist essentiell für die Immortalisierung von B-Zellen durch das Virus. Darüber hinaus transformiert LMP1 Nagerfibroblasten in Kultur. LMP1 agiert wie ein konstitutiv aktives Rezeptormolekül in der Plasmamembran und induziert intrazelluläre Signaltransduktion durch die Bindung von Signalmolekülen der TNF-Rezeptor Familie. Die bekannten LMP1 Signalwege können die biologischen Funktionen von LMP1 jedoch nur teilweise erklären. In meiner Arbeit sollten daher neue Komponenten der LMP1 Signaltransduktion identifiziert werden. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit konnte TRAF6 als essentielles und spezifisches Signalmolekül für die Induktion von p38 MAPK durch LMP1 auf einem MKK6-abhängigen Signalweg identifiziert werden. In TRAF6 defizienten Maus-Fibroblasten ist eine signifikante p38 MAPK-Aktivierung durch LMP1 von der ektopischen Expression von TRAF6 abhängig. Darüber hinaus ist TRAF6 ebenfalls in der Aktivierung von NF-κB, jedoch nicht von JNK1/AP-1 durch LMP1 involviert. Das PxQxT-Motiv in CTAR1 ist zusammen mit Tyrosin 384 in CTAR2 essentiell für die Aktivierung des LMP1p38 MAPK-Signalweges. Dominant- negatives TRADD, das direkt an CTAR2 bindet, inhibiert die Induktion von p38 MAPK durch LMP1. Zusammengefaßt zeigen diese Ergebnisse zum ersten Mal eine Rolle von TRAF6 als essentielles Signalmolekül in der Signalkaskade eines transformierenden Onkogens, das unterhalb von TRADD und TRAF2 agiert. Im zweiten Teil meiner Arbeit konnte JNK2 als eine weitere, durch LMP1 induzierte MAPK in B-Zellen identifiziert werden. Im Zuge dieser Arbeit wurden dominant-negative Mutanten von JNK1 und JNK2 hergestellt, deren Expression eine Aktivierung von AP-1 durch LMP1 inhibieren und damit eine Rolle von JNK1 und 2 in der Induktion von AP-1 beweisen. In einem konditionalen LMP1-System in B-Zellen induzierte NGF-R:LMP1 die Degradation des p53 Proteins. Dieser Effekt ist spezifisch für p53, erfolgt innerhalb weniger Minuten und ist dominant über der p53-stabilisierenden Wirkung von UV-Strahlung. Somit konnte erstmals ein EBV-spezifischer Mechanismus aufgedeckt werden, der zu einer Deaktivierung des Tumorsuppressors p53 beitragen könnte.

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Identifikation signaltransduktionsrelevanter Gene in Melanom-zelllinien durch Entwicklung und Anwendung eines Verfahrens zur Analyse von Daten aus cDNA-Hybridisierungsarrays

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Play Episode Listen Later Oct 22, 2001


Mit speziell angefertigten cDNA-Makro-Arrays wurden Melanomzelllinien und kulti-vierte Melanozyten auf die transkriptionelle Aktivität von Genen untersucht, welche bekannterweise bei der zellulären Signaltransduktion von Bedeutung sind. Zur Analyse der daraus erhaltenen Daten wurde das Computer-Programm "GeneFish" geschrieben, welches auch für zukünftige, ähnliche Fragestellungen in anderen Systemen verwendbar ist. Mit Hilfe dieses Programmes wurde gefunden, dass bei ADAM-9, ADAM-10, HER3, FAK, SHC und dem IGF-1-Rezeptor die Unterschiede der Expression zwischen Melanomzelllinien und Melanozyten besonders ausgeprägt waren. Bei weiteren Genen wurden schwächer ausgeprägte, jedoch ebenfalls interessante Expressionsmuster beobachtet. Die Rolle von HER3 wurde durch Einführung einer dominant negativ wirkenden Mutante von HER3 in Melanomzelllinien weitergehend untersucht. Bei Verwendung eines konstitutiv exprimierenden Expressionssystems starben die transgenen Zellen, was einem lethalen Effekt der Mutante zugeschrieben wurde. Mit einem induzierbaren Expressionssystem wurden Zellklone erhalten, die veränderte biologische Eigenschaften aufwiesen, welche jedoch unabhängig von der Expression des Transgens waren. Trotz dieser technischen Schwierigkeit bleibt HER3 eines der vielversprechendsten Gene für die künftige Forschung an Melanomen.

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Funktionelle Charakterisierung der Signaltransduktionskaskade des LFA-1-Integrins

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Play Episode Listen Later May 30, 2001


Die Aktivierung von T-Lymphozyten ist ein essentieller Prozeß für die Regulation der adaptiven Immunantwort. Hierbei werden in Folge einer Antigen-Exposition über verschiedene Oberflächenrezeptoren intrazelluläre Signaltransduktionsprozesse initiiert, welche in einer klonalen Expansion von T-Lymphozyten sowie deren Differenzierung zu Effektor- oder Gedächtniszellen resultieren. Die Spezifität dieser Prozesse wird durch die Wechselwirkung zwischen dem jeweiligen T-Zell-Antigenrezeptor (TCR) und einem Antigen-beladenen MHC-Molekül vermittelt, einer Interaktion, die allerdings nicht hinreichend für eine vollständige und dauerhafte Aktivierung der T-Zelle ist. Hierzu ist die Aktivierung sogenannter akzessorischer Oberflächenrezeptoren nötig, welche sowohl zur Verstärkung der Zell-Zell-Adhäsion als auch zur Induktion intrazellulärer Signalwege beitragen. Ein costimulatorisches Signal für naive T-Lymphozyten vermittelt zum Beispiel das CD28-Molekül, wodurch der Übergang dieser Zellen in einen anergischen Zustand verhindert und Zellproliferation ermöglicht wird. Zur Verstärkung der Zell-Zell-Interaktion tragen demgegenüber vor allem Adhäsionsmoleküle wie Selektine, Cadherine und Integrine bei. Der einzige Vertreter der β2-Integrinfamilie auf Lymphozyten, LFA-1, stand im Zentrum der im Folgenden beschriebenen Analysen. Es gab bereits Anhaltspunkte dafür, daß LFA-1 neben seiner Adhäsionsfunktion auch in Signaltransduktionsprozesse involviert ist. Allerdings sind die molekularen Mechanismen der LFA-1-vermittelten Signalwege bislang unvollständig charakterisiert. Dies liegt vor allem darin begründet, daß eine hochaffine Ligandenbindung erst nach einer Konformationsänderung des Integrins erfolgen kann. Eine solche Aktivierung des Integrins wird beispielsweise durch Stimulation der T-Lymphozyten über den T-Zell-Antigenrezeptor induziert, wodurch sich jedoch LFA-1-abhängige Signale mit denen des TCRs überlagern. Daher wurde im Verlauf der hier vorliegenden Arbeit ein auf Fusionsproteinen basierendes experimentelles System etabliert, welches eine aktivierungsunabhängige Untersuchung der LFA-1-vermittelten Signaltransduktion ermöglicht. Hierdurch wurde gezeigt, daß in humanen T-Lymphozyten die Aggregation der zytoplasmatischen Domäne der Integrin β2-Kette (CD18-Untereinheit) zur Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration, zur IL-2-Promotoraktivierung sowie zum Anstiegs des Phosphotyrosingehalts zellulärer Proteine führte. Die Modulation dieser charakteristischen T-Zell- Aktivierungsparameter wird durch die zytoplasmatische Domäne der β2-Untereinheit von LFA-1 induziert, nicht aber durch die intrazellulären Anteile der Integrin αL- bzw. β1-Kette. Weiterhin konnte demonstriert werden, daß ein für die β2-Untereinheit spezifisches NPXFSequenzmotiv für deren Signalfunktion erforderlich ist. Dieselbe Region ist ebenso für die Signaltransduktion des nativen LFA-1-Gesamtmoleküls von elementarer Bedeutung. Überdies zeigten Untersuchungen in TCR-defizienten T-Zellen, daß die Oberflächenexpression des T-Zell-Rezeptors für den LFA-1-induzierten Signalweg essentiell ist. Demgegenüber erfolgte die intrazelluläre Calciummobilisierung durch das CD28-Molekül auch unabhängig von einer Expression des TCRs. Insgesamt konnte durch die vorliegenden Analysen die wesentliche Bedeutung des zytoplasmatischen Anteils der β2-Untereinheit des LFA-1-Integrins für den Prozeß der T-Zell-Aktivierung dokumentiert werden. Darüberhinaus wurde eine bisher unbekannte funktionelle Kooperativität zwischen LFA-1 und Komponenten des T-Zell-Antigenrezeptors aufgezeigt.

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06
Myc-Funktion im Zellwachstum und Identifikation von neuen Myc-regulierten Genen in B-Zellen

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Play Episode Listen Later May 4, 2001


Die Überproduktion des Myc-Proteins ist eine Ursache für die Entstehung einer großen Anzahl von humanen Tumoren. Die Erforschung der Myc-Funktionen ist daher ein wichtiges Ziel der Tumorbiologie. Mit einem neuartigen Zellsystem wurde in dieser Arbeit die Rolle von Myc für das Wachstum von Zellen untersucht. Das Zellsystem P493-6 ist eine B-Zellinie, in der die myc-Expression durch ein Tetrazyklin-Vektorsystem regulierbar ist und das erste menschliche Zellsystem, in dem Myc konditional untersucht werden konnte. Diese Linie exprimiert kein endogenes myc, so daß Myc-Funktionen nur von der Expression des exogenen, konditionalen Myc abhängen. Der Zusatz von Tetrazyklin (Tc) im Kulturmedium bewirkt die Repression von myc und den Zellzyklusarrest. Durch Auswaschen von Tc kann myc wieder induziert werden und die Zellen treten wieder in die Zellzyklusprogression ein. In früheren Arbeiten wurde in dieser Zellinie bereits der Einfluß von Myc auf die Zellzyklusregulation untersucht (Pajic et al. 2000). Diese Untersuchungen wurden in dieser Arbeit erweitert, mit Augenmerk auf die Myc- Funktion im Zellwachstum. Myc löste in P493-6 keine Apoptose aus, wenn dem Kultivierungsmedium Serum entzogen wurde. Myc konnte bei Serum-Entzug nicht den Eintritt in die DNA-Synthesephase induzieren. Stattdessen wurden Myc-Funktionen im Zellwachstum beobachtet. Myc steigerte bei Serum-Entzug die Proteinsynthese, die Aktivität von Stoffwechselenzymen und bewirkte so die Zunahme an Zellmasse und -Größe. Zum ersten Mal wurde damit gezeigt, daß Myc-Expression Zellwachstum induziert, ohne daß die Aktivierung des Zellzyklus erfolgen muß. Zellwachstum kann also durch Myc über einen eigenen, Zellzyklus-unabhängigen Weg reguliert werden. Diese Ergebnisse wurden durch andere Arbeiten über Maus- und Drosophila-Myc bestätigt. Da Myc als Transkriptionsfaktor beschrieben wurde, wurden in der vorliegenden Arbeit neue Myc-regulierte Gene mit modernen Array- und Genchip-Analysen identifiziert. Insgesamt konnten 108 Gene identifiziert werden, die neue Kandidatengene für direkte Regulation durch Myc sind. Viele dieser Gene sind am Ablauf von Stoffwechselwegen beteiligt, wie Aminosäure- und Proteinsynthese, Lipid-Metabolismus, Proteinfaltung und –umsatz, Nukleotid- und DNA-Synthese, Transport, Nukleolus-Funktion, Transkription, Spleissen und oxidativem Stress, was die Beobachtungen der Zellwachstumsregulation bestätigt. Die Identifikation von Myc-Zielgenen, die an der Signaltransduktion beteiligt sind, war eine neue Beobachtung. Neben Komponenten der Signaltransduktion wurden auch Wachstumsfaktoren-, und Wachstumsfaktorrezeptoren als Myc-Zielgene identifiziert. Damit ist Myc an der Regulation von autokrinen und parakrinen Stimulierungs-Signalwegen beteiligt, die die Proliferation entscheidend beeinflussen. Die Ergebnisse des Genexpressionsprofils ist außerdem von Bedeutung für das Verständnis der Zellzyklusaktivierung in B-Zellen.

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06
Funktionelle Charakterisierung minorer Komponenten des plastidären Kompartiments und ihre Bedeutung für thylakoidale Signaltransduktionsprozesse

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Play Episode Listen Later Apr 10, 2001


Pflanzen sind aufgrund ihrer sessilen Lebensweise an die Bedingungen ihres Standortes gebunden. Zur Aufrechterhaltung ihrer photosynthetischen Effizienz, insbesondere unter transienten Veränderungen des Lichtregimes, haben höhere Pflanzen eine Reihe molekularer Anpassungsmechanismen entwickelt, die sowohl kurz- als auch längerfristige Adaptationen des Photosyntheseapparates ermöglichen. Für die einzigartige Dynamik der photosynthetischen Membran höherer Pflanzen spielen die reversible Phosphorylierung von Thylakoidmembranproteinen und komplexe Protein-Protein-Interaktionen unter Beteiligung multifunktioneller, regulatorischer Proteine herausragende Rollen. Hauptziel der vorliegenden Arbeit war es, durch die Identifikation und die funktionelle Charakterisierung minorer Komponenten des plastidären Kompartiments, vor allem der Thylakoidmembran, weitere Erkenntnisse zur Aufklärung der Signaltransduktionsmechanismen beizutragen, die die Lichtenergie mit physiologischen Reaktionen verknüpfen. Die Ergebnisse können wie folgt zusammengefaßt werden: 1. Die Existenz multipler, membranintegraler Proteinkinasen in den Thylakoidmembranen aus Spinatchloroplasten wurde durch den Nachweis von sechs minoren, kinaseaktiven Polypeptiden in Cytochrom b/f-Komplex-angereicherten, subthylakoidalen Fraktionen bekräftigt. Die Instabilität der in Abwesenheit des Kinasesubstrats HistonIII-S renaturierten Aktivitäten im basischen Milieu spricht für eine Autophosphorylierung der potentiellen Proteinkinasen an Serin- oder Threoninresten. 2. Die 64 kDa-Komponente AMS6 wurde mit dem monospezifischen Antikörper gegen den NTerminus seiner Aminosäuresequenz als membranintegrale Komponente gestapelter Regionen der Thylakoidmembran identifiziert. AMS6 ist weder mit der phosphorylierbaren Polyphenoloxidase noch der redoxkontrollierten LHCII-Kinase identisch, was mit Hilfe hochauflösender Gelsysteme bzw. durch Perfusionschromatographie subthylakoidaler Thylakoidmembranfraktionen gezeigt wurde. Die funktionelle Rolle von AMS6, dessen Assoziation mit dem trimeren LHCII-Komplex, nicht aber mit PSII-LHCII-Superkomplexen nachgewiesen werden konnte, ist unklar. Eine mögliche regulatorische Rolle der 64 kDa- Komponente in der Modulation des Absorptionsquerschnittes am PSII wird diskutiert. 3. Die potentielle Sensorkinase AMS9 (58 kDa) wurde mit dem heterologen Antikörper gegen das mutmaßliche cyanobakterielle Homologe slr0311 als periphere Komponente der Thylakoidmembran identifiziert. Die Interaktion mit der Stromaseite der photosynthetischen Membran erfolgte über schwache hydrophobe und elektrostatische Wechselwirkungen. Die Akkumulation von AMS9 in den ungestapelten Regionen der Thylakoidmembran war konsistent mit seiner Assoziation mit dem PSI. Die mögliche Funktion von AMS9 als Sensorkinase eines thylakoidalen Zwei-Komponenten-Signaltransduktionssystems unter Beteiligung des komplexen Polypeptids TTP30 wurde am Beispiel des rekombinanten cyanobakteriellen Homologen untersucht. Die Zerstörung des slr0311-Gens im Genom von Synechocystis sp. PCC6803 eignete sich unter den Versuchsbedingungen jedoch nicht zur Aufklärung der physiologischen Rolle von AMS9 in Spinatchloroplasten. 4. Das komplexe Polypeptid TTP30, für das in den Genomen von Spinacia oleracea L. und Arabidopsis thaliana L. mehr als ein Gen existiert, wurde durch den in organello-Import des in vitro-translatierten Vorläufers als plastidäre Komponente identifiziert. Das importierte Protein konnte über einen kurzen hydrophoben Abschnitt am C-Terminus mit der Thylakoidmembran interagieren. Die Deletion des potentiellen Membranankers führte zur Akkumulation des C-terminal verkürzten Proteins im Stroma. Die proteolytischen Erkennungssequenzen seiner größeren hydrophilen Domäne waren der Protease-Aktivität im Stroma durch die räumliche Anordung des charakteristischen, zentralen Tetratricopeptid- "repeat"-Moduls vermutlich nur bedingt zugänglich. 5. Der polyklonale Antikörper gegen den rekombinanten TTP30-Vorläufer identifizierte ein 34 kDa-Polypeptid im Stroma von Spinatchloroplasten, ein Ergebnis, das der thylakoidalen Lokalisation des in vitro importierten Proteins widersprach. Als möglicher Faktor, welcher die Spezifität des Antikörpers neben der komplexen Struktur des Vorläuferproteins beeinflussen könnte, wurde die Bindung von Calciumionen an das mutmaßliche "helix-loophelix"- Motiv in der N-terminalen Domäne von TTP30 untersucht. 6. Die DNS-Bindeaktivität des mutmaßlichen "helix-loop-helix"-Motivs von TTP30 wurde durch die "South-Western"-Analyse nachgewiesen. Der rekombinante TTP30-Vorläufer konnte Plastiden-DNS aus Spinatchloroplasten in vitro spezifisch binden. Seine säurestabile in vitro-Phosphorylierung sprach für die Regulation der potentiellen DNS-Bindeaktivität durch die posttranslationale Modifikation eines Serin- oder Threoninrestes. Eine mögliche Modulation seiner Aktivität im Sinne eines klassischen Zwei-Komponenten-Systems bestätigte sich nicht. Der Asparaginsäurerest D95 in der N-terminalen, "response regulator"- ähnlichen Domäne des rekombinanten Vorläufers übernahm in vitro keine Phosphorylgruppe von der prokaryotischen Sensorkinase EnvZ. 7. Mit dem kernkodierten Immunophilin TLP40 ist eine weitere plastidäre Komponente mit komplexer, molekularer Struktur untersucht worden. Das Protein war in seiner temporär membrangebundenen Form mit dem Cytochrom b/f-Komplex in den ungestapelten Regionen der Thylakoidmembran assoziiert. Seine lateral heterogene Verteilung und die Diskriminierung der Komplexe in den Granastapeln wurden im Zusammenhang mit der regulatorischen Interaktion von TLP40 und einer thylakoidalen Serin-/Threoninphosphatase vom Typ 2A untersucht. 8. Die reversible Interaktion von TLP40 im Thylakoidlumen mit der Innenseite der photosynthetischen Membran aus Spinatchloroplasten wurde in einem Zwei-Phasen- Polymersystem unter Verwendung von "inside-out"-Membranvesikeln nachgewiesen. Zur Identifikation essentieller Interaktionsbereiche wurden verschiedene rekombinante Deletions- und Punktmutanten von TLP40 hergestellt, die entweder keinen funktionellen Leucin-"zipper" besaßen und/oder denen die mutmaßlichen Phosphatasebindestellen im Nterminalen Abschnitt fehlten. 9. Das Gleichgewicht zwischen "freiem" TLP40 und seiner membranassoziierten Form konnte in vitro durch submillimolare Cyclosporin A-Konzentrationen zugunsten des "freien" Anteils verschoben werden. Die reversible Interaktion von TLP40 mit der Innenseite der Thylakoidmembran beeinflußte die Dephosphorylierungsrate thylakoidaler Phosphoproteine und war ein weiterer Hinweis auf eine regulatorische Interaktion des komplexen Immunophilins im Thylakoidlumen mit einer membranintegralen Proteinphosphatase vom Typ 2A. 10. Das Modell der transmembranen Signaltransduktion, die über die katalytische Aktivität der membranintegralen Proteinphosphatase auf der Stromaseite die Stabilität, die Degradation und den Umsatz der Polypeptiduntereinheiten des PSII-Holokomplexes koordinieren soll, wurde anhand zweier molekularbiologischer Ansätze untersucht. Weder die Expression der Antisens- bzw. Sens-RNS für TLP40 in A. thaliana L. noch die Inaktivierung des Gens für das potentielle cyanobakterielle Homologe sll0408 konnten jedoch unter den gewählten Versuchsbedingungen einen detaillierteren Einblick in die physiologische Bedeutung des komplexen Immunophilins TLP40 im Thylakoidlumen von Spinatchloroplasten geben.

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06
Signaltransduktion des Neurotrophinrezeptors p75 durch die Zinkfingerproteine NRIF1 und NRIF2

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Play Episode Listen Later Mar 23, 2001


Der Neurotrophinrezeptor p75 wurde als erstes Mitglied der Tumornekrosefaktor-Rezeptor-Superfamilie kloniert. Da die trophischen Eigenschaften der Neurotrophine durch eine zweite Klasse von Rezeptoren, die Trk-Rezeptor-Tyrosinkinasen, vermittelt werden, wurde p75 lange als deren „Corezeptor“ angesehen. Inzwischen gibt es viele Beweise für eine eigen-ständige Signaltransduktion durch p75, die beispielsweise zur Aktivierung von NF-κ B oder zu programmiertem Zelltod führen kann. Zu Beginn dieser Arbeit war weitgehend unbekannt, wie der Neurotrophinrezeptor p75 apoptotische Signale im Inneren der Zelle weiterleitet. Unter Verwendung des Hefe-„Two-Hybrid“- Systems war im Vorfeld das Zinkfingerprotein NRIF1 („Neurotrophin Receptor Interacting Factor“) als potentieller p75-Interaktionspartner identifiziert worden. Die wichtige Rolle dieses Proteins als Vermittler von apoptotischen Signalen konnte später durch gezielte Deletion des nrif1-Gens in der Maus bestätigt werden: In nrif1-Nullmutanten wurde eine Reduktion des embryonalen Zelltodes von Nervenzellen der Netzhaut nachgewiesen, deren Ausmaß dem einer p75- oder ngf („Nerve Growth Factor“)-Deletion entsprach (Casademunt et al., 1999). In der vorliegenden Arbeit wurde ein zweites nrif-Gen (nrif2) kloniert, das zu über 90% mit nrif1 identisch ist. Beide Proteine besitzen typische Strukturmerkmale negativ regulatorisch wirkender Transkriptionsfaktoren. Der carboxyterminale Abschnitt enthält fünf Zinkfinger des Cys2-His2-Typs, die eine Bindung an DNA vermitteln könnten, während der aminoterminale Bereich zwei KRAB-Domänen enthält, die Transkriptionsrepressor-Module darstellen. Das nrif2-Gen wird im 5’-untranslatierten Bereich differentiell gespleißt. Durch Experimente mit rekombinanten Proteinen aus E. coli und Fibroblasten-Zellinien wurde die vermutete Interaktion von NRIF und p75 biochemisch nachgewiesen. Die Ver-wendung unterschiedlicher Deletionskonstrukte zeigte, daß für die Wechselwirkung nur die Juxtamembran-Domäne des Rezeptors und ein carboxyterminaler Abschnitt von NRIF (stromaufwärts der Zinkfinger) nötig sind. NRIF-Proteine können unter Bildung von Homo- und Heterodimeren mit sich selbst interagieren. Die Colokalisierung von NRIF1 und NRIF2 bzw. NRIF und p75 nach transienter Transfektion von Fibroblasten-Zellinien bestätigte die biochemisch nachgewiesenen Interaktionen auch in vivo. Die Expression von NRIF in Zellinien neuronalen Ursprungs offenbarte eine mögliche Funktion als Auslöser von Apoptose, welche unabhängig von p75 allein durch Über-expression dieser Zinkfingerproteine verursacht wurde. Außerdem war in NRIF-überexprimierenden Zellen der Einbau von BrdU, einem Thymidin-Analogon, das Zellen in der S-Phase des Zellzyklus markiert, stark eingeschränkt. Diese Funktionen von NRIF sindbesonders interessant, da in den letzten zwei Jahren weitere Adaptermoleküle des Neuro-trophinrezeptors p75 identifiziert wurden, die einen Einfluß auf Apoptose und/oder den Ablauf des Zellzyklus besitzen. p75 spielt insbesondere während des programmierten Zelltodes in der Entwicklung des Nervensystems eine wichtige Rolle und wird im Embryonalstadium am stärksten exprimiert. Die Analyse der mRNA-Expression von nrif bestätigte, daß auch nrif1 und nrif2 während der Embryonalentwicklung deutlich höher exprimiert sind als in adulten Mäusen. Nrif-mRNA wurde jedoch im Gegensatz zu p75-mRNA ubiquitär in allen untersuchten embryonalen Geweben nachgewiesen. In weiterführenden Experimenten wurden transgene Mäusen untersucht, in denen das nrif1-Gen durch homologe Rekombination entfernt worden war. Diese Mäuse sind in einem kongenen Sv129- oder einem gemischten Sv129/BL6-Hintergrund lebensfähig und fertil, sterben jedoch im BL6-Hintergrund ungefähr am zwölften Embryonaltag. Die Hypothese, daß die nrif2-mRNA-Menge in überlebenden Tieren erhöht sein könnte, wurde zuerst in neugebo-renen Sv129-Mäusen durch semiquantitative RT-PCR-Analysen bestätigt. Eine vergleichen-de Untersuchung 10,5 Tage alter Embryonen aus verschiedenen Stämmen deutete auf die Möglichkeit einer funktionellen Kompensation hin: Während in Nullmutanten des Sv129- Stammes die nrif2-mRNA-Konzentration ungefähr doppelt so hoch war wie in Wildtyp-Tieren, konnten BL6-Nullmutanten die nrif2-Menge nicht differentiell regulieren. Das Fehlen von NRIF1 und die gleichzeitige Unfähigkeit einer ausgleichenden Hochregulation von NRIF2 könnten ein wichtiger Grund für die embryonale Letalität der nrif1 (-/-)-Embryonen im BL6- Stamm sein. Eine genau ausgewogene Menge der Zinkfingerproteine NRIF1 und NRIF2 scheint demnach essentiell zu sein, damit wichtige Prozesse wie Zellzyklus und Apoptose ungestört ablaufen können.

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Etablierung und Anwendung von Hochdurchsatz-Verfahren zur Identifizierung strahleninduzierbarer Gene in der Hefe

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Play Episode Listen Later Oct 10, 2000


Die Microarray-Technik stellt eine sehr neue Technologie dar, die zwei wesentliche Vorteile gegenüber herkömmlichen Techniken besitzt. Zum einen ist durch Fluoreszenzmarkierung eine kompetitive Hybridisierung möglich, so daß die behandelte Probe und die zugehörige Kontrolle in einem Experiment unter exakt gleichen Bedingungen untersucht werden können. Der noch größere Vorteil dieser Technik liegt in der Möglichkeit, die Expression mehrerer tausend Gene gleichzeitig untersuchen zu können. In diesem Kapitel wurde der Einfluß verschiedener Strahlenarten (UV-C, γ-, Protonen- und C6+-Ionen-Strahlung) auf die Expression von Hefegenen getestet. In einem ersten Schritt wurden für die verschiedenen Noxen die äquitoxischen Dosen ermittelt, um die Strahlenarten miteinander vergleichen zu können. Als Kontrolle wurde zusätzlich zu den verwendeten Strahlenarten der Einfluß der alkylierenden Chemikalie MMS auf die Expression untersucht. Hierzu liegt bereits eine publizierte Arbeit vor (Jelinsky and Samson, 1999), mit der die hier erzielten Ergebnisse verglichen werden konnten. Fünf der zehn am stärksten induzierten Gene wurden bereits von Jelinsky und Samson als stark induzierbar (Faktor >10) beschrieben. Die Diskrepanz bei den fünf restlichen Genen könnte trotz weitgehender Adaption des „Jelinsky“- Protokolls durch die Verwendung eines anderen Stammes oder durch die unterschiedliche Microarray Technik (hier cDNA-Arrays, bei Jelinsky und Samson Oligonukleotid-Arrays) erklärbar sein. Eine Wiederholung der Hybridisierung ergab, daß die Expressionsunterschiede von den zehn am stärksten induzierten Genen im ersten Experiment im Wiederholungsexperiment in neun Fällen bestätigt werden konnten. Interessanterweise ließen sich sieben dieser Gene in drei Gruppen einordnen, die räumlich auf dem Chromosom direkt benachbart angeordnet sind und vermutlich koreguliert werden. Während bei MMS-behandelten Zellen die stärksten Expressionsunterschiede beobachtet wurden, zeigten sämtliche verwendete ionisierende Strahlenarten einen geringen Effekt auf das Expressionsprofil. UV-Strahlung bewirkte ein intermediäres Expressionsmuster bezüglich der Transkriptmengen - es waren deutlich mehr Gene induziert bzw. reprimiert als bei den ionisierenden Strahlenarten, wohingegen im Vergleich zur MMS-Behandlung signifikant weniger Expressionsveränderungen festgestellt wurden. Die Analyse der Gene mit stark veränderten Transkriptmengen ergab, daß viele Gene, deren Induktion nach Bestrahlung bereits früher publiziert worden ist, hier nicht als induzierbar gefunden wurden. Mehrere Faktoren könnten dafür verantwortlich sein: Niedrig exprimierte Gene (viele der DNAReparaturgene sind niedrig exprimiert!) sind wie bei vielen anderen Methoden der Expressionsmessung schwer detektierbar. Zudem können geringe Expressionsunterschiede (kleiner Faktor zwei) bislang nicht festgestellt werden. Ferner konnten aufgrund des zeitlichen Rahmens meines Aufenthalts am NIEHS alle Hybridisierungen nur einmal (bei γ-Strahlung zweimal) wiederholt werden, wodurch eine statistisch verläßliche Aussage im Fall von geringen Expressionsunterschieden erschwert ist. Daher wurden in diesem Kapitel nur Expressionsunterschiede von mindestens Faktor zwei berücksichtigt. Trotz dieser Schwierigkeiten gibt es einige Indizien, die für eine biologische Relevanz der gezeigten Ergebnisse sprechen. So wurden in mehreren Fällen Genpaare (bzw. -gruppen) identifiziert, deren Transkriptmengen nach Bestrahlung ähnlich stark verändert vorlagen und die bereits früher aufgrund funktioneller Ähnlichkeiten in Genfamilien zusammengefasst wurden (z.B. wurden fünf ribosomale Gene mit mehr als dreifach erhöhter Transkriptmenge nach UV-Bestrahlung gefunden). Außerdem wurden die RNR-Gene bei allen getesteten Strahlenarten als stark induzierbar eingestuft, was aus früheren Expressionsmessungen bereits bekannt ist (Endo-Ichikawa, et al., 1996; Huang and Elledge, 1997; Hurd and Roberts, 1989). Nach UV- und C6+-Ionen - Bestrahlung konnten zudem mit DUN1 und RAD53 zwei Gene als induzierbar eingestuft werden, die an der Signaltransduktion, die zur Induktion der RNR-Gene notwendig ist, beteiligt sind. Schließlich zeigte auch die stichprobenartige Überprüfung der mit Microarrays erzielten Expressionsdaten durch Northern-Hybridisierungen eine gute Übereinstimmung. So konnten die in den drei untersuchten Genen (EGT2, HSP30 und YPR015C) gefundenen Transkriptionsveränderungen nach Bestrahlung bzw. Behandlung mit MMS verifiziert werden. Neben den Genen mit bekannter Funktion in der DNA-Schadensprozessierung wurden einige Gene identifiziert, die bislang nicht in Verbindung mit DNA-Schädigung gebracht worden sind. So zeigte sich nach Behandlung mit allen untersuchten Strahlenarten (auch MMS) eine deutliche Verringerung der Transkriptmenge des EGT2-Gens, für das eine Rolle in der Zellzykluskontrolle gezeigt wurde (Kovacech, et al., 1996). Eine erhöhte Transkriptmenge wurde für den Leserahmen YLL030C nach UV-,C6+- und γ-Bestrahlung gefunden. Bei sämtlichen verwendeten Strahlenarten wurde eine ebenfalls deutlich erhöhte Transkriptmenge für den Leserahmen YPR015C gezeigt, der aufgrund von Sequenzhomologien als möglicher Transkriptionsfaktor diskutiert wird (Bohm, et al., 1997). Inwieweit Gene, die lediglich bei einer Bestrahlungsart induziert bzw. reprimiert vorlagen, tatsächlich strahlenspezifisch reguliert sind, muß erst durch weitergehende Analysen geklärt werden.