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Enzymverstärkte Testsysteme wie der ELISA finden in der serologischen Diagnostik bei Hühnervögeln bereits breite Anwendung. Beim Wassergeflügel gilt dagegen immer noch der Hämagglutinationshemmungstest (HAH) als Test der ersten Wahl. Für große Probenmengen ist er jedoch ungeeignet und insbesondere bei Seren mangelhafter Qualität mit dem Problem unspezifischer Reaktionen behaftet. Daraus ergibt sich die Notwendigkeit der Etablierung alternativer serologischer Testverfahren auch für das Wassergeflügel. Basierend auf einem monoklonalen, gegen die leichte Kette von Pekingenten-Immunglobulin (Ig) gerichteten Antikörper (mAk 14A3) (Kothlow et al., 2005) wurden im Rahmen dieser Arbeit indirekte Testsysteme für das Wassergeflügel etabliert. Die Kreuzreaktivität des mAk 14A3 mit verschiedenen Entenspezies (Flugente = Cairina moschata, Stockente = Anas platyrhynchos, Weißflügelente = Asarcornis scutulatus, Spießente = Dafila acuta) sowie zwei Schwanenspezies (Höckerschwan = Cygnus olor, Schwarzhalsschwan = Sthenelides melanocoryphus) und zwei Gänsespezies (Hausgans = Anser anser var. domestica, Rothalsgans = Rufibrenta ruficollis) wurde mittels Western Blot (WB) überprüft. Der Antikörper wies Reaktivität gegenüber der leichten Kette des Serum-Ig aller getesteten Wassergeflügelspezies auf. Mit Hilfe seropositiver Seren von gegen aviäre Paramyxoviren des Serotyps 1 (APMV-1) geimpften Hausgänsen und Moschusenten konnte gezeigt werden, dass der Antispezies-Antikörper fähig ist die spezifische Färbung APMV-1-infizierter Zellen im Immunfluoreszenztest zu vermitteln. Darüber hinaus bewährte er sich auch im indirekten ELISA und im WB (Kothlow et al., 2008). Mit dem etablierten indirekten Newcastle Disease (ND)-ELISA ließ sich in Seren adulter Moschusenten und Hausgänse drei Wochen nach Vakzination mit einem inaktivierten ND-Impfstoff für Hühner eine Serokonversion nachweisen, die bis zum Versuchsende (10 Wochen p.v.) anhielt. Zwischen den ELISA-Werten und den parallel ermittelten HAH-Titern war eine positive lineare Korrelation feststellbar (Pearson’s product moment correlation; r = 0.652; P < 0.001). In Woche 7 und 10 nach der Impfung erkannte der ELISA jedoch zehn Seren geimpfter Tiere mehr positiv als der HAH, wobei für acht dieser Seren mittels WB eine spezifisch gegen aviäre Paramyxoviren gerichtete Reaktivität bestätigt werden konnte. Die sich aus dem Vergleich der Tests ergebende relative diagnostische Sensitivität (rDSe) des ELISA (100.0%) war höher als die des HAH (91.1%), seine relative diagnostische Spezifität (rDSp) etwas niedriger (ELISA: 91.7%; HAH: 97.2%). Die zweimalige Testung aller Seren unter den gleichen Versuchsbedingungen ergab eine sehr gute Wiederholbarkeit des etablierten ELISA mit einer positiven linearen Korrelation der Ergebnisse (Pearson’s product-moment correlation; r = 0.982; P < 0.001; ls = 0.05) (Häuslaigner et al., 2009). Der untersuchte monoklonale Antispezies-Antikörper stellt somit ein attraktives und vielseitig einsetzbares Reagenz dar, das die Möglichkeit eröffnet, serologische Testverfahren für das Wassergeflügel, zum Einsatz in Diagnostik und Forschung zu entwickeln. Der etablierte indirekte ELISA erwies sich als gut geeignet, die Immunantwort beim Wassergeflügel nach ND-Impfung zu detektieren. Die gute Reproduzierbarkeit seiner Ergebnisse spricht für eine hohe Aussagesicherheit. Basierend auf der sich aus dem Vakzinationsstatus ergebenden diagnostischen Sensitivität (DSe) (92.2%) und Spezifität (DSp) (96.2%), kann der etablierte ND-ELISA als geeignete Alternativ- und Ergänzungsmethode zum HAH (DSe 83.0%, DSp 100.0%) angesehen werden. Vor allem zu späteren Zeitpunkten nach Viruskontakt scheint er mehr seropositive Reagenten als der HAH zu erkennen, wohingegen sich letzterer in der DSp überlegen zeigte. Die Ergebnisse der serologischen Untersuchungen unterstreichen zudem die Immunogenität des inaktivierten ND-Impfstoffes bei domestizierten Hausgänsen und Moschusenten, wobei die doppelte Hühnerdosis eine effizientere Antikörper-Antwort zu induzieren scheint.

The vaccination against avian paramyxovirus of the serotype 1 (APMV-1), the highly contagious agent of Newcastle Disease, is usually conducted with live attenuated vaccine strains within the first two weeks after hatch. Multiple efforts have been made to develop an in ovo vaccine, yet none of the approaches proved suitable for an application in commercial poultry. The aim of the performed study was to evaluate the strain APMV-1 599, which had proven apathogenic for day-old chicks, for its progress of infection and the induction of protective immunity after inoculation of spf-chicken eggs. The inoculation of embryonated chicken eggs with 106 EID50 of the APMV-1 599 strain at incubation day 18 caused an infection in virtually all hatched chicks at a maintained hatch rate of 81,7%, which was not substantially lower than that the 60% hatch rate of a group of uninfected sentinel animals that hatched in the same incubator and the hatch rate of 95% of an uninfected and separately hatched control group. Although the hatch rate was not reduced, the animals that were infected in ovo with APMV-1 599 showed pronounced clinical signs during the first ten days after hatch. These manifested themselves in the form of respiratory symptoms, apathy, diarrhea and in sporadic cases central nervous impairments, which led to a mortality rate of 54,1% within the first eight days after hatch. Opposed to this, the affiliated sentinel animals showed neither distinct clinical signs nor a substantially elevated mortality rate despite the proven transmission of the virus by the animals of the in ovo infected goup. To determine the spread of the virus to numerous organs, a novel Real-Time RT-PCR protocol targeting an amplificate located at the 5’ end of the nucleoprotein gene was established in addition to the published and validated method targeting a sequence on the matrix protein gene (WISE et al, 2004). Due to low fluorescence levels and irregular fluorescence curves, six of the conventional nucleotides incorporated into the 5’ nuclease probe were replaced by “locked nucleic acid” (LNA) nucleotides. This led to a shortening of the probe from 25 to 17 bases and thus an improvement of probe hybridization. The newly developed assay showed a comparable performance to the previously established protocol. During the first eight days after hatch, viral RNA was detectable in multiple organs with a predilection for lung and cecum / cecal tonsil. Viral RNA could also be detected in twelve of the liver samples as well as nine of the brain samples. Following the period of clinical impairment, no viral RNA was detectable in the samples from days 14 and 21. Specific antibodies could be detected by hemagglutination inhibition test from day seven and from day 21 by commercial ELISA. Additionally, the evaluation of cellular immune response indicates the formation of t-memory cells in the in ovo infected group and the sentinel animals. One single inoculation of APMV-1 599 in ovo was sufficient to induce a humoral and cellular immune response to protect all in ovo infected and most of the sentinel animals upon challenge with velogenic NDV Herts (Weybridge 33 / 56) at day 21. Shedding of the challenge virus was not noted in the in ovo infected group, while three of the ten sampled sentinel animals as well as all the animals in the control group shed virus two and four days after challenge, respectively. Due to the visible clinical impairment of the chicks, an in ovo vaccination with APMV-1 599 in the applied mode is not to be considered. The performed experiments demonstrated a generalization of the infection and servere clinical symptoms compared to the vaccination of animals after hatch. These results are indicative of embryonic developmental processes within the last three days before hatch, which are essential for the immunologic defense of very young chicks. A complete understanding of these ongoing immunological processes would not only be of importance for the development of in ovo vaccines against Newcastle Disease, but also in regard to potential early infections with other infectious agents.

Ein Tauben APMV-1 Impfstoff (ParamyxovacÒ, Fa. Intervet), der auf einem schwach virulenten homologen Tauben APMV-1 Stamm basiert, wurde auf seine Schutzwirkung nach drei, sechs, neun und zwölf Monaten getestet. Anhand ungeimpfter Kontrolltiere wurde die Manifestation der experimentellen APMV-1 Infektion bei Tauben untersucht, unter besonderer Berücksichtigung der feingeweblichen Veränderungen. Bei den ungeimpften Kontrolltauben wurden durch die Infektion (10 5,5 EID50, i.m.) klassische neurologische APMV-1 Krankheitsanzeichen in Form von motorischen Ausfallserscheinungen der Flügel induziert. Histologisch war mit dem siebten Tag im Rückenmark im Bereich des Plexus lumbosacralis eine nicht-eitrige Panmyelopathie sowie eine nicht-eitrige Neuritis bzw. Ganglionitis nachweisbar. In den geschädigten Gebieten des Rückenmarks wurde immunhistochemisch APMV-1 Antigen nachgewiesen. Auch die histopathologischen Befunde der inneren Organe wiesen auf eine generalisierte Infektion hin. Neben einer nicht-eitrigen Pankreatitis, die bei 22 von 39 der Tauben auftrat, wurden bei 16 von 39 Tieren Nekrosen des Pankreasparenchyms und bei 3 von 29 Nekrosen des Nebennierenparenchyms beobachtet. Gegenüber uninfizierten Negativ-Kontrolltauben, bei denen in der Niere eine geringgradige Infiltration mit mononukleären Entzündungszellen zu beobachten war, trat bei den experimentell infizierten Tauben eine mittel- bis hochgradige nicht-eitrige, interstitielle Nephritis auf. Für den quantitativen Vergleich zwischen den unterschiedlichen Gruppen wurde ein Histologischer Pathogenitätsindex (HPI) herangezogen. Neu im Zusammenhang mit der APMV-1 Infektion der Taube ist der Befund einer nicht-eitrigen Polyserositis, der bei 23 von 39 der APMV-1 infizierten Kontrolltauben erhoben wurde. Bei den geimpften Tauben wurde nach Belastungsinfektion, die drei, sechs und neun Monate nach der Impfung erfolgte, keine klinischen Symptomatik beobachtet. In der Gruppe D, die zwölf Monate nach der Impfung infiziert wurde, zeigte eine von 15 Tauben reduzierte Flugfähigkeit bis Flugunfähigkeit, so dass der prozentuale Anteil der kummulativ erkrankten Tauben in dieser Gruppe bei 7,7 % lag. Histologisch konnte aufgezeigt werden, dass die Impfung eine Reduktion der APMV-1 induzierten Veränderungen an den inneren Organen vermittelt. So trat zwar bei 14 von 52 APMV-1 geimpften Tieren eine nicht-eitrige Serositis auf, der HPI weist jedoch in Bezug auf Häufigkeit und Ausprägungsgrad eine statistisch signifikant geringere Ausprägung (p = 0,001) gegenüber den ungeimpften Tauben nach. Durch Betrachtung des HPI konnte ebenfalls gezeigt werden, dass die geimpften gegenüber den ungeimpften Tauben vor spezifischen Veränderungen am Pankreas (Pankreasnekrosen, mononukleäre Infiltrate) sowie an der Niere geschützt waren. Durch die Impfung wurde ebenfalls eine deutliche Reduktion der Virusausscheidung erreicht.